WO2002001222A2 - Verfahren und vorrichtung zur detektion von farbstoffen in der fluoreszenzmikroskopie - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur detektion von farbstoffen in der fluoreszenzmikroskopie Download PDF

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WO2002001222A2
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Carl Zeiss Jena Gmbh
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    • G02B21/008—Details of detection or image processing, including general computer control

Definitions

  • the irradiated photons of a certain energy excite the dye molecules through the absorption of a photon from the ground state into an excited state.
  • This excitation is usually referred to as single-photon absorption (Fig. 1a).
  • the dye molecules excited in this way can return to the ground state in various ways.
  • fluorescence microscopy the transition with the emission of a fluorescence photon is most important.
  • the wavelength of the emitted photon is generally red-shifted due to the Stokes shift compared to the excitation radiation, so it has a longer wavelength. The Stokes shift enables the fluorescence radiation to be separated from the excitation radiation.
  • the fluorescent light is split off from the excitation radiation with suitable dichroic beam splitters in combination with block filters and observed separately. This makes it possible to display individual cell parts colored with different dyes. In principle, however, several parts of a preparation can also be colored simultaneously using different specific dyes (multiple fluorescence). To distinguish between the fluorescence signals emitted by the individual dyes, special dichroic beam splitters are used.
  • the dye emission is not influenced by this type of excitation, ie that The emission spectrum experiences a negative Stokes shift with the multi-photon absorption option, ie it has a shorter wavelength compared to the excitation radiation.
  • the separation of the excitation radiation from the emission radiation takes place in the same way as with the single-photon absorption.
  • LSM confocal laser scanning microscope
  • An LSM is essentially divided into 4 modules: light source, scan module, detection unit and microscope. These modules are described in more detail below. Reference is also made to DE19702753A1.
  • lasers with different wavelengths are used in an LSM. The choice of the excitation wavelength depends on the absorption properties of the dyes to be examined.
  • the excitation radiation is generated in the light source module.
  • Various lasers are used here (argon, argon krypton, TiSa laser).
  • the wavelengths are selected and the intensity of the required excitation wavelength is selected in the light source module, for example by using an acousto-optical crystal.
  • the laser radiation then arrives in the scan module via a fiber or a suitable mirror arrangement.
  • the laser radiation generated in the light source is focused into the specimen with the aid of the objective (2) with limited diffraction via the scanner, the scanning optics and the tube lens.
  • the focus raster scans the sample in the xy direction.
  • the pixel dwell times when scanning over the sample are usually in the range of less than a microsecond to a few seconds.
  • the excitation of the dye fluorescence takes place in a small volume at which the Excitation intensity is particularly high. This area is only marginally larger than the detected area when using a confocal arrangement.
  • the use of a confocal diaphragm can thus be omitted and the detection can take place directly after the lens (non-descanned detection).
  • a descanned detection still takes place, but this time the pupil of the objective is imaged in the detection unit (non-confocal descanned detection).
  • the LSM is therefore suitable for examining thick specimens.
  • the excitation wavelengths are determined by the dye used with its specific absorption properties. Dichroic filters matched to the emission properties of the dye ensure that only the fluorescent light emitted by the respective dye is measured by the point detector.
  • the fluorescent light is switched off using a
  • Prism spectrally split The method differs from the arrangement described above with dichroic filters only in that the filter used can be adjusted in its characteristics. However, the emission band of a dye is preferably recorded for each point detector.
  • dyes have been modified so that they differ from one another either in their absorption properties or in their emission properties.
  • 3a shows the emission spectra of various typical dyes. The emission signal is plotted as a function of the wavelength. It can be seen that the dyes labeled 1 to 4 differ in the position and shape of their emission spectra. In most cases, however, these dyes are toxic to live preparations. This means that studies on the evolution of cell aggregates in living preparations are impossible.
  • natural dyes the so-called fluorescent proteins (GFP, YFP, CFP, TOPAS, GFT, RFP) were discovered (company: Clonetech. USA). These dyes are characterized by a low sample influence.
  • 3b) shows the emission signals as a function of the wavelength for the dyes GFP, Topas, GFT and Cyan-FP.
  • the distance between the two molecules can be determined.
  • the emission spectrum of a dye which is in a biological preparation can differ from the emission spectrum measured in a dye cell.
  • 3c) shows the emission spectra of a dye as a function of the environment in which the dye is located.
  • the emission signal is plotted as a function of the wavelength.
  • the wavelength shift can be up to several 10 nm.
  • the invention therefore relates to new methods for flexible and freely programmable detection. These methods should be used in imaging as well as in analytical microscopy systems. Therefore may the data acquisition rate will not deteriorate when using these methods.
  • the microscope systems are imaging systems such as laser scanning microscopes for three-dimensional examination of biological specimens with an optical resolution of up to 200 nm, scanning near-field microscopes for high-resolution examination of surfaces with a resolution of up to 10 nm. Fluorescence correlation microscopes for quantitative Determination of molecular concentrations and for the measurement of molecular diffusions. Furthermore, methods for screening dyes based on fluorescence detection are included. In all of the above systems, fluorescent dyes are used for the specific labeling of the preparations.
  • the background of the method for flexible detection is a spectrally split detection of fluorescence.
  • the emission light is split off from the excitation light in the scan module or in the microscope (in the case of multi-photon absorption) using the main color splitter (MDB).
  • MDB main color splitter
  • a block diagram of the following detector unit is shown in Fig. 5.
  • the light of the sample is now focused by means of an imaging optics PO with confocal detection through an aperture (pinhole) PH, whereby fluorescence that has arisen out of focus is suppressed.
  • the aperture is omitted for undescanned detection.
  • the light is now broken down into its spectral components using an angle-dispersive element DI.
  • Prisms, gratings and acousto-optical elements come into question as angle-dispersive elements.
  • the light split by the dispersive element into its spectral components is subsequently imaged on a line detector DE.
  • This line detector DE therefore measures the emission signal as a function of the wavelength and converts this into electrical signals S ().
  • a line filter for suppressing the excitation wavelengths can be connected upstream of the detection unit.
  • FIG. 6 A possible embodiment of the optical beam path of the detector unit shown in Fig. 5 in the block diagram is shown in Fig. 6.
  • the structure essentially describes a Cerny Turner structure.
  • the light L of the sample is focused with the pinhole optics PO through the confocal aperture PH. This aperture can be omitted in the case of undescanned detection in the case of multiphoton absorption.
  • the first imaging mirror S1 collimates the fluorescent light. Then the light hits a line grating G, for example a grating with a number of lines of 651 lines per mm. The grating bends the light in different directions according to its wavelength.
  • the second imaging mirror S2 focuses the individual spectrally split wavelength components on the corresponding channels of the line detector DE.
  • the use of a line secondary electron multiplier from Hamamatsu H7260 is particularly advantageous.
  • the detector has 32 channels and high sensitivity.
  • the free spectral range of the embodiment described above is approximately 350 nm. In this arrangement, the free spectral range is evenly distributed over the 32 channels of the line detector, resulting in an optical resolution of approximately 10 nm. This arrangement is therefore only conditionally suitable for spectroscopy. However, their use in an imaging system is advantageous since the signal per detection channel is still relatively large due to the relatively broad spectral band detected.
  • the free spectral range can also be shifted by rotating the grating, for example.
  • a slit diaphragm is used as the confocal diaphragm instead of a pinhole diaphragm. Detection using a multi-photon absorption can also be carried out with this arrangement again the confocal aperture can be omitted.
  • the algorithm determines the position of the center of gravity or maxima of the emission signal detected in the pixel for each pixel.
  • the following is a advantageous possible way of determining the focus is described in more detail.
  • Other types of determining the center of gravity or maxima, such as interpolation fits, etc. are part of the invention without restriction.
  • the signals per channel (left diagram) detected by the line detector are multiplied by a calibration function (right diagram), ie each channel is given a specific weighting.
  • the diagram on the left in Fig. 7 shows an example of a measured emission signal depending on the channel number in which the signal was detected.
  • the diagram on the right shows an example of a weighting function for the corresponding individual channels depending on the channel number.
  • Fig. 8a shows the position signal depending on the position of the center of gravity or maximum of the detected emission spectrum.
  • Position /, Po k • C k , k
  • Pos k is the characteristic position of the center of gravity of a dye
  • C k is the concentration of a dye
  • n is the number of dyes simultaneously excited in the pixel.
  • the algorithm can thus also determine ion concentrations and n for the detection of an FRET signal be used.
