JPH06138027A

JPH06138027A - 光エコー顕微鏡

Info

Publication number: JPH06138027A
Application number: JP4284701A
Authority: JP
Inventors: Akira Furusawa; 明古澤
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 1992-09-14
Filing date: 1992-10-22
Publication date: 1994-05-20

Abstract

(57)【要約】【目的】単純な構成の光エコー顕微鏡を提供する。【構成】光源手段（Ａ）と、光変調光学系（Ｂ）と、
光学顕微鏡（Ｃ）と、検出器１２と、ロックインアンプ
１３と、電気信号処理装置４０と、データ処理装置５０
と、制御手段３０とを有する。光変調光学系（Ｂ）は、
光分割器２と、光合波器３と、第１の直交反射面６ａ,
６ｂと、第２の直交反射面７ａ, ７ｂと、図示省略した
可動ステージに固定された第１のコーナーキューブ４ａ
と、変位器４ｂと、位相変調手段５と、コーナーキュー
ブ５ａと、圧電素子５ｂと、交流駆動電源５ｃとを有す
る。光学顕微鏡（Ｃ）は、半透過鏡１０と、光トラップ
１４と、対物レンズ系１１からなる照射光学系とを有す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、例えば物質の物理化学
的な性質の差を光学的に観察できる光エコー顕微鏡に関
する。

【０００２】

【従来の技術】一般に、レーザー光で試料を走査して得
られた光情報を用いて試料を観察するレーザー走査顕微
鏡が知られている。しかし、従来のレーザー走査顕微鏡
によって得られる試料の情報は、通常の光学顕微鏡の画
像から得られる情報と比較すると質的に大差ないもので
あった。これに対して、本出願人は特願平３−３０３５
０号の明細書において、通常の光学顕微鏡では得られな
い試料の物理化学的な性質の差異に関する情報を得るこ
とができる顕微鏡として光エコー顕微鏡を提案した。光
エコー顕微鏡は、原理的には試料にレーザー光を照射し
て、試料中に含まれているそのレーザー光と共鳴しうる
光吸収体における光エコーによる光学的位相緩和時間
（一般に、「Ｔ２緩和時間」又は「横緩和時間」と呼ば
れている時間である）を測定する物である。光エコーの
現象については、例えば、「超高速光技術」（矢島達男
編、丸善、平成２年３月発行）に記載されている。

【０００３】特願平３−３０３５０号明細書において
は、光エコー測定とレーザー走査顕微鏡と組み合わせて
そのレーザー光と試料とを２次元的に、さらには３次元
的に相対的に走査して、得られた位相緩和時間を２次元
的又は３次元的にマッピングすることにより、試料の物
理化学的な性質の分布状態を明らかにすることができる
と述べた。また、同時に通常のレーザー走査顕微鏡とし
ての画像も得ることができるとした。

【０００４】例えば、レーザー光と共鳴し得る色素を、
結晶質と非晶質とが混在するポリマー中に分散した場
合、結晶質中と非晶質中とでは光学的位相緩和時間が異
なることを利用することにより、結晶質相と非晶質相と
がどのような形で混在するのかを光エコー顕微鏡により
観察することができる。また、固体の場合には、その光
学的位相緩和時間は蓄積フォトンエコーのヘテロダイン
検出により容易に測定することができる。さらに、光位
相変調によるヘテロダイン検出法も使用できる。

【０００５】本発明で利用している光エコーの光位相変
調によるヘテロダイン検出法については、本出願人によ
る特願平２−２５３０１１号の明細書に開示されてい
る。以下、特願平２−２５３０１１号明細書により測定
法を述べる。

【０００６】本測定は、パルス光を用い、基本的には誘
導フォトンエコーという現象を利用している。

【０００７】よく知られているように、物質の光励起状
態はその密度行列の運動法的式（Ｌｉｏｖｉｌｌｅの法
定式）で表現でき、便宜的に密度行列の対角成分の緩和
時間をＴ₁時間（縦緩和時間）、非対角成分の緩和時間
をＴ₂時間（横緩和時間）と呼んで区別している。縦緩
和とは、光励起状態がエネルギーの放出をともなって緩
和する過程を意味すると考えられており、横緩和とは入
射光によって物質中にもたらされた電気的分極の振動の
コヒーレンシーが乱されてゆく過程も示すと考えられて
いる。

【０００８】光エコー（フォトンエコー）という現象
は、３次の非線形光学効果の一種であると考えられる
が、その中の誘導フォトンエコーについて図２により説
明する。物質をエネルギー共鳴的に適当なパルス光で励
起する場合を考える。まずｔ₁時にＥ₁のパルス光を照
射し、続いてｔ₂時にＥ₂のパルス光を照射する。次に
ｔ₃時に第３のパルスＥ₃を照射すると、（ｔ₃＋ｔ₂
−ｔ₁＝ｔ₃＋τ）時に今度は逆に物質から光が放射さ
れてくる。これが誘導フォトンエコー光である。そし
て、誘導フォトンエコー光の強度は、ｅｘｐ（−４τ／
Ｔ₂）に比例して減衰する。従って、光エコー顕微鏡で
は、τを変えながら強度測定をして、物質ごと、または
状態ごとに異なるＴ₂を求めるものである。

【０００９】先のＬｉｏｖｉｌｌｅの方程式を、回転波
近似、及び弱励起光近似による摂動展開により計算する
と、３次の非線形分極波すなわちエコー波が求まる。

【００１０】フォトンエコーは、３次の非線形光学現象
の一種でり、一般にはその効果は小さい。再生励起光に
対してフォトンエコー光強度は数桁弱いのが普通であ
る。このような微弱光を検出するのに、光の干渉を利用
すると検出精度が上がることが知られている。

