DE19921127A1

DE19921127A1 - Mikroskopsysteme zur optischen Abtastung von mikroskopischen Objekten sowie Verfahren zur optischen Abtastung

Info

Publication number: DE19921127A1
Application number: DE1999121127
Authority: DE
Inventors: Thomas Loerch; Andreas Plesch
Original assignee: Metasystems Hard and Software GmbH
Current assignee: Metasystems Hard and Software GmbH
Priority date: 1999-05-07
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2000-11-16
Also published as: WO2000068667A1; EP1177426A1; AU4563200A

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Mikroskopsystem zur optischen Abtastung von Objekten, insbesondere unter Fluoreszenzbedingungen, welches zumindest eine Objektbeleuchtungseinrichtung 14, 16, zumindest eine Bilddetektionseinrichtung 20, 22 zur Detektion von Detektionsbereichen des Objekts und eine Objektverschiebeeinrichtung 12 zur Verschiebung des Objekts umfaßt, wobei die Objektverschiebeeinrichtung 12 zu einer Verschiebung des Objekts mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit ausgelegt ist, so daß man nach einer Verschiebezeitdauer t¶verschieb¶ das Objekt um einen Detektionsbereich verschoben ist, und die Objektbeleuchtungseinrichtung 14, 16 zu einer Erzeugung von Objektbeleuchtungspulsen der Zeitdauer t¶puls¶ ausgelegt ist, wobei t¶puls¶ einen Bruchteil von t¶verschieb¶ beträgt.

Description

Die Erfindung betrifft Mikroskopsysteme zur optischen Abtastung von mikrosko pischen Objekten, wie sie in den Ansprüchen 1, 3, 7 und 8 beschrieben sind, sowie ein entsprechendes Verfahren zur optischen Abtastung, wie es in An spruch 17 beschrieben ist.

Für eine Vielzahl von Anwendungen in verschiedensten Technologiebereichen, insbesondere in der biologischen und medizinischen Forschung, ist eine automa tisierte Abtastung eines zu untersuchenden Objektes (z. B. Objektträgers) er forderlich. Herkömmlicherweise wird dies mit Hilfe eines motorisierten Mikro skops so realisiert, daß der Objektträger mittels eines motorisierten Objektver schiebetischs in x- und y-Richtung, z. B. mäanderförmig unter dem Objekt verfah ren wird und von einer CCD-Kamera sukzessive erfaßt wird. Die Geschwindigkeit der automatischen Abtastung mikroskopischer Präparate ist insbesondere unter Fluoreszenzbedingungen, d. h. unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops, durch folgende Faktoren limitiert:

1. Die Signalintensitäten von Fluoreszenzsignalen von mikrobiologischen Präparaten sind teilweise verhältnismäßig klein. Insbesondere bei hohen Vergrößerungen ist daher für eine ausreichende Bildqualität eine ver gleichsweise lange Integrations- bzw. Detektionszeit solcher Signale notwendig, welche teilweise einige Sekunden betragen kann.
2. Vielfach müssen Fluoreszenzsignale unterschiedlicher Wellenlängen in dem gleichen Bild- bzw. Detektionsbereich eines mikroskopischen Objekts untersucht werden. Dies ist insbesondere bei mikrobiologischen Objekten der Fall, die mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen bzw. Fluorochromen präpariert worden sind. In solchen Fällen muß der gleiche Detektions bereich mehrmals unter Verwendung der für den jeweiligen Fluoreszenz farbstoff geeigneten Filterkombination des Mikroskops aufgenommen werden. Farbkameras, die drei Farbkanäle (rot R, grün G, blau B) gleich zeitig aufnehmen können, sind hierzu ungeeignet, da zum einen die inte grierten R-, G-, B-Filter nicht an die Emissionsspektren der Fluoreszenzfarb stoffe angepaßt sind, und da es zum anderen nicht möglich ist, die Detek tionszeit für die einzelnen Farbkanäle individuell zu steuern. Dies ist aber angesichts der erheblichen Unterschiede der Fluoreszenzintensitäten von beispielsweise DAPI-Gegenfärbung und Hybridisierungssignalen im Fall von FISH zwingend erforderlich.
3. Wird ein motorisierter Objektverschiebetisch für ein schrittartiges Abra stern bzw. "Scannen" eines mikroskopischen Objekts verwendet, so muß nach einem Anhalten des Objektverschiebetischs eine für den Objektver schiebetisch charakteristische Einschwingzeit abgewartet werden, um eine Bewegungsunschärfe, d. h. ein "Verwackeln" eines zu detektierenden Bildes zu vermeiden. Eine solche Bewegungsunschärfe würde sich anson sten zwangsläufig bei den herkömmlicherweise verwendeten Detektions zeiten von CCD-Kameras ergeben.

Angesichts der obigen geschwindigkeitsbegrenzenden Faktoren ist es daher eine Aufgabe der Erfindung, die Abtastgeschwindigkeit eines Objekts zu erhöhen, ohne dabei einen Verlust an Bildqualität hinnehmen zu müssen. Vorzugsweise soll die Abtastgeschwindigkeit bzw. -rate nur durch die Verschiebegeschwindig keit des Objektverschiebetisches limitiert sein. Es ist ferner eine Aufgabe der Erfindung, ein entsprechendes Verfahren zur optischen Abtastung von Objekten anzugeben.

Der die Vorrichtung betreffende Teil der Aufgabe wird durch ein Mikroskopsy stem mit den in Anspruch 1, 3, 7 und 8 angegebenen Merkmalen gelöst. Bevor zugte Ausführungsformen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.

