JP6264210B2 - キャピラリ電気泳動装置とその焦点位置調整方法 - Google Patents

Description

本発明は、試料が電気泳動する分離媒体が充填されたキャピラリカラムを使用するキャピラリ電気泳動装置と、装着されたキャピラリに対する電気泳動装置の光学系の焦点位置を調整する方法に関するものである。

電気泳動装置は核酸、タンパク質、ぺプチド、糖などを分離分析するために使用されており、特に、ＤＮＡの塩基配列の解析には重要な役割を果たしている。

キャピラリ電気泳動装置では、蛍光標識された試料を分離媒体の充填されたキャピラリに導入し、キャピラリの両端間に電圧を印加することにより試料を泳動させて試料成分の分離を行う。検出部では、キャピラリの検出部位に励起光を照射し、発生する蛍光を回折素子により分光して検出する。

検出部の検出光学系はリファレンスとなるキャピラリを用いて、検出部位に焦点が合うように調整されている。

キャピラリ電気泳動装置には、キャピラリと光学系位置が一体化されて固定されているものと、キャピラリと光学系が分離されて、キャピラリ部のみ交換できる着脱式のものがある。

本発明はキャピラリ着脱式のキャピラリ電気泳動装置を対象とする。キャピラリ着脱式の場合、着脱による位置誤差や、キャピラリの個体差による位置誤差が存在する。そのため、キャピラリの交換後は検出光学系の焦点を調整しなおすことが好ましい。

キャピラリ温度が一定の条件で測定されることが通常である。その際の設定温度によってキャピラリ自体の位置や、周辺部の膨張又は収縮により焦点位置が変動する。そのため、キャピラリの設定温度が変更された場合にも検出光学系の焦点を調整しなおすことが好ましい。

一方、より多くの蛍光を検出部に導入しようとすると開口数（ＮＡ）の大きい対物レンズを使用する必要がある。このようなレンズは焦点距離が短く、焦点深度も短いものとなるため、キャピラリの交換や設定温度の変更により焦点が合焦点位置からずれやすくなる。そして、検出光学系の焦点が合焦点位置からずれると検出感度が低下する。

観測目標であるキャピラリの内径部を観測する場合、キャピラリに白色光を照射する明視野による透過光での調整も考えられるが、キャピラリ内部と外周部で、光の屈折と散乱がおこるので、その影響で明確なコントラストを得ることが難しい。よってキャピラリ内径部を観測する場合、暗視野にてキャピラリに励起光を照射してキャピラリ内から発生する蛍光により焦点を調整する方法が最も正確に検出しうる方法である。暗視野での調整とはキャピラリに励起光を照射してキャピラリ内から発生する蛍光により焦点を調整することである。

その際、十分な蛍光強度が得られる蛍光色素を使用することが最も確実な方法である。かし、蛍光色素を使用すると、蛍光色素がキャピラリに付着することによる影響が懸念される。そのため、試料測定に用いるキャピラリに蛍光色素を使用して焦点位置を調整することは好ましくない。

本発明は、試料測定に用いるキャピラリに蛍光色素を充填することなく、暗視野にて試料測定に用いるキャピラリの焦点位置を調整できるようにすることを目的とするものである。

本発明は、キャピラリを着脱可能に装着する装着部、二次元光検出器、及び装着されたキャピラリの検出位置からの光を取り込んで分光し前記二次元光検出器上に二次元像を形成する光学系を備えた電気泳動装置を対象にしている。