【００１１】この場合、微弱光（フォトンエコー光）
は、位相特性の既知の光波（プローブ光Ｅ₄）と干渉さ
せて、微弱光の強度及び位相の変化を増幅して観測（測
定）する。このとき、微弱光の強度又は周波数をなんら
かの方法で変調し、合成光（エコー光とプローブ光との
合成光）出力中の同期成分だけを増幅してコントラスト
を上げることが一般に行われている。

【００１２】光エコーとプローブ光の干渉により得られ
る光の信号強度は、書込時の遅延時間ｔ₂₁（＝ｔ₂−
ｔ₁）と読出時の遅延時間ｔ₄₃（＝ｔ₄−ｔ₃）との僅か
な差により、大きく変化する。これは、光干渉の極めて
優れた特長である反面欠点でもある。

【００１３】本発明においては、遅延時間ｔ₂₁と遅延時
間ｔ₄₃とを、１０~¹⁰ ｓｅｃの精度で一致させなければ
ならない。この時間は、光路長に変換すると、１０~²μ
ｍに相当する。従って、エコー光をプローブ光との干渉
により検出する装置では、１０~²μｍ程度の機械的精度
が要求されることになり、これを現在の技術力で成し遂
げようとすると、極めて高価で大掛かりな装置が必要に
なる。そのために、本発明では、以下のようにしてい
る。

【００１４】ｔ₄₂−ｔ₂₁を、光の１周期以上変調する
と、エコー光とプローブ光との合成光の強度もそれと同
期して変調することが判る。ここで、ｔ₄₃即ち励起光と
プローブ光との遅延時間を同期して振動させることを考
える。これは励起光に対しプローブ光を相対的に位相変
調したことと同等である。この時に、位相変調周波数の
偶数倍の変調成分のみが残ることが判る。

【００１５】従って、励起光とプローブ光を相対的に周
波数ｆで位相変調し、エコー光とプローブ光との合成光
を光電変換して得られる電信信号からｆの偶数倍（２
倍、４倍、６倍・・・・・・）の成分だけを抽出すれ
ば、エコー光を安定に高精度で検出器することができる
訳である。

【００１６】特願平２−２５３０１１号の明細書で述べ
た実施例においては、光源としては、再生励起光光源プ
ローブ光光源とを兼用したものであり、モード同期ＹＡ
Ｇレーザーの高調波励起キトンレッド色素レーザであ
る。繰り返し周波数８２ＭＨｚのパルス光を出力する。
キトンレッド色素レーザーからは全ての波長選択素子を
取り外した。その結果、中心波長６２０ｎｍ、スペクト
ル幅４００ｃｍ~¹（相関時間３７ｆｓｅｃフェムト秒に
相当）のインコヒーレント光が得られる。

【００１７】図２に、ｔ₁，ｔ₂，ｔ₃，ｔ₄の関係を示
す。ｔ₁とｔ₃、ｔ₂とｔ₄が８０ＭＨｚで繰り返され、ｔ
₁とｔ₂、ｔ₃とｔ₄の間が遅延手段によって例えば、５ｐ
ｓｅｃという遅延時間に設定される。ｔ₁とｔ₂、ｔ₃と
ｔ₄の間は位相変調手段によって、位相変調が加えられ
る。

【００１８】

【発明が解決しようとする課題】その本出願人の先願に
係わる光エコー顕微鏡は、基本構成として共焦点型レー
ザー顕微鏡であった。共焦点型レーザー走査顕微鏡は、
走査手段および光学系の共焦点配置などが必要であり装
置が複雑になる。先願の光エコー顕微鏡においても装置
が複雑になるという問題点があった。

【００１９】本発明はかかる点に鑑み、簡便な光エコー
顕微鏡を提供することを第１の目的とする。

【００２０】ところで、人間組織・細胞の病理状態を光
学的に検査できる光学的病理検査装置に関して、一般
に、光学顕微鏡やレーザー走査顕微鏡を用いた光学的病
理組織・細胞診断法が知られている。これらの従来法で
は、主に被検試料の色素染色による可視化・形態観察お
よび染色の程度・分布から病理診断を行っている。従っ
て、被検試料の分子レベルでの構造およびダイナミクス
に関する情報は得られず、分子レベルでの病理診断はほ
とんど不可能であった。特に、発病初期などに見られる
非常に微妙な変化−分子レベルでの構造・組成変化を検
出し診断する必要のあるものには、従来法では不十分な
場合があった。これは、生物組織・細胞のミクロな多様
性が正常・病理状態に大きく影響を与えるためと考えら
れる。

【００２１】従来の光学的病理検査法では、被検試料の
分子レベルでの構造・組成変化を検出し診断する必要が
ある場合、その能力が不十分であった。

【００２２】本発明はかかる点に鑑み、被検物質の分子
レベルでの構造・組成変化を検出し得る光学的病理検査
装置を提供することを第２の目的とする。

【００２３】

【課題を解決するための手段】上記第１の課題を解決す
るために、本発明は、光エコーにより被検物体を観察す
る光エコー顕微鏡において、光を供給するレーザー光源
と、該光源からの光を２光束に分割する光分割器と、該
光分割器により分岐された２光束の一方の光路中に配置
された光遅延器と、該２光束のうちの一方の光を所定の
周波数で位相変調するための位相変調器と、該２光束を
合波する光合成器と、該合波された光束を被検物体上に
導いて光スポットを形成するための照射光学系と、前記
被検物体からの光を検出する光検出器と、前記光検出器
の出力信号から前記位相変調器の変調周波数の偶数倍の
変調成分を抽出して、遅延時間に応じた光エコーの強度
を出力する信号処理手段とを有する。

