DE19744649A1 - Zur Zelluntersuchung mit Hilfe der Patch Clamp-Methode bestimmte Vorrichtung und Verfahren - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine zur Zelluntersu­ chung mit Hilfe der Patch Clamp-Methode bestimmte Vor­ richtung sowie auf ein dazu bestimmtes Verfahren.

Die Patch Clamp-Methode ist ein Verfahren, um bioelek­ trische Signale, namentlich das elektrische Potential im Innern einer Zelle und den durch ionische Transport­ prozesse, die sog. Ionenkanäle zustandekommenden Strom durch eine Zellmembran zu messen. Mit diesem Verfahren ist es heutzutage möglich, den Strom durch eine Zell­ membran sogar separat für einen spezifischen Ionenkanal zu messen und dadurch Erkenntnisse über die Funktions­ weise der Zellmembran zu gewinnen. Messungen mit Hilfe der Patch Clamp-Methode werden in der Neurowissenschaft vorgenommen, um die Wirkung von Pharmaka und Chemothe­ rapeutika auf die Aktivität von Ionenkanälen zu erfor­ schen.

Aus der Patch Clamp-Methode wurden verschiedene Varian­ ten entwickelt, um die elektrische Leitfähigkeit in einzelnen Membranabschnitten zu bestimmen. Für die Un­ tersuchung wird die Membran einer Zelle, üblicherweise einer Nervenzelle, mit einer als Mikropipette dienenden Glaskapillare anzusaugt und je nach Variante auch durchstoßen, um das intrazelluläre Potential von typi­ scherweise 1-500 µmV mit einer in der Glaskapillare befindlichen Elektrode gegenüber einer Referenzelektro­ de zu messen. Dabei ist die Zelle mechanisch fest mit der Mikropipette verbunden und steht über ihre Membran mit der umgebenden Lösung in Kontakt. Gemäß einer ande­ ren Variante wird ein angesaugter Teil einer Zellmem­ bran von der Zelle abgetrennt, um dann die Leitfähig­ keit dieses Membranstücks (patch) zu ermitteln. Bezüg­ lich der Art der Membranabtrennung sind verschiedene Varianten geläufig, um das Membranstück für die nach­ folgenden Messungen in beiderlei Orientierungen (insi­ de-out patch bzw. outside-out patch) an der Mikropipet­ te zu befestigen
Die Messung des Potentials innerhalb der Zelle bzw. die Messung von Strömen durch die Zellmembran hindurch er­ folgt mit Hilfe von Mikroelektroden, die sich innerhalb der Mikropipette befinden können oder mit Hilfe heutiger Verfahren wie der Dünnschichttechnik auf Substraten hergestellt werden, auf denen die zu untersuchenden Neuronen positioniert werden müssen.

Obwohl die Patch Clamp-Methode sich seit ihrer Einfüh­ rung in der Neurowissenschaft zu einer Routinemessung in neurobiologischen Labors entwickelt hat, ist sie meßtechnisch äußerst anspruchsvoll und erfordert bis­ lang noch eine mikroskopische Kontrolle des Eingriffs an der zu untersuchenden Zelle. Nachteilig ist dabei vor allem, daß dieses Verfahren für den Umgang mit der einzelnen Nervenzelle ein erhebliches Geschick und Feingefühl seitens des Operateurs voraussetzt; so müs­ sen die Neuronen beispielsweise auf einem Substrat auf­ gesucht werden und gegebenenfalls auch unmittelbar an Mikroelektroden an der Substratoberfläche positioniert werden, um die erforderlichen Messungen durchführen zu können.