  • an analysis of the local overlay of 2 or more dyes is possible (colocalization measurement)
  • the signal dependent on the ion concentration when using 2 dyes e.g. Fluo-3 and Fura Red, Molecular Probes, Inc.
  • a dye with 2 characteristic emission bands e.g. Indo, Molecular Probes, Inc.
  • the position signal is plotted as a function of the ion concentration.
  • the position signal is a measure of the position of the center of gravity of the emission spectrum. It can therefore serve as a mask for calculating a color-coded intensity image.
  • the algorithm is shown schematically in Fig. 9.
  • the mask i.e. the position signal
  • the lookup table contains the corresponding color assignment depending on the position of the center of gravity of the emission spectrum.
  • the result of this multiplication is then multiplied by the intensity value (the sum signal), that is to say the brightness of the color is adapted to the actual fluorescence intensity.
  • the intensity value the sum signal
  • color-masked intensity images discretrete color distribution
  • intensity images with mixed colors can be created by combining the individual pixels into one image.
  • the decisive advantage of the method is that the entire fluorescence of each dye (the sum signal) can be detected regardless of the degree of overlap of the emission spectra, and the dyes can still be displayed separately (by the position signal). Highly overlapping dyes (Fig. 3c) can thus be detected particularly efficiently.
  • Fig. 10 An arrangement for digital calculation of the sum and position signal is shown schematically in Fig. 10.
  • the current flowing at the anodes of a multi-channel PMT is converted into one by the first amplifier A (switched as a current-voltage converter) Tension changed and strengthened.
  • the voltage is fed to an integrator I which integrates the signal over a corresponding time (eg pixel dwell time).
  • the integrator I can be followed by a comparator K which, as a simple comparator, has a switching threshold which generates a digital output signal when exceeded or which is designed as a window comparator and then forms a digital output signal when the input signal is between the upper and lower ones Switching threshold or if the input signal is outside (below or above) the switching thresholds.
  • the comparator or the window comparator can be arranged both before and after the integrator. Circuit arrangements without an integrator (so-called amplifier mode) are also conceivable. When arranged in the amplifier mode, the comparator K is also arranged after corresponding level adjustment.
  • the output of the comparator K serves as a control signal for a switch register Reg, which switches the active channels directly (online) or the status is communicated to the computer via an additional connection V in order to make an individual selection of the active channels (off-line ).
  • the output signal of the integrator I is directly another ampl. A1 for level adjustment, for the subsequent A / D conversion AD.
  • the AD converted values are transmitted via suitable data transmission to a computer (PC or digital signal processor DSP), which carries out the calculation of the position signal and the sum signal according to Figs. 7 and 9.
  • Fig. 10 is shown in Fig. 11.
  • the signals of the individual channels are in turn transformed with an amplifier into voltage signals.
  • the individual voltage signals are then integrated in an integrator I during the pixel dwell time.
  • a comparator K which compares the integrated signal with a reference signal, is connected downstream of the integrator.
  • the comparator actuates a switch S via Reg and the individual channel is switched off for the pixel just measured. With the aid of the comparators in combination with the switches, the spectral range relevant for the pixel currently being measured is automatically selected.
  • the integrated voltage signal is then converted into a current again using a resistor R. Each individual channel thus generates a current which is dependent on the fluorescence intensity impinging on the individual channel. All adjacent individual channels are then connected to another resistor R1 located between them.
  • the resulting total current at the upper and lower end of the detector line is in turn converted into a voltage using a current-voltage converter A1.
  • the voltage at the upper and lower ends Eo and Eu correspond to the sum of the signals of the individual channels weighted with opposite straight lines.
  • the two signals at the top and at the bottom are summed in the following with a summation amplifier SV.
  • the resulting signal corresponds to the sum signal of the entire measured fluorescence.
  • This sum signal and the signal from the upper end or the signal from the lower end (shown in broken lines) are fed to an analog divider, which forms the position signal at the output.
  • the algorithm according to Fig. 9 can also be implemented in the circuit according to Fig. 11. Three options are explained in more detail below.
  • the multiplication with the lookup table is carried out by changing the Resistors (R1) located between the adjacent single detection channels. The rest of the circuit remains as described above.
  • the multiplication is done with the lookup table in the amplifier (A1).
  • the amplifier A1 is operated with a variable non-linear characteristic.
  • a third arrangement digital (according to Fig. 10) and analog detection (according to Fig.
  • the input signals of the individual detection channels are manipulated or distorted by: a change in the gain of (A), a change in the integration times of (I ), by feeding an additional offset in front of the integrator and / or by digitally influencing the counted photons in a photon counting arrangement. All 3 methods can also be combined with one another as desired.
  • the excitation light backscattered from the sample or at least to attenuate it so much that it is smaller than or in the same order of magnitude as the emission maximum in a fluorescence measurement.
  • the additional line filter described above or a correspondingly optimized main color splitter (MDB) can be used for optical attenuation. Since the spectral width of the excitation laser radiation is much smaller than the bandwidth detected by the individual channel, the backscattered or reflected excitation radiation can also be achieved by specifically switching off the corresponding individual channel using the switch shown in Fig. 11.
  • the arrangement according to Fig. 11 has several advantages over the arrangement according to Fig. 10.
  • the most noticeable advantage is that only 2 channels need to be converted to digital data and sent to the computer. This minimizes the data rates to be processed by the computer. This is particularly important when using the method in real-time microscopy, in which, for example, more than 50 images with 512x512 pixels and 12 bit pixel depth have to be detected in order to be able to register the extremely fast-running dynamic processes.
  • this method is furthermore not limited to the number of individual channels of the line detector (matrix detector) used and thus to the size of the detectable spectral range and / or the spectral resolution of the spectral sensor.
  • the signal levels to be converted are significantly smaller. This means that the signal to noise ratio to be expected is lower.
  • Fig. 12 shows measurements made with the arrangements shown in Figs. 10 and 11.
  • Fig. 12a shows the emission spectra of the dyes GFP, CFP and DI measured with a spectrometer. The dyes were excited with an argon laser with a wavelength of 488 nm. These dyes were subsequently brought specifically to specific regions in a biological preparation.
  • Fig. 12b shows a histogram of the position signal when scanning over a sample section where all 3 dyes are located. The 3 maxima in the histogram can be clearly recognized by the 3 dyes having their characteristic position signal. The positions for the 3 dyes are listed in the following table:
  • the dyes should therefore be easily separated using the arrangements according to the invention.
  • local wavelength shifts are visible due to the different local environments within a dye. This manifests itself in the width of the maxima for the individual dyes in the histogram.
  • Fig. 13a shows the intensity image formed from the sum signals.
  • Fig. 13b is the corresponding image formed from the position signals. This image embodies the corresponding focus of the emission spectra.
  • the differently stained cell nuclei (partly stained with GFP, partly stained with CFP) and cell stains stained with DI are clearly distinguishable.
  • Fig. 13c shows the color-coded intensity image calculated according to the algorithm in Fig. 9. The individual regions to which different dyes have accumulated are now separated by the color coding. The separation is illustrated by the representation of an image in its 3 RGB channels. For comparison, an image measured by means of a detection according to the prior art is also shown in Fig. 13d.

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Abstract

Verfahren zur optischen Erfassung von charakteristischen Grössen des wellenlängenabhängigen Verhaltens einer beleuchteten Probe, insbesonde des Emissions- und/oder Absorptionsverhaltens, vorzugsweise der Fluoreszenz und/oder Lumineszenz und/oder Phosphoreszenz und/oder enzymaktivierten Lichtemission und/oder enzymaktivierten Fluoreszenz, wobei mindestens ein spektraler Schwerpunkt und/oder ein Maximum der Emissionsstrahlung und/oder absorbierten Strahlung bestimmt wird sowie die Bestimmung des Schwerpunkts und/oder des Maximums der Emissionsstrahlung von Fluorochromen zur Unterscheidung von verschiedenen Farbstoffen und/oder zur Bestimmung der lokalen Farbstoff-Zusammensetzung eines Bildpunktes bei Verwendung von mehreren Farbstoffen simultan und/oder zur Bestimmung der lokalen Verschiebung des Emissionsspektrums in Abhängigkeit von der lokalen Umgebung an den der/die Farbstoffe gebunden sind und/oder zur Vermessung von Emissionsratiofarbstoffen zur Bestimmung von Ionenkonzentrationen erfolgt.