【００２４】ここで、レーザー光源は、被検物体に対し
て注目する光吸収帯の光学的位相緩和時間よりも短い時
間コヒーレンスを有することが望ましい。

【００２５】照射光学系により光学顕微鏡の視野内の被
検物体の１点に、前記光合成器通過後の合波された２光
束を集光し、被検物体からの光を光検出器及び信号処理
手段により解析する。信号処理手段からの出力信号は光
遅延器による遅延時間に対して記録する。

【００２６】本発明による光エコー顕微鏡では、光学顕
微鏡による観察と光エコー測定による被検物体の解析
が、同時に或いは切り替えで行うことができる。つま
り、光学顕微鏡の対物光学系と光エコー測定における照
射光学系は共通とする。

【００２７】上記第２の課題を解決するために、上記光
エコー顕微鏡を光学的病理検査装置に適用するものであ
る。

【００２８】

【作用】かかる本発明の光エコー顕微鏡によれば、従来
の光学顕微鏡視野内の１点の光エコーを観測することが
でき、光エコーを観測した正確な位置およびそのまわり
の形態観測ができる。

【００２９】さらに、同一出願人の先願による光エコー
顕微鏡に比べ、構造を単純にすることができる。つま
り、先願の光エコー顕微鏡は共焦点型顕微鏡であった
が、本願の光エコー顕微鏡では、従来の光学顕微鏡を用
いて、光学顕微鏡の視野内の光エコーを観測するもので
ある。

【００３０】上記第２の課題を解決するために、上記光
エコー顕微鏡を光学的病理検査装置に適用すると、分子
レベルでの構造・組成変化を反映する物理量である、光
学的位相緩和時間（Ｔ２）が利用できる。本発明に係る
光エコー測定では、病理的には試料にレーザー光を照射
して、試料中に含まれるそのレーザー光と共鳴し得る光
吸収体から放射される光エコーにより光学的位相緩和時
間が測定される。

【００３１】

【実施例】以下、本発明による光エコー顕微鏡の一実施
例につき図１を参照して説明する。

【００３２】図１は本実施例の光エコー顕微鏡の概略の
構成を示し、この１図に示すように、本例の光学系は大
別すると、それぞれ点線で囲まれた３つの部分、即ち、
光源手段（Ａ）と、光変調光学系（Ｂ）と、光学顕微鏡
（Ｃ）と、光検出器である検出器１２と、ロックインア
ンプ１３と、電気信号処理装置４０と、データ処理装置
５０と、制御手段３０とを有する。ロックインアンプ１
３と、電気信号処理装置４０と、データ処理装置５０
と、制御手段３０とは、信号処理手段を構成する。

【００３３】光変調光学系（Ｂ）は、光分割器２と、光
合成器である光合波器３と、第１の直交反射面６ａ, ６
ｂと、第２の直交反射面７ａ, ７ｂと、図示省略した可
動ステージに固定された第１のコーナーキューブ４ａ
と、光遅延器である変位器４ｂと、位相変調器である位
相変調手段５と、コーナーキューブ５ａと、圧電素子５
ｂと、交流駆動電源５ｃとを有する。

【００３４】光学顕微鏡（Ｃ）は、半透過鏡１０と、光
トラップ１４と、対物レンズ系１１からなる照射光学系
とを有する。

【００３５】本例の光源手段（Ａ）は、レーザー光源１
そのものであり、このレーザー光源１は８０ＭＨｚのモ
ード同期アルゴンイオンレーザー励起による色素レーザ
ーである。レーザー光源１としては、その外に、マルチ
モード半導体レーザー、モード同期半導体レーザー、発
光ダイオード又は固体レーザー等を使用することができ
る。レーザー光源１から発生される光は、像面上で点と
みなせる空間コヒーレンスを有し、且つ被検物体の注目
する光吸収帯の光学的な位相緩和時間よりも短い時間コ
ヒーレンスを有することが望ましい。

【００３６】図１において、レーザー光源１で発生され
たレーザー光を光変調光学系（Ｂ）の入力側の光分割器
２に入射させ、この光分割器２でそのレーザー光を２つ
の光束に分割する。また、光変調光学系（Ｂ）の出力側
には、そのように分岐された２つの光束を合波する光合
波器３を配置する。光分割器２及び光合波器３は共に偏
光ビームスプリッターであるが、代わりに偏光特性がほ
とんど無いか或いは全く無い半透鏡なども用いることが
できる。それら光分割器２と光合波器３との間に並列に
第１の直交反射面６ａ, ６ｂと第２の直交反射面７ａ,
７ｂとを配する。このように光源手段（Ａ）からの光を
２分して再び合波する光学系としては、マイケルソン干
渉計やマッハツェンダー干渉計等に類する２光路干渉光
学系が好適である。

【００３７】光分割器２の分割面を透過した光束は、第
１の直交反射面の一方の反射面６ａで反射された後に、
図示省略した可動ステージに固定された第１のコーナー
キューブ４ａに向かう。このコーナーキューブ４ａで反
射された光束が第１の直交反射面の第１の直交反射面の
他方の反射面６ｂで反射されて光合波器３に入射する。
４ｂはその可動ステージを介してコーナーキューブ４ａ
を変位させる変位器を示し、コーナーキューブ４ａ、可
動ステージ及び変位器４ｂより光遅延手段４が構成され
ている。この変位器４ｂを用いてコーナーキューブ４ａ
を移動させることにより、一方の光束に所定量だけ遅延
を生じさせることができる。ここで、コーナーキューブ
４ａの代わりに、２枚の鏡或いは直角プリズム等を用い
ても良い。

【００３８】光分割器２の分割面で反射された光束は、
第２の直交反射面の一方の反射面７ａで反射された後
に、位相変調手段５に入射する。位相変調手段５として
は、一般に電気光学結晶を用いたものがよく知られてい
るが、本実施例においては、一端が固定され他端にコー
ナーキューブ５ａが固定された圧電素子５ｂを用いてい
る。そして、交流駆動電源５ｃにより圧電素子５ｂに所
定の周波数ｆの交流電圧を印加することによって、周波
数ｆの位相変調手段を構成している。ここで、コーナー
キューブ５ｂの代わりに分散の小さな直角プリズム等を
用いても良い。位相変調手段５を通過した光束は、第２
の直交反射面７ｂで反射されて光合波器３に入射する。

