CN102665914B - 用于检验带有弹性体的细胞的装置以及该装置的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检验带有弹性体的细胞的装置及其应用。所述弹性体（1）具有底部（2，3）以及更厚的边缘区域（4，6，8），并且在底部（3）中布置有规则的微型结构。这种弹性体特别适合于拉伸实验、尤其是单轴向的类型的拉伸实验。本发明同样也公开了这种装置的有利的应用。

Description

用于检验带有弹性体的细胞的装置以及该装置的应用

技术领域

本发明涉及一种用于检验带有弹性体的细胞的装置以及该装置的应用。

背景技术

细胞变形系统在基础研究和药学/临床分析中具有重要贡献，以便模拟周期性的变形，如在动物组织中所出现的那样。这种变形、例如围绕动脉血管或者围绕消化管道周围，对于细胞来说是一个信号，并且导致所涉及的组织的形态的以及功能的变化，没有这种变形就不能保证所述组织的功能。

通常细胞与施加的变形以确定的角度对齐。该角度在这里可以在关于施加的变形为60o和90o之间的范围中变化。在细胞培养中，细胞的静态的和周期性变形的实验模拟借助于所谓的细胞拉伸器来实施。在此，了解细胞的重新对齐对于理解结构化的组织来说是重要的研究分支。

细胞拉伸器按照实验配置细分为单向的、双向的和等二轴向的（equibiaxial）拉伸器。等二轴向的细胞拉伸器大多数情况下使用不同类型的活塞系统，通过所述活塞系统在一端夹紧弹性膜片。通过借助于风动触发在活塞内部施加过压或者负压，使位于其上方的膜片变形。散布在膜片上的细胞，当它们粘附在表面上时就经受变形。这种系统的缺点在于：各向同性的伸长实验只提供非常有限的可利用的结果。

单向的、双向的细胞拉伸器使用电动的驱动装置。通常应用步进电机或者同步电机。弹性膜片、所谓的弹性体或者腔室，它们安装在保持装置和相应的驱动装置之间，如此可以单轴地拉伸。通过应用至少四个、通常为八个这样的驱动装置，也可以使弹性的膜片或者腔室沿两个方向顺序地双轴地依次进行伸长。

不利的是，按照背景技术的这种双轴向的细胞拉伸器单单由于马达的数量和附属的控制电子装置就较贵。此外不利的是：按照背景技术的细胞拉伸器不能确定弹性体的变形和细胞力，并且因此不能将所求得的结果用于模拟细胞在原地的、也就是说在组织中由于伸长而引起的响应。

发明内容

本发明的任务在于，开发一种用于检验带有弹性体的细胞的装置，借助于所述装置可以更好地检验外部的机械应力对细胞的影响。

本发明的任务通过按照权利要求1所述的装置及其按从属权利要求所述的应用来解决。有利的设计方案分别由各自关联的权利要求得出。

由交叉交联的硅油（聚二甲基硅氧烷，PDMS）组成的弹性体实施为腔室，所述腔室同时用作在拉伸实验过程中的细胞培养皿。弹性体腔室用于容纳细胞。也就是说，细胞散布到弹性体上，所述细胞粘附在表面上。弹性体为此具有底部以及比较厚的边缘区域。

在底部中规则地布置有微型结构，细胞就粘附在这些结构上。微型结构的直径以及微型结构之间的间距有利地处于微米范围中，而且通常大约为1μm至10μm。微型结构的深度可以调整并且可以这样变化，使得细胞或者不能识别它、或者有目标地识别它。微型结构在实验中用作为标尺，利用所述微型结构可以确定施加到弹性体上的伸长以及作用到细胞上的力。