Description

Verfahren und Anordnung zur optischen Erfassung von charakteristischen Größen des wellenlängenabhängigen Verhaltens einer beleuchteten Probe
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Anordnung in der Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere der Laser Scanning Mikroskopie, der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie und der Scanning Nahfeldmikroskopie, zur Untersuchung von vorwiegend biologischen Proben, Präparaten und zugehörigen Komponenten. Mit eingeschlossen sind auf Fluoreszenzdetektion basierenden Verfahren zum Screenen von Wirkstoffen (High Throughput Sceening) Durch den Übergang von der Detektion von wenigen breiten spektralen Farbstoffbändern zur simultanen Aufnahme kompletter Spektren eröffnen sich neue Möglichkeiten bei der Identifikation, Separation und Zuordnung der meist analytischen oder funktionalen Probeneigenschaften zu räumlichen Teilstrukturen oder dynamischen Prozessen. Simultan-Untersuchungen von Proben mit Mehrfachfluorophoren werden damit bei überlappenden Fluoreszenzspektren auch in räumlichen Strukturen von dicken Proben möglich. Zusätzlich ist es möglich, lokale spektrale Verschiebungen von Emissionsbändern der Farbstoffe zu detektieren und den räumlichen Strukturen zu zuordnen. Die Datenaufnahme- rate wird durch die Anordnung nicht verringert.
Stand der Technik
Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Präparaten ist die Fluoreszenzmikroskopie (Lit.: Pawley, „Handbook of biological confocal Microscopy"; Plenum Press 1995). Hierbei werden bestimmte Farbstoffe zur spezifischen Markierung von Zellteilen verwendet.
Die eingestrahlten Photonen einer bestimmten Energie regen die Farbstoffmoleküle durch die Absoption eines Photons aus dem Grundzustand in einen angeregten Zustand an. Diese Anregung wird meist als Einphotonen- Absorption bezeichnet (Abb. 1a). Die so angeregten Farbstoffmoleküle können auf verschiedene Weise in den Grundzustand zurück gelangen. In der Fluoreszenzmikroskopie ist der Übergang unter Aussendung eines Fluoreszenzphotons am wichtigsten. Die Wellenlänge des emittierten Photons ist aufgrund der Stokesverschiebung im Vergleich zur Anregungsstrahlung generell rotverschoben, besitzt also eine größere Wellenlänge. Die Stokesverschiebung ermöglicht die Trennung der Fluoreszenzstrahlung von der Anregungsstrahlung.
Das Fluoreszenzlicht wird mit geeigneten dichroitischen Strahlteilern in Kombination mit Blockfiltern von der Anregungsstrahlung abgespalten und getrennt beobachtet. Dadurch ist die Darstellung einzelner, mit verschiedenen Farbstoffen eingefärbten Zellteilen, möglich. Grundsätzlich können jedoch auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen sich spezifisch anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden (Mehrfachfluoreszenz). Zur Unterscheidung, der von den einzelnen Farbstoffen ausgesendeten Fluoreszenzsignale, werden wiederum spezielle dichroitischen Strahlteiler verwendet.
Neben der Anregung der Farbstoffmoleküle mit einem hochenergetischen Photon (Einphotonen-Absoption) ist auch eine Anregung mit mehreren Photonen geringerer Energie möglich (Abb. 1b). Die Summe der Energien der Einzelphotonen entspricht hierbei ungefähr einem Vielfachen des hochenergetischen Photons. Diese Art der Anregung der Farbstoffe wird als Mehrphotonen-Absorption bezeichnet (Lit.: Code, Kino; „Confocal Scanning Optical Microscopy and Related Imaging Systems"; Academic Press 1996). Die Farbstoffemission wird durch diese Art der Anregung jedoch nicht beeinflußt, d.h. das Emissionsspektrum erfährt bei der Mehrphotonen- Absoption einen negativen Stokesshift, besitzt also eine geringere Wellenlänge im Vergleich zur Anregungsstrahlung. Die Trennung der Anregungs- von der Emissionsstrahlung erfolgt in der gleichen Art und Weise wie bei der Einphotonen-Absorption.
Der Stand der Technik soll im folgenden beispielhaft anhand eines konfokalen Laser-Scanning- Mikroskopes (LSM) erläutert werden (Abb. 2 IL 11). Ein LSM gliedert sich im wesentlichen in 4 Module: Lichtquelle, Scanmodul, Detektionseinheit und Mikroskop. Diese Module werden im folgenden näher beschrieben. Es wird zusätzlich auf DE19702753A1 verwiesen. Zur spezifischen Anregung der verschiedenen Farbstoffe in einem Präparat werden in einem LSM Laser mit verschiedenen Wellenlängen eingesetzt. Die Wahl der Anregungswellenlänge richtet sich nach den Absorptionseigenschaften der zu untersuchenden Farbstoffe. Die Anregungsstrahlung wird im Lichtquellenmodul erzeugt. Zum Einsatz kommen hierbei verschiedene Laser (Argon, Argon Krypton, TiSa-Laser). Weiterhin erfolgt im Lichtquellenmodul die Selektion der Wellenlängen und die Einstellung der Intensität der benötigten Anregungswellenlänge, z.B. durch den Einsatz eines akusto optischen Kristalls Anschließend gelangt die Laserstrahlung über eine Faser oder eine geeignete Spiegelanordnung in das Scanmodul. Die in der Lichtquelle erzeugte Laserstrahlung wird mit Hilfe des Objektivs (2) beugungsbegrenzt über die Scanner, die Scanoptik und die Tubuslinse in das Präparat fokussiert. Der Fokus rastert punktförmig die Probe in x-y-Richtung ab. Die Pixelverweilzeiten beim Scannen über die Probe liegen meist im Bereich von weniger als einer Mikrosekunde bis zu einigen Sekunden. Bei einer konfokalen Detektion (descanned Detection) des Fluoreszenzlichtes, gelangt das Licht das aus der Fokusebene (Specimen) und aus den darüber- und darunterliegenden Ebenen emittiert wird, über die Scanner auf einen dichroitischen Strahlteiler (MDB). Dieser trennt das Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht. Anschließend wird das Fluoreszenzlicht auf eine Blende (konfokale Blende / Pinhole) fokussiert, die sich genau in einer zur Fokusebene konjugierten Ebene befindet. Dadurch werden Fluoreszenzlichtanteile außerhalb des Fokus unterdrückt. Durch Variiren der Blendengröße kann die optische Auflösung des Mikroskops eingestellt werden. Hinter der Blende befindet sich ein weiterer dirchroitischer Blockfilter (EF) der nochmals die Anregungsstrahlung unterdrückt. Nach Passieren des Blockfilters wird das Fluoreszenzlicht mittels eines Punktdetektors (PMT) gemessen.
Bei Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption erfolgt die Anregung der Farbstofffluoreszenz in einem kleinen Volumen an dem die Anregungsintensität besonders hoch ist. Dieser Bereich ist nur unwesentlich größer als der detektierte Bereich bei Verwendung einer konfokalen Anordnung. Der Einsatz einer konfokalen Blende kann somit entfallen und die Detektion kann direkt nach dem Objektiv erfolgen (non descannte Detektion).
In einer weiteren Anordnung zur Detektion einer durch Mehrphotonenabsorption angeregten Farbstofffluoreszenz erfolgt weiterhin eine descannte Detektion, jedoch wird diesmal die Pupille des Objektives in die Detektionseinheit abgebildet (nichtkonfokal descannte Detektion).
Von einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild wird durch beide Detektionsanordnungen in Verbindung mit der entsprechenden Einphotonen bzw. Mehrphotonen-Absorption nur die Ebene (optischer Schnitt) wiedergegeben, die sich in der Fokusebene des Objektivs befindet. Durch die Aufzeichnung mehrerer optische Schnitte in der x-y Ebene in verschiedenen Tiefen z der Probe kann anschließend rechnergestützt ein dreidimensionales Bild der Probe generiert werden.
Das LSM ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Die Anregungswellenlängen werden durch den verwendeten Farbstoff mit seinen spezifischen Absorptionseigenschaften bestimmt. Auf die Emissionseigenschaften des Farbstoffes abgestimmte dichroitische Filter stellen sicher, daß nur das vom jeweiligen Farbstoff ausgesendete Fluoreszenzlicht vom Punktdetektor gemessen wird.-
In biomedizinischen Applikationen werden zur Zeit mehrere verschiedene Zellregionen mit verschiedenen Farbstoffe gleichzeitig markiert (Multifluoreszenz). Die einzelnen Farbstoffe können mit den Stand der Technik entweder aufgrund verschiedener Absorptionseigenschaften oder Emissionseigenschaften (Spektren) getrennt nachgewiesen werden. Dazu erfolgt eine zusätzliche Aufspaltung des Fluoreszenzlichts von mehreren Farbstoffen mit den Nebenstrahlteilem (DBS) und eine getrennte Detektion der einzelnen Farbstoffemissionen in getrennten Punktdetektoren (PMT x). Eine flexible Anpassung der Detektion und der Anregung an entsprechende neue Farbstoffeigenschaften durch den Anwender ist mit der oben beschriebenen Anordnung nicht möglich. Statt dessen müssen für jeden (neuen) Farbstoff neue dichroitische Strahlteiler und Blockfilter kreiert werden.
