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Die
Erfindung betrifft eine Einrichtung zur Fluoreszenzphotometrie von
in Durchflussküvetten befindlichen
Flüssigkeiten
mit Markern.
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Herkömmliche
universelle Fluoreszenzspektrometer enthalten als Lichtquelle leistungsstarke Lampen
oder Mischgaslaser. Zur Auswahl der Anregungswellenlänge wird
meist ein Spektrometer verwendet. Auch zur Detektion des Fluoreszenzlichtes kommen
dort Spektrometer zum Einsatz.
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Die
Spektralfluoreszenzphotometer mit Zubehör und Durchflussküvetten sind
sehr kostenaufwendig. Sie sind räumlich
sehr groß und
besitzen nur wenige, z.B. maximal nur vier Probenkammern. Außerdem geht
die zeitliche Änderung
der Wellenlängen
sehr langsam vor sich. Bei Verwendung eines sehr teuren „fast filter" kann die Messung
nur bei zwei Wellenlängen
erfolgen.
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Es
ist ein Verfahren zur Fluoreszenzanalyse von mehrfach gefärbten Partikeln,
insbesondere biologischen Zellen im kontinuierlichen Durchfluss
in der Druckschrift DE AS 27 32 272 beschrieben, wobei die Partikel
in einer Trägerflüssigkeit
aufgeschwemmt werden und sodann von einem Hüllstrom umgeben und in laminarer
Strömung
durch eine intensive Laserlichtzone hindurchgeführt werden. Die von den Partikeln
ausgehenden Fluoreszenzlicht-Impulse werden detektiert und von einer
Auswerteelektronik in Echtzeit verarbeitet.
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Wenigstens
zwei Laserstrahlen unterschiedlicher Wellenlänge werden auf hintereinander
und in einem vorgegebenen Abstand liegende Stellen entlang dem laminaren
Probenstrom fokussiert und die von den Stellen ausgehenden Fluoreszenzlicht-Signale werden unter
Berücksichtigung
des Stellen-Abstandes und der Strömungsgeschwindigkeit so korreliert,
dass nur der Laufzeit der einzelnen Partikel zwischen den Stellen
entsprechende Signale ausgewertet werden.
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Ein
solches Gerät
ist durch die verwendeten Laser teuer, wobei eine quasi kontinuierliche
Messung verschiedener Proben nur durch Strahlumschaltung oder Strahlaufspaltung
möglich
ist.
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Ein
weiteres Verfahren und eine zugehörige Vorrichtung zur langzeitstabilen
und gut reproduzierbaren polarimetrischen Messung der Konzentrationen
der Bestandteile wässriger
Lösungen
sind in der Druckschrift
DE
100 20 613 A1 beschrieben. Das Verfahren wird insbesondere
zur Messung von Dialysaten interstitieller Gewebeflüssigkeiten
eingesetzt, bei dem ein Messstrahl durch eine Messküvette, die beispielsweise
durch ein Diaphragma von der zu messenden Lösung getrennt ist oder die
an ein Pumpsystem mit Austauschstrecke, die durch ein Diaphragma
von der zu vermessenden Lösung
getrennt ist, angeschlossen ist, geleitet und anschließend durch
einen Strahlteiler in zwei Teilstrahlen zerlegt wird, die Lichtintensität beider
Teilstrahlen gemessen und die Messsignale einer symmetrischen Signalverarbeitung
zugeführt
werden. Dabei wird mittels einer miniaturisierten Vorrichtung das
Verfahren realisiert.
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Eine
Messung unterschiedlicher Substanzen in der gleichen Probe ist hier
nicht vorgesehen.
