JP5085460B2 - 共焦点走査型顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、液侵対物レンズを用いた共焦点顕微鏡技術に関する。

生物標本の観察ツールの１つとして共焦点走査型顕微鏡がある。
生物標本の観察に用いられる共焦点走査型顕微鏡は、一般に、レーザ光源より射出された励起光を対物レンズの焦点位置に配置された標本に照射し、標本から生じた蛍光を光検出器により検出することで標本を観察する。この際、焦点位置と共役な位置に設けられたピンホールにより焦点位置からずれた位置から生じる光は遮断される。このため、共焦点走査型顕微鏡は、標本中の焦点位置以外の部位からの光が重畳して像がぼやけてしまうことがなく、コントラストのよい画像が得られるという特徴がある。

このような共焦点走査型顕微鏡では、焦点位置への高い集光性能と高い解像度が必要とされるため、対物レンズと標本の間を、例えば、水や油などの液体（以降、液浸と称する。）で満たした液浸対物レンズが用いられることも少なくない。

液浸対物レンズを用いた共焦点走査型顕微鏡で標本を観察する場合、液浸が十分に満たされている状態を前提としているため、液浸が満たされていない状態、または、液浸が十分に満たされていない状態では、光が正常に標本に集光せず、共焦点走査型顕微鏡本来の性能が損なわれてしまう。このような不適切な状態はさまざまな要因により発生しうる。例えば、標本を走査するためのステージや対物レンズの移動による液浸の飛散や、標本の経時変化を見るための長期間にわたるタイムラプス観察における液浸の蒸発などがある。

このような技術的な課題を解決するため、標本で反射した励起光の強度を検出し液浸の有無を判定する技術が特許文献１で開示されている。
特開２００５−２２７０９８号公報

ところで、特許文献１で開示された技術では、蛍光とは別の経路に反射された励起光を観測することにより液浸の有無を判定する。このため、蛍光観察用とは別の励起光観測用の光検出器が必要となり、システムが過度に複雑化するといった課題がある。また、液浸の有無を判定するための励起光は、蛍光と異なりピンホールを介さずに光検出器に到達することになるため、ピンホールを介した場合のような高精度な光の検出が困難である。

このような課題を踏まえ、過度にシステムを複雑化することなく、高精度に液浸の有無を判定する技術が必要とされている。
以上を踏まえ、本発明の目的は、過度にシステムの複雑化を伴うことなく、液浸の有無を高精度に検出する技術を提供することにある。

本発明の第１の態様は、光源と、標本を保持する標本保持部材と、光源から射出される光を標本に集光する対物レンズと、対物レンズにより集光された集光光を標本面上で走査する第１の走査手段と、集光光の集光位置と共役な位置に配置された共焦点ピンホールと、標本から射出される蛍光と標本保持部材の表面で反射した反射光とを共焦点ピンホールを介して検出する光検出器と、光検出器による反射光の検出結果に基づいて、対物レンズと標本保持部材との間に液体が満たされているか否かを判断する制御装置と、を具備する共焦点走査型顕微鏡装置を提供する。

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、第１の走査手段は、ガルバノミラーである共焦点走査型顕微鏡装置である。
本発明の第３の態様は、第１の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、表面は、標本と標本保持部材との境界面である共焦点走査型顕微鏡装置である。

本発明の第４の態様は、第１の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、表面は、標本保持部材の対物レンズ側の表面である共焦点走査型顕微鏡装置である。
本発明の第５の態様は、第１の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、さらに、光軸方向に集光光を走査する第２の走査手段を備え、検出結果は、第２の走査手段により集光光を走査して取得した、集光位置と光検出器で検出される反射光の強度との関係を示すＩ−Ｚプロファイルであり、制御装置は、基準となるＩ−Ｚプロファイルと現在のＩ−Ｚプロファイルとの比較結果により、対物レンズと標本保持部材との間に液体が満たされているか否かを判断する共焦点走査型顕微鏡装置である。

本発明の第６の態様は、第５の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、比較結果は、基準となるＩ−Ｚプロファイルの半値幅に対する撮影前のＩ−Ｚプロファイルの半値幅の増加率であり、増加率が一定値以上の場合に対物レンズと標本保持部材との間に液体が満たされていないと判断する共焦点走査型顕微鏡装置である。

本発明の第７の態様は、第５の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、基準となるＩ−Ｚプロファイルは、対物レンズと標本保持部材との間に液体が満たされている状態のＩ−Ｚプロファイルであり、観察開始時に取得される共焦点走査型顕微鏡装置である。

本発明の第８の態様は、第５の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、基準となるＩ−Ｚプロファイルは、対物レンズと標本保持部材との間に液体が満たされている状態のＩ−Ｚプロファイルであり、観察開始前に予め取得されたＩ−Ｚプロファイルである共焦点走査型顕微鏡装置である。

