DE19722790B4

DE19722790B4 - Anordnung und Verfahren zur zeitaufgelösten Messung nach dem Scannerprinzip

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Publication number: DE19722790B4
Application number: DE19722790A
Authority: DE
Inventors: Dietrich Dr.Ing.habil. Schweitzer; Martin Dipl.-Phys. Hammer; Karl-Heinz Dr.Rer.Nat. Donnerhacke; Theo Prof. Dipl.-Phys. Lasser; Wolfgang Prof.Dr.rer.nat.habil. Triebel
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH; Institut fuer Physikalische Hochtechnologie eV
Current assignee: Leibniz Institut fuer Photonische Technologien eV; Jenoptik AG
Priority date: 1997-05-30
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2017-05-31
Also published as: DE19722790A1; US5984474A

Abstract

Anordnung zur mindestens zweidimensional ortsaufgelösten Erfassung von Zeitvorgängen an biologischen Objekten, wobei zwischen einem konfokalen Beleuchtungsstrahl und dem Objekt eine Relativbewegung erzeugt wird und neben mindestens einem konfokal angeordneten Detektionselement zur konfokalen Erfassung des von Objektpunkten stammenden Lichtes mindestens je ein weiteres Detektionselement zur Erfassung und Auswertung von Objektlicht jeweils zeitlich vor und nach der konfokalen Erfassung vorgesehen ist.

Description

Zur Untersuchung des Augenhintergrundes werden Laser Scanner Ophthalmoskope eingesetzt, die gegenüber bekannten Netzhautkameras für photometrische Messungen Vorteile aufweisen:

– die unsymmetrische Teilung der Aperturblende in der Augenpupille zu Gunsten der Meßapertur
– die hohe kurzzeitig zulässige Bestrahlungsstärke auf einem kleinen Untersuchungsort
– die prinzipielle Möglichkeit zur Messung in Richtung der optischen Achse (Laser Scanner Tomografie).

Bekannt sind Laser Scanner Ophthalmoskope, mit denen der Augenhintergrund punktweise abgescannt wird, wobei ein Detektor das Licht registriert, das von jedem Punkt des Augenhintergrundes reflektiert wird. Nach einer synchronen Zuordnung der Bildpunkte zu einer Zeile und weiterhin der Zeilen zu einem Bilde entsteht ein Bild der Augenhintergrundes. Dieses Bild kann ein Reflexionsbild- oder nach Einschalten eines Sperrfilters- ein Fluoreszenzbild sein. Das so gewonnene Bild kann nach Analog/Digitalwandlung der Pixelsignale digital gespeichert werden und steht anschließend zur weiteren Bildverarbeitung zur Verfügung.

Ein derartiges Ophthalmoskop ist beispielsweise in WO 88/03396, DE 3638226 A1 beschrieben.

Hier sind zur Erfassung und Detektion der flächenhaften Intensitätsverteilung des reflektierten Lichtes aus unterschiedlichen Ebenen und seines Polarisationszustandes mehrere, vorzugsweise kreissektorförmig angeordnete Einzeldetektoren vorgesehen. DE 3818084 A1 beschreibt ebenfalls eine Augenhintergrundkamera mit Laserstrahlabtastung, in der zur Scharfstellung des Bildes vom Augenhintergrund während der Fluoreszenzangiografie gleichzeitig mit dem Fluoreszenzbild ein Reflexionsbild gewonnen wird.

EP 307185 A2 betrifft eine Scaneinrichtung mit einem Detektorarray sowie einem anamorphotischen Element zur Erzeugung eines streifenförmigen Fokusbildes, das über die Retina geführt wird.

DE 3037983 C2 betrifft nicht die rasterförmige Erfassung des Augenhintergrundes. Ein Ausführungsbeispiel betrifft die Abtastung mittels eines sich in Abtastrichtung erstreckendes Diodenarray als Empfänger.

Es soll nur der gerade beleuchtete Probenpunkt auf einen bestehenden Empfänger abgebildet werden.

Das zeitliche Verhalten der Fluoreszenzstrahlung kann durch die Anwahl bestimmter Diodengruppen und einer Verzögerungszeit zwischen der Beleuchtung des Probenpunktes und dem Nachweis der Fluoreszenzstrahlung eingestellt werden.

Die Dioden werden im Takt der Abtastfrequenz ausgelesen.