利用按照本发明的装置可以初次精确地确定：施加到弹性体腔室上的伸长和实际在细胞上产生的伸长之间的差别。腔室沿X方向的伸长引起弹性体沿Y方向的横向收缩和纵向压缩。这导致弹性体腔室的、尤其也是腔室底部的枕状的变形，细胞则粘附在所述腔室底部上。腔室底部变形的过程可以通过识别微型结构来精确地确定。附加地，可以在了解弹性体弹性模量的情况下也初次地确定在周期性的伸长实验中粘附的细胞的力。

微型结构的识别不仅可以用于没有散布细胞的标定目的，而且也可以随时在实施实验的过程中进行。因此可以做出初次准确的预报来推测细胞的对齐角度，并且如此来调整实验参数，从而使得这些参数最佳地适合于预报的检验。

在本发明范围中已知：利用用于检验细胞的装置，可以准确地确定静态的或者周期性的作用力对带有弹性体的细胞的影响。在此，细胞设置在弹性体上或者说一般来说放置在弹性基板上，并且所述基板在将细胞粘附在其上面之后静态地或者周期性地伸长，也就是说使细胞与底部一起变形。已知的是：细胞的重新对齐在此取决于所用基板的横向收缩，这就是说，细胞在周期性伸长实验时同时被纵向压缩了。横向收缩系数说明了弹性基板的纵向压缩（沿Y方向）与伸长（沿X方向）之比，其中腔室底部（沿Z方向）的厚度变化可以忽略不计，这是因为附着的细胞只是觉察到X_Y平面中的变形场。横向收缩系数、也称为泊松系数，是材料特有的并且例如对于作为基质材料的PDMS来说为0.5。腔室和底部的纵向压缩可以通过一种相应的几何成型和加固而改变。

在本发明的范围中已知：利用背景技术的装置并不能准确地表示出施加到细胞上的伸长、并不能确定力以及不能确定横向收缩。此外已知：弹性体腔室的横向收缩对于细胞的特性、尤其是在重新对齐时具有决定性的影响。因为由背景技术已知的细胞腔室在细胞拉伸器中、在这里存在不准确性，因此在对实验进行分析时出现较大的误差。

弹性基板优选具有矩形的、例如正方形的腔室形状，因为尤其是涉及到腔室的制造，例如以铸造方法为此可以简单而成本低廉地制造阴模。

弹性体特别有利地在其边缘区域中具有空隙。该空隙为孔状的并且可以优选沿Z方向引导穿过弹性体的整个边缘。所述空隙起导向作用，利用此空隙使弹性体稳定地与细胞拉伸器的电动驱动装置固定在一起。

所述空隙特别有利地在弹性体腔室的制造过程中，自动地在共同的交叉交联过程中安装到边缘中。为此将销钉安装到阴模中，所述销钉具有用于到阴模的相应的位置上的空隙的、期望的尺寸。所述销钉具有如同用于弹性体的细胞拉伸器中的固定销钉同样的尺寸。聚合物（PDMS硅油）与异量分子聚合物（交叉交联体）混合，并使得还是液体的弹性体注入到阴模中，并且还作为液体在没有交叉交联的状态下包围住销钉。之后按照制造商说明将PDMS硬化或者说交叉交联。在硬化之后特别有利的是保证弹性体中的空隙与细胞拉伸器的电动机的支承装置形状锁合地连接，其以尽可能好的方式使弹性体稳定地与细胞拉伸器的紧固装置连接。

弹性体优选具有带有经过倒圆的角部的边缘区域。这些经过倒圆的角部，与按照背景技术所述的尖锐边棱的过渡相比，即使在通过经常的周期性伸长以及压缩的持久加载时也有利地并不撕裂。

经过倒圆的角部优选能够存在于指向外部的和/或也存在于指向内部的边缘区域中。因为空隙布置在圆角区域中并且弹性体关于此与细胞拉伸器的固定销连接，所以保证了在基板伸长的过程中，细胞拉伸器特别良好地将力传递到基板的腔室底部上，并且因此传递到细胞上。经过倒圆的角部通过与之关联的更加有利的受力过程，比由背景技术已知的有棱角的角部传递拉伸器的施加的振幅要精确得多。