【００３９】本実施例では、光分割器２の透過光路上に
光遅延手段４を、反射光路上に位相変調手段５を配置し
たが、これに限らず、逆の配置でも可能であり、また光
遅延手段と位相変調手段とを共に一方の光路上に配置す
ることも可能である。

【００４０】これら光分割器２、光合波器３、光遅延手
段４及び位相変調手段５により光変調光学系（Ｂ）が構
成されている。この光変調光学系（Ｂ）内の２光束が光
合波器３で合波されて、光学顕微鏡（Ｃ）の半透鏡１０
に向かう。

【００４１】光学顕微鏡（Ｃ）において、光軸に４５°
の傾斜角で斜設された半透過鏡１０で反射された光変調
光学系（Ｂ）からの光束は、対物レンズ系１１からなる
照射光学系により、被検物体２０上に集光され光スポッ
トが形成される。被検物体２０の光スポット形成部にお
ける蛍光若しくは燐光による発光、照射レーザー光の反
射、回折若しくは散乱等をうまく検出できるよう、光電
子増倍管よりなる検出器１２を配置する。検出器１２の
前には必要に応じてフィルターを挿入する。ここで、検
出器１２の位置は、図の位置に限定されるものではな
く、透過光を検出する配置であっても良い。

【００４２】検出器１２は光電変換により入射光量に応
じた信号を出力し、この検出器１２から出力される信号
のなかから位相変調周波数の２倍の変調成分のみがロッ
クインアンプ１３により増幅される。増幅された信号
は、光遅延器４による遅延時間に応じて、電気信号処理
装置４０を介してデータ処理装置５０の中に蓄えられ解
析される。尚、光変調光学系（Ｂ）からの光のうち半透
過鏡１０を透過する光が、集光光学系に入射して迷光を
生ずるのを防止するために、光トラップ１４が配置され
ている。また、被検物体を入れる試料室２１は必要に応
じて冷却できる。

【００４３】光学顕微鏡による形態観察は、光エコー測
定と同時に或いは切り替えにより行うことができる。

【００４４】以上の如き本実施例の光エコー顕微鏡によ
り、例えば、ローダミン６４０またはテキサスレッドな
る色素を用いて生体組織を染色して観察する場合、レー
ザー光源１のレーザー光として波長が６００ｎｍ付近の
レーザー光を選択し、位相変調器５の位相変調周波数を
２０ＫＨｚとした。光学顕微鏡による形態観察と共に、
顕微鏡視野内の１点にレーザービームを照射し、光遅延
器４のステージ位置を走査しながら４０ＫＨｚの電気信
号のみをロックインアンプ１３により増幅記録すると、
その点における光学的位相緩和時間が得られ、形態情報
と共に生体組織についてより詳しい情報が得られた。

【００４５】次に、本発明による光学的病理検査装置の
一実施例につき図３を参照して説明する。図３は本実施
例の光学的病理検査装置の概略の構成を示し、この１図
に示すように、本例の光学系は大別すると、それぞれ点
線で囲まれた２つの部分、即ち、光源手段（Ａ）、光変
調光学系（Ｂ）と、光検出器である検出器９と、ロック
インアンプ３１と、電気信号処理装置４０と、データ処
理装置５０と、制御手段３０とを有する。ロックインア
ンプ３１と、電気信号処理装置４０と、データ処理装置
５０と、制御手段３０とは、信号処理手段を構成する。

【００４６】光変調光学系（Ｂ）は、光分割器２と、光
合成器である光合波器３と、第１の直交反射面６ａ, ６
ｂと、第２の直交反射面７ａ, ７ｂと、図示省略した可
動ステージに固定された第１のコーナーキューブ４ａ
と、光遅延器である変位器４ｂと、位相変調器である位
相変調手段５と、コーナーキューブ５ａと、圧電素子５
ｂと、交流駆動電源５ｃとを有する。

【００４７】本例の光源手段（Ａ）は、レーザー光源１
そのものであり、このレーザー光源１は８０ＭＨｚのモ
ード同期アルゴンイオンレーザー励起による色素レーザ
ーである。レーザー光源１としては、その外に、マルチ
モード半導体レーザー、モード同期半導体レーザー、発
光ダイオード又は固体レーザー等を使用することができ
る。レーザー光源１から発生される光は、像面上で点と
みなせる空間コヒーレンスを有し、且つ被検物体の注目
する光吸収帯の光学的な位相緩和時間よりも短い時間コ
ヒーレンスを有することが望ましい。

【００４８】図３において、レーザー光源１で発生され
たレーザー光を光変調光学系（Ｂ）の入力側の光分割器
２に入射させ、この光分割器２でそのレーザー光を２つ
の光束に分割する。また、光変調光学系（Ｂ）の出力側
には、そのように分岐された２つの光束を合波する光合
波器３を配置する。光分割器２及び光合波器３は共に偏
光ビームスプリッターであるが、代わりに偏光特性がほ
とんど無いか或いは全く無い半透鏡なども用いることが
できる。それら光分割器２と光合波器３との間に並列に
第１の直交反射面６ａ，６ｂと第２の直交反射面７ａ，
７ｂとを配する。このように光源手段（Ａ）からの光を
２分して再び合波する光学系としては、マイケルソン干
渉計やマッハツェンダー干渉計等に類する２光路干渉光
学系が好適である。