Der das Verfahren betreffende Teil der Aufgabe wird durch ein Verfahren zur optischen Abtastung von Objekten gelöst, welches die Merkmale von Anspruch 17 aufweist. Bevorzugte Ausgestaltungen des Verfahrens sind in den abhängi gen Ansprüchen 18-21 ausgeführt.

Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung umfaßt ein Mikroskopsystem zur optischen Abtastung von Objekten, insbesondere unter Fluoreszenzbedingungen bzw. -anregung, zumindest eine Objektbeleuchtungseinrichtung, zumindest eine erste Bilddetektionseinrichtung zur Detektion eines ersten Detektionsbereichs des Objekts und eine zweiten Bilddetektionseinrichtung zur Detektion eines zweiten Detektionsbereichs, welcher den ersten Detektionsbereichs im wesentlichen umfaßt, wobei die Objektbeleuchtungseinrichtung einen Beleuchtungsmanipula tor zur selektiven Beleuchtung des ersten und/oder des zweiten Detektions bereichs umfaßt. Der Beleuchtungsmanipulator ermöglicht es demgemäß, den gesamten zweiten Detektionsbereich oder lediglich den ersten Detektionsbereich gezielt zu beleuchten.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die erste Bilddetektionsein richtung eine CCD-Kamera, die zweite Bilddetektionseinrichtung ein Okular zum direkten optischen Betrachten und der Beleuchtungsmanipulator ein afokales Relay-System bzw. einen Strahlkompressor. Der Beleuchtungsmanipulator gestattet es demgemäß, den kleinen (ersten) Detektionsbereich der CCD-Kamera selektiv zu beleuchten, ohne gleichzeitig die durch das Okular des Mikroskopsy stems sichtbaren umliegenden bzw. anderen Teile des (zweiten) Detektions bereichs mitbeleuchten zu müssen. Die Verwendung eines afokalen Relay-Sy stems bzw. eines Strahlkompressors ermöglicht somit vorteilhafterweise eine Konzentration der Anregungsbeleuchtung auf den für eine Detektion mit der CCD-Kamera maßgeblichen (ersten) Detektionsbereich. Im Falle einer Fluo reszenzdetektion von Fluoreszenzfarbstoffen, beispielsweise von entsprechend präparierten mikrobiologischen Objekten, wird durch diese Ausführungsform vorteilhafterweise ein unnötig schnelles Ausbleichen der Fluoreszenzfarbstoffe durch ein unnötig großes beleuchtetes Bildfeld vermieden.

Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung umfaßt ein erfindungsgemäßes Mikroskopsystem zur optischen Abtastung von Objekten, insbesondere unter Fluoreszenzbedingungen, zumindest zwei Bilddetektionseinrichtungen, welche zur gleichzeitigen bzw. simultanen Detektion eines Detektionsbereichs des Objekts ausgelegt sind, wobei die erste Bilddetektionseinrichtung zur Detektion eines ersten und die zweite Bilddetektionseinrichtung zur Detektion eines zweiten optischen Wellenlängenbereichs ausgelegt ist. Dies ist insbesondere für Fluo reszenzanwendungen eines Mikroskopsystems vorteilhaft, bei weichen das mikroskopische Objekt mit mehreren zu detektierenden Fluoreszenzfarbstoffen präpariert wurde, die ihre Emissionsbanden in unterschiedlichen optischen Wellenlängenbereichen aufweisen. Die erfindungsgemäße Bereitstellung von zwei Bilddetektionseinrichtungen ermöglicht somit eine simultane Detektion des Detektionsbereichs des Objekts in beiden optischen Wellenlängenbereichen, wodurch sich eine spürbare Verbesserung der Abtastgeschwindigkeit bzw. -rate im Vergleich zu herkömmlichen, sequentiell arbeitenden Mikroskopsystemen ergibt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind jeweilige Detektionszeitdauern der ersten und zweiten Bilddetektionseinrichtung abhängig von detektierten Bildsignalstärken in den jeweiligen Wellenlängenbereichen getrennt voneinander einstellbar. Hierdurch ist es beispielsweise möglich, die für einen Wellenlängen bereich vorgesehene Bilddetektionseinrichtung mit einer vergleichsweise langen Detektionszeitdauer zu betreiben, wenn die Bildsignalstärken in diesem Wellen längenbereich klein sind, während die andere Bilddetektionseinrichtung un abhängig davon mit einer kurzen bzw. normalen Detektionszeitdauer betreibbar ist.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die erste Bilddetek tionseinrichtung eine erste CCD-Kamera und einen dichroitischen Strahlteiler und die zweite Bilddetektionseinrichtung eine zweite CCD-Kamera, wobei der Strahl teiler derart ausgelegt und im Detektionsstrahlengang angeordnet ist, daß Detek tionsstrahlen des Detektionsbereichs in dem ersten Wellenlängenbereich per Transmission durch den Strahlteiler auf die erste CCD-Kamera und Detektions strahlen des Detektionsbereichs in dem zweiten Wellenlängenbereich per Refle xion an dem Strahlteiler auf die zweite CCD-Kamera fallen. Diese besonders für Fluoreszenzanwendungen vorteilhafte Ausführungsform gestattet somit prinzi piell die Verwendung von baugleichen CCD-Kameras, da die Wellenlängen bereichselektion durch den dichroitischen Strahlteiler vorgenommen wird. Sollen Emissionsbanden von Fluoreszenzfarbstoffen in drei unterschiedlichen Wellenlän genbereichen detektiert werden, so können drei CCD-Kameras mit zwei dichroiti schen Strahlteilern bereitgestellt werden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind analoge Kamera ausgänge der zumindest ersten und zweiten CCD-Kamera jeweils mit Signal eingängen einer Digitalisiereinrichtung bzw. -modul verbunden, welche für eine Multiplexverarbeitung von analogen Kamerasignalen ausgelegt ist. Eine solche Multiplexverarbeitung der einzelnen Kamerasignale ermöglicht vorteilhafterweise die kostengünstige Verwendung eines einzigen Digitalisiermoduls für mehrere Bilddetektionseinrichtungen. Zwar können in dieser Konfiguration die Signale der CCD-Kameras nicht zum gleichen Zeitpunkt ausgelesen und digitalisiert werden, jedoch bedeutet dies keine praktische Einschränkung. Zum einen ist die Auslese zeit einer CCD-Kamera mit einem Wert von typischerweise 0,1 Sekunden in der Regel deutlich kürzer als typische Detektionszeitdauern. Ferner sind die Detek tionszeitdauern für verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe unterschiedlich lang, so daß das CCD-Kamerasignal des signalstärkeren Fluoreszenzfarbstoffs bereits ausgelesen werden kann, während die andere CCD-Kamera das intensitäts schwächere Signal noch detektiert und integriert. Durch eine geeignete Steue rung dieses Ablaufs läßt sich erreichen, daß die Gesamtaufnahmezeit durch die erforderliche Detektionszeit für den intensitätsschwächesten Fluoreszenzfarbstoff begrenzt wird.

Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung umfaßt ein Mikroskopsystem zur optischen Abtastung von (mikroskopischen) Objekten bzw. Präparaten, ins besondere unter Fluoreszenzbedingungen, zumindest eine Objektbeleuchtungs einrichtung, zumindest eine Bilddetektionseinrichtung zur Detektion von Detek tionsbereichen des Objektes und eine Objektverschiebeeinrichtung zur Ver schiebung des Objektes, wobei die Objektverschiebeeinrichtung zu einer Verschiebung des Objektes mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit ausgelegt ist, so daß nach einer Ver schiebezeitdauer t_verschieb das Objekt um einen Detektionsbereich bzw. um die maximale Detektionsbereichslänge in Verschieberichtung verschoben ist, und die Objektbeleuchtungseinrichtung zu einer Erzeugung von Objektbeleuchtungs pulsen der (jeweiligen) Zeitdauer t_puls ausgelegt ist, wobei t_puls einen Bruchteil von t_verschieb beträgt.

Weist der Detektionsbereich beispielsweise eine rechteckige Gestalt auf, so ist die Objektverschiebeeinrichtung dazu ausgelegt, das Objekt innerhalb der Zeit t_verschieb um die maximale Länge des rechteckigen Detektionsbereichs in Ver schieberichtung zu verschieben. Verläuft die Verschieberichtung beispielsweise parallel zu einer Seitenkante des Detektionsbereichs, so entspricht diese maxima le Länge dieser Kantenlänge. Da die Zeitdauer t_puls des Objektbeleuchtungspulses lediglich einen Bruchteil dieser Verschiebezeitdauer t_verschieb beträgt, ergibt sich selbst dann ein qualitativ hochwertiges, von der Bilddetektionseinrichtung detektiertes Bild, wenn sich das Objekt während der Detektion bewegen sollte. Demgemäß wird durch die erfindungsgemäße gepulste Beleuchtung (ähnlich einer Blitz- bzw. Stroboskop-Beleuchtung) die Bewegungsunschärfe bzw. eine "Verwackelungsgefahr" eines zu detektierenden Bildes wirkungsvoll vermieden. Es ist folglich nicht notwendig, das Objekt mit einer Objektverschiebeeinrichtung schrittweise, d. h. in einem Start-/Stopbetrieb, zu verschieben, um eine Bilddetek tion lediglich in Ruhezuständen des Objektes vorzunehmen. Statt dessen kann das mikroskopische Objekt kontinuierlich (z. B. gleichförmig mit konstanter Geschwindigkeit) bewegt werden, wodurch ein Abwarten einer Einschwingzeit der Objektverschiebeeinrichtung sowie eine Beschleunigungs- und Abbremszeit derselben im Vergleich zu herkömmlichen Mikroskopsystemen hinfällig ist. Vorteilhafterweise läßt sich daher eine gesteigerte Abtastgeschwindigkeit des Objekts erzielen.

Gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung umfaßt ein Mikroskopsystem zur optischen Abtastung von Objekten, insbesondere unter Fluoreszenzbedingungen, zumindest eine Objektbeleuchtungseinrichtung, zumindest eine Bilddetektionsein richtung zur Detektion von Detektionsbereichen des Objekts innerhalb einer Detektionszeitdauer t_detektion und eine Objektverschiebeeinrichtung zur Verschie bung des Objekts, wobei die Objektverschiebeeinrichtung zu einer Verschiebung des Objekts mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit ausgelegt ist, so daß nach einer Ver schiebezeit t_verschieb das Objekt um einen Detektionsbereich bzw. um eine maxima le Länge des Detektionsbereichs in Verschieberichtung verschoben ist, wobei t_detektion einen Bruchteil von t_verschieb beträgt. Eine solche Verkürzung der Detek tionszeitdauer t_detektion ist insbesondere bei Transmissions- bzw. Durchlichtunter suchungen vorteilhaft. Ein derartiges Mikroskopsystem gestattet es demgemäß, einen Detektionsbereich des Objekts zu detektieren, selbst wenn sich dieses bewegen sollte, da eine eventuelle Bewegung durch die im Vergleich zur Ver schiebezeit t_verschieb kleinen Detektionszeit t_detektion "eingefroren" wird. Wie im dritten Aspekt der Erfindung wird so einer Bewegungsunschärfe eines detektier ten Bildes wirkungsvoll begegnet. Folglich kann die Detektion von Detektions bereichen des Objekts mit der maximal mechanisch möglichen Verschieberate der Objektverschiebeeinrichtung erfolgen (typischerweise etwa 10 Detektions bereiche bzw. -positionen pro Sekunde), ohne die Einschwingzeit des Objekts bzw. der Objektverschiebeeinrichtung abwarten zu müssen. Eine eventuell reduzierte Intensität des von der Bilddetektionseinrichtung detektierten Bild signals läßt sich durch einen entsprechend erhöhten Beleuchtungspegel wieder anheben.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Mikroskopsystems gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung ist die Zeitdauer der Objektbeleuchtungspulse t_puls ≦ t_verschieb/500, vorzugsweise t_puls ≦ t_verschieb/1000. Vorzugsweise wird die Zeit dauer t_puls der Objektbeleuchtungspulse kleiner als 1 msec, vorzugsweise kleiner als 0,1 msec gewählt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Mikroskopsystems gemäß dem vierten Aspekt der Erfindung ist die Detektionszeitdauer t_detektion ≦ t_verschieb/500, vorzugsweise t_detektion ≦ t_verschieb/1000. Vorzugsweise ist die Detektionszeitdauer t_detektion kleiner als 1 msec, vorzugsweise kleiner als 0,1 msec.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Objektverschiebeeinrichtun gen der erfindungsgemäßen Mikroskopsysteme zur zumindest zweidimensionalen Verschiebung des Objekts senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopsystems ausgelegt (x- und y-Richtung). Vorteilhafterweise ermöglicht die Objektverschie beeinrichtung jedoch ebenfalls eine Verschiebung des Objekts entlang der optischen Achse (z-Richtung), was insbesondere zur automatisierten Abtastung "dicker" Objekte vorteilhaft ist.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Objektverschie beeinrichtung einen Objektverschiebetisch und einen diesen verschiebenden elektrischen Verschiebemotor.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Bilddetektions einrichtung eine CCD-Kamera (Charge-Coupled-Device-Kamera), die vorzugs weise einen elektronischen Verschluß (Shutter) umfaßt.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Mikroskopsystem mit einer Steuereinrichtung bereitgestellt, die mit der Objektbe leuchtungseinrichtung, der Bilddetektionseinrichtung und der Objektverschie beeinrichtung in Signalverbindung steht und ein automatisches (d. h. unbeauf sichtigtes) optisches Abtasten eines mehrere Detektionsbereiche bzw. Bildfelder umfassenden Bereichs des Objekts steuert. Hierdurch kann vorteilhafterweise mit hoher optischer Abtastgeschwindigkeit eine automatische Abtastung bzw. Detektion des mikroskopischen Objekts erfolgen, ohne daß Benutzereingriffe während dieses Vorgangs notwendig wären.

Gemäß der Erfindung umfaßt ein Verfahren zur optischen Abtastung von Objek ten, insbesondere unter Fluoreszenzbedingungen, mittels eines (vorzugsweise erfindungsgemäßen) Mikroskopsystems, welches zumindest eine Objektbeleuch tungseinrichtung, zumindest eine Bilddetektionseinrichtung zur Detektion von Detektionsbereichen des Objekts und eine elektrisch angetriebene Objektver schiebeeinrichtung zur Verschiebung des Objekts umfaßt, die folgenden Schritte in dieser Reihenfolge:

a) Rücksetzen eines Bildsignalspeichers der Bilddetektionseinrichtung und Einstellen eines Zeitzählers timer = t₀;
b) zum Zeitpunkt timer = t₀ + t_verschieb des Zeitzählers Beleuchten eines Detek tionsbereichs des Objekts mit einem Objektbeleuchtungspuls der Zeitdauer t_puls und
c) Auslesen eines zeitintegrierten Bildsignals aus dem Bildsignalspeicher der Bilddetektionseinrichtung,

wobei das Objekt während aller Schritte (a) bis (c) kontinuierlich durch die elektrische Objektverschiebeeinrichtung derart verschoben wird, daß nach der Verschiebezeitdauer t_verschieb

das Objekt um einen Detektionsbereich bzw. um eine maximale Länge des Detektionsbereichs in Verschieberichtung verschoben ist, und die Pulszeitdauer t_puls

derart gewählt wird, daß t_puls

einen Bruchteil von t_verschieb

beträgt.