本発明の第９の態様は、第５の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、第２の走査手段は、光軸方向に駆動される対物レンズである共焦点走査型顕微鏡装置である。
本発明の第１０の態様は、第５の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、さらに、標本を配置するステージを備え、第２の走査手段は、光軸方向に駆動されるステージである共焦点走査型顕微鏡装置である。

本発明の第１１の態様は、第１の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、反射光の検出は、タイムラプス観察時のインターバル中に行う共焦点走査型顕微鏡装置である。

本発明の第１２の態様は、第１の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、さらに、液体を供給する供給手段を具備し、制御装置は、液体が満たされていないと判断した場合に、供給手段により液体を供給する共焦点走査型顕微鏡装置である。

本発明の第１３の態様は、第５の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、制御装置は、第１の走査手段を制御して表面上の複数点における検出結果を取得し、複数点の各々に対して液体が満たされているか否かを判断する共焦点走査型顕微鏡装置である。

本発明の第１４の態様は、第１３の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、さらに、液体を供給する供給手段を具備し、複数点は、同一視野内に位置し、制御装置は、複数点の少なくとも１点で液体が満たされていないと判断した場合に、液体を供給する共焦点走査型顕微鏡装置である。

本発明の第１５の態様は、第５の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、さらに、標本を配置するステージを備え、制御装置は、ステージを制御して表面上の複数点における検出結果を取得し、複数点の各々に対して液体が満たされているか否かを判断する共焦点走査型顕微鏡装置である。

本発明の第１６の態様は、第１５の態様に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、さらに、液体を供給する供給手段を具備し、複数点は、それぞれ異なる視野内に位置し、制御装置は、液体が満たされていないと判断した場合に、液体を供給する共焦点走査型顕微鏡装置である。

本発明によれば、励起光観測用の光検出器など、液浸の有無を検出するための追加の構成要素を必要とせず、蛍光と同様に共焦点ピンホールを介して同一の光検出器により励起光を観測するため、過度にシステムの複雑化を伴うことなく、液浸の有無を高精度に検出する技術を提供することができる。

以下、図面を参照しながら、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
＜第１の実施形態＞
本実施形態では、タイムラプス観察における液浸の有無の判定方法について説明する。

図１は、本実施形態に係る共焦点走査型顕微鏡の構成について例示した図である。以下、図１を参照しながら本実施形態に係る共焦点走査型顕微鏡の構成と動作について説明する。

図１で例示される共焦点走査型顕微鏡１は、レーザ光源２と、ダイクロイックミラー３と、ガルバノミラー４と、瞳投影レンズ５と、結像レンズ６と、対物レンズ７と、カバーガラス８と、コンフォーカルレンズ９と、共焦点ピンホール１０、光検出器１１と、制御装置１２と、給水装置１３と、水補給ノズル１４を含んで構成されている。対物レンズ７とカバーガラス８の間は、水１５で満たされた状態で使用され、標本１６側からカバーガラス８、水１５、対物レンズ７の順に並べられている。

なお、本実施形態では、液浸として水１５を例示したが、特にこれに限定されるものではない。標本１６によっては、例えば、油を用いても良い。また、標本１６と液浸の間にカバーガラス８を用いた構成を例示したが、特にこれに限定されるものではない。また、標本保持部材としてカバーガラス８を例示したが、ガラスボトムディッシュの底面やウェルプレパラートの底面など、厚さや屈折率などにより入射する光に対する光学的な影響を考慮して設計された、その他の標本保持部材により標本を固定しても良い。

次に、本実施形態に係る共焦点走査型顕微鏡１の動作について説明する。まず、レーザ光源２から射出されたレーザ光が標本１６に入射するまでの動作について説明する。
レーザ光源２から射出されたレーザ光は、ダイクロイックミラー３に入射する。レーザ光の光軸に対して傾いて配置されたダイクロイックミラー３は、レーザ光のうち少なくとも標本１６を励起する励起波長成分を反射し、且つ、蛍光を透過する性質を有している。本明細書では、ダイクロイックミラー３で反射された標本１６を励起する励起波長成分を含むレーザ光を励起光と称する。このようなダイクロイックミラー３の性質により、ダイクロイックミラー３に入射したレーザ光は、励起光とそれ以外に分離される。励起光はダイクロイックミラー３により標本方向へ反射され、それ以外の成分はダイクロイックミラー３を透過して不要光として処理される。

なお、レーザ光源２とダイクロイックミラー３の間には、さらに励起フィルタを設けても良い。この場合、励起波長成分以外の波長成分の少ない励起光を得ることができる。
ダイクロイックミラー３を反射した励起光は、ガルバノミラー４に入射する。共焦点走査型顕微鏡１は、入射光束の焦点位置にある標本１６の一点を観察する構成となっている。このため、観察用の画像を生成するに当たっては、焦点位置を標本１６面上で走査する必要がある。ガルバノミラー４は標本１６面上における焦点位置の走査手段であり、制御装置１２により制御されている。

なお、標本１６面に垂直な方向、つまり光軸方向については、対物レンズ７を光軸方向に移動させることにより走査する。その他にも、標本１６やカバーガラス８が配置される不図示のステージを移動させることにより光軸方向に走査することも可能である。また、この際の対物レンズ７や不図示のステージの移動も制御装置１２により制御される。