【００４９】光分割器２の分割面を透過した光束は、第
１の直交反射面の一方の反射面６ａで反射された後に、
図示省略した可動ステージに固定された第１のコーナー
キューブ４ａに向かう。このコーナーキューブ４ａで反
射された光束が第１の直交反射面の第１の直交反射面の
他方の反射面６ｂで反射されて光合波器３に入射する。
４ｂはその可動ステージを介してコーナーキューブ４ａ
を変位させる変位器を示し、コーナーキューブ４ａ、可
動ステージ及び変位器４ｂより光遅延手段４が構成され
ている。この変位器４ｂを用いてコーナーキューブ４ａ
を移動させることにより、一方の光束に所定量だけ遅延
を生じさせることができる。ここで、コーナーキューブ
４ａの代わりに、２枚の鏡或いは直角プリズム等を用い
ても良い。

【００５０】光分割器２の分割面で反射された光束は、
第２の直交反射面の一方の反射面７ａで反射された後
に、位相変調手段５に入射する。位相変調手段５として
は、一般に電気光学結晶を用いたものがよく知られてい
るが、本実施例においては、一端が固定され他端にコー
ナーキューブ５ａが固定された圧電素子５ｂを用いてい
る。そして、交流駆動電源５ｃにより圧電素子５ｂに所
定の周波数ｆの交流電圧を印加することによって、周波
数ｆの位相変調手段を構成している。ここで、コーナー
キューブ５ｂの代わりに分散の小さな直角プリズム等を
用いても良い。位相変調手段５を通過した光束は、第２
の直交反射面７ｂで反射されて光合波器３に入射する。

【００５１】本実施例では、光分割器２の透過光路上に
光遅延手段４を、反射光路上に位相変調手段５を配置し
たが、これに限らず、逆の配置でも可能であり、また光
遅延手段と位相変調手段とを共に一方の光路上に配置す
ることも可能である。

【００５２】これら光分割器２、光合波器３、光遅延手
段４及び位相変調手段５により光変調光学系（Ｂ）が構
成されている。この光変調光学系（Ｂ）内の２光束が光
合波器３で合波され、適当なレンズ系８を通して試料室
２１中の被検試料２０に照射される。試料室２１は必要
に応じて冷却できる。

【００５３】被検試料２０の光スポット形成部における
蛍光若しくは燐光による発光、照射レーザー光の反射、
回折若しくは散乱等をうまく検出できるよう、光電子増
倍管よりなる検出器１０を配置する。検出器１０の前に
は必要に応じてフィルターを挿入する。ここで、検出器
１０の位置は、図の位置に限定されるものではなく、透
過光を検出する配置にあっても良い。

【００５４】検出器１０は光電変換により入射光量に応
じた信号を出力し、この検出器１０から出力される信号
のなかから位相変調周波数の２倍の変調成分のみがロッ
クインアンプ１１により増幅される。増幅された信号
は、光遅延器４による遅延時間に応じて、電気信号処理
装置４０を介してデータ処理装置５０の中に蓄えられ解
析される。

【００５５】以上の如き本実施例の光学的病理検査装置
により、被検試料としてローダミン６４０染色人肝臓組
織の正常組織および腫瘍組織を用いて検査を行ったとこ
ろ、両者を明確に区別することができた。即ち、人肝臓
組織の正常・異常を区別でき、非常に高感度な病理検査
が可能であった。染色色素としては、テキサスレッドお
よびその誘導体を用いても同様な結果が得られた。被検
試料としては、組織試料に限らず細胞試料であっても可
能であった。ここで、実験条件は試料温度５ケルビン、
レーザー光源１のレーザー光として波長が６００ｎｍ付
近のレーザー光であり、位相変調器５の位相変調周波数
は２０ｋＨｚであった。光遅延器４のステージ位置を走
査しながら４０ｋＨｚの電気信号のみをロックインアン
プ１１により増幅記録すると、光学的位相緩和時間が得
られ、その情報を基に客観的な検査結果を出すことがで
きた。

【００５６】第２の実施例によれば、非常に高感度な光
学的病理検査装置を提供できる。本光学的病理検査装置
を用いれば、従来の病理検査装置では検出できなかった
組織・細胞における微妙な変化を検出でき、非常に高感
度な病理検査が可能になる。

【００５７】

【発明の効果】本発明は単純な構成の光エコー顕微鏡を
提供する。本発明の光エコー顕微鏡を用いれば、光学顕
微鏡による形態観察と共に光エコー測定による被検物体
の物理化学情報を得ることができる。また、本発明によ
れば、光エコー測定部分を容易に従来の光学顕微鏡に組
み込むことができ、光エコー顕微鏡の利用分野を広げる
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による光エコー顕微鏡の実施例を示す構
成図である。

【図２】光エコー顕微鏡の測定原理の説明図である。

【図３】本発明による光学的病理検査装置の実施例を示
す構成図である。

【符号の説明】

１光源２光分割器３光合波器４光遅延手段５光変調手段１１対物光学系１２光検出器３０制御手段４０電気信号処理装置５０データ処理装置

【手続補正書】

【提出日】平成５年２月１９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正内容】

【書類名】明細書

【発明の名称】光エコー顕微鏡

【特許請求の範囲】

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、例えば物質の物理化学
的な性質の差を光学的に観察できる光エコー顕微鏡、及
び人間組織・細胞の病理状態を光学的に検査できる光学
的病理検査装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に、レーザー光で試料を走査して得
られた光情報を用いて試料を観察するレーザー走査顕微
鏡が知られている。しかし、従来のレーザー走査顕微鏡
によって得られる試料の情報は、通常の光学顕微鏡の画
像から得られる情報と比較すると質的に大差ないもので
あった。これに対して、本出願人は特願平３−３０３５
０号公報において、通常の光学顕微鏡では得られない試
料の物理化学的な性質の差異に関する情報を得ることが
できる顕微鏡として光エコー顕微鏡を提案した。光エコ
ー顕微鏡は、原理的には試料にレーザー光を照射して、
試料中に含まれているそのレーザー光と共鳴しうる光吸
収体における光エコーによる光学的位相緩和時間（一般
に、「Ｔ２緩和時間」又は「横緩和時間」と呼ばれてい
る時間である）を測定する物である。光エコーの現象に
ついては、例えば、「超高速光技術」（矢島達男編、丸
善、平成２年３月発行）に記載されている。