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Eine
Vorrichtung zur Messung der Lumineszenz oder Fluoreszenz von Proben
ist in der Druckschrift
DE
197 55 187 A1 beschrieben. Die Probe befindet sich in einem
Probengefäß, das aus
einer Anzahl von Probengefäßen auswählbar ist,
welche nebeneinander auf einem Probenträger angeordnet sind. Die Vorrichtung
weist auf:
- – Eine Einrichtung zum Aufnehmen
des Probenträgers,
- – einen
Strahlungsdetektor,
- – eine
zwischen dem Probenträger
und dem Strahlungsdetektor angeordnete Lichtleiteinrichtung mit
einer dem ausgewählten
Probengefäß gegenüberliegenden
Lichteintrittsöffnung
- – eine
Einrichtung zum Verschieben des Probenträgers relativ zu der Lichteintrittsöffnung,
wodurch ein ausgewähltes
Probengefäß in eine
der Lichteintrittsöffnung
gegenüberliegenden
Stellung gebracht wird,
- – eine
Vorrichtung zum Zugeben einer mit der ausgewählten Probe reagierenden Substanz
zu der Probe,
wobei die Zugabevorrichtung eine gegen das
ausgewählte,
im Gesichtsfeld der Lichtleiteinrichtung liegenden Probengefäß gerichtete
Mündung
hat und die Lichtleiteinrichtung aus einer oder mehrerer Lichtleitfasern
mit einem für
sichtbares Licht höchstens 20° betragenden Öffnungswinkel
besteht.
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Ein
Problem besteht darin, dass die Messung unterschiedlicher Fluoreszenzen
nicht vorgesehen ist.
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Ein
System zur Mehrfach-Kanal-Messung ist in der Druckschrift
US 5 337 139 beschrieben.
Das Anregungslicht wird mittels eines Filterrades ausgewählt und über Lichtwellenleiter
auf die Messzellen geleitet. Leuchtdioden an jeder Küvette sind
zur Messung der Transmission vorgesehen.
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Ein
Problem besteht darin, dass die verwendete Lichtquelle eine hohe
Leistung benötigt,
wobei die Aufteilung durch kostenintensive Lichtleiterbündel erfolgt.
Durch beide Gegebenheiten verteuert sich das System.
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Zur
Zelluntersuchung mit Hilfe der Patch Clamp-Methode bestimmte Vorrichtung
und Verfahren sind in der Druckschrift
DE 197 44 649 A1 beschrieben.
Die Vorrichtung ist mit einer flächigen
Anordnung einer ersten Anzahl von Mikroküvetten zur Aufnahme von Zellen
und mit einer flächigen
Anordnung einer zweiten Anzahl von Mikropipetten versehen, die relativ
zur flächigen
Anordnung der Mikroküvetten
positionierbar ist, um eine Vielzahl in den Mikroküvetten befindlicher
Zellen gleichzeitig zu untersuchen.
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In
diesem System wird der gleiche Parameter in einer Vielzahl von Küvetten bestimmt.
Die Messung unterschiedlicher Parameter, insbesondere von Fluoreszenzen,
ist nicht vorgesehen.
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Eine
weitere Einrichtung und ein Verfahren für eine in Vitro-Analyse für therapeutische
Mittel ist in der Druckschrift WO 02/059599 A2 beschrieben. Darin
ist nicht vorgesehen, mit der gleichen Messeinrichtung unterschiedliche
Proben zu bestimmen.
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Es
ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zur 2-Photonen-Fluoreszenz-Koinzidenzanalyse
in der Druckschrift
DE
100 35 190 B4 beschrieben. Die Fluoreszenzmessung erfolgt
an mit unterschiedlichen, spektral verschiedene Fluoreszenzemissionen
aufweisenden Fluoreszenzmarkern markierten Analyten in einer Probe
in mehreren Schritten:
- – Beleuchtung der Probe in
einem Messvolumen mit einem Laser zur Anregung der Fluoreszenzemission
der mindestens zwei Fluoreszenzmarker, wobei die Beleuchtung der
Probe im Messvolumen mit maximal einer einzelnen Laserlinie mit
einer derart hohen Anregungsintensität erfolgt, dass die Fluoreszenzmarker
gemeinsam durch 2-Photonen-Absorptionen angeregt werden,
- – Detektion
der Fluoreszenzemission mit mindestens zwei Detektoreinrichtungen,
die zur Lichtdetektion in verschiedenen Spektralbereichen entsprechend
den spektralen Fluo reszenzeigenschaften der Fluoreszenzmarker ausgelegt
sind, und
- – Durchführung einer
Kreuzkorrelation und/oder eine Koinzidenzanalyse von Detektorsignalen
der Detektoreinrichtungen.