Für die einzelnen Probenpunkte ergeben sich durch die Art der Abrasterung unterschiedliche Möglichkeiten, überhaupt Werte zu erfassen.

Aufgabe der Erfindung ist die zweidimensionale Bilderfassung und Messung von Zeitvorgängen, vorzugsweise am lebenden menschlichen Augenhintergrund. Die Aufgabe wird durch die unabhängigen Ansprüche gelöst.

Bevorzugte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche. Insbesondere können mittels der Erfindung Abklingzeiten von Fluorophoren gemessen werden, so daß eine Unterscheidbarkeit verschiedener Fluorophore mit ähnlichen Fluoreszenzspektren, aber mit stark unterschiedlichen Fluoreszenzintensitäten möglich ist. Aus der Veränderung der Abklingzeit bekannter Fluorophore (Quenchen) kann auf die Eigenschaften des Umgebungsmediums geschlossen werden. Mit diesen Untersuchungen am lebenden Auge wird eine stoffwechselbezogene Funktionsdiagnostik prinzipiell möglich, bevor eine Erkrankung morphologische Veränderungen bewirkt, die dann im reflektierten Licht erkennbar sind.

Ein Vorteil der vorgeschlagenen Erfindung besteht darin, daß eine klinisch eingeführte Technik als Basis genutzt und durch deren Erweiterung ohne größeren Aufwand eine neue Qualität der Meßgrößen gewonnen wird.

Eine zeitaufgelöste Messung der Fluoreszenz einer Probe erfolgt ohne Verwendung von wellenlängenselektiven Elementen, durch Differenzbildung der Signale aus paarweise zugeordneten, vor – und nacheilenden Detektoren, wodurch der Einfluß von Reflexionslicht, Streulicht, statischem Fluoreszenzlicht eliminiert wird.

Die erfindungsgemäße Anordnung wird nachstehend anhand der schematischen Zeichnungen weiter erläutert. Es zeigen:
1 Ein Schema der Anordnung zur Messung von Zeitvorgängen am Augenhintergrund
2 Eine Schematische Darstellung der Überlagerung von zeitabhängigem Fluoreszenzlicht mit Reflexions-, Streu- und statischem Fluoreszenzlicht
3 Ein Blockschaltbild für die Bearbeitungsschritte zur Gewinnung der Fluoreszenzabklingzeit und deren 2-dimensionaler Darstellung am Augenhintergrund
4: Verschiedene Anordnungen der Detektoren aus mehreren Elementen mit v-voreilend, n-nacheilend

a) für kurze Fluoreszenzlebensdauern längs der Abtastrichtung in einer Zeile
b) für längere Fluoreszenzlebensdauern längs einer Spalte
c) für schnelle Abtastung des Gesamtbildes durch Parallelscannen einer Zeile und Abtasten der Fluoreszenzsignale in den Spalten einer Matrix