在本发明的另外一种设计方案中，弹性体腔室的角部的壁厚大于其余边缘区域中的壁厚。这有利地导致了在伸长实验过程中腔室的进一步的稳定性。

弹性体特别有利地具有一种形状，其中相互对置的边缘区域具有相同的壁厚，并且其中不相互对置的边缘区域具有相同的或者不同的壁厚。壁高是恒定的。弹性体腔室可以特别有利地如此变化，从而通过弹性体腔室的平行于拉伸方向的边缘的壁厚能够调整腔室底部的横向收缩。这导致了：在相同的拉伸振幅时细胞可以重新对齐。

在纵向压缩较小而伸长较大（基板的较小的横向收缩）时可以进行检验，其方法是：将弹性体的平行于拉伸方向的边缘制造成比其余的边缘区域更小地挠曲。

弹性体的平行于拉伸方向的边缘但是也可以本身断开或者也可以完全空出。由此加大了横向收缩。在弹性体腔室的底部自由悬挂时，也就是说在没有边缘区域沿拉伸方向平行的情况下，就实现最大的横向收缩。因此可以利用单轴向的细胞拉伸系统，通过调整横向收缩来模拟双轴向的细胞拉伸系统，并且研究相应的细胞特性。因为已知的双轴向的细胞拉伸系统的成本是单轴向的系统的多倍，所以这在降低成本的方向上是重大的一步。

弹性体的垂直于拉伸方向的边缘区域可以特别有利地进行加强。加强部使得力特别均匀地传递到弹性体底部上并因此传到散布在上面的细胞上。加强部可以包括腔室类型的、与弹性体形状锁合连接的材料，例如像支撑角。这些附加的支承装置垂直于拉伸方向，避免了边缘区域沿拉伸方向的弯曲，并且在将腔室安装到细胞拉伸器中时，明显改善了施加的腔室伸长与实际上出现在细胞上的伸长之间的比值。应用附加的支承装置或者说支撑角此外还产生腔室底部的更类似的伸长过程，进而产生显著更大的区域，在所述区域中可以检验细胞的特性。

除了确定横向收缩之外，微型结构可以在基板伸长之前、期间和之后与细胞受力分析同时地使用。这可以首次实现两个物理参数（拉伸力和细胞力）的同时的、多维的数据分析。在受到拉伸的情况下，细胞力分析的分辨率极限可以在使用的腔室中附加地通过将发荧光的纳米球（Nanokugel）引入到腔室底部中来提高。

原则上微型结构可以通过冲头来产生，如在德国专利申请DE 10 2005 005 121中描述的那样。但本发明并不局限于此。该结构更确切地说也可以通过发荧光的纳米球和类似规则的结构来产生。

弹性体腔室附加地可以以不同的弹性制造，或者说以衬有薄层的不同弹性的弹性体制造。装置优选具有弹性在0.1kPa至1MPa范围内的弹性体。

作为驱动系统可以优选采用商业用直线驱动装置，其中用户可以自由调整在所选择的驱动装置的技术规格的范围中的所有参数、例如像速度和移动行程。

其它可自由选择的参数是在初始位置和终止位置中的停止时间，可以有选择地调整单一的或者循环的伸长。在此，循环的数量或者实验的持续时间可选地是可以自由选择的。

驱动装置是自动标定的，并且关于弹性体腔室的几何形状具有自动调零装置。附加地，可以使腔室预先伸长一个可自由选择的量，以便平衡腔室底部的下垂。计算机程序可以在每个任意时刻使得所调整的驱动控制程序中断、暂停并且在任意时刻继续，其中驱动装置可以无电流地接通并带至另一个位置，例如在实验位置从CO₂保温箱变换成显微镜时。因为计算机程序也可以由交换数据载体来运行，其同样也可以由一台PC机传送（portieren）到另一台PC机。在实施例中中断的实验因此也可以在另一台PC机上继续。此外，计算机程序具有将信号输出到其它运行的程序的接口，例如用于触发照相机，以便在实验期间照相。此外，所有的程序调整可以作为txt文件记录下来。由操作者为实验所选择的驱动参数可以作为设置－调整（Setup－Einstellung）任意地存储和重新调用。