Vorzugsweise ist die kontinuierliche Verschiebung des Objekts durch die elek trische Objektverschiebeeinrichtung eine gleichförmige Verschiebebewegung mit konstanter Geschwindigkeit, jedoch kann sich das Objekt zum Zeitpunkt der Pulsbeleuchtung auch langsamer bewegen oder sich im Stillstand befinden. Da die Pulszeitdauer t_puls lediglich einen Bruchteil von t_verschieb beträgt, kann ein qualitativ hochwertiges, zeitintegriertes Bildsignal durch die Bilddetektionsein richtung auch dann gewonnen werden, wenn sich das Objekt während der detektierenden Integration des Bildes bewegt, ohne daß eine spürbare Beein trächtigung durch Bewegungsunschärfe resultieren würde. Folglich gestattet das Verfahren vorteilhafterweise eine optische Abtastung von Objekten mit einer erhöhten Abtastrate, da auf Einschwingprobleme der Objektverschiebeeinrich tung sowie auf sonstige Bewegungsunschärfeprobleme nicht durch ein nachteili ges Abwarten einer charakteristischen Einschwingzeit reagiert werden muß. Stattdessen wird die Abtastrate des erfindungsgemäßen Verfahrens lediglich durch die Verschiebegeschwindigkeit der Objektverschiebeeinrichtung begrenzt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist t_puls kleiner oder gleich wie t_verschieb/500, vorzugsweise t_verschieb/1000.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird nachfolgend auf den Schritt (c) des Verfahrens ein zusätzlicher Objektverschiebeschritt (d) durch geführt, der insbesondere eine andere Objektverschiebegeschwindigkeit und - richtung aufweisen kann. Ein solcher zusätzlicher Objektverschiebeschritt kann vorteilhaft sein, wenn die Detektionsbereiche des Objekts nicht in Verschiebe richtung unmittelbar aneinander angrenzen sollen, sondern durch nichtdetektierte Bereiche des Objekts beabstandet sein sollen. Dies ist insbesondere dann er forderlich, wenn ein "stichpunktartiges" Detektieren verteilter Detektionsbereiche eines Objekts erforderlich sind. Ferner kann in dem Objektverschiebeschritt (d) eine Umkehrung der Verschieberichtung erfolgen, so daß ein mäanderförmiges Abtasten größerer Objekte erfolgen kann.

Zu diesem Zweck können die Verfahrensschritte (a) bis (c) bzw. (a) bis (d) eine vorbestimmte Anzahl von Wiederholungen wiederholt werden, um auf diese Weise eine Vielzahl von Detektionsbereichen des Objekts automatisch zu erken nen.

Die Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf begleitende Zeichnungen beispielshaft beschrieben. Es zeigen

Fig. 1 eine schematische Ansicht einer erfindungsgemäßen Ausführungs form eines Mikroskopsystems;

Fig. 2 eine schematische Prinzipanordnung einer erfindungsgemäßen Aus führungsform eines Mikroskopsystems mit einem als Beleuchtungs manipulator ausgebildeten afokalen Relay-System und

Fig. 3 eine schematische Ansicht einer Ausführungsform eines Mikro skopsystems mit drei Bilddetektionseinrichtungen, die über wellen längensensitive, dichroitische Strahlteiler angesteuert werden.

In Fig. 1 ist der Aufbau eines Mikroskopsystems 10 gemäß einer Ausführungs form der Erfindung schematisch dargestellt. Das Mikroskopsystem umfaßt einen in alle Raumrichtungen verschiebbaren Objektverschiebetisch 12, welcher mit einem nicht dargestellten elektrischen Verschiebemotor bereitgestellt ist. Der Verschiebemotor und der Objektverschiebetisch 12 bilden eine Objektverschie beeinrichtung. Das zu untersuchende mikroskopische Objekt ist an dem Objekt verschiebetisch festgelegt. Das Mikroskopsystem 10 weist zwei Objektbeleuch tungseinrichtungen auf, wobei eine Durchlichtbeleuchtungseinrichtung 14 und eine zweite mikroskopseitige Beleuchtungseinrichtung (EPI-Beleuchtung) 16 vorgesehen ist. Das Detektionslicht wird von einem Objektiv 18 gesammelt und über ein Linsensystem einer CCD-Kamera 20 zugeführt, die als eine erste Bildde tektionseinrichtung dient. Über einen in den Strahlengang einklappbaren Schwenkspiegel oder einen Strahlteiler läßt sich der Detektionsbereich des zu untersuchenden Objekts auch über ein Okular 22 direkt visuell betrachten. Die nicht näher dargestellten Objektbeleuchtungseinrichtungen (14, 16), der Ver schiebemotor des Objekttisches 12 sowie die CCD-Kamera 20 sind mit einer nicht dargestellten externen Steuereinrichtung verbunden.

Die Objektbeleuchtungseinrichtung 16 ist für eine gepulste Beleuchtung (ähnlich einer Blitz- bzw. Stroboskopbeleuchtung) ausgelegt und kann bei hoher Puls- Wiederholfrequenz ca. t_puls = 0,1 msec lange Beleuchtungspulse emittieren. Die CCD-Kamera 20 weist z. B. eine Chipauflösung von 1280 × 1024 Bildpunkten auf und kann typischerweise innerhalb von einigen 10 msec ausgelesen werden.

Wenn ein beispielsweise mikrobiologisches Präparat unter Fluoreszenzbedingun gen untersucht werden soll, läßt sich durch die mögliche gepulste Beleuchtung durch die Objektbeleuchtungseinrichtung 16 eine wesentliche Verkürzung der Integrationszeit bzw. Detektionszeit, die effektiv benötigt wird, erzielen, da sich die erforderliche Lichtenergie in sehr viel kürzerer Zeit als bei der kontinuierlichen Leistungsabgabe einer konventionellen Fluoreszenzbeleuchtung auf das Präparat übertragen läßt. Dies ermöglicht es, vorteilhafterweise den Objektverschiebetisch 12 anstatt des üblichen Start/Stop-Betriebs sogar kontinuierlich zu verfahren, ohne daß verwackelte Aufnahmen aufgrund von Bewegungsunschärfe die Folge sind. Wenn beispielsweise eine Bildunschärfe von 1 Pixel akzeptiert wird, kann der Objektverschiebetisch mit 104 Pixel/sec verfahren werden, was bei einer CCD-Auflösung von 1280 × 1024 Bildpunkten ca. 10 Detektionsbereichen bzw. Bildfeldern/sec entspricht. Auf die herkömmlicherweise notwendigen Warte pausen für ein Einschwingen des Objektverschiebetischs kann somit verzichtet werden.