5a–c: Die Gewinnung von Informationen aus unterschiedlichen Gewebetiefen durch Messung unterschiedlicher Laufzeiten des Lichtes
5a: Detektion des Oberflächen- Reflexionslichtes durch konfokale Abtastung
5b: Detektion des Lichtes aus einer mittleren Zwischenschicht
5c: Detektion des Lichtes aus einer tief liegenden Zwischenschicht
In 1 sendet ein Laser 1 kontinuierlich oder gepulst einen Anregungsstrahl 2 über einen Strahlteiler 5 aus, der nach Ablenkung durch einen Polygonscanner 3 für die Abtastung in einer Zeile und durch einen Galvanometerscanner 4 für die Ablenkung der Zeilen in einem Bild nach Abbildung durch den Konkavspiegel 6 über eine Korrekturoptik 11 mit konstanter Geschwindigkeit über eine Probe 7, vorzugsweise den Augenhintergrund, geführt wird und diese kurzzeitig zur Fluoreszenz anregt, wobei die Anregung durch die während der Überstreichungszeit wirkende Strahlungsleistung oder durch einen kurzen Lichtimpuls während des Überstreichens erfolgen kann.
Bei einer konfokalen Abbildung wird ein Reflexionslicht und nach Filterung ein statisches Fluoreszenzlicht, ermittelt zum Zeitpunkt des Auftreffens des Anregungsstrahles 2, von einem beleuchteten Punkt des Augenhintergrundes durch einen Einzeldetektor 8 gemessen.
Erfindungsgemäß ist zusätzlich zum konfokal wirkenden Einzeldetektor 8 eine Mehrfachdetektoranordnung 9 angeordnet.
Diese Mehrfachdetektoranordnung 9 ist eine vorzugsweise lineare Anordnung, in der symmetrisch zu dem Konfokaldetektor 8 eine Folge von vorzugsweise gleichen Detektoren, auf beiden Seiten des Konfokaldetektors angeordnet ist.
Diese Mehrfachdetektoranordnung 9 ist vorzugsweise parallel zur durch einen Pfeil gekennzeichneten Abtastrichtung das Laserspots längs einer Zeile ausgerichtet (4a). Auch in diesem Falle registriert der konfokal angeordnete Detektor 8 das Reflexionslicht oder/und nach spektraler Filterung das statische Fluoreszenzlicht eines angeregten Ortes der Probe 7.
Wenn nun das Fluoreszenzlicht eine bestimmte Zeit weiter strahlt, ohne gleichzeitig angeregt zu werden, und der Anregungsstrahl sich infolge der konstanten Abtastgeschwindigkeit, in 2a dargestellt, in einer Zeit t1 um die Strecke x1 vom angeregten Ort der Probe 7 aus weiterbewegt hat, trifft das noch strahlende Fluoreszenzlicht des angeregten Ortes der Probe 7, das durch das Scansystem in bekannter Weise in die Detektorebene abgebildet wird, nicht mehr auf den Konfokaldetektor 8, sondern auf einen Detektor 10, der zum Konfokaldetektor 8 um die Strecke x1' verschoben ist.
Die für den Meßvorgang notwendige Strecke x1' ergibt sich aus der zu messenden verzögerten Abtastung der Fluoreszenzabklingzeit und der Scangeschwindigkeit.
Hat sich der Anregungsstrahl 2 in der Zeit t2 um die Strecke x2 vom angeregten Ort der Probe 7 aus weiterbewegt, so trifft das Fluoreszenzlicht, das zum Zeitpunkt t2 noch vom angeregten Ort der Probe 7 emittiert wird, auf einen Detektor 11, der um die Strecke x2' vom Konfokaldetektor 8 entfernt angeordnet ist.
Das Fluoreszenzlicht hat dabei das Abtastsystem in umgekehrter Richtung zum Anregungsstrahl durchlaufen.
Durch die erfindungsgemäße Anordnung erfolgt eine Transformation vom Zeitbereich in den Ortsbereich. Die Abtastzeit ti ergibt sich aus dem Abstand xi des i-ten Detektors vom Konfokaldetektor und der Scangeschwindigkeit, mit der die Probe 7 abgetastet wird.
Auf diese Weise wird das zeitabhängige Fluoreszenzlicht eines angeregten Ortes der Probe 7 in bestimmten Zeitabständen gemessen, so daß dessen Verlauf aus den durch die Messung gewonnenen Stützstellen berechnet werden kann.