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Ein
Problem besteht darin, dass die benötigten Kurzpulslaser kostenintensiv
sind. Eine Messung mehrerer Proben ist nicht vorgesehen. Das System ist
zur Messung der Bindung zwischen zwei Analyten vorgesehen.
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Einrichtung zur Fluoreszenzphotometrie
von in Durchflussküvetten
befindlichen Flüssigkeiten
mit Markern anzugeben, die geeignet ausgebildet ist, dass sie kostengünstig und
miniaturisiert ist und ein Nachweis von 10–11 mol/l eines Markers bei
einer Markierungsrate von 1% gewährleistet
werden kann, Es sollen im Wesentlichen zeitgleiche Mehrfachmessungen
sowohl bei unterschiedlichen Wellenlängen als auch an mehreren Durchflussküvetten,
durch die eine Flüssigkeit
mit einer zu messenden Konzentration des Markers fließt, durchgeführt und
dabei störendes
Streulicht minimiert werden.
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Es
soll eine Einrichtung zur Messung der Fluoreszenz von verschiedenen
fluoreszierenden Farbstoffen in mehreren kleineren verschiedenen
Durchflussküvetten
angegeben werden, wobei die Messung von verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen oder
-partikeln, insbesondere von Markern bzw. Tracern gleichzeitig oder
nur wenig zeitlich und räumlich versetzt
erfolgen soll, um im Wesentlichen Messzeit zu sparen.
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Die
Aufgabe der Erfindung wird mit den Merkmalen des Patentanspruchs
1 gelöst.
Die Einrichtung zur Fluoreszenzphotomet rie von in Durchflussküvetten befindlichen
Flüssigkeiten
mit Markern ist mit mindestens einer Detektionseinheit, die eine Anregungsanordnung
und eine Detektoranordnung enthält,
versehen, zwischen denen eine Halterungsvorrichtung vorgesehen ist,
auf der sich mindestens eine Durchflussküvette mit einem Küvettenzufluss und
einem Küvettenabfluss
befindet, wobei durch die Durchflussküvette eine Flüssigkeit
mit mindestens einem Marker strömt
und wobei zur Detektoranordnung eine Auswerteeinrichtung, die in
ein Computersystem integriert ist, gehört.
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Die
Anregungsanordnung kann im Wesentlichen aus
- – einer
Lichtquelle in Form einer Leucht- oder Laserdiode,
- – einer
Energieversorgungseinheit, an die die Laserdiode angeschlossen ist,
und
- – einem
Anregungsfilter, der der ersten Optik nachgeordnet ist,
bestehen.
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Die
Detektoranordnung kann aus
- – einer zweiten Optik,
- – einem
Detektionsfilter,
- – einer
dritten Optik sowie
- – einem
Detektor und
- – der
Auswerteeinrichtung, die in das Computersystem integriert ist, bestehen.
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Dabei
sind Anschlusskabel – Versorgungs- und
Signalempfangsleitungen – für den Anschluss der
Lichtquelle und für
den Anschluss der Auswerteeinrichtung vorgesehen.
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Die
Einrichtung kann mit mehreren Detektionseinheiten und einer Haltevorrichtung
für mehrere Durchflussküvetten in
zentralsymmetrischer Anordnung versehen sein, wobei zur Haltevorrichtung
ein Boden zur Halterung der Durchflussküvetten sowie zugehörige Trennwände gehören, wobei
die Detektionseinheiten, jeweils bestehend aus einer Anregungsanodnung
und Detektionsanordnung, einer Drehhalterungseinrichtung zugeordnet
sind, die mit einem die Drehrichtung umschaltbaren Antriebssystem
verbunden ist, das vom Computersystem aus steuerbar und um die Haltevorrichtung
drehbar gelagert angeordnet ist.