整个细胞拉伸系统放置在夹紧框上，所述夹紧框可以直接装到细胞显微镜上。因此可以根据提出的问题也进行时间分辨的实验。通过整个系统的紧凑的结构也可以使用在CO₂保温箱里。

按照本发明的装置的有利应用在于用于细胞的拉伸实验，更确切地说，尤其在于单轴向的拉伸实验。

细胞为此有利地散布和粘附在底部上。按照本发明的装置的有利应用在于：弹性体的横向收缩取决于施加的伸长通过微型结构来标定和改变。

弹性体为此注定地要与细胞拉伸器一起使用在单轴向的拉伸实验中，所述细胞拉伸器仅仅能够沿弹性体的X方向引起拉伸。因为按照本发明的装置的壁厚在不同的边缘区域中可以实施成不同的，所以双向的细胞拉伸器就多余的了，因为弹性体腔室的横向收缩可以通过弹性体腔室的壁厚的改变而自由调整。

一种特别有利的应用规定了：弹性体的边缘区域沿细胞拉伸器的拉伸方向利用不含有弹性体的材料进行加强。

装置的其它优点在于：细胞对齐的角度可以通过微型结构准确地确定，细胞对齐的角度可以取决于横向收缩在接下来的实验中自由确定，并且可以使横向收缩在原地与细胞结合的情况匹配。

此外腔室底部在所有位置上都显示出在伸长的过程中的一种类似的并且首先可验证的特性。

此外根据实施例和附图对本发明进行详细说明。给出的尺寸和材料都是示例性的并且能够不限于此地理解。

附图说明

附图示出：

图1 是弹性体－细胞腔室系统；

图2 是具有两个夹板类型的加强部的弹性体－细胞腔室系统；

图3是具有四个夹板类型的加强部的弹性体－细胞腔室系统。

具体实施方式

第一实施例

图1示意性地示出了按照本发明的弹性体的俯视图和横截面图，该弹性体作为结构的细胞腔室系统使用在用于细胞的拉伸实验中。

弹性体1在化学上由作为基质的、乙烯终止的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxan）组成。作为交叉交联剂（Kreuzvernetzer）采用了甲基硅烷－二甲基硅氧烷共聚物。在制造过程中首先将基质与交叉交联剂相互混合、去除气体，并接着注入细胞腔室的阴模中。在基质中掺入铂催化剂并在60oC时整夜进行交叉交联。弹性体在硬化之后具有大约50kPa的弹性。

细胞腔室系统1具有近似正方形的形状。边长为35mm。四个角部6中的每一个都进行了加强。也就是说，边缘区域8和4分别具有仅仅5mm的厚度（St?rke），相反角部6具有半圆形并且超出其余外边缘4，8的耳状的圆形加强部，其直径为10mm。边角既向外也向内倒圆。

这些措施有利地使得，角部在拉伸实验中防止了通过拉伸器的固定销钉（未示出）施加到空隙7中的拉伸力，并且不容易撕开或者说损坏。

在角部6中的每一个中都有一个引导穿过弹性体材料的空隙7。空隙7的直径为3mm并且布置在角部6中的每一个的中间。

空隙7直接在细胞腔室1交叉交联期间制成。基质和共聚物注入到带有销钉的阴模中并且进行硬化，所述销钉的直径如同空隙6一样。在伸长实验中将腔室1又利用其空隙7安放到销钉上，所述销钉对应于按照在制造过程的交叉交联时的那一个的直径。因此，空隙7在实验中具有相对于细胞拉伸器以及相对于其固定销钉（未示出）的完美的形状锁合连接和配合（Sitz）。这有利地使伸长精确地传递到腔室底部3上。附加地，通过角部6的经过倒圆的加强部使弹性体撕裂的危险最小化。