In 2b ist beispielhaft das Abklingverhalten der Fluoreszenz eines Probenpunktes mit zwei der Erfassung durch Detektoren 10, 11 entsprechenden Zeiten t1, t2 dargestellt. Durch die beschriebene Beleuchtung des Augenhintergrundes mit einem Anregungsstrahl und die Abtastung des Reflexionslichtes sowie des statischen und zeitabhängigen Fluoreszenzlichtes, das im gleichen Ablenksystem wie für den Anregungsstrahl in bekannter Weise ein Descannen erfährt, mit der vorgeschlagenen Mehrfachdetektoranordnung, liegen für jeden angetasteten Bildpunkt die Informationen für das Abklingzeitverhalten der Fluoreszenz vor.
Der Anregungsstrahl tastet ein zweidimensionales Objekt ab. Der Konfokaldetektor liefert dabei das Reflexionsbild oder nach Filterung das Bild der statischen Fluoreszenz.
Jeder andere Detektor erzeugt ebenfalls ein vollständiges Bild.
Auf diese Weise liegen nach einer Objektabtastung neben dem Reflexionsbild oder dem Bild der statischen Fluoreszenz n weitere Bilder vor, die den Verzögerungszeiten t1 bis tn entsprechen.
Die aus den Messungen der Fluoreszenzintensität zu definierten Abtastzeiten berechneten Zeitkonstanten werden pixelweise 2-dimensional dargestellt und dienen so zur Charakterisierung von unterschiedlichen Substanzen oder von unterschiedlichen Zuständen.
Bei Verwendung von n Detektoren wird eine Fluoreszenzabklingkurve durch n zeitlich äquidistante Stützstellen vom Anregungszeitpunkt aus angetastet.
Durch Verschieben einzelner Detektoren oder der gesamten Detektoranordnung in der Bildebene senkrecht zur Strahlrichtung, parallel zur Abtastrichtung des Objektes und relativ zum Konfokalpixel, können unterschiedliche Bereiche aus der Abklingkurve untersucht werden.
Abklingkurven mit unterschiedlicher Zeitkonstante lassen sich durch Verändern des Detektorabstandes oder der Scangeschwindigkeit vermessen.
Die Abtastgeschwindigkeit des Laserstrahles, mit der das zu untersuchende Objekt längs einer Zeile mit der Mehrtachdetektoranordnung abgetastet wird, und der kleinste realisierbare Detektorabstand bestimmen den zeitlichen Abstand der Stützstellen für die Berechnung der kleinsten auflösbaren Abklingzeitkonstante des Fluoreszenzlichtes.
Ist die Mehrtachdetektionsanordnung, entsprechend 4b, längs einer Spalte senkrecht zur Abtastrichtung angeordnet, so bestimmt die Zeit zwischen der Abtastung benachbarter Zeilen den kleinsten zeitlichen Abstand zwischen den Stützstellen zur Berechnung der Abklingzeitkonstante.
Da beispielsweise bei X/Y – Scannern die Spaltenabtastgeschwindigkeit wesentlich langsamer ist als die Zeilenabtastgeschwindigkeit, lassen sich mit spaltenparalleler Anordnung der Mehrfachdetektoren wesentlich längere Abklingzeiten messen, als bei zeilenparalleler Anordnung der Mehrfachdetektoren.
Wird der Augenhintergrund mit einem Streifenscanverfahren, beispielsweise entsprechend EP 307185 A2 abgetastet, so ist die Mehrfachdetektoranordnung entsprechend 4c eine Matrix, die in Pfeilrichtung bewegt wird.
In diesem Falls wird das Konfokalelement durch eine Konfokalzeile ersetzt.
Jeder Detektor der Konfokalzeile registriert parallel das Reflexionslicht, das Streulicht und das statische Fluoreszenzlicht.
Die Detektorelemente zur Messung der Fluorezenzabklingzeit befinden sich in jeder Spalte der Matrix, jeweils der Konfokalzeile benachbart.
Die Verarbeitung der Signale der Spaltenelemente erfolgt in gleicher Weise wie bereits anhand 2 beschrieben.
Ein wesentlicher Vorteil dieser Anordnung besteht in der Möglichkeit der zweidimensionalen Bestimmung des Fluoreszenzabklingverhaltens kurzlebiger Fluorophore.