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Durch
zwei Trennwände
und eine dazwischen befindliche Durchflüssküvette wird jeweils ein Messsektor
gebildet.
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Auf
der Halterungsvorrichtung können
die Durchflussküvetten
ortsfest gehaltert oder in Reihe nebeneinander ausgerichtet sein.
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Die
Einrichtung kann dabei relativ linear und parallel zur Reihen-Anordnung
der Durchflussküvetten
verschiebbar angeordnet sein.
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Bei
der Einrichtung können
sich in einem vorgegebenen Strahlengang sich die Lichtquelle, die erste
Optik, das Anregungsfilter, die zweite Optik, das Detektionsfilter,
die dritte Optik und der Detektor, der über das Anschlusskabel mit
der Auswerteeinrichtung verbunden ist, sowie ein semipermeabler
Spiegel, der sich zwischen dem Anregungsfilter und der zweiten Optik
befindet und der die rückstrahlende,
zu erfassende Fluoreszenz in der Durchflussküvette zur dritten Optik und
dem Detektor gerichtet umlenkt, befinden.
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Zur
wesentlichen Verringerung des Streulichts bzw. zur Verbesserung
des wellenlängenabhängigen Fluoreszenzsignal/Rausch-Verhältnisses können Blenden
in die Strahlengänge
eingefügt,
die Ablenk-Winkel optimal eingestellt sowie Durchflussküvetten schwarz
eingefärbt
sein.
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Die
Durchflussküvetten
können
aus Quarzglas sein, mit denen ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis auch
bei kurzer Anregungswellenlänge
erreicht werden kann.
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Die
Einrichtung kann mit dem Computersystem über zweite Leitungen in elektrischer
und signaltechnischer Verbindung stehen.
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Das
Computersystem kann derart ausgebildet sein, dass es selbst eine
Steuer-/Regeleinrichtung darstellt oder in eine solche als Hauptbestandteil integriert
ist.
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Z.B.
können
die vorgesehenen, durch eine Zellkultur diffundierenden fluoreszierenden
Marker ein FITC-Albumin oder ein TRITC-Dextran sein, wobei sich
die diffundierenden Marker im Molekulargewicht oder in der Qualität voneinander
unterscheiden.
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Die
Einrichtung kann zur Bestimmung von Permeabilitäten von Zellkulturen eingesetzt
werden, wobei mit der Einrichtung Messungen von Konzentrationen,
insbesondere von Ausgangskonzentrationen KA von
fluoreszierenden Markern, die sich in strömenden Flüssigkeiten befinden, durchgeführt werden
können.
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Die
Erfindung ermöglicht
die Erfassung des Volumens/der Masse von fluoreszierenden Markern, die
durch einen dimensionsminimierten Zellenrasen, insbesondere Zellenkultur,
hindurchgelangten sind, mittels einer miniaturisierten Einrichtung
zur Fluoreszenzphotometrie bzw. eines Fluoreszenzphotometers.
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Zur
Erreichung einer verbesserten Langzeitstabilität können Fluoreszenzstandards für jeden Marker
oder für
jede Detektionseinheit integriert sein, die in Reihe oder im Kreis
mit den Durchflussküvetten angeordnet
sind. Mit Hilfe der Fluoreszenzstandards können Veränderungen durch Temperatur,
durch Alterung, Schmutz oder andere Umweltfaktoren und Parameter
kompensieren werden. Dabei sind in weiteren Positionen neben den
Durchflussküvetten
die langzeitstabilen Fluoreszenzstandards vorgesehen, die zur Normierung
der Messsignale dienen.
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Weiterbildungen
und weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in weiteren Unteransprüchen beschrieben.
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Die
Erfindung wird anhand von drei Ausführungsbeispielen mittels mehrerer
Zeichnungen näher erläutert.