ガルバノミラー４により焦点位置を制御された励起光は、瞳投影レンズ５、結像レンズ６、対物レンズ７、水１５、カバーガラス８を順番に経由して標本１６へ入射する。
以上のようにして入射した励起光により、標本１６側からは、標本１６が励起されたことにより生じる蛍光や、標本１６面及びカバーガラス８表面で反射された励起光などが光検出器１１側に向けて射出される。

次に、光検出器１１に向けて射出された光が光検出器１１に入射するまでの動作について説明する。
標本１６側から射出された蛍光と励起光は、入射時と同様の経路を遡ってダイクロイックミラー３へ入射する。

ダイクロイックミラー３は、上述したとおり、励起光を反射し、蛍光を透過する性質を有している。このため、蛍光はダイクロイックミラー３を透過しコンフォーカルレンズ９へ入射する。一方、励起光については、入射した励起光の大部分はダイクロイックミラー３で反射されるが、ごく一部の励起光はダイクロイックミラー３を透過し、蛍光同様にコンフォーカルレンズ９へ入射する。このようにごく一部の励起光がダイクロイックミラー３を透過する理由は、励起光の波長に対するダイクロイックミラー３の透過率が０％ではなく、わずかであるが透過率を有しているためである。

以上のようにしてコンフォーカルレンズ９に入射した励起光と蛍光は、共焦点ピンホール１０上に集光され、共焦点ピンホール１０を介して光検出器１１に入射し検出されることになる。

ここで、共焦点ピンホール１０は焦点位置と共役な位置に配置されているため、焦点位置からずれた位置から生じた蛍光や励起光は共焦点ピンホール１０により遮断される。これにより焦点位置からの光のみを高精度に検出することができる。

次に、対物レンズ７とカバーガラス８の間の水１５の有無についての判定方法について説明する。なお、以降では、対物レンズ７とカバーガラス８の間の水１５の有無についての判定を、液浸判定と称する。

図２は、図１で例示した共焦点走査型顕微鏡１の対物レンズ７と、水１５と、カバーガラス８と、標本１６との位置関係とそれぞれの屈折率について示した概略図である。ここでは、水１５、カバーガラス８、標本１６の屈折率を、それぞれｎｗ、ｎｃ、ｎｓで示している。

図２に例示したように水１５、カバーガラス８、標本１６はそれぞれ異なる屈折率を有している。光が屈折率の異なる物質間を通過するとき、屈折率差に応じた反射光が発生する。このため、レーザ光源２から標本１６へ励起光を照射すると、水１５とカバーガラス８との境界面である第１の境界面１７や、カバーガラス８と標本１６との境界面である第２の境界面１８で、境界を構成する物質の屈折率差に応じた割合だけ反射光が発生する。

本実施形態における液浸判定では、これらの反射光を利用する。具体的には、対物レンズ７や不図示のステージなどの光軸方向の走査手段により、入射光の焦点位置を図２に示される光軸１９に沿って、カバーガラス８内部のＣ点から標本１６内部のＥ点まで移動させる。その際に光検出器１１で検出される光検出の強度を、制御装置１２と連携して焦点位置と関連付けて記録する。この焦点位置と光検出の強度の情報（以降、Ｉ−Ｚプロファイルと称する。）を分析することにより液浸判定を行う。

図３は、本実施形態に係る共焦点走査型顕微鏡１で記録されるＩ−Ｚプロファイルの特性を示した概念図である。縦軸は光検出の強度（Ｉ）、横軸は光軸方向（Ｚ軸方向）の焦点位置（Ｚ）を示している。

まず、図３を参照しながら、本実施形態で記録されるＩ−Ｚプロファイルの形状について説明する。
図３で例示されるように、本実施形態で記録されるＩ−Ｚプロファイルは、第２の境界面１８上のＤ点で光検出の強度（Ｉ）が最高値を示し、Ｄ点から両側のＣ点及びＥ点に向けて光検出の強度（Ｉ）が低下する形状を示す。

Ｃ点からＤ点（Ｄ点を含まない）までは屈折率が均一であるとみなすことのできるカバーガラス８内部であり、このような位置からはほとんど反射光は生じない。このため、記録されるＩ−Ｚプロファイルでは、Ｃ点からＤ点（Ｄ点を含まない）までの光検出の強度（Ｉ）は０になるように思われる。

しかし、実際には、Ｃ点からＤ点（Ｄ点を含まない）の間においても、Ｄ点から発生した反射光の一部が共焦点ピンホール１０を通過し、光検出器１１で検出されるため、図３で例示されるような形状となる。このような理由から、Ｉ−Ｚプロファイルは、焦点位置からずれた位置からの光を共焦点ピンホールでより多く遮断できるほどＤ点からの広がりの小さい形状を示すことになる。