Die Synchronisation des Abtast- und Meßvorganges erfolgt durch einen Taktgenerator, der von der Polygonbewegung, das heißt, von der Scanbewegung in einer Zeile, gesteuert ist. Die Anzahl der Bildpunkte in eine Zeile wird gezählt und nach Erreichen der geforderten Bildpunkte in einer Zeile erfolgt ein Weiterschalten der Zeile über die Ansteuerung eines Galvanometerscanners. Ist die geforderte Zahl von Zeilen innerhalb eines Bildes erreicht, erfolgt der nächste Bildaufbau. Mit der erfindungsgemäßen Anordnung werden sowohl das Reflexionsbild, als auch Bilder des Augenhintergrundes detektiert, die das Fluoreszenzlicht nach definierten Zeiten ti in zweidimensionaler Darstellung liefern.
Die vom Augenhintergrund zu verschiedenen Zeiten nach der Anregung gemessene Fluoreszenz ist sehr gering. Ein Averagen zur Verbesserung des Signal/Rausch Verhältnisses ist notwendig.
Bei einem fest stehenden Objekt ist es vorteilhaft, die zu jeder Zeitverzögerung ti gehörenden Bilder vielfach aufzunehmen und zu mitteln.
Sind die Detektoren empfindlich genug, ist eine Messung der Fluoreszenzabklingzeit nach dem Prinzip des Einzelphotonenzählens möglich. In diesem Falle erfolgt bei Mehrfachabtastungen des Objektes eine Akkumulation der Photonen, die bei den Einzelabtastungen durch jeden Detektor registriert werden, der um den Ort xi gegenüber dem Konfokaldetektor entfernt angeordnet ist.
Unter den Bedingungen des lebenden Auges ist mit Augenbewegungen während und zwischen den Aufnahmen zu rechnen. Da eine feste Zuordnung zwischen dem Konfokaldetektor 8 und den Elementen der Mehrfachdetektoranordnung 9 besteht, ist eine aktive Bildlagenkorrektur der Fluoreszenzbilder ohne deutliche Strukturmerkmale innerhalb der Fluoreszenzbilder auf der Grundlage von Ankerpunkten im kontrastreichen Reflexionsbildes zweckmäßig und möglich.
Die Koeffizienten der Transformationspolynome zwischen einem Bezugsbild und den weiteren Bildern, die mit dem Bezugsbild zur Deckung gebracht werden müssen, werden für jede Messung aus dem Reflexionsbild bestimmt und für jeden Pixel eines zeitverzögerten Bildes angewandt.
Die Erfindung ist besonders vorteilhaft für die Bestimmung des 2-dimensionalen Fluoreszenzverhaltens schwach fluoreszierender und bewegter Objekte einsetzbar, da durch die Detektion des Reflexionsbildes oder des Bildes der statischen Fluoreszenz ein kontrastreiches Bezugsbild vorliegt, nach dem eine Bildlagenkorrektur auch in den zu den Verzögerungszeiten ti gehörenden Bildern ausgeführt werden kann.
Nach erfolgter Bildlagenkorrektur wird ein Averaging der Bilder vorgenommen, die die Fluoreszenzinformationen zu gleichen Abtastzeitpunkten enthalten, so daß trotz der stark verrauschten Einzelbilder bei einer festen Zeitverzögerung ein rauscharmes Bild für jede Verzögerungszeit ti berechnet werden kann.
Als Ergebnis des Averagens liegt ein Satz von pixelweise zugeordneten Bildern vor, die die Fluoreszenzintensität zu verschiedenen Abtastzeitpunkten repräsentieren.
Aus der Entflechtung des zeitabhängigen Verlaufes der Fluoreszenz an jedem Pixelort werden durch bekannte Verfahren der Modellanpassung die Art des exponentiellen Abfalls sowie die zugehörigen Zeitkonstanten bestimmt. Auf diese Weise ist eine 2-dimensionale Verteilung von Fluorophoren mit unterschiedlicher Fluoreszenzabklingzeit darstellbar, was eine Unterscheidbarkeit von Fluorophoren mit ähnlichem Fluoreszenzspektrum oder stark unterschiedlicher statischer Fluoreszenzintensität erst ermöglicht.
Sowohl Reflexionslicht als auch Fluoreszenzlicht fallen im allgemeinen nicht gerichtet, sondern partiell isotrop auf die Detektoren.
Um den Anteil des partiell isotrop auffallenden statischen Fluoreszenzlichtes und des Reflexionslichtes zu beseitigen, wird symmetrisch zum Konfokaldetektor und parallel zur Abtastrichtung zusätzlich zu der zur Bewegungsrichtung des Scanstrahles nacheilenden Detektoranordnung eine gleich gestaltete weitere Detektoranordnung angeordnet, durch die aber nur das partiell isotrop auffallende statische Fluoreszenzlicht, das diffuse Reflexionslicht und das Streulicht gemessen werden.