In einer Anordnung gemäß DE wird das Fluoreszenzlicht mit Hilfe eines
Prismas spektral aufgespalten . Das Verfahren unterscheidet sich von der oben beschriebenen Anordnung mit dichroitischen Filtern nur dadurch, dass der verwendete Filter in seiner Charakteristik einstellbar ist. Es werden jedoch weiterhin pro Punktdetektor vorzugsweise das Emissionsband eines Farbstoffs aufgezeichnet.
Überlagern sich die Emissionsspektren zweier Farbstoffe, so stoßen die bisherigen Detektionseinrichtungen an ihre Grenzen. Um ein Übersprechen zwischen beiden Farbstoffen zu vermeiden, muß der spektrale Detektionsbereich eingeschränkt werden. Der Bereich in dem sich die beiden Farbstoffe überlagern wird hierzu einfach herausgeschnitten und nicht detektiert. Somit verschlechtert sich die Effizienz der Detektionseinheit. Ein gleiches Signal- zu Rauschverhältnisses kann nur durch die Erhöhung der Anregungsleistung erzielt werden, wodurch es zu einer Präparatschädigung kommen kann. Deshalb werden heutzutage maximal bis zu 6 verschiedene Farbstoffsonden simultan eingesetzt, da die Farbstoffe sonst aufgrund der sich stark überlagernden Emissionsbänder nicht getrennt werden können.
Bisher wurden Farbstoffe so modifiziert, daß sie sich entweder in ihren Absorptionseigenschaften oder in ihren Emissionseigenschaften voneinander unterscheiden. Fig 3a) zeigt die Emissionsspektren von verschiedenen typischen Farbstoffen. Aufgetragen ist das Emissionssignal in Abhängigkeit von der Wellenlänge. Zu erkennen ist das sich die mit 1 bis 4 bezeichneten Farbstoffe in der Lage und der Form ihrer Emissionsspektren unterscheiden. Diese Farbstoffe sind jedoch in den meisten Fällen toxisch für Lebendpräparate. Somit sind Untersuchungen zur Evolution von Zellverbänden in Lebendpräparaten unmöglich. Ende der 90 er Jahre wurden in der Natur vorkommende Farbstoffe, die sogenannten fluoreszierenden Proteine (GFP, YFP, CFP, TOPAS, GFT, RFP) entdeckt (Firma: Clonetech. USA). Diese Farbstoffe zeichnen sich durch eine geringe Probenbeeinflussung aus. Deshalb sind sie zur Markierung von Zellregionen in Lebendpräparaten besonders geeignet. Nachteilig ist jedoch, daß sich die Farbstoffe in ihren Emissionseigenschaften nur geringfügig unterscheiden. Fig 3b) zeigt die Emisssionssignale in Abhängigkeit von der Wellenlänge für die Farbstoffe GFP, Topas, GFT und Cyan-FP.
Mit den herkömmlichen Methoden könnte nur das CFP und RFP aufgrund seiner geänderten Absoptionseigenschaften effizient, d.h. bei sequentieller Bildaufnahme von den übrigen getrennt werden. Eine Trennung der Farbstoffe GFP und GFT wäre mit herkömmlichen Mitteln überhaupt nicht möglich.
In einer weiteren Methode zur Bestimmung der Lokalisation von zwei Proteinen werden beide Proteine mit verschiedenen Farbstoffen markiert, wobei das Emissionsspektrum des ersten Farbstoffes sich mit dem Absorptionsspektrum des zweiten Farbstoffs überlagert. Anschließend wird der erste Farbstoff mit einer geeigneten Wellenlänge zur Fluoreszenz angeregt. Befinden sich beide Moleküle sehr nahe beieinander (<10 nm) so kann die Emissionsstrahlung des ersten Farbstoffs vom zweiten absorbiert werden, wodurch der zweite Farbstoff und nicht der erste Farbstoff im Anschluß emittiert. Fig 3d) zeigt das Energieterm-Schema für diesen Vorgang, der in der Literatur Fluorescence Resonant Energy Transfer (FRET) genannt wird.(Lit.: Fan et al.; Biophysical Journal, V 76, May 1999, P 2412- 2420). Wenn man bei diesem Verfahren die Emissionsstrahlungen beider Farbstoffe detektiert und das Verhältnis beider Detektorsignale bestimmt, so kann man den Abstand beider Moleküle voneinander bestimmen. Weiterhin ist bekannt, dass das Emissionsspektrum eines Farbstoffes der sich in einem biologischen Präparat befindet von dem Emissionsspektrum gemessen in einer Farbstoffküvette unterscheiden kann . Fig 3c) zeigt die Emissionsspektren eines Farbstoffes in Abhängigkeit von der Umgebung in der sich der Farbstoff befindet. In der Abbildung aufgetragen ist hierzu das Emissionssignal in Abhängigkeit von der Wellenlänge. Die Wellenlängenverschiebung kann bis zu mehreren 10 nm betragen. Genauere Untersuchungen der Abhängigkeit dieser
Wellenlängenverschiebung von der Umgebung sind bisher nicht bekannt, da eine derartige Untersuchung mit den Methoden nach dem Stand der Technik nur schwer möglich sind. Zwar werden heutzutage Spektrometer auch in Verbindung mit einem LSM eingesetzt. Hierbei wird statt eines Punktdetektors ein herkömmliches meist hochauflösendes Spektrometer eingesetzt (Patent Dixon, et al. US 5,192,980). Diese können jedoch nur punktuell oder gemittelt über ein Gebiet ein Emissionsspektrum aufzeichnen. Es handelt sich also um eine Art der Spektroskopie. In einer weiteren Anordnung wird die Lebensdauer der Farbstofffluoreszenz gemessen, wodurch wiederum auf die Art der Umgebung geschlossen werden kann. Würde man jedoch ein komplettes Bild aufzeichnen so würde dies eine lange Datenaufnahmezeit erfordern. Deshalb können diese Verfahren nur bedingt bei der Untersuchung von Lebendpräparaten eingesetzt werden.
In einer weiteren Applikation der Fluoreszenzmikroskopie wird die lonenkonzentration (z.B.: Ca+, K+, Mg2+, ZN+,...) insbesondere in biologischen Präparaten bestimmt. Hierzu werden spezielle Farbstoffe oder Farbstoffkombinationen (z.B. Fura, Indo, Fluo; Molecular Probes, Inc.) verwendet, die eine spektrale Verschiebung in Abhängigkeit von der lonenkonzentration besitzen, lonenkonzentration besitzen. Abb. 4a) zeigt die Emissionsspektren von lndo-1 in Abhängigkeit von der Konzentration der Kalziumionen. Abb. 4b) zeigt ein Beispiel für die Emissionsspektren in Abhängigkeit von der Kalzium lonenkonzentration bei Verwendung der Kombination von FLuo-3 und Fura Red-Farbstoffen. Diese speziellen Farbstoffe werden als Emissionsratiofarbstoffe bezeichnet. Detektiert man wiederum die beiden in Abb. 4a dargestellten Fluoreszenzbereiche und bildet das Verhältnis beider Intensitäten, so kann auf die entsprechende lonenkonzentration rückgeschlossen werden. Meist werden bei diesen Messungen dynamische Änderung der lonenkonzentration in Lebendpräparaten untersucht, die eine Zeitauflösung von weniger als einer Millisekunde erfordern.