本発明の焦点位置調整方法は、装着されたキャピラリに対する光学系の焦点を以下のステップを含んで調整する。
（Ｓ１）前記電気泳動装置にリファレンス用キャピラリを装着し該キャピラリに前記光学系の焦点を合わせた状態において、前記キャピラリへの分離媒体送液動作中の分離媒体からの自家蛍光を含む光の前記二次元画像、及び分離媒体の送液を停止して自家蛍光が消失した後の分離媒体からのラマン散乱光の前記二次元画像をリファレンスデータとして取得するリファレンスデータ取得ステップ、
（Ｓ２）前記リファレンスデータから自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータを得るリファレンスデータ加工ステップ、
（Ｓ３）前記電気泳動装置に泳動用キャピラリを装着し、前記光学系の焦点位置を異ならせた複数の状態のそれぞれにおいて、前記泳動用キャピラリへの分離媒体送液動作中の分離媒体からの自家蛍光を含む光の前記二次元画像、及び分離媒体の送液を停止して自家蛍光が消失した後の分離媒体からのラマン散乱光の前記二次元画像を実測データとして取得する実測画像取得ステップ、
（Ｓ４）前記実測データから、前記複数の状態のそれぞれについて、自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータを得る実測画像解析ステップ、並びに
（Ｓ５）前記ステップＳ４で得られた前記複数の状態についての自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータを、それぞれ前記ステップＳ２で得られた自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータと比較して、最も一致したデータが得られたときの前記光学系の焦点位置を、装着された泳動用キャピラリに対する合焦点位置とする焦点位置決定ステップ。

本発明のキャピラリ電気泳動装置は、キャピラリを着脱可能に装着する装着部と、キャピラリの検出位置に光を照射する光源と、二次元光検出器と、装着されたキャピラリの検出位置からの光を取り込んで分光し前記二次元光検出器上に二次元画像を形成する光学系と、前記二次元光検出器が取得した二次元画像に基づいて前記キャピラリに対する前記光学系の焦点を合わせる焦点調整部と、を備えている。

焦点調整部は、データ加工部、リファレンスデータ保持部、焦点調節機構及びデータ比較部を備えている。

データ加工部は、前記二次元光検出器が取得した二次元画像から光パターンデータを作成するように構成されている。

リファレンスデータ保持部は、前記装着部にリファレンス用キャピラリが装着され該キャピラリに前記光学系の焦点が合わせられた状態において前記データ加工部が作成した自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータを保持する。

焦点調節機構は、前記光学系の焦点位置を複数の状態に変化させるように構成されている。

データ比較部は、前記装着部に泳動用キャピラリが装着された状態において前記データ加工部が作成した自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータを、それぞれ前記リファレンスデータ保持部に保持されたリファレンス用の自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータと比較し、前記焦点調節機構により変化させられた前記光学系の複数の焦点位置状態のうちで最も類似性の高い焦点位置を決定するように構成されている。

リファレンスデータ取得ステップはキャピラリに光学系の焦点を合わせた状態において行われる。光学系の焦点を合わせた状態とするにはキャピラリに蛍光色素を充填し、暗視野により蛍光を測定するのが一般的な方法である。その方法ではキャピラリに蛍光色素が充填されるが、リファレンスデータ取得ステップで使用されるキャピラリは泳動用に使用されるキャピラリではなく、リファレンスデータ取得のためにのみ使用されるキャピラリであるため、キャピラリに蛍光試薬が付着しても試料測定には影響はない。

自家蛍光とラマン散乱は、いずれも単独では低い信号のためコントラストが得にくく、また散乱光等の外乱の影響もあることから、いずれか一方のみを用いて焦点を調整しようとするとその精度が低くなるが、本発明により双方を組み合わせることにより焦点調整の精度を高めることができる。

そして、本発明では、泳動用キャピラリを装着して行う実測画像取得ステップは、測定に用いる分離媒体を充填する工程を利用することができるので、実測画像取得ステップのための特別な工程が不要である。

分析開始直前に行われる分離媒体充填の工程を利用して焦点位置を実施することができるので、設置誤差及び温度変動の影響を含んだ状態の焦点位置に調整できる。

一実施例のマルチキャピラリ電気泳動装置をキャピラリ配列方向に沿って切断した状態で示す概略断面図である。 同実施例のマルチキャピラリ電気泳動装置をキャピラリ長さ方向に沿って切断した状態で示す概略断面図である。 キャピラリアレイ（Ａ）と二次元画像（Ｂ）の位置の対応関係を示す図である。 リファレンスデータ取得ステップを示すフローチャートである。 リファレンスデータ加工ステップを示すフローチャートである。 実測画像取得ステップを示すフローチャートである。 実測データ加工ステップと焦点決定ステップを示すフローチャートである。 一実施例で使用される画像を概略的に示した図であり、（Ａ）は明視野観測時の画像、（Ｂ）は分離媒体からの自家蛍光画像、（Ｃ）は分離媒体からのラマン散乱光画像である。 一実施例で得られるデータの一例を示すグラフである。