此外，四个角部6也在其内部的边缘区域5中进行了倒圆。单是这种措施也有利地使施加的伸长精确地传递到腔室底部上。此外，也使弹性体1的撕裂危险关于此进一步最小化。

在边缘区域4，6，8中弹性体的厚度一致为5mm。在相互对置的边缘区域4或者说8中的厚度（St?rke）（或者说深度）一致为5mm，而在四个角部6中为10mm。

与边缘区域4，6，8中不同，底部区域2，3具有显著小的、通常为0.1－0.5mm的厚度。底部具有结构化的中间区域3以及布置在该中间区域和边缘区域4，6，8之间的非结构化的区域2。中间区域3具有以凸起和凹部的形式规则地布置的结构。凸起和凹部例如相互具有1.5μm的均匀的间距以及2μm的直径。结构的深度通常取决于腔室弹性处于50至500nm的范围中。这种结构在用于在结构上散布细胞（未示出）的伸长实验中作为标尺或者说尺度，利用其来检验：施加的振幅如何从细胞拉伸器传递到腔室底部上并且因此传递到细胞上。利用在底部的中间区域中的结构3，因此可以首次精确地确定施加于弹性体腔室上的伸长和实际上在细胞上出现的伸长之间的差别。

第二实施例

图2示出了与图1相同的细胞腔室21，所述细胞腔室在四个角部26中的每个角部中又具有一个中间的空隙27。作为腔室21的弹性体与图1不同，在对置的边缘区域24上以及在角部26上设置有总共两个夹板类型的加强部29。加强部29配合精确地并且形状锁合连接地放置在边缘区域上以及空隙上。夹板29有利地进一步防止了由于施加拉伸力对边缘造成损害，所述拉伸力通过粗箭头表示。夹板在这里由阳极氧化处理的（eloxiertem）铝组成。

在伸长实验中的拉伸方向在图2中通过沿X方向的粗箭头表示。只要对置的边缘区域24更厚，也就是说沿X方向比与之垂直布置的边缘区域28更厚、例如两倍厚地实施，那么沿Y方向的纵向压缩就提高并因此使横向收缩加大。由此可以通过改变边缘区域24，28的厚度来调整沿X方向的测量腔室的拉伸与其沿横向于拉伸方向的Y方向的纵向压缩之间的比值。因此可以考虑多个其它实施例。

第三实施例

图3示出了大致相同的细胞腔室31，所述细胞腔室在四个角部36中的每个角部中又具有中间的空隙。弹性体31与图1和图2不同，仅仅直接在角部36上设置有总共四个夹板类型的加强部39。加强部39配合精确地并且形状锁合连接地放置在角部36上以及空隙上。夹板39有利地进一步防止了由于施加拉伸力对边缘造成损害，所述拉伸力通过沿X方向的粗箭头表示。此外，超出图2中夹板29的作用，夹板39避免了对置的边缘区域38的弯曲。因此可以在单向的拉伸器中应用图3中的边缘加强部，从而最小化横向收缩。

如图3所示的边缘加强部也可以有利地应用在双向的拉伸器中。

夹板39由阳极氧化处理的铝组成。厚度和外形尺寸取决于所采用的腔室设计。在所选的实施例中，夹板39的材料厚度通常为0.5－1.0mm。按照弹性体腔室的外形尺寸进行成型，在夹板厚度或者说高度为5mm时，夹板的嵌入深度通常为4.5mm。

图2和图3中的夹板特别有利地加强了传递到较薄的弹性体底部上的伸长。它们形状锁合连接地布置在弹性体中，并且由此避免了沿拉伸方向（粗箭头）布置的边缘区域24，34的弯曲。