ところで、焦点位置からずれた位置からの光を共焦点ピンホールによりどの程度遮断できるかについては、光の波長や共焦点ピンホールの径、対物レンズの開口数などに依存することが知られている。このうち、対物レンズの開口数は、液浸の有無によって変動する値である。

そこで、本実施形態では、開口数の違いによるＩ−Ｚプロファイルの形状の変化を分析し、液浸の有無を判定する。
図４Ａは、対物レンズ７とカバーガラス８の間に水１５が満たされている（水切れなし）場合のＩ−Ｚプロファイルを例示した図である。図４Ｂは、対物レンズ７とカバーガラス８の間に水１５が満たされていない（水切れあり）場合のＩ−Ｚプロファイルを例示した図である。

以下では、図４Ａ及び図４Ｂを参照して、水１５の有無によるＩ−Ｚプロファイルの形状の違いについて具体的に説明する。
対物レンズの開口数は、対物レンズ７と標本１６の間の媒体の屈折率に比例する。このため、水１５が満たされている場合と、満たされていない場合（つまり、空気が満たされている場合）では、水１５が満たされている場合の方が、高い開口数を示す。

開口数が高いほど、焦点位置からずれた位置からの光をより多く共焦点ピンホールで遮断できるため、図４Ａに例示される水１５が満たされている場合のＩ−Ｚプロファイルは、図４Ｂに例示される水１５が満たされていない場合のＩ−Ｚプロファイルと比べて、Ｄ点を中心とした狭い範囲で反射光が検出される形状となる。

また、ここでは図示しないが、液浸中に泡などが混入している場合、対物レンズ７と標本１６の間の一部が水１５で満たされていないため、水１５が完全に満たされている場合に比べて開口数が低下する。

このため、図４Ａに例示される水１５が満たされている場合のＩ−Ｚプロファイルに比べて広い範囲で反射光が検出され、図４Ｂに例示される水１５が満たされていない場合のＩ−Ｚプロファイルに比べて狭い範囲で反射光が検出される形状となる。

次に、液浸判定のためのＩ−Ｚプロファイルの形状の変化の分析方法について説明する。
Ｉ−Ｚプロファイルの形状の定量化は、以下の方法で行う。まず、Ｉ−Ｚプロファイルが示す光検出の強度（Ｉ）の最大値Ｉｍを取得し、取得した最高値の半分の値（以降、半値Ｉｈと称する。）を算出する。次に、半値Ｉｈを検出した際の焦点位置Ｚｈ１、焦点位置Ｚｈ２を取得し、焦点位置Ｚｈ１と焦点位置Ｚｈ２間の距離（以降、半値幅Ｗｈと称する。）を算出する。この半値幅ＷｈをＩ−Ｚプロファイルの形状の指標、特にＩ−Ｚプロファイルの広がりを示す指標と定義する。このようにしてＩ−Ｚプロファイルの形状を定量化した上で、Ｉ−Ｚプロファイルの形状の変化を分析する。

すでに説明したように、水１５が満たされていない状態では、水１５が満たされている状態と比較して開口数が低下するため、半値幅Ｗｈが増加する。これを利用して、予め設定された閾値Ｒｔｈ［％］以上に半値幅Ｗｈが増加したか否かで水１５の有無を判定する。以上の方法による液浸判定は、光検出器１１と制御装置１２が連携して行う。また、閾値Ｒｔｈ［％］を比較的小さく設定することで、液浸の有無だけではなく、泡の混入も検出することができる。

なお、本実施形態では、図２におけるＣ点からＥ点の間のＩ−Ｚプロファイルを取得し、Ｄ点（第２の境界面１８）で発生した反射光により、液浸の有無を判断したが、特にこれに限定されるものではない。図２におけるＡ点からＣ点の間のＩ−Ｚプロファイルを取得し、Ｂ点（第１の境界面１７）で発生した反射光により、液浸の有無を判断してもよい。前者の場合、観察条件に近い状態でＩ−Ｚプロファイルを評価できる利点があるのに対して、後者の場合、焦点位置が標本１６の手前にあるため、標本１６から生じた蛍光の影響を受けにくく、反射光のみの強度をより高い精度で検出することができる利点がある。

図５は、定点タイムラプス観察における液浸判定についてのフローチャートの例である。以下では、図５を参照しながら、液浸判定についてのフローについて具体的に説明する。

液浸判定は、タイムラプス観察の準備が整った状態から開始する。具体的には、標本１６をカバーガラス８により保持し、対物レンズ７とカバーガラス８の間に水１５を満たした状態から開始する。

まず、ステップＳ１では、制御装置１２が、予め設定されている閾値Ｒｔｈ［％］を不図示の記録装置から取得する。
ステップＳ２では、制御装置１２の制御のもと、光検出器１１により基準Ｉ−Ｚプロファイルを取得し、基準となる半値幅（以降、基準半値幅Ｗｈｂ）を算出して、不図示の記録装置に記録する。

なお、基準半値幅Ｗｈｂについては、予め観察環境に応じた値をデータベース化し、不図示の記録装置に記録しておいてもよい。その場合、ステップＳ２では、不図示の記録装置から基準半値幅Ｗｈｂを取得する。

