DE10145823B4 - Verfahren zur Auswertung intensitätsschwacher, zeitaufgelöster Fluoreszenzbilder - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Auswertung intensitätsschwacher, zeitaufgelöster Fluoreszenzbilder, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der örtlichen Verteilung der Fluorophore eine Approximation des intensitätsschwachen zeitaufgelösten Fluoreszenzsignals durch eine multiexponentielle Abklingfunktion (1)erfolgt, in der die Abklingzeitkonstanten τfest sind, B der Untergrund des Fluoreszenzsignals ist und die präexponentiellen Faktoren aan jedem Ort des zeitaufgelösten Fluoreszenzbildes berechnet werden, und dass daraus die relativen Anteile einzelner Fluorophore an der Gesamtfluoreszenz Fjeweils als Produkt aus präexponentiellem Faktor aund Abklingzeitkonstante τeines Fluorophors Fdividiert durch die Summe aller Produkte aus präexponentiellen Faktoren ai und Abklingzeiten τnach der Beziehung (2)berechnet werden, wobei die verwendeten Abklingzeitkonstanten τberechnet werden, nämlich indem das gesamte Fluoreszenzbild oder zumindest jeweils ein Bereich dessen mit gleichem bzw. ähnlichem Abklingzeitverhalten zu einem Gesamtfluoreszenzsignal (3)über die Koordinaten x, y des detektierten Fluoreszenzbild-Bereiches zusammengefasst wird und eine Approximation dieses Gesamtfluoreszenzsignals F(t) durch die multiexponentielle Beziehung (4)erfolgt, in welcher Bden Untergrund für das Gesamtfluoreszenzsignal F(t) darstellt und die präexponentiellen Faktoren afür die Berechnung der Abklingzeitkonstanten τohne Relevanz sind.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auswertung intensitätsschwacher, zeitaufgelöster Fluoreszenzbilder nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.
• Aus der US 5,828,452 A ist es bekannt, Fluoreszenz zu nutzen, um Flüssigkeiten, nämlich insbesondere Treibstoffe, zu detektieren.
  Es ist bekannt, zur Analyse von biologischem Gewebe, insbesondere zur Bewertung des Stoffwechselzustandes von Zellen, die Autofluoreszenz des biologischen Gewebes auszunutzen. Dazu ist eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Fluorophoren sowie die Bestimmung der örtlichen Verteilung der Fluorophore im Gewebe erforderlich.
  Eine selektive Anregung der Fluorophore ist für Untersuchungen des Augenhintergrundes im Allgemeinen nicht möglich, da die Transmission der Okularmedien keine Anregung des Augenhintergrundes im Bereich kürzer als 400 nm zulässt, in dem sich die Anregungsspektren der zu erwartenden bekannten Fluorophore deutlich unterscheiden. Neben Anregungs- und Fluoreszenzspektren sind die Fluoreszenzabklingzeiten Merkmale zur Charakterisierung von Fluorophoren.
  In der Offenlegungsschrift DE 199 20 158 A1 „Verfahren und Anordnung zur Bestimmung von Fluorophoren an Objekten, insbesondere am lebenden Augenhintergrund“ wurde gezeigt, wie eine 2-dimensionale Messung der zeitaufgelösten Autofluoreszenz am lebenden Augenhintergrund realisierbar ist. Bedingt durch die maximal zulässige Exposition des Auges entsprechend American National Standard for Safe Use of Lasers ANSI Z 136.1-2000, den geringen Quantenwirkungsgrad der inneren Fluorophore und durch die begrenzte Fixationsfähigkeit des Auges sind allerdings nur wenige hundert Photonen detektierbar, aus denen das zeitabhängige Verhalten der Autofluoreszenz nach Pulsanregung zu bestimmen ist. Wie von Köllner gezeigt (Köllner M, Wolfrum J: „How many photons are necessary for fluorescence - lifetime measurements?“, Chemical Physics Letters, 1992, 200), kann aus diesen Photonenzahlen nur ein monoexponentieller Abfall der Fluoreszenz mit akzeptablem Fehler bestimmt werden. Obwohl die Bestimmung von Bereichen mit unterschiedlichem Verhalten der dynamischen Autofluoreszenz aus extrem schwachen Signalen einen wesentlichen Fortschritt darstellt, besteht für diagnostische
• Zwecke das entscheidende Interesse an einer Unterscheidung und Darstellung der 2-dimensionalen Verteilung der Fluorophore.
• Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zu Bestimmung der 2-dimensionalen Verteilung verschiedener Fluorophore auch für den Fall extrem schwacher Signale anzugeben.
• Erfmdungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass zur Bestimmung der örtlichen Verteilung der Fluorophore eine Approximation des intensitätsschwachen zeitaufgelösten Fluoreszenzsignals durch eine multiexponentielle Abklingfunktion $$F_{x,y}\left(t\right)={\displaystyle \sum _i{a}_i\cdot e^{-\frac{t}{{\tau }_i}}+B}$$