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Es
zeigen:
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1 eine
erfindungsgemäße Einrichtung mit
einer Detektionseinheit in einer perspektivischen Darstellung mit
einer Durchflussküvette
sowie einer Anregungsanordnung und einer Detektionsanordnung,
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2 ein
Fluoreszenzphotometer in einer perspektivischen Darstellung mit
einer Drehhalterungseinrichtung für mehrere Detektionseinheiten
in zentralsymmetrischer Anordnung,
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3 ein
Fluoreszenzphotometer in einer schematischen Darstellung mit einer
Verschiebehalterungseinrichtung und mehreren stationären Durchflussküvetten für eine Detektionseinheit,
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4 eine
Darstellung einer Transmissions-Wellenlängen-Kurve von Anregungsfilter und Detektionsfilter
für eine
Probe FITC-Dextran als Marker,
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5 eine
Darstellung einer Fluoreszenzintensität(Detektorstromsignal)-Zeit-Kurve
mit Eichkurve in Abhängigkeit
von Konzentrationen des FITC-Dextrans,
und
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6 eine
Darstellung eines Diagramms der relativen Fluoreszenz zur Konzentration
von FITC-Dextran
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In 1 ist
eine Einrichtung 1 zur Fluoreszenzphotometrie in einer
einfachen schematischen Form mit einer Durchflussküvette 4 auf
einer Haltevorrichtung 50 gezeigt.
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Die
Einrichtung 1 zur Fluoreszenzphotometrie einer in der Durchflussküvette 4 befindlichen
Flüssigkeit 5 mit
mindestens einem fluoreszierenden Marker 3 ist mit mindestens
einer Detektionseinheit 51 versehen, die eine Anregungsanordnung 10 und eine
Detektoranordnung 13 enthält, wobei zwischen der Anregungsanordnung 10 und
der Detektoranordnung 13 eine Halterungsvorrichtung 50 vorgesehen ist,
auf der sich die Durchflussküvette 4 mit
einem Küvettenzufluss 11 und
einem Küvettenabfluss 12 befindet,
wobei durch die Durch flussküvette 4 die
Flüssigkeit 5 mit
mindestens einem vorgesehenen Marker 3 strömt und wobei
zur Detektoranordnung 13 eine Auswerteeinrichtung 18,
die in ein Computersystem 2 integriert ist, gehört.
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Die
Einrichtung 1 kann mit der Detektionseinheit 51 im
Wesentlichen folgende Bauelemente/Baugruppen aufweisen:
- – eine
Energieversorgungseinheit 6, an die
- – eine
Lichtquelle 7 in Form einer Laserdiode angeschlossen ist,
- – eine
erste Optik 8, der
- – ein
Anregungsfilter 9 nachgeordnet ist, die allesamt eine Anregungsanordnung 10 bilden,
- – die
auf der Haltevorrichtung 54 angeordnete Durchflussküvette 4 mit
dem Küvettenzufluss 11 und
dem Küvettenabfluss 12,
wobei sich in der Durchflussküvette 4 die
zugeführte
Flüssigkeit 5 mit
dem vorgesehenen Marker 3 befindet,
- – eine
zweite Optik 14,
- – einen
Detektionsfilter 15,
- – eine
dritte Optik 16 sowie
- – einen
Detektor 17,
- – eine
Auswerteeinrichtung 18, die in das Computersystem 2 integriert
ist, wobei die zweite Optik 14, das Detektionsfilter 15,
die dritte Optik 16 und der Detektor 17 mit Auswerteeinerichtunq 18 eine Detektoranordnung 13 bilden.
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Anschlusskabel 19, 20 – als Versorgungs- und
Signalempfangsleitungen – für den Anschluss der
Lichtquelle 7 und für
den Anschluss der Auswerteeinrichtung 18 vervollständigen die
Einrichtung 1.
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Der
Küvettenzufluss 11,
die Durchflussküvette 4 und
der Küvettenabfluss 12 können ein
Teil eines Flüssigkeitskreislaufes
sein.