Es hat sich gezeigt, daß ein Verhältnis von Objektbeleuchtungspulsdauer t_puls zu einer Verschiebezeitdauer t_verschieb von t_puls/t_verschieb ≦ 0,5% bereits hinreichend scharfe Bilder liefert. Die Verschiebezeitdauer t_verschieb ist hierbei diejenige Zeit, während welcher das Objekt in seiner Verschieberichtung durch den Objektver schiebetisch 12 verschoben werden muß, um einen Detektionsbereich bzw. um die maximale Länge des Detektionsbereichs in Verschieberichtung verscho ben zu werden.

Insbesondere für Durchlichtuntersuchungen läßt sich die Bewegungsunschärfe wirkungsvoll auch durch eine Verkürzung der Detektionszeitdauer t_detektion redu zieren. Verwendet man eine CCD-Kamera, die über einen sogenannten elektro nischen Shutter, d. h. einen elektronischen Verschluß, verfügt, so läßt sich die Detektionszeitdauer t_detektion, d. h. die Zeitdauer, während der das einfallende Licht auf dem CCD-Chip gesammelt wird, auf beispielsweise 0,1 msec verkürzen. Eine unter Umständen dadurch reduzierte CCD-Detektionssignalstärke läßt sich durch einen entsprechend erhöhten Beleuchtungspegel wieder anheben. Die sehr kurze Detektionszeit erlaubt es, ein Bild aufzunehmen, bevor der Objekttisch 12 eingeschwungen ist und damit stabil steht, da, wie bei einer Pulsbeleuchtung, eine eventuelle Restbewegung gewissermaßen "eingefroren" wird. Als Folge kann die Bildaufnahme mit der maximalen, durch den Objekttisch 12 bestimmten Verschiebefrequenz erfolgen (typischerweise etwa 10 Detektionsbereiche bzw. -positionen pro Sekunde), ohne Einschwingzeiten des Objekttischs 12 abwarten zu müssen.

In Fig. 2 ist schematisch die Anordnung eines Beleuchtungsmanipulators 24 in dem Beleuchtungsstrahlengang des Mikroskopsystems dargestellt. Mittels eines Linsensystems 26 wird parallel zur optischen Achse des Mikroskopsystems gerichtetes Anregelicht von einer Lichtquelle 28, die in einem Lampenhaus 30 eingebaut ist, erzeugt. Das Anregelicht trifft auf eine erste Sammellinse 32 des Beleuchtungsmanipulators 24, welcher als ein afokales Relay-System ausgeführt ist. Die Sammellinse 32 fokussiert das parallele Lichtbündel in einen Brennpunkt auf der optischen Achse des Mikroskopsystems, welcher um den Abstand f₂ von der Hauptebene der Sammellinse 32 entfernt ist. Dieser Brennpunkt fällt mit dem Brennpunkt einer zweiten Sammellinse 34 des Beleuchtungsmanipulators 24 zusammen, welcher nachfolgend wiederum ein zur optischen Achse paralleles Lichtbündel erzeugt, welches weiter in Richtung Mikroskop gerichtet ist. Da die Brennweite f₁ der Sammellinse 34 kleiner als die Brennweite f₂ der Sammellinse 32 ist, wird der ursprüngliche Anregungsstrahldurchmesser D₂ auf den Durch messer D₁ komprimiert, wobei D₁ = D₂ f₁/f₂.

Fig. 3 zeigt schematisch einen Teil des Strahlengangs einer weiteren Aus führungsform des erfindungsgemäßen Mikroskopsystems. Hierbei werden drei verschiedene und getrennt ansteuerbare Bilddetektionseinrichtungen eingesetzt, die als erste 40, zweite 42 und dritte 44 CCD-Kamera ausgebildet sind. Eine Objektbeleuchtungseinrichtung 46, die aus einer Lichtquelle und einem Linsen system besteht, erzeugt mittels eines ersten Strahlteilers 48 eine Auflichtbe leuchtung auf ein nicht dargestelltes mikroskopisches Objekt. Der erste Strahl teiler 48 ist hierbei als ein Drei-Band-Strahlteiler (Triple Band Beam Splitter) ausgebildet, welcher eine hohe Transmission in optischen Wellenlängenbereichen F₁, F₂ und F₃ aufweist. In Verbindung mit der Objektbeleuchtungseinrichtung 46 kann der Strahlteiler 48 beispielsweise zur Simultananregung mehrerer Fluo reszenzfarbstoffe bzw. Fluorochrome in diesen Wellenlängenbereichen dienen.