  

  erfolgt, in der die Abklingzeitkonstanten τ₁ fest sind, B der Untergrund des Fluoreszenzsignals ist sowie die präexponentiellen Faktoren α, an jedem Ort des zeitaufgelösten Fluoreszenzbildes berechnet werden und dass daraus die relativen Anteile einzelner Fluorophore an der Gesamtfluoreszenz F_G jeweils als Produkt aus präexponentiellem Faktor α, und Abklingzeitkonstante τ_i eines Fluorophors F₁ dividiert durch die Summe aller Produkte aus präexponentiellen Faktoren α, und Abklingzeiten τ₁ nach der Beziehung $$\frac{F_1}{F_G}=\frac{a_1\cdot {\tau }_1}{{\displaystyle \sum _i{a}_i\cdot {\tau }_i}}$$

  

  berechnet werden.
• Im Allgemeinen sind die in einem Gewebe messtechnisch nachweisbaren Fluorophore sowie deren Abklingzeiten nicht bekannt. Besteht allerdings die Vermutung, welche Fluorophore im Gewebe enthalten sein könnten, so ist es möglich, unter Verwendung der Fluoreszenzabklingzeiten aus der Literatur für jeden Ort im Fluoreszenzbild die vorgenannte multiexponentielle Approximation mit konstanten Fluoreszenzabklingzeiten vorzunehmen.
• Anderenfalls werden die Abklingzeitkonstanten τ_i berechnet, beispielsweise indem das gesamte Fluoreszenzbild oder zumindest jeweils ein Bereich dessen mit gleichem bzw. ähnlichem Abklingzeitverhalten zu einem Gesamtfluoreszenzsignal $$F_G\left(t\right)={\displaystyle \sum _{x,y}{F}_{x,y}\left(t\right)}$$

  

  über die Koordinaten x, y des detektierten Fluoreszenzbild-Bereiches zusammengefasst wird und eine Approximation dieses Gesamtfluoreszenzsignals F_G (t) durch die multiexponentiale Beziehung $$F_G\left(t\right)={\displaystyle \sum _i{a}_i\cdot e^{-\frac{t}{{\tau }_i}}+B_G}$$

  