ステップＳ３では、標本１６を撮影する。
ステップＳ４では、次回の撮影時間に近づくまで一定時間待機する。なお、この際の一定の待機時間は、タイムラプス観察のインターバルなどに応じて決定される時間である。

ステップＳ５では、制御装置１２の制御のもと、光検出器１１によりＩ−Ｚプロファイルを取得し、半値幅Ｗｈを算出する。
ステップＳ６では、制御装置１２は、不図示の記録装置から基準半値幅Ｗｈｂを取得し、半値幅Ｗｈの基準半値幅Ｗｈｂからの増加率Ｒｇｒ［％］を算出する。

ステップＳ７では、増加率Ｒｇｒ［％］が閾値Ｒｔｈ［％］以上か否かを判断する。増加率Ｒｇｒ［％］が閾値Ｒｔｈ［％］以上の場合は、水１５が適切に満たされていないと判断し、給水動作を行うステップＳ８へ遷移する。増加率Ｒｇｒ［％］が閾値Ｒｔｈ［％］未満の場合は、水１５が適切に満たされていると判断しステップＳ３へ遷移する。

ステップＳ８では、制御装置１２の制御のもと、給水装置１３から水補給ノズル１４を介して、対物レンズ７とカバーガラス８の間に水１５を供給する。この際、一旦、対物レンズ７とカバーガラス８の間の水１５をすべて排水してから水１５を供給しても良い。水１５の供給動作が終了するとステップＳ３へ遷移する。

以上の処理をタイムラプス観察が終了するまで繰り返す。
このように、タイムラプス観察の撮影毎に液浸判定処理を実施することにより、撮影時には、常に水１５が満たされた環境を維持し、共焦点走査型顕微鏡１本来の性能で撮影することが可能となる。

以上、本実施形態の共焦点走査型顕微鏡１では、共焦点ピンホール１０を介して光を検出することにより、焦点位置における液浸の有無を高い位置精度で判定することで適切な撮影環境を維持することが可能となる。これにより、液浸の消失による共焦点走査型顕微鏡の性能の劣化を防止する効果が得られる。

また、閾値Ｒｔｈ［％］の設定によっては、水切れだけではなく泡の混入も検出するできるため、泡の混入による共焦点走査型顕微鏡の性能の劣化を防止することができる。
また、本実施形態の共焦点走査型顕微鏡１では、液浸判定のためだけに必要とされる追加の構成要素は特に必要とされない。このため、過度に共焦点走査型顕微鏡１のシステムを複雑化することなく、液浸判定を行うことができる。

なお、本実施形態の液浸判定処理は、タイムラプス観察のインターバル中に実施する。このため、タイムラプス観察で設定した撮影タイミングに影響を及ぼすことなく、上記の効果を得ることができる。
＜第２の実施形態＞
本実施形態では、定点タイムラプス観察における液浸の有無の判定方法について説明する。なお、本実施形態は、同一視野内の複数点で液浸の有無の判定を行う点が第１の実施形態と異なっている。

本実施形態に係る共焦点走査型顕微鏡の構成や液浸の有無の判定方法は、第１の実施形態と同様であり、ここでは説明を割愛する。
図６は、定点タイムラプス観察における複数点での液浸判定についてのフローチャートの例である。以下では、図６を参照しながら、液浸判定についてのフローについて具体的に説明する。

液浸判定は、タイムラプス観察の準備が整った状態から開始するのは、第１の実施形態における定点タイムラプス観察の場合と同様である。
まず、ステップＳ１では、各種初期化処理を行う。具体的には、制御装置１２は、予め設定されている閾値Ｒｔｈ［％］を不図示の記録装置から取得する。その他、同一視野内で液浸の有無を判定する複数の観測点の座標などを取得する。

なお、以降では、同一視野内での複数の観測点を識別する一時変数として観測点変数Ｖを導入する。例えば、同一視野内のＮ点（ここで、Ｎは自然数。）の観測点で液浸判定を行う場合、観測点変数Ｖは０からＮ−１までのいずれかの整数値をとり、Ｎ点の各々はそれぞれ異なる観測点を示すものとする。ここでは、観測点変数Ｖを初期値０に設定する。

ステップＳ２では、制御装置１２の制御のもと、ガルバノミラー４により観測点変数Ｖに対応する観測点に焦点位置を移動して光検出器１１により基準Ｉ−Ｚプロファイルを取得する。さらに、観測点変数Ｖでの基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ）を算出して、不図示の記録装置に記録する。

ステップＳ３では、観測点変数Ｖを１だけインクリメントする。
ステップＳ４では、観測点変数ＶがＮ以上か否かを判定する。観測点変数ＶがＮ以上であればステップ５へ遷移し、Ｎ未満であればステップ２へ遷移する。

なお、基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ）については、予め観察環境に応じた値をデータベース化し、不図示の記録装置に記録しておいてもよい。その場合、ステップＳ２では、不図示の記録装置から基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ）を取得する。