Gegenstand der Erfindung sind daher neue Methoden zur flexiblen und frei programmierbaren Detektion. Diese Methoden sollen in bildgebenden wie in analytischen Mikroskopiersystemen eingesetzt werden können. Deshalb darf beim Einsatz dieser Methoden die Datenaufnahmerate nicht verschlechtert werden. Die Mikroskopsysteme sind bildgebende Systeme wie Laser- Scanning-Mikroskope zur dreidimensionalen Untersuchung von biologischen Präparaten mit einer optischen Auflösung bis zu 200 nm, Scanning-Nahfeld- Mikroskope zur hochaufgelösten Untersuchung von Oberflächen mit einer Auflösung von bis zu 10 nm. Fluoreszenzkorrelations-Mikroskope zur quantitativen Bestimmung von Molekülkonzentrationen und zur Vermessung von Molekül-Diffussionen. Weiterhin sind auf Fluoreszenzdetektion basierende Verfahren zum Screenen von Farbstoffen eingeschlossen. In all den o.g. Systemen werden Fluoreszenzfarbstoffe zur spezifischen Markierung der Präparate eingesetzt. Diese Zielstellungen werden durch Verfahren und Anordnungen gemäß den Patentansprüchen gelöst. Durch die Erfindung können sich teilweise oder auch vollständig überlagernde Farbstoffe noch getrennt und dabei die oben erwähnten Nachteile bzw. Limitationen der bisher eingesetzten Techniken umgangen bzw. überwunden werden. Multifluoreszenzaufnahmen unter Verwendung von den in der Natur vorkommenden fluoreszierenden Proteinen sind hierdurch möglich. Weiterhin können mit dieser Methode besonders effizient Wellenlängenverschiebungen aufgrund von verschiedenen Umgebungen in den zu untersuchenden Präparaten bestimmt werden.
Beschreibung der Erfindung
Hintergrund des Verfahrens zur flexiblen Detektion ist eine spektral aufgespaltete Detektion der Fluoreszenz. Dazu wird das Emissionslicht im Scanmodul oder im Mikroskop (bei Mehrphotonen-Absorption) mit Hilfe des Hauptfarbteilers (MDB) vom Anregungslicht abgespalten. Ein Blockschaltbild der nun folgenden Detektoreinheit ist in Abb. 5 dargestellt. Das Licht der Probe wird nun mit Hilfe von einer abbildenden Optik PO bei konfokaler Detektion durch eine Blende (Pinhole) PH fokusiert, wodurch Fluoreszenz, die außerhalb des Fokus entstand, unterdrückt wird. Bei einer nichtdescannten Detektion entfällt die Blende. Das Licht wird nun mit Hilfe eines winkeldispersiven Elements DI in seine Spektralanteile zerlegt. Als winkeldispersive Elemente kommen Prismen, Gitter und akusto optische Elemente in Frage. Das vom dispersiven Element in seine spektralen Komponenten aufgespaltete Licht wird im Anschluß auf einen Zeilendetektor DE abgebildet. Dieser Zeilendetektor DE mißt also das Emissionssignal in Abhängigkeit von der Wellenlänge und wandelt dies in elektrische Signale S( ) um. Zusätzlich kann der Detektionseinheit noch ein Linienfilter zur Unterdrückung der Anregungswellenlängen vorgeschaltet werden.
Eine mögliche Ausführungsform des optischen Strahlenganges der in Abb. 5 im Blockschaltbild gezeigten Detektoreinheit ist in Abb. 6 dargestellt. Der Aufbau beschreibt im wesentlichen einen Cerny Turner Aufbau. Bei einer konfokalen Detektion wird das Licht L der Probe mit der Pinholeoptik PO durch die konfokale Blende PH fokusiert. Bei einer nichtdescannten Detektion im Falle einer Mehrphotonen-Absorption kann diese Blende entfallen. Der erste abbildende Spiegel S1 kollimiert das Fluoreszenzlicht. Anschließend trifft das Licht auf ein Liniengitter G, beispielsweise ein Gitter mit einer Linienzahl von 651 Linien pro mm Das Gitter beugt das Licht entsprechend seiner Wellenlänge in verschiedene Richtungen. Der zweite abbildende Spiegel S2 fokusiert die einzelnen spektral aufgespaltenen Wellenlängenanteile auf die entsprechenden Kanäle des Zeilendetektors DE . Besonders vorteilhaft ist der Einsatz eines Zeilen- Sekundärelektronenverfielfachers der Firma Hamamatsu H7260. Der Detektor besitzt 32 Kanäle und eine hohe Empfindlichkeit. Der freie Spektralbereich der oben beschriebenen Ausführungsform beträgt etwa 350 nm. Der freie Spektralbereich wird in dieser Anordnung gleichmäßig auf die 32 Kanäle des Zeilendetektors verteilt, wodurch sich eine optische Auflösung von etwa 10 nm ergibt. Somit ist diese Anordnung nur bedingt zur Spektroskopie geeignet. Jedoch ist ihr Einsatz in einem bildgebenden System vorteilhaft, da das Signal pro Detektionskanal aufgrund des relativ breiten detektierten Spektralbandes noch relativ groß ist. Eine Verschiebung des freien Spektralbereiches kann zusätzlich durch eine Verdrehung beispielsweise des Gitters erfolgen.
Eine weitere mögliche Ausführungsform könnte die Verwendung eines Matrixdetektors (z.B. eine CCD, ...) beinhalten. Hierbei wird in einer Koordinate durch das dispersive Element eine Aufspaltung in verschiedene Wellenlängenanteile vorgenommen. In der verbleibenden Richtung auf dem Matrixdetektor wird eine komplette Zeile (oder Spalte) des gescannten Bildes abgebildet. Diese Ausführungsform ist besonders vorteilhaft beim Aufbau eines Linienscanners (Lit: Corle, Kino; „Confocal Scanning Optical Microscopy and Related Imaging Systems"; Academic Press 1996). Der prinzipielle Aufbau entspricht im wesentlichen dem eines LSM nach Abb. 2. Jedoch wird statt eines Punktfokus eine Linie in den Fokus abgebildet und die zu untersuchende Probe nur noch in einer Richtung gescannt. Als konfokale Blende dient in einem solchen Aufbau statt einer Lochblende eine Schlitzblende. Eine nichtdescannte Detektion bei Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption kann auch mit dieser Anordnung erfolgen. Hierzu kann wiederum die konfokale Blende entfallen.
Im folgenden wird der Auswertealgorithmus für die in Abb. 6 dargestellte Anordnung also für eine Punktscanner beschrieben. Der Algorithmus kann jedoch ohne Einschränkung auf die Anordnung für einen Linienscanner angewendet werden.
Wie aus Abb. 3 und 4 ersichtlich ist unterscheiden sich die einzelnen Farbstoffe in der Lage und der Form der Emissionsspektren. Der Algorithmus (Abb. 7) bestimmt pro Bildpunkt die Lage des Schwerpunkts bzw. Maxima des in dem Bildpunkt detektierten Emissionssignals. Im folgenden wird eine vorteilhafte mögliche Art der Bestimmung des Schwerpunktes näher beschrieben. Andere Arten der Bestimmung des Schwerpunktes bzw. Maxima, wie Interpolationsfits, etc. sind uneingeschränkt Teil der Erfindung. Die vom Zeilendetektor detektierten Signale pro Kanal (linkes Diagramm) werden dazu mit einer Kalibrierfunktion (rechtes Diagramm) multipliziert, d.h. jeder Kanal erhält eine bestimmte Wichtung. Das linke Diagramm in Abb. 7 stellt beispielhaft ein gemessenes Emissionssignal in Abhängigkeit von der Kanalnummer in dem das Signal detektiert wurde dar. Im rechten Diagramm ist ein Beispiel einer Wichtungsfunktion für die entsprechenden Einzelkanäle in Abhängigkeit von der Kanalnummer aufgeführt.
Die gewichteten Einzelsignale pro Kanal werden nun aufsummiert und durch die Summe der ungewichteten Einzelsignaie pro Kanal (Summensignal) geteilt. Damit ergibt sich ein Signal, das ein charakteristisches Maß für die Lage des Schwerpunktes des Emissionsspektrums und damit eines angeregten Farbstoffe ist (Abb. 8a). Dieses Signal wird im folgenden Positionssignal genannt. Abb 8a zeigt das Positionssignal in Abhängigkeit von der Lage des Schwerpunkts bzw. Maximums des detektierten Emissionsspektrums.
Es können durch die Messung des Positionssignals verschiedene Farbstoffe aufgrund ihrer Lage und Art der Emissionsspektren unterschieden werden. Weiterhin kann bei Verwendung beispielsweise eines Farbstoffes die von der Umgebung abhängige Wellenlängenverschiebung des Emissionsspektrum gemessen werden.