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Die
Einrichtung 1 und die Haltevorrichtung 50 mit
den wahlweise darauf befestigten Durchflussküvetten können relativ zueinander bewegbar
angeordnet sein.
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Dazu
ist in der 2 eine zweite Einrichtung 21 zur
Fluoreszenzphotometrie in einer perspektivischen Darstellung mit
einer Drehvorrichtung 29 für mehrere Durchflussküvetten 441, 442, 443, 444 (vier von
sechs möglichen)
in zentralsymmetrischer Anordnung gezeigt, wobei zur Drehvorrichtung 29 ein Boden 22 zur
Halterung der Durchflussküvetten 441, 442, 443, 444 sowie
zugehörige
Trennwände 31, 32, 33, 34, 35, 36 gehören. Die
drei Detektionseinheiten 25, 26, 27,
jeweils bestehend aus einer Anregungsanordnung 101, 102, 103 und
einer Detektionsanordnung 131, 132, 133,
sind einer schematisch dargestellten Drehhalterungseinrichtung 23 zugeordnet, die
mit einem die Drehrichtung umschaltbaren Antriebssystem (nicht eingezeichnet)
verbunden ist, das vom Computersystem 2 aus gesteuert werden
kann. Die Drehvorrichtung 29 ist um die Drehhalterungseinrichtung 23 drehbar
gelagert angeordnet.
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Mittel
der Trennwände 31, 32; 32, 33; 33, 34; 34, 35; 35, 36; 36, 31 und
der jeweils dazwischen befindlichen Durchflüssküvette 441, 442, 443, 444 usw. entsteht
jeweils ein Messsektor 24, wobei in 2 sechs
Messektoren 24 einem Winkel von 60° zugeordnet und drei Detektionseinheiten 25, 26, 27 vorgesehen
sind.
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Der
Boden 22 kann in einer anderen Ausführung zur Halterung der Detektionseinheiten 25, 26, 27 dienen,
wodurch die Ausbil dung von stationären Durchflussküvetten und
bewegbaren Detektionseinheiten möglich
sind.
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Eine
dritte Einrichtung 30 kann auch, wie in 3 gezeigt
ist, mit einer Verschiebevorrichtung 41 für die Durchflussküvetten 441, 442, 443 angeordnet sein,
wobei die Durchflussküvetten 441, 442, 443 ortsfest
gehaltert und in Reihe nebeneinander ausgerichtet sein können. Die
dritte Einrichtung 30 kann aber auch dabei linear und parallel
zur Reihen-Anordnung
der Durchflussküvetten 441, 442, 443 verschiebbar
angeordnet und die Verschiebevorrichtung 41 fest platziert
sein. Auf einem in Pfeilrichtung 37 bewegbaren Verschiebetisch 38 ist
die Anregungsanordnung und die Detektionsanordnung fest platziert. Im
vorgegebenen Strahlengang 39 befinden sich die Lichtquelle 7,
die erste Optik 8, der Anregungsfilter 9, die
zweite Optik 14, der Detektionsfilter 15, die
dritte Optik 16 und der Detektor 17, der über das
Anschlusskabel 20 mit der Auswerteeinrichtung 18 verbunden
ist, sowie ein semipermeabler Spiegel 40, der sich zwischen
dem Anregungsfilter 9 und der zweiten Optik 16 befindet,
und die rückstrahlende,
zu erfassende Fluoreszenz in der Durchflussküvette 442 zur dritten
Optik 16 und dem Detektor 17 gerichtet umlenkt.
Zur Messung mehrerer Marker 3 können mehrere Detektionseinheiten
mit unterschiedlichen Filterkombinationen und unterschiedlichen
Lichtquellen auf dem Verschiebetisch 38 platziert sein
und gleichzeitig in unterschiedlichen Durchflussküvetten 441, 442, 443 die
unterschiedlichen Marker 3 bestimmen.
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Dabei
können
die auf dem Verschiebetisch 38 platzierten Detektionseinheiten
relativ zur Verschiebeinrichtung 41 verschiebbar angeordnet
sein.