ステップＳ５では、観測点変数Ｖを０にリセットする。
ステップＳ６では、制御装置１２の制御のもと、ガルバノミラー４により観測点変数Ｖに対応する観測点に焦点位置を移動して光検出器１１によりＩ−Ｚプロファイルを取得する。さらに、観測点変数Ｖでの半値幅Ｗｈ（Ｖ）を算出する。

ステップＳ７では、制御装置１２は、不図示の記録装置から基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ）を取得し、半値幅Ｗｈ（Ｖ）の基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ）からの増加率Ｒｇｒ（Ｖ）［％］を算出する。

ステップＳ８では、増加率Ｒｇｒ（Ｖ）［％］が閾値Ｒｔｈ［％］以上か否かを判断する。増加率Ｒｇｒ（Ｖ）［％］が閾値Ｒｔｈ［％］以上の場合は、水１５が適切に満たされていないと判断し、給水動作を行うステップＳ９へ遷移する。増加率Ｒｇｒ（Ｖ）［％］が閾値Ｒｔｈ［％］未満の場合は、水１５が適切に満たされていると判断しステップＳ１０へ遷移する。

ステップＳ９では、制御装置１２の制御のもと、給水装置１３から水補給ノズル１４を介して、対物レンズ７とカバーガラス８の間に水１５を供給する。この際、一旦、対物レンズ７とカバーガラス８の間の水１５をすべて排水してから水１５を供給しても良い。水１５の供給動作が終了するとステップＳ１２へ遷移する。

ステップＳ１０では、観測点変数Ｖを１だけインクリメントする。
ステップＳ１１では、観測点変数ＶがＮ以上か否かを判定する。観測点変数ＶがＮ以上であればステップＳ１２へ遷移し、Ｎ未満であればステップＳ６へ遷移する。

ステップＳ１２では、制御装置１２の制御のもと、標本１６を撮影する。
ステップＳ１３では、次回の撮影時間に近づくまで一定時間待機した後、ステップ５へ遷移する。なお、この際の一定の待機時間は、タイムラプス観察のインターバルなどに応じて決定される時間である。

以上の処理をタイムラプス観察が終了するまで繰り返す。
以上、本実施形態の共焦点走査型顕微鏡１によっても、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。さらに、本実施形態では、同一視野内の複数の観測点で液浸判定処理を実施することにより、特定の観測点における部分的な水切れについても検出可能となり、液浸の部分的な消失による共焦点走査型顕微鏡の性能の劣化を防止することができる。
＜第３の実施形態＞
第１及び第２の実施形態では、標本１６内の一領域（一視野）を経時的に観察する定点タイムラプスにおける液浸の有無の判定方法について説明した。

本実施形態では、標本１６内の複数の領域を経過時的に観察する多点タイムラプスにおける液浸の有無の判定方法について説明する。なお、本実施形態では、各々の領域において第２の実施形態と同様に複数点で液浸の有無の判定を行う例を示すが、特にこれに限定されるものではない。第１の実施形態と同様に各々の領域の１点で液浸の有無の判定を行ってもよい。

本実施形態に係る共焦点走査型顕微鏡の構成や液浸の有無の判定方法は、第１の実施形態と同様であり、ここでは説明を割愛する。
図７は、多点タイムラプス観察における複数点での液浸判定についてのフローチャートの例である。以下では、図７を参照しながら、液浸判定についてのフローについて具体的に説明する。

液浸判定は、タイムラプス観察の準備が整った状態から開始するのは、第１の実施形態の場合と同様である。
まず、ステップＳ１では、各種初期化処理を行う。具体的には、制御装置１２により、予め設定されている閾値Ｒｔｈ［％］を不図示の記録装置から取得する。その他、複数の観察領域の位置情報や、一観察領域内で液浸の有無を判定する複数の観測点の位置情報を取得する。

なお、以降では、同一視野内での複数の観測点を識別する一時変数として観測点変数Ｖを、多点観察のための複数の観察領域を識別する一時変数として観察領域変数Ｗを導入する。例えば、同一視野内のＮ点（ここで、Ｎは自然数。）の観測点で液浸判定を行う場合、観測点変数Ｖは０からＮ−１までのいずれかの整数値をとる。また、多点観察をＭ個（ここで、Ｍは自然数。）の観察領域で行う場合、観察領域変数Ｗは０からＭ−１までのいずれかの整数値をとる。ここでは、観測点変数Ｖ及び観察領域変数Ｗをともに初期値０に設定する。

ステップＳ２では、制御装置１２の制御のもと、不図示のステージを移動することにより観察領域変数Ｗに対応する観察領域に視野を移動する。
ステップＳ３では、制御装置１２の制御のもと、ガルバノミラー４により観測点変数Ｖに対応する観測点に焦点位置を移動して光検出器１１により基準Ｉ−Ｚプロファイルを取得する。さらに、観測領域変数Ｗ、観測点変数Ｖでの基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ，Ｗ）を算出して、不図示の記録装置に記録する。