Befinden sich im Bildpunkt gleichzeitig mehrere Farbstoffe so ergibt sich je nach Konzentration des einen Farbstoffs im Vergleich zum anderen Farbstoff eine Linearkombination der Lage des Schwerpunkts nach folgender Gleichung:
n
Position = / , Po k • Ck , k wobei Posk die charakteristische Lage des Schwerpunkts eines Farbstoffs, Ck die Konzentration eines Farbstoffs und n die Anzahl der simultan in dem Bildpunkt angeregten Farbstoffe sind. Der Algorithmus kann somit auch lonenkonzentrationen bestimmen und zur Detektion eines FRET-Signals n eingesetzt werden. Zusätzlich ist eine Analyse der lokalen Überlagerung von 2 oder mehrenen Farbstoffen möglich (Colokalisationsmessung) Das von der lonenkonzentration abhängige Signal bei Verwendung von 2 Farbstoffe (z.B. Fluo-3 und Fura Red, Molecular Probes, Inc.) oder von einem Farbstoff mit 2 charakteristischen Emissionsbändern (z.B. Indo, Molecular Probes, Inc.) ist in Abb. 8b dargestellt. Aufgetragen ist das Positionssignal in Abhängigkeit von der lonenkonzentration.
Wie bereits erwähnt ist das Positionssignal ein Maß für die Lage des Schwerpunktes des Emissionsspektrums. Es kann also als Maske für eine Berechnung eines farbkodierten Intensitätsbildes dienen. Der Algorithmus ist in Abb. 9 schematisch dargestellt. Dazu wird im ersten Schritt die Maske (also das Positionssignal) mit einer entsprechenden Lookup Tabelle multipliziert. Die Lookup Tabelle beinhaltet die entsprechende Farbzuordnung in Abhängigkeit von der Lage des Schwerpunktes des Emissionsspektrums. Im Anschluß wird das Ergebnis dieser Multiplikation mit dem Intensitätswert (dem Summensignal) multipliziert, also die Helligkeit der Farbe der tatsächlichen Fluoreszenzintensität angepaßt. Je nach Wahl der Lookup Tabelle können farbmaskierte Intensitätsbilder (diskrete Farbverteilung), d.h. pro Pixel kommt nur ein Farbstoff vor oder auch Intensitätsbilder mit Mischfarben durch ein Zusammensetzen der Einzelbildpunkte zu einem Bild erzeugt werden.
Der entscheidende Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass die gesamte Fluoreszenz eines jeden Farbstoffe (das Summensignal) unabhängig von dem Grad der Überlagerung der Emissionsspektren detektiert werden kann und trotzdem die Farbstoffe noch getrennt (durch das Positionssignal) darstellbar sind. Sich stark überlagernden Farbstoffe (Abb. 3c) können somit besonders effizient detektiert werden.
Eine Implementation des Algorithmus in den Aufbau nach Abb. 6 kann digital oder auch analog erfolgen. Beide Anordnungen werden im folgenden näher beschrieben. Eine Anordnung zur digitalen Berechnung des Summen- und des Positionssignals ist in Abb. 10 schematisch dargestellt. Hierbei wird der an den Anoden eines Mehrkanal-PMT fließende Strom , jeweils durch den ersten Amplifier A (als Strom-Spannungswandler geschaltet) in eine Spannung gewandelt und verstärkt. Die Spannung wird einem Integrator I zugeführt der über eine entsprechende Zeit (z.B. Pixelverweilzeit) das Signal integriert.
Zur schnelleren Auswertung kann dem Integrator I ein Komparator K nachgeschaltet werden, der als einfacher Komparator eine Schaltschwelle hat, die bei Überschreitung ein digitales Ausgangssignal erzeugt oder der als Fensterkomparator ausgebildet ist und dann ein digitales Ausgangssignal bildet , wenn sich das Eingangssignal zwischen der oberen und unteren Schaltschwelle befindet oder wenn sich das Eingangssignal außerhalb (unter oder über) den Schaltschwellen liegt. Die Anordnung des Komparators bzw. des Fensterkomparators kann sowohl vor dem Integrator als auch danach erfolgen. Schaltungsanordnungen ohne Integrator (so genannte Verstärkermode) sind ebenfalls denkbar. Bei der Anordnung im Verstärkermode wird der Komparator K auch nach entsprechender Pegelanpassung angeordnet. Der Ausgang des Komparators K dient als Steuersignal für ein Switch-Register Reg, das direkt die aktiven Kanäle schaltet (online) oder der Zustand wird dem Computer über eine zusätzliche Verbindung V mitgeteilt, um eine individuelle Auswahl der aktiven Kanäle zu treffen (off-line). Das Ausgangssignal des Integrators I wird direkt einem weiteren Ampl. A1 zur Pegelanpassung , für die nachfolgende A/D-Wandlung AD zugeführt. Die AD gewandelten Werte werden über geeignete Datenübertragung an einen Rechner (PC oder Digital-Signal-Prozessor DSP) übertragen, der die Berechnung des Positionssignales und des Summensignales nach Abb.7 und 9 durchführt.
Ein auf analoger Datenverarbeitung basierendes Äquivalent der Anordnung in
Abb. 10 ist Abb. 11 dargestellt. Die Signale der Einzelkanäle werden hierbei wiederum mit einem Verstärker in Spannungssignale transformiert.
Anschließend werden die einzelnen Spannungssignale in einem Integrator I während der Pixelverweilzeit aufintegriert.
Dem Integrator nachgeschaltet ist ein Komperator K der einen Vergleich des aufintegrierten Signals mit einem Referenzsignal durchführt.
Falls das aufintegrierte Signal kleiner als die Komperatorschwelle ist, so würde in dem entsprechenden Einzelkanal kein oder ein zu kleines Fluoreszenzsignal gemessen. In einem solchen Falle soll das Signal des Einzelkanals nicht weiter verarbeitet werden, da dieser Kanal nur einen Rauschanteil zum Gesamtsignal beiträgt. Der Komperator betätigt in einem solchen Falle über Reg einen Schalter S und der Einzelkanal wird für den gerade gemessenen Pixel ausgeschalten. Mit Hilfe der Komperatoren in Kombination mit den Schaltern wird also automatisch der für den gerade gemessenen Bildpunkt relevante Spektralbereich ausgewählt. Im Anschluß wird das integrierte Spannungssignal wieder mit Hilfe eines Widerstandes R in einen Strom umgewandelt. Jeder Einzelkanal erzeugt somit einen von der auf den Einzelkanal auftreffenden Fluoreszenzintensität abhängigen Strom. Alle aneinander grenzenden Einzelkanäle werden anschließend mit einem weiteren zwischen ihnen liegenden Widerstand R1 verbunden. Der entstehende Gesamtstrom am oberen und unteren Ende der Detektorzeile wird wiederum mit einem Strom-Spannungswandler A1 in eine Spannung gewandelt. Die Spannung am oberen und unteren Ende Eo und Eu entsprechen der Summe der mit gegenläufigen Geraden gewichteten Signale der Einzelkanäle. Die beiden Signale am oberen und am unteren Ende werden im folgenden mit einem Summationsverstärker SV summiert. Das so entstehende Signal entspricht dem Summensignal der gesamten gemessenen Fluoreszenz. Dieses Summensignal und das Signal vom oberen Ende oder das Signal vom unteren Ende ( gestrichelt dargestellt) werden einem analogen Dividierer zugeführt, der am Ausgang das Positionssignal bildet.
Das Summen- und das Positionssignal werden im Anschluß mit jeweils einem Analog-Digital-Wandler in digitale Signale umgewandelt und vom Computer oder DSP weiterverarbeitet. Es können jedoch auch uneingeschränkt das obere und untere Signal gewandelt und vom Computer verarbeitet werden. In diesem Falle würde der Computer das Summensignal und das Positionssignal bestimmen. In beiden Fällen wird der Algorithmus nach Abb. 9 im Computer durchgeführt.
Jedoch kann auch eine Implementierung des Algorithmus nach Abb. 9 in die Schaltung nach Abb. 11 erfolgen. Hierzu werden im folgenden 3 Möglichkeiten näher erläutert. In einer ersten Anordnung erfolgt die Multiplikation mit der Lookup Tabelle durch eine Veränderung der Widerstände (R1), die sich zwischen den benachbarten Einzeldetektionskanälen befinden. Der Rest der Schaltung bleibt wie Eingangs beschrieben. In zweiten Anordnung erfolgt die Multiplikation mit der Lookup Tabelle im Verstärker (A1). Hierzu wird der Verstärker A1 mit einer veränderlichen nichtlinearen Kennlinie betrieben. In einer dritten Anordnung (digitale (nach Abb. 10) und analoge Detektion (nach Abb. 11)) erfolgt eine Manipulation bzw. Verzerrung der Eingangssignale der Einzeldetektionskanäle durch: eine Veränderung der Verstärkung von (A), eine Veränderung der Integrationszeiten von (I), durch ein Einspeisen eines zusätzlichen Offsets vor dem Integrator und/oder durch eine digitale Beeinflußung der gezählten Photonen bei einer Photonenzählanordnung. Alle 3 Methoden können auch beliebig miteinander kombiniert werden.