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Zusätzlich können in
beiden Einrichtungen 1 und 11 Blenden in die Strahlengänge eingefügt, die Ablenk-Winkel
optimal eingestellt sowie Durchflussküvetten 4, 441, 442, 443, 444 schwarz
eingefärbt zur
wesentlichen Verringerung des Streulichts bzw. zur Verbesserung
des wellenlängenabhängigen Fluoreszenzsignal/Rausch-Verhältnisses
eingesetzt sein.
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Als
zweckmäßig erweisen
sich Durchflussküvetten 4, 441, 442, 443, 444 aus
Quarzglas, mit denen das Signal-Rausch-Verhältnis auch
bei kurzwelliger Anregung wesentlich gesteigert werden kann.
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Die
Fluoreszenzsignale bezogen auf den jeweiligen Marker 3 in
der Flüssigkeit 5 werden
folgendermaßen
dargestellt:
In 4 ist eine Darstellung der Transmissions-Wellenlängen-Kurve
des Anregungsfilters 9 und des Detektionsfilters 15 aus 1 oder 3 für eine Probe des
Markers FITC-Dextran 3 bei
einer Küvettenlänge von
10 mm und einer Konzentration von 100 μg/ml (rechts Größenachse)
gezeigt. Dabei sind die Transmissionen des Anregungsfilters 9 und
des Detektionsfilters 15 angegeben. Für eine Strahlung unter größerem Einfallswinkel
als 0° verschiebt
sich die Transmission des Detektionsfilters 15 zu kürzeren Wellenlängen, so
dass dann auch Anregungslicht das Detektionsfilter 15 passieren
kann. Das kann durch Blenden verhindert werden, Das FITC-Fluoreszenzspektrum
wird aus dem Absorptionsspektrum durch Spiegelung mit dem bekannten
Emissionsmaximum von 517 nm berechnet. Zum Vergleich ist das Spektrum
einer als Lichtquelle 7 eingesetzten Leuchtdiode aufgetragen.
Die Anregungswellenlänge 28 liegt
etwa bei 470 nm, die fluoreszierende Beobachtungswellenlänge 52 hat
Ihr Maximum bei etwa 520 nm.
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In 5 ist
eine Darstellung der Fluoreszenzintensität-Zeit-Kurve (Kalibrierkurve) in Form
einer Detektorsignal- Zeitreihe
in Abhängigkeit
von der Konzentration des FITC-Dextrans
gezeigt, wobei die Fluoreszenzintensität als Signal jeweils im Detektor 17 in
Ampere für
eine Verdünnungsreihe
von FITC-Dextran gemessen wird. Die Konzentration von FITC-Dextran wird ausgehend
von einer Stammlösung
mit einer Konzentration von 100 mg/ml zunächst um einen Faktor 1000 auf
100μg/ml
verdünnt. Danach
ist eine Verdünnungsreihe
erstellt, bei der die Konzentration jeweils um einen Faktor 10 bis
auf 0,1 ng/ml reduziert wird.
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Auch
die verwendete Basis-Nährlösung – Promocell – ergibt
bereits ein geringes Fluoreszenzsignal. Ab einer Konzentration von
0,01 μg/ml
ist eine deutliche Zunahme der Fluoreszenzintensität zu erkennen.
Nach Erreichen der höchsten
Konzentration von 100 μg/ml
ist die Durchflussküvette
mit der Flüssigkeit 5 gespült und erneut
die Fluoreszenz gemessen worden. Der Vorgang wird solange wiederholt, bis
kein weiterer Abfall der Detektorsignale mehr zu beobachten ist,
Zwischen den einzelnen Messungen wird die Durchflussküvette 4 aus
dem Strahlengang entfernt, was am Einbruch der Detektorsignale erkennbar
ist.
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In 6 ist
ein Diagramm der relativen Fluoreszenz zur Konzentration von FITC-Dextran 3 dargestellt.
Die aus den der 5 zugrunde liegenden Messungen
ermittelten Fluoreszenzströme
sind auf das Maximum normiert und gegen die Konzentration aufgetragen.