【０００３】特願平３−３０３５０号公報においては、
光エコー測定とレーザー走査顕微鏡と組み合わせてその
レーザー光と試料とを２次元的に、さらには３次元的に
相対的に走査して、得られた位相緩和時間を２次元的又
は３次元的にマッピングすることにより、試料の物理化
学的な性質の分布状態を明らかにすることができると述
べた。また、同時に通常のレーザー走査顕微鏡としての
画像も得ることができるとした。

【０００５】本発明で利用している光エコーの光位相変
調によるヘテロダイン検出法については、本出願人によ
る特願平２−２５３０１１号公報に開示されている。以
下、特願平２−２５３０１１号公報により測定法を述べ
る。

【００１３】本発明においては、遅延時間ｔ₂₁と遅延時
間ｔ₄₃とを、１０~¹³ ｓｅｃの精度で一致させなければ
ならない。この時間は、光路長に変換すると、１０~²μ
ｍに相当する。従って、エコー光をプローブ光との干渉
により検出する装置では、１０~²μｍ程度の機械的精度
が要求されることになり、これを現在の技術力で成し遂
げようとすると、極めて高価で大掛かりな装置が必要に
なる。そのために、本発明では、以下のようにしてい
る。

【００１４】ｔ₄₃−ｔ₂₁を、光の１周期以上変調する
と、エコー光とプローブ光との合成光の強度もそれと同
期して変調することが判る。ここで、ｔ₄₃即ち励起光と
プローブ光との遅延時間を同期して振動させることを考
える。これは励起光に対しプローブ光を相対的に位相変
調したことと同等である。この時に、位相変調周波数の
偶数倍の変調成分のみが残ることが判る。

【００１５】従って、励起光とプローブ光を相対的に周
波数ｆで位相変調し、エコー光とプローブ光との合成光
を光電変換して得られる電信信号からｆの偶数倍（２
倍、４倍、６倍・・・・・・）の成分だけを抽出すれ
ば、エコー光を安定に高精度で検出することができる訳
である。

【００１６】特願平２−２５３０１１号公報で述べた実
施例においては、光源としては、再生励起光光源プロー
ブ光光源とを兼用したものであり、モード同期ＹＡＧレ
ーザーの高調波励起キトンレッド色素レーザである。繰
り返し周波数８２ＭＨｚのパルス光を出力する。キトン
レッド色素レーザーからは全ての波長選択素子を取り外
した。その結果、中心波長６２０ｎｍ、スペクトル幅４
００ｃｍ~¹（相関時間３７ｆｓｅｃフェムト秒に相当）
のインコヒーレント光が得られる。

【００１７】図２に、ｔ₁，ｔ₂，ｔ₃，ｔ₄の関係を示
す。ｔ₁とｔ₃、ｔ₂とｔ₄が８２ＭＨｚで繰り返され、ｔ
₁とｔ₂、ｔ₃とｔ₄の間が遅延手段によって例えば、５ｐ
ｓｅｃという遅延時間に設定される。ｔ₁とｔ₂、ｔ₃と
ｔ₄の間は位相変調手段によって、位相変調が加えられ
る。

【００１８】

【００２３】

【００２６】上記第２の課題を解決するために、本発明
は、光エコーにより被検物体を観察する光学的病理検査
装置において、光を供給するレーザー光源と、該光源か
らの光を２光束に分割する光分割器と、該光分割器によ
り分岐された２光束の一方の光路中に配置された光遅延
器と、該２光束のうちの一方の光を所定の周波数で位相
変調するための位相変調器と、該２光束を合波する光合
成器と、該合波された光束を被検物体上に導いて光スポ
ットを形成するための照射光学系と、前記被検物体から
の光を検出する光検出器と、前記光検出器の出力信号か
ら前記位相変調器の変調周波数の偶数倍の変調成分を抽
出して、遅延時間に応じた光エコーの強度を出力する信
号処理手段とを有することとしたものである。

【００２７】

【００２８】さらに、同一出願人の先願による光エコー
顕微鏡に比べ、構造を単純にすることができる。つま
り、先願の光エコー顕微鏡は共焦点型顕微鏡であった
が、本願の光エコー顕微鏡では、従来の光学顕微鏡を用
いて、光学顕微鏡の視野内の光エコーを観測するもので
ある。

【００２９】上記第２の課題を解決するための、本発明
に係る光学的病理検査装置によれば、分子レベルでの構
造・組成変化を反映する物理量である、光学的位相緩和
時間（Ｔ２）が利用できる。本発明に係る光エコー測定
では、試料にレーザー光を照射して、試料中に含まれる
そのレーザー光と共鳴し得る光吸収体から放射される光
エコーにより光学的位相緩和時間が測定され、被検試料
の病理状態を検査できる。

【００３０】

【００３１】図１は本実施例の光エコー顕微鏡の概略の
構成を示し、この１図に示すように、本例の光学系は大
別すると、それぞれ点線で囲まれた３つの部分、即ち、
光源手段（Ａ）と、光変調光学系（Ｂ）と、光学顕微鏡
（Ｃ）と、光検出器である検出器１２と、ロックインア
ンプ１３と、電気信号処理装置４０と、データ処理装置
５０と、制御手段３０とを有する。ロックインアンプ１
３と、電気信号処理装置４０と、データ処理装置５０
と、制御手段３０とは、信号処理手段を構成する。