Für die Vermeidung von Artefakten ist es bei einer Fluoreszenzmessung notwendig das von der Probe rückgestreute Anregungslicht zu unterdrücken oder zumindest so stark abzuschwächen das es kleiner als oder in der gleichen Größenordnung wie das Emissionsmaximum ist. Hierzu kann der oben beschriebene zusätzliche Linienfilter oder ein entsprechend optimierter Hauptfarbteiler (MDB) zur optischen Abschwächung verwendet werden. Da die spektrale Breite der Anregungslaserstrahlung sehr viel kleiner als die vom Einzelkanal detektierte Bandbreite ist, kann die rückgestreute bzw. reflektierte Anregungsstrahlung auch durch ein gezieltes Ausschalten des entsprechenden Einzelkanals mit dem in Abb. 11 dargestellten Schalter erfolgen.
Die Anordnung nach Abb. 11 hat gegenüber Anordnung nach Abb. 10 mehrere Vorteile. Der aufälligste Vorteil ist, dass lediglich 2 Kanäle in digitale Daten gewandelt und an den Computer gesendet werden müssen. Dadurch werden die vom Computer zu verarbeitenden Datenraten minimiert. Dies ist besonders wichtig bei der Anwendung des Verfahrens in der Echtzeitmikroskopie bei der beispielsweise mehr als 50 Bilder mit 512x512 Pixeln und 12 bit Pixeltiefe detektiert werden müssen, um die extrem schnell ablaufenden dynamischen Prozesse registrieren zu können. Beim Einsatz diese Verfahrens ist weiterhin keine Grenzen an die Anzahl der Einzelkanäle des verwendeten Zeilendetektor (Matrixdetektors) und damit an die Größe des detektierbaren Spektralbereiches und/oder die spektrale Auflösung des Spektralsensors gesetzt.
Weiterhin sind bei der in Abb. 10 dargestellten Vorrichtung die zu wandelnden Signalpegel wesentlich kleiner. Dadurch ist das zu erwartende Signal zu Rauschverhältnis geringer.
In den beide oben beschriebenen Anordnungen zur Umsetzung des Auswertealgorithmus wurde eine Integratorschaltung zur Detektion der Einzelkanalsignale verwendet. Uneingeschränkt kann jedoch auch eine Photonenzählung in den Einzelkanälen erfolgen. Die in Abb. 10 dargestellte Anordnung hat jedoch den Vorteil, dass sie neben dem Positionssignal auch noch die komplette Spektralinformation zur nachträglichen Bildverarbeitung zur Verfügung stellt. Die Erfindung schließt deshalb auch eine Kombination beider Anordnungen ein.
Abb. 12 zeigt Messungen, die mit den in Abb. 10 und 11 dargestellten Anordnungen durchgeführt worden. In Abb. 12a sind die mit einem Spektrometer gemessen Emissonsspektren der verwendeten Farbstoffe GFP, CFP und DI aufgeführt. Die Anregung der Farbstoffe erfolgte mit einem Argon Laser mit einer Wellenlänge von 488 nm. Diese Farbstoffe wurden im folgenden spezifisch an bestimmte Regionen in einem biologischen Präparat gebracht. Abb. 12b zeigt ein Histogramm des Positionssignals beim Scannen über einem Probenausschnitt an dem sich alle 3 Farbstoffe befinden. Deutlich sind die 3 Maxima im Histogramm zu erkennen an denen die 3 Farbstoffe ihr charakteristisches Positionssignal besitzen. Die Positionen für die 3 Farbstoffe sind in der folgenden Tabelle aufgelistet:
Figure imgf000017_0001
Die Farbstoffe sollten sich also ohne weiteres mit den erfindungsgemäßen Anordnungen trennen lassen. Zusätzlich sind lokale Wellenlängenverschiebungen aufgrund der verschiedenen lokalen Umgebungen innerhalb eines Farbstoffes sichtbar. Dies äußert sich in der Breite der Maxima für die einzelnen Farbstoffe im Histogramm.
Abb. 13a zeigt das aus den Summensignalen gebildete Intensitätsbild. In Abb. 13b ist das entsprechende aus den Positionssignalen gebildete Bild. Dieses Bild verkörpert die entsprechenden Schwerpunkte der Emissionsspektren. Deutlich sind die unterschiedlich eingefärbten Zellkerne (teils mit GFP, teils mit CFP gefärbt) und die mit DI gefärbten Zellgerüste unterscheidbar. Abb. 13c stellt das entsprechend dem Algorithmus in Abb. 9 berechnete farbkodierte Intensitätsbild dar. Die einzelnen Regionen, an denen sich unterschiedliche Farbstoffe anlagerten sind nun durch die Farbkodierung getrennt. Die Trennung wird verdeutlicht durch die Darstellung eines Bildes in seinen 3 RGB Kanälen. Zum Vergleich ist auch ein mittels einer Detektion nach dem Stand der Technik gemessenes Bild in Abb. 13d dargestellt. Hierbei erfolgte die Detektion nur in extrem engen Spektralbändern, um ein übersprechen der Fluoreszenzsignale unterschiedlicher Farbstoffe untereinander zu vermeiden. Durch das starke Einengen der Detektionsbänder konnte nur ein Bruchteil des von der Probe emittierten Fluoreszenzsignales gemessen werden. Um ein Bild mit möglichst gleichem Signal zu Rauschverhältnis zu erhalten, mußte die Anregungsleistung um ein vielfaches erhöht werden. Dies demonstriert die hohe Effizienz der erfindungsgemäßen Anordnungen im Vergleich zu Anordnungen nach dem Stand der Technik. Weiterhin können Regionen in denen sich das CFP bzw. das GFP anlagerten aufgrund der sich überlagernden Emissionsspektren beider Farbstoffe nicht getrennt werden. Dies äußert sich in der gelben Einfärbung dieser Zellregionen bzw. in dem doppelten Erscheinen der Regionen in 2 Bildkanälen (R und G).

Claims

Patentansprüche
1.
Verfahren zur optischen Erfassung von charakteristischen Größen des wellenlängenabhängigen Verhaltens einer beleuchteten Probe, insbesondere des Emissions - und/oder Absorptionsverhaltens , vorzugsweise der Fluoreszenz und/ oder Lumineszenz und/ oder Phosphoreszenz und/oder enzymaktivierten Lichtemission und/oder enzymaktivierten Fluoreszenz, wobei mindestens ein spektraler Schwerpunkt und/oder ein Maximum der Emissionsstrahlung und/oder der absorbierten Strahlung bestimmt wird.
2.
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Bestimmung des Schwerpunkts und/oder des Maximums der Emissionsstrahlung von Fluorochromen zur:
Unterscheidung von verschiedenen Farbstoffen und/ oder zur Bestimmung der lokalen Farbstoff-Zusammensetzung eines Bildpunktes bei Verwendung von mehreren Farbstoffen simultan und/oder zur Bestimmung der lokalen Verschiebung des Emissionsspektrums in
Abhängigkeit von der lokalen Umgebung an den der/die Farbstoffe gebunden sind und/oder zur Vermessung von Emissionsratiofarbstoffen zur Bestimmung von lonenkonzentrationen erfolgt .
3.
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Bestimmung des Schwerpunkts und/oder des Maximums der reflektierten oder transmittierten
Anregungsstrahlung von Fluorochromen zur:
Unterscheidung von verschiedenen Farbstoffen und/ oder zur Bestimmung der lokalen Farbstoff-Zusammensetzung eines Bildpunktes bei Verwendung von mehreren Farbstoffen simultan und/oder zur Bestimmung der lokalen Verschiebung des Absorptionsspektrums in
Abhängigkeit von der lokalen Umgebung an den der/die Farbstoffe gebunden sind und/oder zur Vermessung der Absorptionsratio zur Bestimmung von lonenkonzentrationen erfolgt .
4.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Emissionsstrahlung der Probe mit einem dispersiven Element aufgespalten und in mindestens einer Richtung ortsaufgelöst detektiert wird. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Aufspaltung der Fluoreszenzstrahlung erfolgt
5.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zur Absorptionsmessung die von der Probe reflektierte oder transmittierte Strahlung mit einem dispersiven Element aufgespalten und in mindestens einer Richtung ortsaufgelöst detektiert wird.