Infolge des manuellen Umgangs mit der einzelnen Zelle ist die Patch Clamp-Methode bislang mit einem erhebli­ chen Zeitaufwand verbunden. Insbesondere bei der Unter­ suchung einer Vielzahl von Zellen ist dieser Nachteil um so gravierender, da die Zellen nach ihrer Isolierung vom Gewebe räumlich beliebig verteilt sind und aus die­ sem Grunde nur nacheinander aufgesucht, plaziert und untersucht werden können.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung sowie ein Verfahren bereitzustellen, um mit Hilfe der Patch Clamp-Methode eine Vielzahl von Zel­ len gleichzeitig zu untersuchen, die Untersuchung der Zellen zu automatisieren und so auf die bislang erfor­ derliche mikroskopische Kontrolle zu verzichten. Ferner soll die Untersuchung einer Vielzahl von Zellen auf kleinstem Raum ermöglicht und schließlich der für die Patch Clamp-Messung nötige Zeitaufwand drastisch mini­ miert werden.

Eine erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe ist für die Vorrichtung im Anspruch 1 und für das Verfahren im An­ spruch 6 angegeben. Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Vor­ richtung mit einer flächigen Anordnung einer ersten An­ zahl von Mikroküvetten zur Aufnahme von Zellen und mit einer flächigen Anordnung einer zweiten Anzahl von Mi­ kropipetten, die relativ zur flächigen Anordnung der Mikroküvetten positionierbar ist, um eine Vielzahl in den Mikroküvetten befindlicher Zellen gleichzeitig zu untersuchen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß ferner durch ein Ver­ fahren gelöst, wonach eine Vielzahl von Zellen angeord­ net wird und mit Hilfe einer Vielzahl von Mikropipetten eine Vielzahl angeordneter Zellen gleichzeitig unter­ sucht wird.

Durch die systematische räumliche Anordnung sowohl der zur Aufnahme der Zellen bestimmten Mikroküvetten als auch der Mikropipetten wird es erstmals möglich, die Patch Clamp-Methode zu automatisieren und auf diese Weise zeit- und kostensparend durchzuführen. Die zu un­ tersuchenden Neuronen werden von einer flächigen Anord­ nung von Mikroküvetten - in der Regel ein Substrat mit gleichmäßig verteilten Vertiefungen in seiner Oberflä­ che - aufgenommen und so auf exakt bestimmbaren Posi­ tionen gehalten. Eine flächige Anordnung von Mikropi­ petten ermöglicht bei genauer Positionierung gegenüber der Anordnung der in den Mikroküvetten befindlichen Zellen die gleichzeitige Durchführung einer Vielzahl von Einzelmessungen, die bislang nur nacheinander und bei gleichzeitiger Beobachtung durch ein Mikroskop durchgeführt werden konnten. Die Mikropipetten bzw. Mi­ kroküvetten können auf den entsprechenden Flächen auf engstem Raum angeordnet werden und ermöglichen so den Bau sehr kompakter Meßvorrichtungen. Die Küvetten und Pipetten werden auf den dafür vorgesehenen Flächen vor­ zugsweise regelmäßig verteilt, d. h. sie bilden bei fe­ stem gegenseitigem Abstand untereinander ein gleichmä­ ßiges Raster. Die genaue Gestalt der Raster wird sich in der Praxis an Größe und Form der Mikropipetten bzw. der Mikroküvetten orientieren.