【００３２】光変調光学系（Ｂ）は、光分割器２と、光
合成器である光合波器３と、第１の直交反射面６ａ, ６
ｂと、第２の直交反射面７ａ, ７ｂと、図示省略した可
動ステージに固定された第１のコーナーキューブ４ａ
と、光遅延器である変位器４ｂと、位相変調器である位
相変調手段５とを有する。位相変調手段５は、コーナー
キューブ５ａと、圧電素子５ｂと、交流駆動電源５ｃと
を有する。

【００３３】光学顕微鏡（Ｃ）は、半透過鏡１０と、光
トラップ１４と、対物レンズ系１１からなる照射光学系
とを有する。

【００３４】本例の光源手段（Ａ）は、レーザー光源１
そのものであり、このレーザー光源１は８０ＭＨｚのモ
ード同期アルゴンイオンレーザー励起による色素レーザ
ーである。レーザー光源１としては、その外に、マルチ
モード半導体レーザー、モード同期半導体レーザー、発
光ダイオード又は固体レーザー等を使用することができ
る。レーザー光源１から発生される光は、像面上で点と
みなせる空間コヒーレンスを有し、且つ被検物体の注目
する光吸収帯の光学的な位相緩和時間よりも短い時間コ
ヒーレンスを有することが望ましい。

【００３５】図１において、レーザー光源１で発生され
たレーザー光を光変調光学系（Ｂ）の入力側の光分割器
２に入射させ、この光分割器２でそのレーザー光を２つ
の光束に分割する。また、光変調光学系（Ｂ）の出力側
には、そのように分岐された２つの光束を合波する光合
波器３を配置する。光分割器２及び光合波器３は共に偏
光ビームスプリッターであるが、代わりに偏光特性がほ
とんど無いか或いは全く無い半透鏡なども用いることが
できる。それら光分割器２と光合波器３との間に並列に
第１の直交反射面６ａ, ６ｂと第２の直交反射面７ａ,
７ｂとを配する。このように光源手段（Ａ）からの光を
２分して再び合波する光学系としては、マイケルソン干
渉計やマッハツェンダー干渉計等に類する２光路干渉光
学系が好適である。

【００３６】光分割器２の分割面を透過した光束は、第
１の直交反射面の一方の反射面６ａで反射された後に、
図示省略した可動ステージに固定された第１のコーナー
キューブ４ａに向かう。このコーナーキューブ４ａで反
射された光束が第１の直交反射面の他方の反射面６ｂで
反射されて光合波器３に入射する。４ｂはその可動ステ
ージを介してコーナーキューブ４ａを変位させる変位器
を示し、コーナーキューブ４ａ、可動ステージ及び変位
器４ｂより光遅延手段４が構成されている。この変位器
４ｂを用いてコーナーキューブ４ａを移動させることに
より、一方の光束に所定量だけ遅延を生じさせることが
できる。ここで、コーナーキューブ４ａの代わりに、２
枚の鏡或いは直角プリズム等を用いても良い。

【００３７】光分割器２の分割面で反射された光束は、
第２の直交反射面の一方の反射面７ａで反射された後
に、位相変調手段５に入射する。位相変調手段５として
は、一般に電気光学結晶を用いたものがよく知られてい
るが、本実施例においては、一端が固定され他端にコー
ナーキューブ５ａが固定された圧電素子５ｂを用いてい
る。そして、交流駆動電源５ｃにより圧電素子５ｂに所
定の周波数ｆの交流電圧を印加することによって、周波
数ｆの位相変調手段を構成している。ここで、コーナー
キューブ５aの代わりに分散の小さな直角プリズム等を
用いても良い。位相変調手段５を通過した光束は、第２
の直交反射面７ｂで反射されて光合波器３に入射する。

【００３８】本実施例では、光分割器２の透過光路上に
光遅延手段４を、反射光路上に位相変調手段５を配置し
たが、これに限らず、逆の配置でも可能であり、また光
遅延手段と位相変調手段とを共に一方の光路上に配置す
ることも可能である。

【００３９】これら光分割器２、光合波器３、光遅延手
段４及び位相変調手段５により光変調光学系（Ｂ）が構
成されている。この光変調光学系（Ｂ）内の２光束が光
合波器３で合波されて、光学顕微鏡（Ｃ）の半透鏡１０
に向かう。

【００４０】光学顕微鏡（Ｃ）において、光軸に４５°
の傾斜角で斜設された半透過鏡１０で反射された光変調
光学系（Ｂ）からの光束は、対物レンズ系１１からなる
照射光学系により、被検物体２０上に集光され光スポッ
トが形成される。被検物体２０の光スポット形成部にお
ける蛍光若しくは燐光による発光、照射レーザー光の反
射光、透過光、回折光若しくは散乱光等をうまく検出で
きるよう、光電子増倍管よりなる検出器１２を配置す
る。検出器１２の前には必要に応じてフィルターを挿入
する。ここで、検出器１２の位置は、図の位置に限定さ
れるものではなく、透過光を検出する配置であっても良
い。

【００４１】検出器１２は光電変換により入射光量に応
じた信号を出力し、この検出器１２から出力される信号
のなかから位相変調周波数の２倍の変調成分のみがロッ
クインアンプ１３により増幅される。増幅された信号
は、光遅延器４による遅延時間に応じて、電気信号処理
装置４０を介してデータ処理装置５０の中に蓄えられ解
析される。尚、光変調光学系（Ｂ）からの光のうち半透
過鏡１０を透過する光が、集光光学系に入射して迷光を
生ずるのを防止するために、光トラップ１４が配置され
ている。また、被検物体を入れる試料室２１は必要に応
じて冷却できる。