Neben dem relativen Detektorstrom ist zum Vergleich das mit dem
CytoFluor II 3 für
die gleichen Lösungen
bestimmte Fluoreszenzsignal aufgetragen. Zum leichteren Vergleich
ist das Signal auch auf das Maximum normiert. Durch Abzug des auch mit
reiner Nährlösung vorhandenen
Hintergrundsignals können
auch noch Konzentrationen im Bereich von 0,01 μg/ml erkannt werden.
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Die
Kombination von mehreren bei unterschiedlichen Wellenlängen arbeitenden
Fluoreszenzdetektionseinheiten 25, 26, 27 in
der Einrichtung 21 nach 2 und 5 ermöglicht nahezu
simultane Messungen mehrerer Fluoreszenzmarker 3.
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Im
Folgenden wird die Funktionsweise der erfindungsgemäßen Einrichtung 1 erläutert.
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Die
Einrichtungen 1, 21, 30, wie in den 1, 2 und 3 gezeigt
ist, erfassen den durch die Zellkultur diffundierenden und durch
die Durchflussküvetten 4, 441, 442, 443, 444 fließenden, fluoreszierenden
Marker 3, z.B. ein FITC-Albumin oder ein TRITC-Dextran,
die der Zellkultur gesteuert zugeführt werden. Die zuführbaren
Marker 3 können sich
im Molekulargewicht oder in der Qualität voneinander unterscheiden.
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Die
Erfindung ermöglicht
es, dass insbesondere mit einer mehrkanaligen Einrichtung mehrere
in Molekulargewicht und Qualität
verschiedene Marker 3 weitgehend zeitgleich in mehreren
Detektionseinheiten detektiert werden können.
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Die
bereitgestellten Messwerte werden in einen Speicher des Computersystems 2 eingebracht, dort
gespeichert und nach Lesung mittels programmtechnischer Mittel zumindest
als Funktionen der Zeit berechnet, in Kurvenform dargestellt und
zur Erstellung von Schlussfolgerungen miteinander verglichen.
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- 1
- Einrichtung
- 2
- Computersystem
- 3
- Marker
- 4
- Durchflussküvette
- 441
- Durchflussküvette
- 442
- Durchflussküvette
- 443
- Durchflussküvette
- 444
- Durchflussküvette
- 5
- Flüssigkeit
- 6
- Energieversorgungseinheit
- 7
- Lichtquelle
- 8
- erste
Optik
- 9
- Anregungsfilter
- 10
- Anregungsanordnung
- 101
- Anregungsanordnung
- 102
- Anregungsanordnung
- 103
- Anregungsanordnung
- 11
- Küvettenzufluss
- 12
- Küvettenabfluss
- 13
- Detektoranordnung
- 131
- Detektoranordnung
- 132
- Detektoranordnung
- 133
- Detektoranordnung
- 14
- zweite
Optik
- 15
- Detektionsfilter
- 16
- dritte
Optik
- 17
- Detektor
- 18
- Auswerteeinrichtung
- 19
- Anschlusskabel
- 20
- Anschlusskabel
- 21
- zweite
Einrichtung
- 22
- Boden
- 23
- Drehhalterungseinrichtung
- 24
- Messsektor
- 25
- Detektionseinheit
- 26
- Detektionseinheit
- 27
- Detektionseinheit
- 28
- Anregungswellenlänge
- 29
- Drehvorrichtung
- 30
- Dritte
Einrichtung
- 31
- Trennwand
- 32
- Trennwand
- 33
- Trennwand
- 34
- Trennwand
- 35
- Trennwand
- 36
- Trennwand
- 37
- Pfeilrichtung
- 38
- Verschiebetisch
- 39
- Strahlengang
- 40
- Semipermeabler
Spiegel
- 41
- Verschiebeeinrichtung
- 50
- Haltevorrichtung
- 51
- Detektionseinheit
- 52
- Beobachtungswellenlänge
- KA
- Konzentration
des Markers