ステップＳ４では、観測点変数Ｖを１だけインクリメントする。
ステップＳ５では、観測点変数ＶがＮ以上か否かを判定する。観測点変数ＶがＮ以上であればステップＳ６へ遷移し、Ｎ未満であればステップＳ３へ遷移する。

ステップＳ６では、観察領域変数Ｗを１だけインクリメントし、且つ、観測点変数Ｖを０にリセットする。
ステップＳ７では、観察領域変数ＷがＭ以上か否かを判定する。観察領域変数ＷがＭ以上であればステップＳ８へ遷移し、Ｍ未満であればステップＳ２へ遷移する。

なお、基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ，Ｗ）については、予め観察環境に応じた値をデータベース化し、不図示の記録装置に記録しておいてもよい。その場合、ステップＳ２及びステップＳ３では、不図示の記録装置から基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ，Ｗ）を取得する。

ステップＳ８では、観察領域変数Ｗを０にリセットする。
ステップＳ９では、制御装置１２の制御のもと、不図示のステージを移動することにより観測領域変数Ｗに対応する観察領域に視野を移動する。

ステップＳ１０では、制御装置１２の制御のもと、ガルバノミラー４により観測点変数Ｖに対応する観測点に焦点位置を移動して光検出器１１によりＩ−Ｚプロファイルを取得する。さらに、観測領域変数Ｗ、観測点変数Ｖでの半値幅Ｗｈ（Ｖ，Ｗ）を算出する。

ステップＳ１１では、制御装置１２は、不図示の記録装置から基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ，Ｗ）を取得し、半値幅Ｗｈ（Ｖ，Ｗ）の基準半値幅Ｗｈｂ（Ｖ，Ｗ）からの増加率Ｒｇｒ（Ｖ，Ｗ）［％］を算出する。

ステップＳ１２では、増加率Ｒｇｒ（Ｖ，Ｗ）［％］が閾値Ｒｔｈ［％］以上か否かを判断する。増加率Ｒｇｒ（Ｖ，Ｗ）［％］が閾値Ｒｔｈ［％］以上の場合は、水１５が適切に満たされていないと判断し、給水動作を行うステップＳ１３へ遷移する。増加率Ｒｇｒ（Ｖ，Ｗ）［％］が閾値Ｒｔｈ［％］未満の場合は、水１５が適切に満たされていると判断しステップＳ１４へ遷移する。

ステップＳ１３では、制御装置１２の制御のもと、給水装置１３から水補給ノズル１４を介して、対物レンズ７とカバーガラス８の間に水１５を供給する。この際、一旦、対物レンズ７とカバーガラス８の間の水１５をすべて排水してから水１５を供給しても良い。水１５の供給動作が終了するとステップＳ１６へ遷移する。

ステップＳ１４では、観測点変数Ｖを１だけインクリメントする。
ステップＳ１５では、観測点変数ＶがＮ以上か否かを判定する。観測点変数ＶがＮ以上であればステップ１６へ遷移し、Ｎ未満であればステップＳ１０へ遷移する。

ステップＳ１６では、制御装置１２の制御のもと、標本１６を撮影する。
ステップＳ１７では、観察領域変数Ｗを１だけインクリメントし、且つ、観測点変数Ｖを０にリセットする。

ステップＳ１８では、観察領域変数ＷがＭ以上か否かを判定する。観察領域変数ＷがＭ以上であればステップＳ１９へ遷移し、Ｍ未満であればステップＳ９へ遷移する。
ステップＳ１９では、次回の撮影時間に近づくまで一定時間待機した後、ステップＳ８へ遷移する。なお、この際の一定の待機時間は、タイムラプス観察のインターバルなどに応じて決定される時間である。

以上の処理をタイムラプス観察が終了するまで繰り返す。
このように、タイムラプス観察の撮影毎に液浸判定処理を実施することにより、多点観察のような液浸の飛散が発生しやすい環境においても、撮影時には、常に水１５が満たされた環境を維持し、共焦点走査型顕微鏡１本来の性能で撮影することが可能となる。

以上、本実施形態の共焦点走査型顕微鏡１によっても、第２の実施形態と同様の効果を得ることができる。
なお、本発明は、上述の実施の形態に例示した構成に限らず、その趣旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であることは言うまでもない。

本発明の実施形態に係る共焦点走査型顕微鏡の構成について例示した図である。 本発明の実施形態に係る共焦点走査型顕微鏡の対物レンズと水とカバーガラスと標本の位置関係とそれぞれの屈折率について示した概略図である。 本発明の実施形態に係る共焦点走査型顕微鏡で記録されるＩ−Ｚプロファイルの形状を示した概念図である。 本発明の実施形態に係る焦点走査型顕微鏡において、対物レンズとカバーガラスの間に水が満たされている場合のＩ−Ｚプロファイルの形状を例示した図である。 本発明の実施形態に係る焦点走査型顕微鏡において、対物レンズとカバーガラスの間に水が満たされていない場合のＩ−Ｚプロファイルの形状を例示した図である。 本発明の実施形態に係る焦点走査型顕微鏡における定点タイムラプス観察時の液浸判定についてのフローチャートを例示した図である。 本発明の実施形態に係る焦点走査型顕微鏡における定点タイムラプス観察時の液浸判定についてのフローチャートの変形例を示した図である。 本発明の実施形態に係る焦点走査型顕微鏡における多点タイムラプス観察時の液浸判定についてのフローチャートを例示した図である。