キャピラリ電気泳動装置には１本のキャピラリを使用するシングルキャピラリ電気泳動装置だけでなく、複数本のキャピラリからなるキャピラリアレイを使用するマルチキャピラリ電気泳動装置もある。本発明はいずれのキャピラリ電気泳動装置にも適用できる。

光学系の焦点位置合わせは、キャピラリ中を泳動している試料成分に焦点が合うように行う必要がある。そのため、キャピラリが１本の場合はそのキャピラリの中心軸上に焦点が合うようするのが好ましい。また、キャピラリアレイの場合は、そのうちの１本のキャピラリ、好ましくはキャピラリアレイの中央部に配置されている１本のキャピラリの中心軸上に焦点が合うようするのが好ましい。

その焦点合わせのために、自家蛍光パターンデータとラマン散乱光パターンデータを使用する。自家蛍光パターンデータとラマン散乱光パターンデータとして波長分散方向とキャピラリ幅方向の少なくとも一方の方向のパターンデータを用いる。キャピラリ幅方向とはキャピラリの太さ方向であり、後で説明する図３（Ａ）に示されるＹ軸方向である。キャピラリアレイにおいてキャピラリが配列されている方向でもある。それに直交するＸ軸方向はキャピラリ長さ方向となる。

以下に説明する一実施形態ではマルチキャピラリ電気泳動装置を取りあげるが、１本のキャピラリのみを用いるシングルキャピラリ電気泳動装置についても同様に適用できる。

一実施形態における光学系では、二次元光検出器上に形成される二次元画像は、例えば図２に符号２８で示されるものであり、概略的に示すと図３（Ｂ）のようになる。その二次元画像では、キャピラリ幅方向（Ｙ軸方向）に対応する方向をＶ軸方向と呼び、それに直交する方向をＨ軸方向と呼ぶ。Ｈ軸方向に光が分散され、Ｈ軸方向が波長方向となる。

キャピラリ幅方向のパターンデータとして、最も強度の強い波長を含む所定の波長範囲の平均値についてのキャピラリ幅方向分布データを求めることができる。キャピラリ幅方向分布データは、マルチキャピラリ電気泳動装置ではキャピラリアレイ中の特定の１本のキャピラリについて求めるものであり、特にその特定の１本のキャピラリとしてキャピラリアレイの中央に配置されているキャピラリを選択するのが好ましい。シングルキャピラリ電気泳動装置では焦点合わせの対象になるキャピラリは自ずから特定されている。

リファレンスデータ上で信号強度の強い領域を含む二次元の観測範囲（ＲＯＩ）を規定する観測範囲規定ステップと、電気泳動装置に泳動用キャピラリを装着した状態においてキャピラリからの透過光による画像に基づいて実測データにおける前記観測範囲の位置決めを行うステップとをさらに含み、ステップＳ２でのリファレンスデータ加工ステップとステップＳ４での実測画像解析ステップを観測範囲で実行するようにしてもよい。透過光による観測は白色光などによる明視野での観測である。このようにデータ加工の範囲を規定することにより、加工されたデータの再現性がよくなる。

電気泳動装置に泳動用キャピラリを装着した状態においてキャピラリからの透過光により光学系の焦点位置を粗焦点位置として求める粗調整ステップをさらに含んでもよい。そして、ステップＳ３を明視野で求められた粗焦点位置を含む所定の範囲内での複数の焦点位置で行うようにしてもよい。測定を行う複数の焦点位置をそのように求められた所定の範囲内に制限することにより、ステップＳ３の実測画像取得ステップの時間を短縮することができる。