In 2c ist schematisch dargestellt, daß für den Fall, daß die beleuchtete Probe kein dynamisches Fluoreszenzverhalten zeigt, gleiche Anteile von Reflexions- und Streulicht sowie des statischen Fluoreszenzlichtes symmetrisch auf die voraus – und die nacheilenden Detektoren fallen.
Da diese Anteile das dynamische Fluoreszenzsignal überlagern, das nur von den nacheilenden Detektoren registriert wird, kann deren Störeinfluß durch paarweise Differenzbildung der Signale aus den symmetrisch angeordneten, vor – und nacheilenden Detektoren eliminiert werden.
Da die mit Bezug auf die Bewegungsrichtung des Anregungsstrahls vor – und nacheilenden Detektoranordnungen symmetrisch ausgeführt sind, mißt jeder voreilende Detektor Di_vor das gleiche partiell isotrop auffallende statische Fluoreszenzlicht und das Reflexionslicht, wie jeder nacheilende Detektor Di_nach.
Um das zeitabhängige Fluoreszenzlicht F_time aus dem gesamten Licht Li_nach des nacheilenden Detektors Di_nach zu bestimmen, wird von Li,nach = Li,vor + Ftime der Wert von Li_vor subtrahiert.
Durch Verwenden einer symmetrisch aufgebauten vor- und nacheilenden Detektoranordnung ist es überraschenderweise prinzipiell möglich, auf die verlustbehaftete Filterung zwischen Reflexions- und Fluoreszenzlicht zu verzichten, wenn ein Objekt vorliegt, in dem wegen der angenommenen symmetrischen Streucharakteristik des reflektierten Lichtes keine reguläre Reflexion an unregelmäßigen Strukturen auftritt wodurch der Wirkungsgrad der Anordnung erhöht wird.
Durch den Einsatz der symmetrisch vor- und nacheilenden Detektoranordnung gelingt es ebenfalls, den zeitabhängigen Einfluß der Meßanordnung zu erfassen und zu beseitigen. Beim Einsatz der symmetrisch vor – und nacheilenden Detektoranordnung wird davon ausgegangen, daß die Fluoreszenzanregung mit kurzwelligem Licht erfolgt, für das die Eindringtiefe klein ist. Da weiterhin die Scangeschwindigkeit sehr klein gegenüber der Lichtgeschwindigkeit ist, kann angenommen werden, daß die partiell isotrop gestreuten oder statisch fluoreszierenden Lichtanteile gleichzeitig auf die vor- und rücklaufenden Detektorabschnitte treffen.
Aus diesem Grunde wird von jedem um die Zeit ti gegenüber dem Konfokaldetektor nacheilenden Bild pixelzugeordnet das um ti gegenüber dem Konfokaldetektor voreilende Bild subtrahiert. Eine Bildlagenkorrektur nach dem Reflexionsbild zum Ausgleich von Augenbewegungen und ein Averagen der Fluoreszenzbilder, die bei gleicher Zeit ti abgetastet wurden, erfolgt zweckmäßigerweise auf der Grundlage der Differenzbilder.
3 zeigt schematisch das erfindungsgemäße Verfahren, wobei eine Ansteuereinheit AE mit den Taktgeneratoren TG, dem Frame-Grabber FG für den Konfokaldetektor sowie den vor – und nachgeordneten Detektoren verbunden ist.
Der Konfokaldetektor liefert im Takt der Abtastung eine Folge von Konfokalbildern. Die Ausgänge der voreilenden und nacheilenden Detektoren sind mit Signalverarbeitungsstufen SV verbunden, wo die eingehenden Signale verstärkt und miteinander verknüpft werden.
Das serielle Differenzsignal wird aus der Differenz der mit Meßzeiten ti nacheilenden und der mit ti' voreilenden Detektoren gewonnen und dient zum Aufbau eines Differenzbildes mittels eines Frame-Grabbers FG für jede Verzögerungszeit, aus dem der Einfluß von Reflexionslicht, Streulicht und statischem Fluoreszenzlicht eliminiert ist.
Um nun die Differenzsignale der Objektpunkte mit dem aufgenommenen Konfokalbild in Deckung zu bringen, wird, da die Differenzbildfolge keine Konturen zum Bildabgleich aufweist, über die Konfokalbildfolge und deren aufgenommener Strukturen mittels einer entsprechenden Transformationsvorschrift für jeden Bildpunkt eine Bildlagenkorrektur durchgeführt, in deren Ergebnis die aufgenommenen Bilder deckungsgleich übereinander liegen (aktive Bildlagenkorrektur), bzw. die Transformationsvorschrift des Konfokalabgleichs auf die Pixel der Differenzbilder übertragen (passive Bildlagenkorrektur).