6.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine spektrale Wichtung zwischen mehreren Detektionskanälen , eine
Summation der gewichteten Kanäle der Signale der Detektionskanäle sowie eine Summation der Detektionskanäle erfolgt
7.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Signale von Detektionskanälen gewichtet werden, indem sie mit einer Wichtungskurve multipliziert werden, ein Summensignal erzeugt wird, indem die Summe der berücksichtigten Kanäle bestimmt wird und ein Positionssignal erzeugt wird indem die Summe der gewichteten Signale durch das Summensignal geteilt wird.
8.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Wichtungskurve eine Gerade ist
9.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Signale von Detektionskanälen gewandelt und digital ausgelesen werden und die Wichtung und Summation digital in einem Rechner erfolgt.
10.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Wichtung und Summation mit analoger Datenverarbeitung mittels einer Widerstandskaskade erfolgt
11.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Widerstände einstellbar sind
12.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Wichtungskurve einstellbar ist
13.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Signale der Detektorkanäle durch eine nichtlineare Verzerrung der
Eingangssignale beeinblußt werden
14.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Beeinflussung der Intergrationsparameter erfolgt
15.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Beeinflussung der Kennlinie eines Verstärkers erfolgt
16.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Positonssignal und das Summensignal analog ermittelt , gewandelt und digital ausgelesen werden
17.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein oberes und ein unteres Signal, die der Summe der mit gegenläufigen Wichtungskurven gewichteten Signale der Einzelkanäle entsprechen, ausgelesen, digital gewandelt und dem Rechner zugeführt werden.
18.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Positionssignal und das Summensignal zur Generierung eines Bildes verwendet werden
19.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein farbkodiertes Fluoreszenzbild erzeugt wird
20.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Überlagerung mit weiteren Bildern erfolgt
21.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Positionssignal und das Summensignal mit einer lookup Tabelle kombiniert werden
22.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mittels der lookup-Tabelle eine Darstellung verschiedener Farbstoffe und / oder der Spreizung des generierten Bildes erfolgt
23.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei über Komparatoren in Detektionskanälen ein Vergleich des gemessenen Signals mit einem Referenzsignal erfolgt und im Falle einer Unterschreitung und/oder Überschreitung des Referenzsignals eine Veränderung der Betriebsweiser des Detektionskanales erfolgt
24.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Abschaltung und/oder Nichtberücksichtigung des jeweiligen Detektionskanals erfolgt.
25.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei hierdurch eine Einengung des interessierenden Spektralbereichs erfolgt
26.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Signale der Detektionskanäle jeweils mittels mindestens einer Integratorschaltung generiert werden
27.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Signale der Detektionskanäle mittels Photonenzählung und anschließender Digital/ Analogwandlung generiert werden
28.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Photonenzählung zeitkorreliert erfolgt
29.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, zur Erfassung von Ein- und/oder Mehrphotonenfluoreszenz und/ oder durch entangled photon angeregter Fluoreszenz
30.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit paralleler Beleuchtung und Detektion, vorzugsweise im
Wirkstoffscreening .wobei die Probe vorzugsweise eine Mikrotiterplatte ist
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, in einem Mikroskop
31.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, zur Detektion in einem Scanning-Nahfeldmikroskop.
32.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, zur Detektion einer Ein- und/oder Mehrphotonen-Farbstofffluoreszenz in einem Fluoreszenzkorrelierten Spektroskop.
33.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mittels konfokaler Detektion
34.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit einer scannenden Anordnung
35.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit einem X/Y Scanner in der Beleuchtung
36.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit einem X/Y Scantisch
37.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mittels nichtkonfokaler Detektion
38.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit einer scannenden Anordnung
39.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit descannter Detektion
40.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit Hellfeldabbildung
41.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit Punktabbildung
42.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit nicht descannter Detektion
43.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit Hellfeldabbildung
44.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit nicht scannender, konfokaler oder nichtkonfokaler Detektion und Punktoder Hellfeldabbildung
45.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit einem X/Y Scantisch
46.
Anordnung zur optischen Erfassung von charakteristischen Größen des wellenlängenabhängigen Verhaltens einer beleuchteten Probe, insbesondere des Emissions - und/oder Absorptionsverhaltens , vorzugsweise der Fluoreszenz und/ oder Lumineszenz und/ oder Phosphoreszenz und/oder enzymaktivierten Lichtemission und/oder enzymaktivierten Fluoreszenz, wobei Mittel zur Bestimmung mindestens eines spektralen Schwerpunktes und/oder eines Maximum der Emissionsstrahlung und/oder der absorbierten Strahlung vorgesehen sind.
47.
Anordnung nach Anspruch 46, wobei die Emissionsstrahlung der Probe mit einem dispersiven Element aufgespalten und in mindestens einer Richtung ortsaufgelöst detektiert wird.
48.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Aufspaltung der Fluoreszenzstrahlung erfolgt
49.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zur Absorptionsmessung die von der Probe reflektierte oder transmittierte Strahlung mit einem dispersiven Element aufgespalten und in mindestens einer Richtung ortsaufgelöst detektiert wird.
50.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine spektrale Wichtung zwischen mehreren Detektionskanälen , eine Summation der gewichteten Kanäle der Signale der Detektionskanäle sowie eine Summation der Detektionskanäle erfolgt
51.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Signale von Detektionskanälen gewichtet werden, indem sie mit einer Wichtungskurve multipliziert werden, ein Summensignal erzeugt wird, indem die Summe der berücksichtigten Kanäle bestimmt wird und ein Positionssignal erzeugt wird indem die Summe der gewichteten Signale durch das Summensignal geteilt wird.
52.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Wichtungskurve eine Gerade ist
53. wobei Signale von Detektionskanälen gewandelt und digital ausgelesen werden und die Wichtung und Summation digital in einem Rechner erfolgt.
54.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Wichtung und Summation mit analoger Datenverarbeitung mittels einer Widerstandskaskade erfolgt
55.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Widerstände einstellbar sind
56.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Wichtungskurve einstellbar ist
57.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Positonssignal und das Summensignal analog ermittelt , gewandelt und digital ausgelesen werden
58.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein oberes und ein unteres Signal, die der Summe der mit gegenläufigen Wichtungskurven gewichteten Signale der Einzelkanäle entsprechen, ausgelesen, digital gewandelt und dem Rechner zugeführt werden.
59.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Positionssignal und das Summensignal zur Generierung eines Bildes verwendet werden
60.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein farbkodiertes Fluoreszenzbild erzeugt wird
61.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Überlagerung mit weiteren Bildern erfolgt
62.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Positionssignal und das Summensignal mit einer lookup Tabelle kombiniert werden
63.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mittels der lookup-Tabelle eine Darstellung verschiedener Farbstoffe und / oder der Spreizung des generierten Bildes erfolgt
64.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei über Komparatoren in Detektionskanälen ein Vergleich des gemessenen Signals mit einem Referenzsignal erfolgt und im Falle einer Unterschreitung und/oder Überschreitung des Referenzsignals eine Veränderung der Betriebsweiser des Detektionskanales erfolgt
65.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Abschaltung und/oder Nichtberücksichtigung des jeweiligen Detektionskanals erfolgt.
66.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei hierdurch eine Einengung des interessierenden Spektralbereichs erfolgt
67.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Signale der Detektionskanäle jeweils mittes mindestens einer Integratorschaltung generiert werden
68.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Signale der Detektionskanäle mittels Photonenzählung und anschließender Digital/ Analogwandlung generiert werden
69.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche,wobe9i die Photonenzählung zeitkorreliert erfolgt
70.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, zur Erfassung von Ein-und/oder Mehrphotonenfluoreszenz und/ oder durch entangled photon angeregter Fluoreszenz.
71.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit paralleler Beleuchtung und Detektion, vorzugsweise im
Wirkstoffscreening , wobei die Probe vorzugsweise eine Mikrotiterplatte ist
72.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, in einem Mikroskop
73.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, zur Detektion in einem Scanning-Nahfeidmikroskop.
74.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, zur Detektion einer Ein- und/öder Mehrphotonen-Farbstofffluoreszenz in einem Fluoreszenzkorrelierten Spektroskop.
75.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mittels konfokaler Detektion
76.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit einer scannenden Anordnung
77.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit einem X/Y Scanner in der Beleuchtung
78.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit einem X/Y Scantisch
79.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mittels nichtkonfokaler Detektion
80.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit einer scannenden Anordnung
81.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit descannter Detektion
82.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit Hellfeldabbildung
83.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit Punktabbildung
84.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit nicht descannter Detektion
85.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit Hellfeldabbildung
86.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit nicht scannender, konfokaler oder nichtkonfokaler Detektion und Punktoder Hellfeldabbildung
87.
Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, mit einem X/Y Scantisch
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