図１と図２は一実施例のマルチキャピラリ電気泳動装置（以下、単に電気泳動装置という。）を概略的に表す。図1はキャピラリアレイのキャピラリ配列方向に沿った断面図であり、図２はキャピラリの長さ方向に沿った断面図である。

キャピラリアレイ２は、電気泳動装置の装着部４ａ、４ｂによってオーブン領域６内に装着されている。オーブン領域６はキャピラリアレイ２の温度を一定に保つためのものである。

電気泳動装置は、図示はされていないが、キャピラリアレイ２に分離媒体を充填したり交換したりするための機構や、キャピラリアレイ２の両端間に泳動用の電圧を印加するための機構を備えている。さらに、この電気泳動装置は、リファレンス用キャピラリアレイに蛍光試薬を含んだ溶液を充填できるように、蛍光試薬を含んだ溶液を収容した容器を搭載できるようになっている。

オーブン領域６に隣接して分光器８が配置され、分光器８の分散光を取り出す位置には検出部１０が配置されている。

キャピラリアレイ２と分光器８の間にはキャピラリアレイ２からの蛍光やラマン散乱光又は透過光を受光して分光器８に導く対物レンズ１２が配置されている。対物レンズ１２の位置を焦点調節機構３８により調節することにより分光器８の光学系、すなわち、この電気泳動装置の光学系の焦点位置の調整を行う。

キャピラリアレイ２に励起光や白色光を照射するために、キャピラリアレイ２を挟んで対物レンズ１２とは反対側に光源１４が配置されている。光源１４は励起光源と白色光源を含んでいる。励起光源は暗視野で蛍光測定を行う際に点灯され、白色光源は明視野での観測を行う際に点灯される。励起光源は特に限定されるものではないが、レーザダイオード、固体半導体レーザ、単色ＬＥＤなどを使用することができる。白色光源も特に限定されるものではないが、ハロゲンランプや白色ＬＥＤなどを用いることができる。キャピラリアレイ２で光源１４からの光が照射される位置は電気泳動により分離された試料成分が検出される検出位置である。

分光器８内には対物レンズ１２で取り込まれた光を回折格子２４に導くために、対物レンズ１２から順にフィルタ１６、集光レンズ１８、スリット２０及びミラー２２が配置されている。フィルタ１６は励起光成分を除去し、蛍光成分とラマン散乱光成分を透過させるためのものであり、干渉フィルタ又は吸収フィルタを用いることができる。

対物レンズ１２で取り込まれた光は、フィルタ１６を経て集光レンズ１８によりスリット２０の位置に結像し、スリット２０からミラー２２を経て回折格子２４に導かれる。検出部１０には回折格子２４からの分散光を受光する位置に二次元光検出器２６が配置されている。回折格子２４は平面回折格子でも凹面回折格子でもよいが、ここでは一例として凹面回折格子を用いられており、回折格子２４により分散された光が光検出器２６上に結像する。二次元光検出器は例えばＣＣＤセンサ又はＣＭＯＳセンサ素子が適当である。

キャピラリアレイ２のキャピラリ配列方向がＹ軸方向、キャピラリ長手方向がＸ軸方向、キャピラリアレイ２の面に垂直な方向がＺ軸方向である。焦点位置を調整することは対物レンズ１２によって焦点位置をＺ軸方向に調整することである。

図２には光検出器２６に形成される二次元画像２８が示されており、それは回折格子２４により分光された光により形成される分光画像である。二次元画像２８では、キャピラリ長さ方向（Ｘ軸方向）が、回折格子２４によって分散された回折光の分散方向、すなわち波長方向であり、その方向をＨ軸方向と呼ぶ。それに直交する方向をＶ軸と呼ぶ。Ｖ軸はキャピラリ配列方向（Ｙ軸方向）に対応している。この例ではキャピラリアレイ２は７本のキャピラリが配列されたものを例にしており、二次元画像２８にはキャピラリアレイ２のキャピラリ配列に対応して７本の画像が隣接して現れている。７本の画像はそれぞれキャピラリからの光によるものであり、一実施形態ではそのうちの中央に配置されたキャピラリからの光による画像を用いる。