Zur Verbesserung des Signal/Rauschverhältnisses ist ein Averagen mehrerer Differenzbilder gleicher Abtastzeiten vorteilhaft.
Infolge der Augenbewegungen ist damit zu rechnen, daß bei wiederholter Abtastung des Augenhintergrundes keine deckungsgleichen Bilder gewonnen werden und daß zwischen den zu ermittelnden Bildern nichtlineare Verzerrungen auszugleichen sind.
Die Fluoreszenzsignale zeigen aber in der Regel keine ausreichend kontrastreichen Strukturen, die als Ankerpunkte für die Berechnung von Koeffizienten der Transformationspolynome zur Zuordnung gleicher Bildpunkte geeignet sind.
Da gleichzeitig mit den Fluoreszenzbildern auch das Reflexionsbild aus dem Signal des Konfokaldetektors gewonnen wird, kann dennoch aus einer Ortskorrektur der Reflexionsbilder mit dem gleichen Korrekturalgorithmus eine Korrektur für die Differenzbilder gleicher Abtastzeiten vorgenommen werden.
In einer aktiven Bildlagenkorrektur werden gleiche Strukturen des Augenhintergrundes aus nacheinander aufgenommenen Reflexionsbildern zur Deckung gebracht.
Die für jedes abzugleichende Reflexionsbild berechneten Transformationen werden in einer passiven Bildlagenkorrektur pixelweise auf die zugeordneten Fluoreszenz – Differenzbilder übertragen.
Anschließend wird für jede Abtastzeit ti ein Mittelwertbild berechnet.
Nach diesen Operationen liegt, jedem Bildpunkt zugeordnet, eine Folge von Intensitätswerten zu den Zeitpunkten ti vor, die die Stützstellen für die Berechnung des Fluoreszenzabklingverhaltens an jedem Bildpunkt bildet.
Da die Fluoreszenzabklingzeiten unabhängig von der Konzentration des Fluorophores sind, können in besonders vorteilhafter Weise zweidimensionale Verteilungen von Fluorophoren mit unterschiedlichem Abklingverhalten dargestellt werden, sogar wenn das Fluoreszenzlicht verschiedener Fluorophore im gleichen Spektralbereich liegt oder wenn sehr starke Intensitätsunterschiede zwischen den statischen Fluoreszenzsignalen bestehen.
Neben der Anwendung in der Ophthalmologie kann die erfindungsgemäße Anordnung auch zur Untersuchung der Lichtbeeinflussung in unterschiedlichen Tiefen von lichtstreuendem Gewebe verwendet werden.
Licht, das in oberflächennahen Schichten reflektiert wird, wird von Detektoren registriert, die nahe am Konfokaldetektor angeordnet sind.
Licht, das tiefer in das Gewebe eindringt, hat dagegen gegenüber an der Oberfläche reflektiertem Licht einen Laufzeitunterschied, der von nacheilenden Detektoren registriert wird, die weiter vom Konfokaldetektor entfernt liegen.
Hier ist es nicht erforderlich, daß die Probe in unterschiedlichen Schichttiefen fluoresziert. Es reicht bereits aus, wenn die Probe in unterschiedlichen tiefen Schichten örtliche Unterschiede im zweidimensionalen Reflexions-, Absorptions- oder Streuverhalten aufweist.
In 5 ist das geschilderte Prinzip für die Messung von Lichtanteilen aus unterschiedlichen Gewebetiefen dargestellt.
5a zeigt, wie der Laserstrahl 2 den Probenpunkt 7 beleuchtet und das an der Oberfläche reflektierte Licht durch den Konfokaldetektor 8 registriert wird.
In 5b ist der Laserstrahl in t1 um x1 auf der Probe weiterbewegt.
Am Detektor 10 wird nunmehr von einer Zwischenschicht Z1 stammendes Licht registriert.
In 5c ist dargestellt, daß der Laserstrahl 2 nach einer Zeit t2 einen um x2 vom Probenpunkt 7 entfernten Ort beleuchtet.
Das noch vom Probenpunkt 7 stammende Licht auf dem Detektorelement 11 stammt von einer tiefer als Z1 liegenden Zwischenschicht Z2.