Im Detektions- bzw. Nachweisstrahlengang des Mikroskopsystems sind zwei weitere Strahlteiler 50, 52 angeordnet, die das zu detektierende Licht des Detektionsbereichs des Objekts auf die CCD-Kameras 40, 42 und 44 verteilen. Hierbei erfolgt eine spektrale Aufspaltung des detektierten Lichts durch eine Verwendung von dichroitischen Strahlteilern. So weist der Strahlteiler 50 einen großen Transmissionskoeffizienten in dem Wellenlängenbereich F₁ auf, reflektiert jedoch die Wellenlängenbereich F₂ und F₃ effektiv. Hierdurch gelangt lediglich zu detektierendes Licht im Wellenlängenbereiche F₁ auf die erste CCD-Kamera 40. Der zweite dichroitische Strahlteiler 50 hingegen weist einen hohen Trans missionskoeffizienten im Wellenlängenbereich F₃ auf und einen großen Refle xionskoeffizienten im Wellenlängenbereich F₂. Demgemäß fällt zu detektierendes Licht im Wellenlängenbereich F₂ auf die zweite CCD-Kamera 42, während zu detektierendes Licht im Wellenlängenbereich F₃ auf die dritte CCD-Kamera 44 fällt. Besonders vorteilhaft ist es, diese Strahlteiler auf die verwendeten Fluo reszenzfarbstoffe in ihren spektralen Eigenschaften gezielt anzupassen. Unter eventueller Verwendung von angepaßten Doppel- oder Dreifachanregungsfiltern kann so das Fluoreszenzsignal mehrere Fluoreszenzfarbstoffe gleichzeitig nach gewiesen werden. Eine herkömmliche sequentielle und damit zeitraubende Detektion des gleichen Detektionsbereichs eines Objekts in verschiedenen Wellenlängenbereichen ist somit hinfällig, da eine Parallelisierung durch eine Mehrkanalaufnahme eine gleichzeitige Detektion der Fluoreszenzsignale in allen relevanten Wellenlängenbereichen ermöglicht.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit derartiger simultaner Detektions- bzw. Aufnahmekanäle besteht in der Detektion von "dicken" Objekten, d. h. von mikroskopischen Präparaten, deren Ausdehnung in z-Richtung eine Detektion in unterschiedlichen Fokusebenen des Mikroskopsystems erfordert, um die Detek tionssignale aus allen Objektschichten zu erfassen. Beispiele hierfür sind Gewe beschnitte oder Interphasekerne. Verwendet man zwei Detektionskanäle, die jeweils ca. 50% des Signals empfangen und die auf unterschiedliche Fokus ebenen justiert sind, so können zwei Fokusebenen gleichzeitig aufgenommen werden. Das Prinzip ist auf mehr als zwei Bilddetektionseinrichtungen erweiter bar. Die optische Abtastgeschwindigkeit für N erforderliche Fokusebenen läßt sich auf diese Weise um einen Faktor, welcher der Zahl der Aufnahmekanäle entspricht, reduzieren.

Claims

1. Mikroskopsystem zur optischen Abtastung von Objekten, insbesondere unter Fluoreszenzbedingungen, mit zumindest einer Objektbeleuchtungs einrichtung (14, 16; 46), zumindest einer ersten Bilddetektionseinrichtung (20) zur Detektion eines ersten Detektionsbereichs des Objekts und einer zweiten Bilddetektionseinrichtung (22) zur Detektion eines zweiten Detek tionsbereichs, welcher den ersten Detektionsbereich im wesentlichen umfaßt, wobei die Objektbeleuchtungseinrichtung (14, 16) einen Beleuch tungsmanipulator (24) zum selektiven Beleuchten des ersten und des zweiten Detektionsbereichs umfaßt.

2. Mikroskopsystem nach Anspruch 1, wobei die erste Bilddetektionsein richtung eine CCD-Kamera (20), die zweite Bilddetektionseinrichtung ein Okular (22) zum direkten optischen Betrachten und der Beleuchtungs manipulator (24) ein afokales Relay-System umfaßt.

3. Mikroskopsystem zur optischen Abtastung von Objekten, insbesondere unter Fluoreszenzbedingungen, welches zumindest zwei Bilddetektionsein richtungen (40, 42, 44) umfaßt, welche zur gleichzeitigen Detektion eines Detektionsbereichs des Objekts ausgelegt sind, wobei die erste Bilddetek tionseinrichtung (40) zur Detektion eines ersten und die zweite Bilddetek tionseinrichtung (42) zur Detektion eines zweiten optischen Wellenlängen bereichs ausgelegt ist.

4. Mikroskopsystem nach Anspruch 3, wobei jeweilige Detektionszeitdauern der ersten und zweiten Bilddetektionseinrichtung (40, 42) abhängig von detektierten Bildsignalstärken in den jeweiligen Wellenlängenbereichen getrennt voneinander einstellbar sind.

5. Mikroskopsystem nach Anspruch 3 oder 4, wobei die erste Bilddetektions einrichtung (40) eine erste CCD-Kamera und einen dichroitischen Strahl teiler (50) und die zweite Bilddetektionseinrichtung (42) eine zweite CCD- Kamera umfaßt, wobei der Strahlteiler (50) derart ausgelegt und im Detek tionsstrahlengang angeordnet ist, daß Detektionsstrahlen des Detektions bereichs in dem ersten Wellenlängenbereich per Transmission durch den Strahlteiler auf die erste CCD-Kamera und Detektionsstrahlen des Detek tionsbereichs in dem zweiten Wellenlängenbereich per Reflexion an dem Strahlteiler auf die zweite CCD-Kamera fallen.

6. Mikroskopsystem nach Anspruch 5, wobei analoge Kameraausgänge der zumindest ersten und zweiten CCD-Kamera (40, 42) jeweils mit Signal eingängen einer Digitalisiereinrichtung verbunden sind, welche für eine Multiplexverarbeitung von analogen Kamerasignalen ausgelegt ist.