図３はキャピラリアレイ２と二次元画像２８の位置の対応関係を示している。（Ａ）に示されるようにキャピラリアレイ２の検出部位３に励起光が照射される。検出部位３から分光器８に白色光が入射したとすれば回折格子２４により回折された光が光検出器２６上で（Ｂ）に示されるように分散して、あたかもキャピラリ配列のような二次元画像２８となる。実施例の場合は検出部位３から蛍光とラマン散乱光、又はラマン散乱光のみが発生するので、それらの二次元画像２８は（Ｂ）の一部の画像となる。

図1に戻って説明すると、焦点位置を調整するための一実施例として焦点調整部３０が設けられている。焦点調整部３０は光検出器２６の信号を受け、対物レンズ１２の位置を調節して焦点位置を調整するように構成されている。焦点調整部３０はデータ加工部３２、リファレンスデータ保持部３４、データ比較部３６及び焦点調節機構３８を備えている。

データ加工部３２は光検出器２６が取得した二次元画像２８から光パターンデータを作成するように構成されている。

リファレンスデータ保持部３４は、装着部４ａ、４ｂにリファレンス用キャピラリアレイが装着され、そのキャピラリアレイに光学系の焦点が合わせられた状態においてデータ加工部３２が作成した自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータを保持する。

データ比較部３６は、装着部４ａ、４ｂに泳動用キャピラリアレイ２が装着された状態においてデータ加工部３２が作成した自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータを、それぞれリファレンスデータ保持部３４に保持されているリファレンス用の自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータと比較し、焦点調節機構３８により変化させられた光学系の複数の焦点位置状態のうちで最も類似性の高い焦点位置を決定するように構成されている。

焦点調節機構３８は、対物レンズ１２のＺ方向の位置を調節することにより光学系の焦点位置を調節する機構である。焦点調整機構はモータ等により自動で必要分解能の移動量を設定して動作できるものが望ましい。例えば、カメラなどで使用されている焦点合わせ機構などを使用することができる。

データ加工部３２、リファレンスデータ保持部３４及びデータ比較部３６はコンピューター４０により実現される。コンピューター４０はこの電気泳動装置の動作を制御する専用のコンピューターにより実現することもでき、それとは別に設けられた焦点位置調整用の専用のコンピューターとして実現することもでき、又は汎用のパーソナルコンピューターにより実現することもできる。

図４から図９により一実施例の焦点位置調整方法を示す。図４はリファレンスデータ取得ステップを示したものである。リファレンス用キャピラリアレイを装着部４ａと４ｂにより取りつける。光学系の焦点をキャピラリアレイに合わせるために、そのキャピラリアレイに蛍光色素を含む溶液を注入し、暗視野にてキャピラリアレイに励起光を照射する。すなわち、光源１４としてレーザ装置のみを点灯する。この状態ではキャピラリに蛍光色素が注入されているので十分な強度の蛍光画像を得ることができ、焦点を容易に合わせることができる。

焦点位置を保持した状態でキャピラリ内の蛍光色素を洗い流す。その後、キャピラリに分離媒体を流しながら励起光を照射する。分離媒体として例えばポリマーを使用することができる。このとき、分離媒体からは自家蛍光とラマン散乱光が発生するので、光検出器２６により自家蛍光とラマン散乱光による画像を取得する。この画像は図２に符号２８で示されるような分光画像であり、その画像を「画像−1」とする。この画像を概略的に示したものが図８（Ｂ）の画像である。ただし、図８では３本のキャピラリについての画像を表している。

次に、分離媒体を流すことを停止して分離媒体がキャピラリ内で静止した状態にする。その状態では分離媒体に励起光を照射し続けても自家蛍光は消失し、その後は分離媒体からは自家蛍光は発生せずラマン散乱光のみが発生する。そのラマン散乱光による画像もやはり図２に符号２８で示されるような分光画像であり、その画像を「画像−２」とする。この画像を概略的に示したものが図８（Ｃ）の画像である。