其它实施例

其它实施例涉及到如在图2和图3中所示的测量腔室。这些实施例在没有侧壁28，38的情况下制造并使用在细胞拉伸器中。在弹性体腔室的底部自由悬挂（没有边缘加强部28，38）时，可以实现最大的横向收缩。

Claims (16)

1.用于检验细胞的装置，其具有弹性体（1），所述弹性体具有布置在内部的底部（2），所述底部具有规则的微型结构（3）用于容纳细胞；所述弹性体还具有与底部相比更厚的边缘区域（4，8），所述边缘区域具有至少一个引导穿过弹性体的空隙（7）用于与细胞拉伸系统固定，

其特征在于，

所述装置具有用于通过识别作为用于在细胞上出现的伸长的测量参量的微型结构（3）来对所述底部（2）的变形过程进行分析的机构。

2.按权利要求1所述的装置，

其特征在于，

所述弹性体的平行于拉伸方向的边缘比其余边缘区域更小地挠曲。

3.按权利要求1和2中任一项所述的装置，

其特征在于所述弹性体的矩形的槽形形状。

4.按权利要求3所述的装置，

其特征在于，

所述弹性体具有带有经过倒圆的角部（5，6）的边缘区域，在所述角部中布置有空隙（7）。

5.按权利要求3所述的装置，

其特征在于，

所述弹性体具有一种形状，其中相互对置的边缘区域（4，4；8，8）具有相同的壁厚，其中不相互对置的边缘区域（4，8）具有不同的壁厚，并且其中，壁高是恒定的。

6.按权利要求5所述的装置，

其特征在于，

所述弹性体的边缘区域在区域中本身断开，或者完全空出。

7.按权利要求1和2中任一项所述的装置，

其特征在于，

所述弹性体的边缘区域的角部（6）壁厚大于其余边缘区域（4，8）中的壁厚。

8.按权利要求1和2中任一项所述的装置，

其特征在于，

所述弹性体的边缘区域部分地利用不含有弹性体的材料进行加强。

9.按权利要求8所述的装置，

其特征在于夹板类型的、与弹性体形状锁合连接的加强部（29，39）。

10.用于实施对粘附于弹性体（1）的底部（2）上的细胞进行的拉伸实验的方法，其中所述底部具有规则的微型结构（3）用于容纳细胞，并且其中所述弹性体（1）具有与底部（2）相比更厚的边缘区域（4，8），所述边缘区域具有至少一个引导穿过弹性体的空隙（7）用于与细胞拉伸系统固定，

其特征在于，

包括如下步骤：

识别作为用于在细胞上的出现的伸长的测量参量的微型结构（3）；

通过对微型结构（3）的所述识别来分析所述底部（2）的变形过程。

11.按权利要求10所述的方法，

其特征在于，

由所述底部（2）的变形过程对取决于通过细胞拉伸系统施加的伸长的细胞的重新对齐和/或弹性体的横向收缩进行分析。

12.按权利要求11所述的方法，

其中所述弹性体的横向收缩通过弹性体腔室的边缘厚度的变化而改变。

13.按权利要求11和12中任一项所述的方法，

其特征在于，

所述弹性体的边缘区域沿细胞拉伸系统的拉伸方向利用不含有弹性体的材料进行加强。

14.按权利要求10至12中任一项所述的方法，

其特征在于，

所述弹性体（1）沿一个方向拉伸，沿所述方向所述弹性体（1）的边缘（4，8）比其余边缘区域更小地挠曲。

15.按权利要求10至12中任一项所述的方法，

其特征在于，

所述弹性体（1）沿一个方向拉伸，沿所述方向所述弹性体（1）的边缘区域本身断开或者完全空出。

16.用于制造按上述权利要求1至9中任一项所述装置的方法，

其中在所述弹性体的交叉交联过程中制造空隙。