7. Mikroskopsystem zur optischen Abtastung von Objekten, insbesondere unter Fluoreszenzbedingungen, welches zumindest eine Objektbeleuch tungseinrichtung (14, 16; 46), zumindest eine Bilddetektionseinrichtung (20; 40, 42, 44) zur Detektion von Detektionsbereichen des Objekts und eine Objektverschiebeeinrichtung (12) zur Verschiebung des Objekts umfaßt,
wobei die Objektverschiebeeinrichtung (12) zu einer Verschiebung des Objekts mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit ausgelegt ist, so daß nach einer Verschiebezeitdauer t_verschieb das Objekt um einen Detektions bereich verschoben ist, und
die Objektbeleuchtungseinrichtung (14, 16; 46) zu einer Erzeugung von Objektbeleuchtungspulsen der Zeitdauer t_puls ausgelegt ist, wobei t_puls einen Bruchteil von t_verschieb beträgt.

8. Mikroskopsystem zur optischen Abtastung von Objekten, insbesondere unter Fluoreszenzbedingungen, welches zumindest eine Objektbeleuch tungseinrichtung (14, 16; 46), zumindest eine Bilddetektionseinrichtung (20, 22; 40, 42, 44) zur Detektion von Detektionsbereichen des Objekts innerhalb einer Detektionszeitdauer t_detektion und eine Objektverschiebeein richtung (12) zur Verschiebung des Objekts umfaßt,
wobei die Objektverschiebeeinrichtung (12) zu einer Verschiebung des Objekts mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit ausgelegt ist, so daß nach einer Verschiebezeit t_verschieb das Objekt um einen Detektionsbereich verschoben ist, wobei t_detektion einen Bruchteil von t_verschieb beträgt.

9. Mikroskopsystem nach Anspruch 7, wobei t_puls ≦ t_verschieb/500, vorzugs weise t_puls ≦ t_verschieb/1000 gilt.

10. Mikroskopsystem nach Anspruch 7, wobei die Zeitdauer t_puls der Objektbe leuchtungspulse kleiner als 1 msec, vorzugsweise kleiner als 0,1 msec ist.

11. Mikroskopsystem nach Anspruch 8, wobei t_detektion ≦ t_verschieb/500, vorzugs weise t_puls ≦ t_verschieb/1000 gilt.

12. Mikroskopsystem nach Anspruch 8, wobei die Detektionszeitdauer t_detektion kleiner als 1 msec, vorzugsweise kleiner als 0,1 msec ist.

13. Mikroskopsystem nach einem der Ansprüche 7 bis 12, wobei die Objekt verschiebeeinrichtung (12) zur zumindest zweidimensionalen Verschie bung des Objekts senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopsystems ausgelegt ist.

14. Mikroskopsystem nach einem der Ansprüche 7 bis 13, wobei die Objekt verschiebeeinrichtung (12) einen Objektverschiebetisch und zumindest einen diesen verschiebenden elektrischen Verschiebemotor umfaßt.

15. Mikroskopsystem nach einem der Ansprüche 7 bis 14, wobei die Bildde tektionseinrichtung (20, 22; 40, 42, 44) eine CCD-Kamera ist, die vor zugsweise einen elektronischen Verschluß umfaßt.

16. Mikroskopsystem nach einem der Ansprüche 7 bis 15 mit einer Steuerein richtung, die mit der Objektbeleuchtungseinrichtung (14, 16; 46), der Bilddetektionseinrichtung (20, 22; 40, 42, 44) und der Objektverschie beeinrichtung (12) in Signalverbindung steht und ein automatisches optisches Abtasten eines mehrere Detektionsbereiche umfassenden Bereichs des Objekts steuert.

17. Verfahren zur optischen Abtastung von Objekten, insbesondere unter Fluoreszenzbedingungen, mittels eines Mikroskopsystems, insbesondere nach einem der vorangegangenen Ansprüche, welches zumindest eine Objektbeleuchtungseinrichtung (14, 16; 46), zumindest eine Bilddetek tionseinrichtung (20; 40, 42, 44) zur Detektion von Detektionsbereichen des Objekts und eine vorzugsweise elektrisch angetriebene Objektver schiebeeinrichtung (12) zur Verschiebung des Objekts umfaßt, mit den folgenden Schritten in dieser Reihenfolge:

a) Rücksetzen eines Bildsignalspeichers der Bilddetektionseinrichtung (20; 40, 42, 44) und Einstellen eines Zeitzählers timer = t₀;
b) zum Zeitpunkt timer = t₀ + t_verschieb des Zeitzählers Beleuchten eines Detektionsbereichs des Objekts mit einem Objektbeleuchtungspuls der Zeitdauer t_puls; und
c) Auslesen eines zeitintegrierten Bildsignals aus dem Bildsignalspei cher der Bilddetektionseinrichtung (20; 40, 42, 44),

wobei das Objekt während aller Schritte (a) bis (c) kontinuierlich durch die Objektverschiebeeinrichtung (12) derart verschoben wird, daß nach der Verschiebezeitdauer t_verschieb das Objekt um einen Detektionsbereich ver schoben ist, und die Pulszeitdauer t_puls derart gewählt wird, daß t_puls einen Bruchteil von t_verschieb beträgt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei t_puls ≦ t_verschieb/500, vorzugsweise t_puls ≦ t_verschieb/1000 gilt.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei nachfolgend auf Schritt (c) ein zusätzlicher Objektverschiebeschritt (d), insbesondere mit anderer Geschwindigkeit und Objektverschieberichtung, durchgeführt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Schritte (a) bis (c) eine vorbestimmte Anzahl von Wiederholungen wiederholt werden.

21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Schritte (a) bis (d) eine vorbe stimmte Anzahl von Wiederholungen wiederholt werden.