  erfolgt, in welcher B_G den Untergrund für das Gesamtfluoreszenzsignal F_G(t) darstellt und die präexponentiellen Faktoren α, für die Berechnung der Abklingzeitkonstanten τ_i ohne Relevanz sind. Wesentlich ist für dieses Vorgehen, dass die Abklingzeitkonstanten der vorhandenen Fluorophore auch in größeren Bildbereichen gleich bleiben und Unterschiede in der örtlichen Verteilung der Fluorophore durch Veränderungen der präexponentiellen Faktoren bewirkt werden.
• Um Fluoreszenzbild-Bereiche mit jeweils gleichem bzw. ähnlichem Abklingzeitverhalten zu dem besagten Gesamtfluoreszenzsignal F_G(t) zusammenzufassen, werden diese durch eine an sich bekannte monoexponentielle Approximation des örtlich aufgelösten zeitabhängigen Verhaltens der Fluoreszenz bestimmt.
  Um absolute Werte für die örtliche Verteilung von Fluorophoren zu erhalten, sind die Ausleuchtung des detektierten Fluoreszenzbildes und der Einfluss von absorbierenden Substanzen zu berücksichtigen. Eine vorteilhafte Lösung besteht darin, dass das Fluoreszenzbild oder die Bilder der relativen Verteilung der Fluorophore durch ein simultan gemessenes Reflexionsbild dividiert werden.
• Die vorgeschlagene Lösung zur Bestimmung der 2-dimensionalen Verteilung von Fluorophoren ist nicht auf die Anwendung am Hintergrund des lebenden Auges beschränkt. Sie kann für alle Bestimmungen der örtlichen Verteilung von Fluorophoren eingesetzt werden, bei denen die Auswertung von schwachen Fluoreszenzsignalen zu keinem hinreichenden Ergebnis führt.
• Die vorteilhafte Anwendung der Erfindung soll an einem Ausführungsbeispiel beschrieben werden. Die zeitaufgelöste Autofluoreszenz des lebenden menschlichen Augenhintergrundes wird mit Hilfe der in der DE 199 20 158 A1 beschriebenen Anordnung gemessen. Auf Grund der Begrenzung durch die maximal zulässige Exposition und die Fixationsunruhe des Augenhintergrundes beträgt die detektierte Photonenzahl als Summe über alle Zeitkanäle pro Pixel nur wenige hundert Photonen. Die zeitaufgelöste Autofluoreszenz wird in einem Feld von 20° bei einer örtlichen Auflösung von 50 × 50 µm² detektiert. Wird das Abklingzeitverhalten der Fluoreszenz auf an sich bekannte Weise monoexponentiell approximiert, so können Bereiche gleicher oder ähnlicher Abklingzeit bestimmt werden. Eine detailliertere Unterscheidung der örtlichen Verteilung verschiedener Fluorophore und die Bestimmung von deren am Augenhintergrund wirksamen Konzentration-Schichtdicken-Produktes erfordert die Bestimmung multiexponentieller Abklingzeitkonstanten und der zugehörigen präexponentiellen Faktoren. Eine höhere Photonenzahl ist Voraussetzung für die Anwendbarkeit einer mulitexponentiellen Approximation zur Bestimmung mehrerer Zeitkonstanten.
  Wesentlich ist, dass die Abklingzeitkonstanten der vorhandenen Fluorophore gleich bleiben und Unterschiede in der örtlichen Verteilung der Fluorophore durch Veränderungen der präexponentiellen Faktoren bewirkt werden.
  Um eine möglichst hohe Zahl von Photonen zu erreichen, wird in einem 1. Schritt das zeitaufgelöste Fluoreszenzsignal für das gesamte Fluoreszenzbild, mindestens aber für einen Bildbereich zu einem Gesamtfluoreszenzsignal F_G(t) mit $$F_G\left(t\right)={\displaystyle \sum _{x,y}{F}_{x,y}\left(t\right)}$$

  

  über die Koordinaten x, y des detektierten Bildes der zeitaufgelösten Autofluoreszenz zusammengefasst. Vorteilhaft ist dabei, wenn Bereiche mit ähnlichem Abklingzeitverhalten zuvor in einer an sich bekannten ortsaufgelösten monoexponentiellen Approximation der zeitaufgelösten Autofluoreszenz erkannt werden.
  Das Gesamtfluoreszenzsignal F_G(t) enthält in der Summe aller Zeitkanäle ausreichend viele Photonen, so dass in einem 2. Schritt eine multiexponentielle Approximation (Fit) zur Bestimmung der Abklingzeiten ausgeführt wird: $$F_G\left(t\right)={\displaystyle \sum _i{a}_i\cdot e^{-\frac{t}{{\tau }_i}}+B_G.}$$

  
• Die präexponentiellen Faktoren α, sind bei dieser Rechnung ohne Bedeutung. B_G ist der Untergrund für das Gesamtfluoreszenzsignal F_G(t). Werden beispielsweise bereits 10 x 10 Pixel zusammengefasst, welche jeweils ca. 600 Photonen als Summe in allen Zeitkanälen enthalten, so entsteht eine Messkurve aus 60.000 Photonen, für die eine multiexponentielle Approximation des Abklingverhaltens Parameter mit vertretbarem Fehler liefert. Detektierte Zeitkonstanten sind beispielsweise 400 ps, 1,2 ns und 3 ns.
• In einem 3. Schritt wird das ortsaufgelöste zeitabhängige Fluoreszenzverhalten durch einen multiexponentiellen Fit approximiert, wobei die Abklingzeitkonstanten aus Schritt 2 übernommen werden und unverändert bleiben: $$F_{x,y}\left(t\right)={\displaystyle \sum _i{a}_i}\cdot e^{-\frac{t}{{\tau }_i}}+B$$