図５はリファレンスデータ加工ステップである。データ加工ステップは自家蛍光パターンとラマン散乱光パターンを得るための工程であり、そのデータ加工は規定した観測範囲で行う。

そのために、まず観測範囲を規定する。観測範囲はキャピラリアレイ内の特定の１本のキャピラリ、一例として中央に配置されたキャピラリ、に基づく分光画像に基づいて規定する。その観測範囲を規定するために、「画像−１」を適当な閾値で２値化し、「画像−１」中の中央の画像についてその明るい範囲からなる領域を観測範囲とする。明るい範囲とは、２値化により閾値より大きい強度をもつ画像の点（明るい点）からなる範囲である。閾値によって明るい点の集まる範囲の大きさが決まるので、明るい点の範囲が適当な大きさとなるように閾値を設定する。観測範囲は必ずしも矩形である必要はないが、データ加工の容易さから矩形が好ましい。

そのように規定された観測範囲を「画像−１」に適用する。この場合も「画像−１」中の中央の画像に適用する。その観測範囲でのＶ軸方向の平均値をＨ軸方向の系列としてデータ化し、スムージングしたものをデータ「Ｒｅｆ−１Ｈ」とする。「Ｒｅｆ−１Ｈ」は例えば図９（Ａ）に示されるようなパターンとなる。横軸Ｈは波長、縦軸ＩはＶ軸方向の平均値である。このパターンデータは自家蛍光だけでなく、ラマン散乱光も含んでいるが、本明細書では自家蛍光パターンデータと呼んでいるものの一例である。ピークａは自家蛍光によるもの、ピークｂはラマン散乱光によるものである。

次に、その「Ｒｅｆ−１Ｈ」データ中で蛍光強度が最も大きい波長の点を中心とした特定の波長幅のＨ方向の範囲を決める。その範囲は、例えば図９（Ａ）で符号ｃとして斜線で示された範囲である。その範囲の大きさは特に厳密なものではなく、適当に定めることができ、例えば蛍光強度が最も大きい波長だけでもよい。ここで、特定の波長幅というのは、リファレンスデータ加工ステップと実測画像解析ステップとで同じ波長幅のデータを用いることを意味している。

その波長幅の範囲でのＨ方向の平均値をＶ軸方向の系列としてデータ化し、スムージングしたものを「Ｒｅｆ−１Ｖ」とする。「Ｒｅｆ−１Ｖ」は、例えば図９（Ｂ）に示されたものとなる。

自家蛍光パターンデータは「Ｒｅｆ−１Ｈ」と「Ｒｅｆ−１Ｖ」を含んでいる。

観測範囲を「画像−２」に適用し、同様の処理により「Ｒｅｆ−２Ｈ」と「Ｒｅｆ−２Ｖ」をデータとして取得する。この場合も、「画像−２」中の中央のキャピラリに対応する画像に適用する。「Ｒｅｆ−２Ｈ」は例えば図９（Ｃ）に示されたもの、「Ｒｅｆ−２Ｖ」は例えば図９（Ｄ）に示されたものである。「Ｒｅｆ−２Ｖ」を得る際は「Ｒｅｆ−２Ｈ」データ中でラマン散乱光強度が最も大きい波長の点を中心とした特定の波長幅のデータ（図９（Ｃ）において符号ｄとして斜線で示されたもの）を使用する。ラマン散乱光パターンデータは「Ｒｅｆ−２Ｈ」と「Ｒｅｆ−２Ｖ」を含んでいる。

図６は実測画像取得ステップである。電気泳動装置に泳動用キャピラリアレイを取りつける。明視野にてコントラストによる焦点調整を行う。このときは、光源としてはレーザ装置を点灯せず、ランプのみを点灯する。焦点調整を行い、調整後の画像を取得する。この画像を「画像−０」とする。明視野での焦点調整は粗い調整であり、本発明における所期の目的とする調整ではない。

「画像−０」は概略的には図８（Ａ）に示すものであり、焦点を合わせたいキャピラリ内径部のコントラストは明確ではないが、キャピラリの外周部はコントラストが明確にでるのでキャピラリの位置は特定できる。そのため、キャピラリの外周部の位置からキャピラリの中心を特定することはできる。