Eine erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsform der Vorrichtung sieht vor, daß die flächige Anordnung von Mikroküvetten ein der flächigen Anordnung von Mikropi­ petten angepaßtes, aber in mindestens einer Richtung kleineres Rastermaß besitzt und daß die Anordnung von Mikroküvetten und die Anordnung von Mikropipetten rela­ tiv zueinander seitlich versetzbar sind, um wiederholt eine Vielzahl von Zellen gleichzeitig zu untersuchen. Im einfachsten Fall einer regelmäßigen Anordnung ent­ spricht der Abstand benachbarter Mikroküvetten einem ganzzahligen Bruchteil des Abstandes benachbarter, ge­ genüber den Mikroküvetten größerer Mikropipetten, wo­ durch eine wesentlich erhöhte Zahl von Zellen gleich­ zeitig aufgenommen werden kann als bei einer Anordnung gleich vieler Küvetten wie Pipetten. Die Anzahl gleich­ zeitiger Messungen ist nur noch durch die Größe der Mi­ kropipetten bzw. durch die für sie vorgesehene Flächen­ größe begrenzt. Zur Untersuchung sämtlicher in den Mi­ kroküvetten befindlicher Zellen sieht die entsprechende Ausführungsform des Verfahrens vor, daß die Vielzahl von Mikropipetten relativ zu einer Anordnung von Zellen versetzt wird und wiederholt eine Vielzahl angeordneter Zellen untersucht wird. Auf diese Weise kann die erfin­ dungsgemäße Vielfachmessung in kurzen Zeitabständen wiederholt werden, ohne daß es eines zwischenzeitlichen Austausches der Zellen bedarf. Dies führt zu einer wei­ teren Steigerung der Durchsatzzahlen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sieht einen Mikromotor zum Positionieren und/oder zum Versetzen der Anordnung von Mikroküvetten und der Anordnung von Mi­ kropipetten relativ zueinander vor. Der Mikromotor zum Absenken der Mikropipettenanordnung auf die Mikroküvet­ tenanordnung und zum seitlichen Verfahren beider gegen­ einander gewährleistet mit Hilfe der heutigen Feinmecha­ nik und Mikrotechnologie den punktgenauen Kontakt von Neuronen und Pipetten, wodurch die vorgestellte Erfin­ dung die erstmalige Untersuchung einer Vielzahl von Zellen ermöglicht. Dabei kann die Pipettenanordnung oder auch die Küvettenanordnung durch den Mikromotor verfahren werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sieht eine Zellzuführeinrichtung und/oder eine Spüleinrichtung zum Entfernen von Zellen vor. Dies führt zu einer weiteren Automatisierung der Messungen und damit zu einer weite­ ren Zeitersparnis insbesondere im Falle einer Vielfach­ messung, die die Aufnahmekapazität der Küvettenansamm­ lung übersteigt.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sieht einen Filter auf der Rückseite der Anordnung der Mikroküvet­ ten vor. Da die zu untersuchenden Zellen von der der Pipettenanordnung zugewandten Seite aus in die Mikrokü­ vetten eingebracht werden und die Mikroküvetten vor­ zugsweise in Richtung der Pipetten konisch aufgeweitet sein können, um die Zellen sicher aufzunehmen, emp­ fiehlt sich eine Spülung der Küvettenanordnung von der Rückseite her. In diesem Fall ist ein Filter vorteil­ haft, um ein Verstopfen der Mikroküvetten durch kleine Partikel zu verhindern.

Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens anhand von Ausführungs­ beispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen exem­ plarisch beschrieben, auf die im übrigen hinsichtlich der Offenbarung aller im Text nicht näher erläuterten erfindungsgemäßen Einzelheiten ausdrücklich verwiesen wird. Es zeigen:

Fig. 1 einen Querschnitt durch eine erfindungsgemäßen Vorrichtung während der Patch Clamp-Messung,

Fig. 2 eine vergrößerte Detailansicht aus Fig. 1,

Fig. 3 einen Querschnitt einer erfindungsgemäßen Aus­ führungsform der Vorrichtung und

Fig. 4 eine perspektivische Ansicht der erfindungsge­ mäßen Anordnungen von Mikroküvetten und Mikro­ pipetten.

Die Fig. 1 und 2 zeigen schematisch eine erfindungs­ gemäße Vorrichtung während der Patch Clamp-Messung. Ei­ ne Mikroküvettenanordnung 1 weist eine Vielzahl im Ra­ ster angeordnet er Mikroküvetten zur Aufnahme einer Vielzahl von Zellen 2 auf. Einige der Zellen werden von einer Mikropipettenanordnung 3 berührt bzw. von den Mi­ kropipetten angesaugt. Mit dieser Anordnung von n × n Pipetten können n2 Messungen gleichzeitig durchgeführt werden. Fig. 3 zeigt eine Ausführungsform der erfin­ dungsgemäßen Vorrichtung mit einem unterhalb der Mikro­ küvetten befindlichen Filter 4, gleicht ansonsten der Fig. 1. Die räumliche Anordnung der Mikroküvettenan­ ordnung (MKA) und der Mikropipettenanordnung (MPA) ist in Fig. 4 dargestellt. Die MPA befindet sich über der MKA, wobei die spitz zulaufenden Öffnungen der Mikropi­ petten der MKA zugewandt sind. Die MPA kann durch einen nicht abgebildeten Mikromotor relativ zur MKA verfahren werden.