  

  mit τ_i = konstant und B als der Untergrund des ortsaufgelösten Fluoreszenzsignals.
• Ergebnis dieser Rechnung ist die Bestimmung der präexponentiellen Faktoren α, an jedem Ort des auszuwertenden Bildes der zeitaufgelösten Autofluoreszenz.
• In einem 4. Schritt werden die relativen Anteile der einzelnen Fluorophore berechnet und als Bild des untersuchten Augenhintergrundes dargestellt Für den Fall, dass der Abstand zwischen zwei Anregungspulsen viel größer als die Zeitkonstanten der Fluoreszenz ist, entspricht der relative Anteil eines Fluorophors F₁ an der Gesamtfluoreszenz F_G dem Ausdruck $$\frac{F_1}{F_G}=\frac{a_1\cdot {\tau }_1}{{\displaystyle \sum _i{a}_i\cdot {\tau }_i}}$$

  
• Dabei sind τ₁ die in Schritt 2 bestimmten Zeitkonstanten und a_i die im Schritt 3 bestimmten präexponentiellen Faktoren.
  Um absolute Werte für die örtliche Verteilung von Fluorophoren zu erhalten, sind die Ausleuchtung des detektierten Bildes und der Einfluss von absorbierenden Substanzen zu berücksichtigen. Eine vorteilhafte Lösung besteht darin, dass das Fluoreszenzbild oder die Bilder der relativen Verteilung der Fluorophore durch ein simultan gemessenes Reflexionsbild dividiert werden.

Claims (2)

1. Verfahren zur Auswertung intensitätsschwacher, zeitaufgelöster Fluoreszenzbilder, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der örtlichen Verteilung der Fluorophore eine Approximation des intensitätsschwachen zeitaufgelösten Fluoreszenzsignals durch eine multiexponentielle Abklingfunktion (1) $$F_{x,y}\left(t\right)={\displaystyle \sum _i{a}_i\cdot e^{-\frac{t}{{\tau }_i}}+B}$$

   

   erfolgt, in der die Abklingzeitkonstanten τ_i fest sind, B der Untergrund des Fluoreszenzsignals ist und die präexponentiellen Faktoren a_i an jedem Ort des zeitaufgelösten Fluoreszenzbildes berechnet werden, und dass daraus die relativen Anteile einzelner Fluorophore an der Gesamtfluoreszenz F_G jeweils als Produkt aus präexponentiellem Faktor a_i und Abklingzeitkonstante τ_i eines Fluorophors F₁ dividiert durch die Summe aller Produkte aus präexponentiellen Faktoren ai und Abklingzeiten τ_i nach der Beziehung (2) $$\frac{F_1}{F_G}=\frac{a_1\cdot {\tau }_1}{{\displaystyle \sum _i{a}_i\cdot {\tau }_i}}$$

   

   berechnet werden, wobei die verwendeten Abklingzeitkonstanten τ_i berechnet werden, nämlich indem das gesamte Fluoreszenzbild oder zumindest jeweils ein Bereich dessen mit gleichem bzw. ähnlichem Abklingzeitverhalten zu einem Gesamtfluoreszenzsignal (3) $$F_G\left(t\right)={\displaystyle \sum _{x,y}{F}_{x,y}\left(t\right)}$$

   

   über die Koordinaten x, y des detektierten Fluoreszenzbild-Bereiches zusammengefasst wird und eine Approximation dieses Gesamtfluoreszenzsignals F_G(t) durch die multiexponentielle Beziehung (4) $$F_G\left(t\right)={\displaystyle \sum _i{a}_i\cdot e^{-\frac{t}{{\tau }_i}}+B_G}$$

   

   erfolgt, in welcher B_G den Untergrund für das Gesamtfluoreszenzsignal F_G(t) darstellt und die präexponentiellen Faktoren a_i für die Berechnung der Abklingzeitkonstanten τ_i ohne Relevanz sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bereiche gleichen oder ähnlichen Abklingzeitverhaltens durch eine an sich bekannte monoexponentielle Approximation des örtlich aufgelösten zeitabhängigen Verhaltens der Fluoreszenz bestimmt werden.