粗く調整された焦点位置を中心とした探索範囲を規定する。探索範囲とは、光学系の焦点位置をＺ方向に変化させる範囲である。

焦点調節機構３８により、光学系の焦点を探索範囲の一方の端の点に合わせ、キャピラリに分離媒体を充填しながら、暗視野での画像を取得する。この画像を「画像−１ｎ」とする。「画像−１ｎ」は自家蛍光とラマン散乱光による画像である。次に分離媒体を流すのをやめ、自家蛍光が消失した後のラマン散乱光による画像を取得する。この画像を「画像−２ｎ」とする。「画像−２ｎ」はラマン散乱光による画像である。

次に、探索範囲での焦点位置を移動させ、移動後の焦点位置で、同様に自家蛍光とラマン散乱光による画像と、ラマン散乱光による画像を取得する。そのようにして、「画像−１ｎ」と「画像−２ｎ」を取得する動作を探索範囲の全範囲にわたって行う。ｎ（＝１，２，３，…）は探索範囲におけるＺ軸方向の位置、すなわち焦点位置を表す。

図７は実測データ加工ステップと焦点決定ステップである。「画像−０」からいま焦点を合わせようとしている１本のキャピラリについてＶ軸方向のキャピラリ外径を割り出し、それに基づいてそのキャピラリの中心軸の位置を割り出す。その中心軸がリファレンスデータ上で規定した観測範囲の中心を通るように、「画像−１ｎ」上と「画像−２ｎ」上で観測範囲を規定する。

実測画像取得ステップ（図６）で取得した「画像−１ｎ」と「画像−２ｎ」（ｎ＝１，２，３，…）のそれぞれについて、リファレンスデータ加工ステップ（図５）と同じデータ加工処理を施し、自家蛍光パターンデータとラマン散乱光パターンデータを得る。得られたそれらのデータを（「Ｄａｔａ−１ｎＨ」、「Ｄａｔａ−１ｎＶ」、「Ｄａｔａ−２ｎＨ」、「Ｄａｔａ−２ｎＶ」）とする。データ（「Ｄａｔａ−１ｎＨ」、「Ｄａｔａ−１ｎＶ」、「Ｄａｔａ−２ｎＨ」、「Ｄａｔａ−２ｎＶ」）の組は、探索範囲においてＺ軸方向の位置を異ならせたｎ個だけ得られる。

そして、それらのｎ個のデータを（「Ｒｅｆ−１Ｈ」、「Ｒｅｆ−１Ｖ」、「Ｒｅｆ−２Ｈ」、「Ｒｅｆ−２Ｖ」）と比較し、類似性を順次算出する。類似性を算出方法としては、例えば、これらのデータはいずれも図９に示されるように一次元データであることから、対応するデータごとの偏差を求めて、その偏差の合計の大きさを類似性の基準とすることができる。そのような方法の場合は、偏差の合計の最も少ないものを類似性が高いとして、最も類似性が高い値が得られた焦点位置を合焦位置とすることができる。

焦点調節機構３８は、そのようにして求められた合焦位置に対物レンズ１２を移動させることにより、光学系の焦点位置を調整することができる。

２ キャピラリアレイ
４ａ、４ｂ 装着部
８ 分光器
１２ 対物レンズ
１４ 光源
２４ 回折格子
２６ 二次元光検出器
３０ 焦点調整部
３２ データ加工部
３４ リファレンスデータ保持部
３６ データ比較部
３８ 焦点調節機構

Claims (6)