【００４２】光学顕微鏡による形態観察は、光エコー測
定と同時に或いは切り替えにより行うことができる。

【００４３】光エコー顕微鏡により被検物の複数の場所
を観察するには試料室を手動または機械により移動させ
れば良い。検出器を移動させることとしてももちろん良
い。

【００４６】光変調光学系（Ｂ）は、光分割器２と、光
合成器である光合波器３と、第１の直交反射面６ａ, ６
ｂと、第２の直交反射面７ａ, ７ｂと、図示省略した可
動ステージに固定された第１のコーナーキューブ４ａ
と、光遅延器である変位器４ｂと、位相変調器である位
相変調手段５とを有する。位相変調手段５は、コーナー
キューブ５ａと、圧電素子５ｂと、交流駆動電源５ｃと
を有する。

【００４９】光分割器２の分割面を透過した光束は、第
１の直交反射面の一方の反射面６ａで反射された後に、
図示省略した可動ステージに固定された第１のコーナー
キューブ４ａに向かう。このコーナーキューブ４ａで反
射された光束が第１の直交反射面の他方の反射面６ｂで
反射されて光合波器３に入射する。４ｂはその可動ステ
ージを介してコーナーキューブ４ａを変位させる変位器
を示し、コーナーキューブ４ａ、可動ステージ及び変位
器４ｂより光遅延手段４が構成されている。この変位器
４ｂを用いてコーナーキューブ４ａを移動させることに
より、一方の光束に所定量だけ遅延を生じさせることが
できる。ここで、コーナーキューブ４ａの代わりに、２
枚の鏡或いは直角プリズム等を用いても良い。

【００５３】被検試料２０の光スポット形成部における
蛍光若しくは燐光による発光、照射レーザー光の反射
光、透過光、回折光若しくは散乱光等をうまく検出でき
るよう、光電子増倍管よりなる検出器９を配置する。検
出器９の前には必要に応じてフィルターを挿入する。こ
こで、検出器９の位置は、図の位置に限定されるもので
はなく、透過光を検出する配置にあっても良い。

【００５４】検出器９は光電変換により入射光量に応じ
た信号を出力し、この検出器９から出力される信号のな
かから位相変調周波数の２倍の変調成分のみがロックイ
ンアンプ３１により増幅される。増幅された信号は、光
遅延器４による遅延時間に応じて、電気信号処理装置４
０を介してデータ処理装置５０の中に蓄えられ解析され
る。

【００５５】以上の如き本実施例の光学的病理検査装置
により、被検試料としてローダミン６４０染色人肝臓組
織の正常組織および腫瘍組織を用いて検査を行ったとこ
ろ、両者を明確に区別することができた。即ち、人肝臓
組織の正常・異常を区別でき、非常に高感度な病理検査
が可能であった。染色色素としては、テキサスレッドお
よびその誘導体を用いても同様な結果が得られた。被検
試料としては、組織試料に限らず細胞試料であっても可
能であった。ここで、実験条件は試料温度５ケルビン、
レーザー光源１のレーザー光として波長が６００ｎｍ付
近のレーザー光であり、位相変調器５の位相変調周波数
は２０ＫＨｚであった。光遅延器４のステージ位置を走
査しながら４０ＫＨｚの電気信号のみをロックインアン
プ３１により増幅記録すると、光学的位相緩和時間が得
られ、その情報を基に客観的な検査結果を出すことがで
きた。

【００５７】

【００５８】また、被検物質の分子レベルでの構造・組
成変化を検出し得る光学的病理検査装置を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図２】光エコー顕微鏡の測定原理の説明図である。

【符号の説明】１光源２光分割器３光合波器４光遅延手段５光変調手段１１対物光学系１２光検出器３０制御手段４０電気信号処理装置５０データ処理装置

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】光エコーにより被検物体を観察する光エコ
ー顕微鏡であって、光を供給するレーザー光源と、該レーザー光源からの光を２光束に分割する光分割器
と、該光分割器により分岐された２光束の一方の光路中に配
置される光遅延器と、該２光束のうちの一方の光を所定の周波数で位相変調す
るための位相変調器と、該２光束を合波する光合成器と、該合波された光束を被検物体上に導いて光スポットを形
成するための照射光学系と、前記被検物体からの光を検出する光検出器と、前記光検出器の出力信号から前記位相変調器の変調周波
数の偶数倍の変調成分を抽出して、遅延時間に応じた光
エコーの強度を出力する信号処理手段とを有することを
特徴とする光エコー顕微鏡。
【請求項２】前記レーザー光源は、被検物体に対して注
目する光吸収帯の光学的位相緩和時間よりも短い時間コ
ヒーレンスを有することを特徴とする請求項１記載の光
エコー顕微鏡。
【請求項３】前記光エコー顕微鏡は、光学顕微鏡を有
し、前記照射光学系は、光学顕微鏡の視野内の被検物体の１
点に前記合波された光束を集光し、前記光検出器及び前記信号処理手段は、被検物体からの
光を検出し、処理することを特徴とする光エコー顕微
鏡。
【請求項４】請求項３記載の光エコー顕微鏡において、前記照射光学系は、光学顕微鏡の対物光学系であること
を特徴とする光エコー顕微鏡。
【請求項５】被検物体に対して注目する光吸収帯の光学
的位相緩和時間よりも短い時間コヒーレンスを有する光
を供給する光源手段、該光源手段からの光を２光束に分
割する光分割器と、該光分割器により分岐された２光束の一方の光路中に配
置された光遅延器と、該２光束のうちの一方の光を所定
の周波数で位相変調するための位相変調器と、該２光束を合波する光合成器と、該合波された光束を被検物体上に導いて光スポットを形
成するための照射光学系と、前記被検物体からの光を検出する光検出器の出力信号か
ら前記位相変調器の変調周波数の偶数倍の変調成分を抽
出する信号処理手段とを有することを特徴とする光エコ
ー顕微鏡。