符号の説明

１ 共焦点走査型顕微鏡
２ レーザ光源
３ ダイクロイックミラー
４ ガルバノミラー
５ 瞳投影レンズ
６ 結像レンズ
７ 対物レンズ
８ カバーガラス
９ コンフォーカルレンズ
１０ 共焦点ピンホール
１１ 光検出器
１２ 制御装置
１３ 給水装置
１４ 水補給ノズル
１５ 水
１６ 標本
１７ 第１の境界面
１８ 第２の境界面
１９ 光軸

Claims (16)

1. 光源と、
   標本を保持する標本保持部材と、
   前記光源から射出される光を前記標本に集光する対物レンズと、
   前記対物レンズにより集光された集光光を前記標本面上で走査する第１の走査手段と、
   前記集光光の集光位置と共役な位置に配置された共焦点ピンホールと、
   前記標本から射出される蛍光と前記標本保持部材の表面で反射した反射光とを前記共焦点ピンホールを介して検出する光検出器と、
   前記光検出器による前記反射光の検出結果に基づいて、前記対物レンズと前記標本保持部材との間に液体が満たされているか否かを判断する制御装置と、を具備することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。
2. 請求項１に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、
   前記第１の走査手段は、ガルバノミラーであることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。
3. 請求項１に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、
   前記表面は、前記標本と前記標本保持部材との境界面であることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。
4. 請求項１に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、
   前記表面は、前記標本保持部材の前記対物レンズ側の表面であることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。
5. 請求項１に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、
   さらに、光軸方向に前記集光光を走査する第２の走査手段を備え、
   前記検出結果は、前記第２の走査手段により前記集光光を走査して取得した、前記集光位置と前記光検出器で検出される前記反射光の強度との関係を示すＩ−Ｚプロファイルであり、
   前記制御装置は、基準となる前記Ｉ−Ｚプロファイルと現在の前記Ｉ−Ｚプロファイルとの比較結果により、前記対物レンズと前記標本保持部材との間に液体が満たされているか否かを判断することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。
6. 請求項５に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、
   前記比較結果は、基準となる前記Ｉ−Ｚプロファイルの半値幅に対する撮影前の前記Ｉ−Ｚプロファイルの半値幅の増加率であり、
   前記増加率が一定値以上の場合に前記対物レンズと前記標本保持部材との間に液体が満たされていないと判断することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。
7. 請求項５に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、
   前記基準となる前記Ｉ−Ｚプロファイルは、前記対物レンズと前記標本保持部材との間に液体が満たされている状態のＩ−Ｚプロファイルであり、観察開始時に取得されることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。
8. 請求項５に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、
   前記基準となる前記Ｉ−Ｚプロファイルは、前記対物レンズと前記標本保持部材との間に液体が満たされている状態のＩ−Ｚプロファイルであり、観察開始前に予め取得されたＩ−Ｚプロファイルであることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。
9. 請求項５に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、
   前記第２の走査手段は、光軸方向に駆動される前記対物レンズであることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。
10. 請求項５に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、
    さらに、前記標本を配置するステージを備え、
    前記第２の走査手段は、光軸方向に駆動される前記ステージであることを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。
11. 請求項１に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、
    前記反射光の検出は、タイムラプス観察時のインターバル中に行うことを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。
12. 請求項１に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、
    さらに、前記液体を供給する供給手段を具備し、
    前記制御装置は、前記液体が満たされていないと判断した場合に、前記供給手段により前記液体を供給することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。
13. 請求項５に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、
    前記制御装置は、前記第１の走査手段を制御して前記表面上の複数点における前記検出結果を取得し、前記複数点の各々に対して前記液体が満たされているか否かを判断することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。
14. 請求項１３に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、
    さらに、前記液体を供給する供給手段を具備し、
    前記複数点は、同一視野内に位置し、
    前記制御装置は、前記複数点の少なくとも１点で前記液体が満たされていないと判断した場合に、前記液体を供給することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。
15. 請求項５に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、
    さらに、前記標本を配置するステージを備え、
    前記制御装置は、前記ステージを制御して前記表面上の複数点における前記検出結果を取得し、前記複数点の各々に対して前記液体が満たされているか否かを判断することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。
16. 請求項１５に記載の共焦点走査型顕微鏡装置において、
    さらに、前記液体を供給する供給手段を具備し、
    前記複数点は、それぞれ異なる視野内に位置し、
    前記制御装置は、前記液体が満たされていないと判断した場合に、前記液体を供給することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。

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