1. キャピラリを着脱可能に装着する装着部、二次元光検出器、及び装着されたキャピラリの検出位置からの光を取り込んで分光し前記二次元光検出器上に二次元画像を形成する光学系を備えた電気泳動装置において、装着されたキャピラリに対する前記光学系の焦点を以下のステップを含んで調整する焦点位置調整方法。
   （Ｓ１）前記電気泳動装置にリファレンス用キャピラリを装着し該キャピラリに前記光学系の焦点を合わせた状態において、前記キャピラリへの分離媒体送液動作中の分離媒体からの自家蛍光を含む光の前記二次元画像、及び分離媒体の送液を停止して自家蛍光が消失した後の分離媒体からのラマン散乱光の前記二次元画像をリファレンスデータとして取得するリファレンスデータ取得ステップ、
   （Ｓ２）前記リファレンスデータから自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータを得るリファレンスデータ加工ステップ、
   （Ｓ３）前記電気泳動装置に泳動用キャピラリを装着し、前記光学系の焦点位置を異ならせた複数の状態のそれぞれにおいて、前記泳動用キャピラリへの分離媒体送液動作中の分離媒体からの自家蛍光を含む光の前記二次元画像、及び分離媒体の送液を停止して自家蛍光が消失した後の分離媒体からのラマン散乱光の前記二次元画像を実測データとして取得する実測画像取得ステップ、
   （Ｓ４）前記実測データから、前記複数の状態のそれぞれについて、自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータを得る実測画像解析ステップ、並びに
   （Ｓ５）前記ステップＳ４で得られた前記複数の状態についての自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータを、それぞれ前記ステップＳ２で得られた自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータと比較して、最も一致したデータが得られたときの前記光学系の焦点位置を、装着された泳動用キャピラリに対する合焦点位置とする焦点位置決定ステップ。
2. 前記自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータとして波長分散方向とキャピラリ幅方向の少なくとも一方の方向のパターンデータを得る請求項１に記載の焦点位置調整方法。
3. キャピラリ幅方向のパターンデータとして、最も強度の強い波長を含む所定の波長範囲の平均値についてのキャピラリ幅方向分布データを求める請求項２に記載の焦点位置調整方法。
4. 前記リファレンスデータ上で信号強度の強い領域を含む観測範囲を規定する観測範囲規定ステップと、
   前記電気泳動装置に泳動用キャピラリを装着した状態において前記キャピラリからの透過光による画像に基づいて前記実測データにおける前記観測範囲の位置決めを行うステップと、をさらに含み、
   前記ステップＳ２でのリファレンスデータ加工ステップと前記ステップＳ４での実測画像解析ステップを前記観測範囲で実行する請求項１から３のいずれか一項に記載の焦点位置調整方法。
5. 前記電気泳動装置に泳動用キャピラリを装着した状態において前記キャピラリからの透過光により前記光学系の焦点位置を粗焦点位置として求める粗調整ステップをさらに含み、
   前記ステップＳ３を前記粗焦点位置を含む所定の範囲内での複数の焦点位置で行う請求項１から４のいずれか一項に記載の焦点位置調整方法。
6. キャピラリを着脱可能に装着する装着部と、
   前記キャピラリの検出位置に光を照射する光源と、
   二次元光検出器と、
   装着されたキャピラリの前記検出位置からの光を取り込んで分光し前記二次元光検出器上に二次元画像を形成する光学系と、
   前記二次元光検出器が取得した二次元画像に基づいて前記キャピラリに対する前記光学系の焦点を合わせる焦点調整部と、を備え、
   前記焦点調整部は、前記二次元光検出器が取得した二次元画像から光パターンデータを作成するように構成されたデータ加工部と、
   前記装着部にリファレンス用キャピラリが装着され該キャピラリに前記光学系の焦点が合わせられた状態において前記データ加工部が作成した自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータを保持するリファレンスデータ保持部と、
   前記光学系の焦点位置を複数の状態に変化させるように構成された焦点調節機構と、
   前記装着部に泳動用キャピラリが装着された状態において前記データ加工部が作成した自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータを、それぞれ前記リファレンスデータ保持部に保持されたリファレンス用の自家蛍光パターンデータ及びラマン散乱光パターンデータと比較し、前記焦点調節機構により変化させられた前記光学系の複数の焦点位置状態のうちで最も類似性の高い焦点位置を決定するように構成されたデータ比較部と、を備えているキャピラリ電気泳動装置。