Claims

Anordnung zur mindestens zweidimensional ortsaufgelösten Erfassung von Zeitvorgängen an biologischen Objekten, wobei zwischen einem konfokalen Beleuchtungsstrahl und dem Objekt eine Relativbewegung erzeugt wird und neben mindestens einem konfokal angeordneten Detektionselement zur konfokalen Erfassung des von Objektpunkten stammenden Lichtes mindestens je ein weiteres Detektionselement zur Erfassung und Auswertung von Objektlicht jeweils zeitlich vor und nach der konfokalen Erfassung vorgesehen ist.
Verfahren zur Untersuchung von lichtstreuenden Objekten, wobei zwischen einem konfokalen Beleuchtungsstrahl und dem Objekt eine Relativbewegung erzeugt wird und neben mindestens einem konfokal angeordneten Detektionselement zur konfokalen Erfassung des von Objektpunkten stammenden Lichtes durch mindestens je ein weiteres Detektionselement zeitlich vor und nach der konfokalen Erfassung Objektlicht erfaßt und ausgewertet wird.
Laser – Scanning – Ophthalmoskop mit einer Anordnung nach Anspruch 1.
Anordnung nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Folge von Detektoren so angeordnet ist, daß vorlaufend und nachfolgend zur Scanrichtung zusätzlich zum konfokalen Detektorelement eine Folge weiterer Detektorelemente vorliegt.
Anordnung nach Anspruch 1 oder 3, wobei die Detektoren zeilen – und/oder spaltenförmig angeordnet sind.
Anordnung nach Anspruch 1, 3 oder 5, wobei die Folge von Detektoren zur Ermittlung von längeren Abklingzeiten senkrecht zur Richtung der Relativbewegung angeordnet ist.
Anordnung nach Anspruch 1, 3, 4 oder 5, wobei mindestens eine Zeile von Konfokaldetektoren eine Relativbewegung zum Objekt ausführt.
Anordnung nach mindestens einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 7, wobei Konfokaldetektor und weitere Detektoren Bestandteil einer Matrix von Detektoren sind, wobei Teile der Matrix zur Erfassung von Zeitvorgängen oder tiefenaufgelösten Erfassung des Objektes als Detektorengruppe geschaltet sind.
Anordnung nach einem der Ansprüche 7 oder 8, mit einer beliebigen programmierten Relativbewegung zwischen Konfokaldetektor und Objekt sowie Ansteuerung von jeweils in der Nähe des Konfokaldetektors befindlichen Detektorelementen einer Detektormatrix zur Messung zeitlich zumindest nach der Konfokaldetektion.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei zumindest für einzelne Objektpunkte zeitlich vor und nach einer ersten Detektion von Objektlicht für detektierte gleiche Objektpunkte oder Bereiche mindestes eine zweite Erfassung von Objektlicht erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die mindestens zweite Detektion erfolgt, bevor derselbe Objektpunkt erneut vom Laserstrahl erreicht wird.
Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 2 auf die Erfassung von Fluoreszenzbildern.
Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 2 auf die tiefenaufgelöste Erfassung von Objektstrukturen, insbesondere von biologischen Geweben.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Anregungsstrahl das zu untersuchende Objekt mit hoher Geschwindigkeit überstreicht (abscannt) und dabei zeitlich nacheinander jeden Objektpunkt zur Rückstrahlung anregt, wobei die Messung des Lichtes, das vom Objekt zurückgestrahlt wird, durch mehrere Detektoren erfolgt, und mindestens ein bezüglich der Scanrichtung zeitlich nacheilendes Detektorelement die Rückstrahlung dieses Ortes nach einer Zeit t = n·xi/v, v : Scangeschwindigkeit, xi; i = 0...n Abstand der Detektorelements, mißt, wobei aus den Signalen der nacheilenden Detektorelemente ein um ti zeitverzögertes Bild aufgebaut wird, so daß eine Folge von den Zeiten ti entsprechenden Bildern vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Messung des Lichtes, das vom Objekt zurückgestrahlt wird durch eine Detektoranordnung erfolgt, in der ein zum beleuchteten Objektort konfokales Element das Reflexionslicht und das Licht einer statischen Fluoreszenz detektiert, ein bezüglich der Scanrichtung nacheilendes Detektorelement das Fluoreszenzsignal dieses Ortes nach einer Zeit t = n·xi/v mißt, so daß eine Folge von Bildern als Stützstellen zur Berechnung der Abklingzeitkonstante für jeden Objektort vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtastung zur Verbesserung des Signal/Rauschverhältnisses mehrfach erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 14, 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß zur Korrektur des Streulichtanteils am nacheilenden Detektorelement xi, der durch das Anregungslicht verursacht ist, der vom symmetrisch dazu angeordneten voreilenden Detektorelement xi' gemessene Lichtanteil subtrahiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das vom konfokalen Detektionselement erfaßte Strahlungsbild als Bezugsbild für einen Bildabgleich verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mittelwertbildung der zu gleichen Abklingzeiten ti gehörenden Bilder erfolgt.