Für eine ungefähre Einschätzung der typischen Abmessun­ gen der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden nachste­ hend ohne jegliche Beschränkung der Allgemeinheit eini­ ge exemplarische Zahlenangaben genannt:

Auf der Mikroküvettenanordnung von der Größe eines Qua­ dratzentimeters befinden sich auf einer Fläche von 8 × 8 mm2 entlang jeder Richtung des quadratischen Rasters 160 Küvetten und somit insgesamt 25600 Küvetten im ge­ genseitigen Abstand von 50 µm. Die Mikropipettenanord­ nung weist auf einer Fläche von mindestens 2 × 2 mm2 16 im quadratischen Raster angeordnete Mikropipetten (Nozzles) mit einem gegenseitigen Abstand von 400 µm auf. Das Rastermaß der Mikropipettenanordnung ent­ spricht hier also dem achtfachen Rastermaß der Mikrokü­ vettenanordnung. Um alle in der MKA befindlichen Zellen zu untersuchen, kann die MPA in beiden Richtungen par­ allel zum MKA in 40 Schritten verfahren und damit in insgesamt 1600 unterschiedliche Positionen gebracht werden.

Mikroküvettenanordnung sowie Mikropipettenanordnung werden mit Hilfe lithographischer Methoden der Halblei­ tertechnik, die Elektroden der MPA in Dünnfilmtechnik gefertigt. Mikromechanische Strukturen dienen zur Ju­ stierung des Motors; die Komponenten werden feinmecha­ nisch und mikrotechnisch verbunden. Ein Mikroprozessor steuert die Mikroaktoren und erfaßt die anfallenden Meßdaten, die dann elektronisch ausgewertet werden.

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem beschrie­ benen Verfahren können (derzeit) bereits einige Tausend Messungen in wenigen Minuten durchgeführt werden.

Claims (7)

1. Zur Zelluntersuchung mit Hilfe der Patch Clamp- Methode bestimmte Vorrichtung mit einer flächigen An­ ordnung einer ersten Anzahl von Mikroküvetten (1) zur Aufnahme von Zellen (2) und mit einer flächigen Anord­ nung einer zweiten Anzahl von Mikropipetten (3), die relativ zur flächigen Anordnung der Mikroküvetten posi­ tionierbar ist, um eine Vielzahl in den Mikroküvetten befindlicher Zellen gleichzeitig zu untersuchen.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die flächige Anordnung von Mikroküvetten ein der flächigen Anordnung von Mikropi­ petten angepaßtes, aber in mindestens einer Richtung kleineres Rastermaß besitzt und daß die Anordnung von Mikroküvetten und die Anordnung von Mikropipetten rela­ tiv zueinander seitlich versetzbar sind, um wiederholt eine Vielzahl von Zellen gleichzeitig zu untersuchen.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch einen Mikromotor zum Positionieren und/oder zum Versetzen der Anordnung von Mikroküvetten und der Anordnung von Mikropipetten relativ zueinander.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch eine Zellzuführeinrichtung und/oder eine Spüleinrichtung zum Entfernen von Zellen.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch einen Filter (4) auf der Rückseite der Anordnung der Mikroküvetten.

6. Zur Zelluntersuchung mit Hilfe der Patch Clamp- Methode bestimmtes Verfahren, wonach eine Vielzahl von Zellen (2) angeordnet wird und mit Hilfe einer Vielzahl von Mikropipetten (3) eine Vielzahl angeordneter Zellen gleichzeitig untersucht wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Vielzahl von Mikropi­ petten relativ zu einer Anordnung von Zellen versetzt wird und wiederholt eine Vielzahl angeordneter Zellen untersucht wird.