JPH11508688A - 空間自己相関によるレンズの焦点フィールドのイメージングおよび特徴化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 光集束素子の焦点で少なくとも２つの電磁ビームの焦点フィールドの相関を少なくとも空間的に実現する方法およびシステムであって、２つの電磁ビームの焦点フィールドから組み合わせられた焦点フィールドの振幅、位相、および偏光の空間分布が生成され、焦点に置かれた標本での前記生成された焦点フィールドへの物理応答が測定される。１つの電磁ビームの焦点フィールドの中に、他の電磁ビームの焦点フィールドに関して相対的な一次元または複数次元の空間シフトが導入される。これら電磁ビームの相対位相は、少なくとも１つの電磁ビームの周期的可変光学通路長によって制御される。標本中の物理処理の結果として、または標本における焦点フィールドの散乱の結果として、物理応答が検出されるが、その検出は任意選択的に所定の収集関数の助けを借りてなされる。物理応答は集束素子の焦点における物理応答の空間／時間分布の結合像である。前記の焦点フィールドに置かれた標本の物理応答が収集関数によって検出されるとき、横方向もしくは軸方向で分解能が増大した顕微鏡結像が可能である。前記の収集関数は特定されても特定されなくてもよい。さらに振幅、位相、または偏光に関しては、集束素子の光学軸上またはそれに沿って、集束素子の焦点フィールドの空間および時間量構造をポイント・スプレッド関数に関連させて決定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 空間自己相関によるレンズの焦点フィールドのイメージングおよび特徴化 本発明は、光集束素子の焦点の２つ以上の電磁場の少なくとも空間における相 関を実現する方法およびシステムに関するものである。 レンズおよびレンズシステムの光集束素子の製造者およびユーザにとっては、 レンズの特性を定量的に決定できることは非常に重要なことである。製造者にと って、ここで問題となっている点は、新しく設計した製品の検査およびきまりき った製品の品質管理の両方である。さまざまな用途のためのレンズおよびレンズ システムに関して、定量データは測定データの判定にとって重要である。現在の ところ、レンズの品質を決定するために使用できるさまざまな技術がある。実際 上、これらの技術の全ては、２つの主要な種類、すなわち(i)レスポンス関数（ ＯＴＦ）の測定［ケー・アール・バーアンズ(K.R．Barnes)著「レスポンス関数 」(Adam Hilger，London 1971)］あるいは(ii)ポイントスプレッドファンクショ ンの測定［ジー・ジェー・ブレーケンホッフ(G.J．Brakenhoff)、ピー・ブロム( P．Blom)、ピー・バーレンズ(P．Barends)共著「高開口浸漬レンズを有する共焦 点走査光顕微鏡法」(J．Microsc．117，1979，pp．219-232)］に割り当てること ができる。 全てのＯＴＦ測定法の原理は、２つの条件［エム・ボーン(M．Born)、イー・ ウォルフ(E．Wolf)共著「光学の原理」(Pergamon Press，Oxford，1980)］、す なわち(i)同一平面状態、すなわち結像レンズの結果としての波面収差は目標の 位置とは無関係である、および(ii)線形重ね合わせ、すなわち１つ以上の目標に よって発生された像点に及ぼす全影響は目標の各々の像点の個別値の線形合計に よって示されること、が満たされる場合、レンズシステムは目標における２次元 空間周波数に関して線形フィルタとみなすことができる仮定に基づいている。こ れらの仮定の下で、ＰＳＦはフーリエ変換によるＯＴＦに関連がある。 全てのＯＴＦ測定法が得られる２つの基本原理、すなわち(i)走査法、および( ii)シャーインターフェロメトリーがある。 走査方法は、検査さるべき目標のフーリエ成分の選択のための正弦格子の使用 に基づいている。格子は、目標あるいは像のいずれかにおいて使用することがで きる。この原理に基づいている技術の限界は、一般に、測定の精度に悪影響を及 ぼす低フォトン効率の結果である。さらに、空間周波数ゼロ（ＯＴＦの正規化に 必要である）および高空間周波数の伝達関数を容易に決定できないことがしばし ばある。必要な同一平面状態の仮定もこれらの技術の適応性における限定因子を 構成する。 シャーインターフェロメトリーに基づいている技術は、結像システムの出口口 径平面の自己相関関数を決定する。非コヒーレント照明の場合、ＯＴＦがこの自 己相関関数に等しいことを得ることは可能である［ジェー・ジェー・スタムネス (JJ．Stamnes)著の「焦点領域内の波動」(IOP出版社、Bristol，1986)］。これ はまた、わすかな修正で、コヒーレント照明の場合に応用する。シャーインター フェロメトリーに基づいている技術の限界は、単色光ＯＴＦだけが決定すること ができ、一般に非常に複雑な光学システムが必要であるということである。 全てのＯＴＦ測定法の限界は、これらの方法が３次元でシステムの応答を決定 できないことである。このような情報は、特に、サブミクロン分解能で３次元像 を形成することができる、例えば、（共焦点）顕微鏡法にとって重要である。 ポイントスプレッドファンクション（ＰＳＦ）もさまざまな方法で決定するこ とができる。大部分の場合、この方法は、ＰＳＦの固有幅よりも非常に小さい典 型的なサイズを有する点目標の３次元結像に基づいている。したがって、ＰＳＦ は、数学的再構成によって全視界で決定されるかあるいは点目標の移動による走 査あるいは検出器によって直接測定されるかいずれかである。これらの方法は高 精度でＰＳＦを決定することができるけれども、これらの方法は比較的遅く、す なわちしばしば１時間が単一測定のために必要であるので、光学測定セットアッ プの要求長期（ナノメートル）安定性を必要であるという著しい欠点を有する。 この種の方法の緩慢さもきまりきった整列あるいは検査手順に対してこれらの方 法を非実用的にする。これらの方法に対する光学・電子測定セットアップは一般 に非常に複雑であるので、測定を再現可能にすることは困難である。さらに、こ れらの方法は、しばしば特定のサンプルの形成を要求し、それによって、例えば 、蛍光、あるいは散乱ラテックスビードは特定の媒体に埋め込まれなければなら な い。したがって、サンプルの選択は、蛍光ビードの適用性および埋め込み媒体の 典型的な屈折率によって制限される。したがって、ＰＳＦを決定する場合、蛍光 物質の特性および溶剤の屈折率の両者に関して特定の実験条件はしばしばシミュ レートできない。 本発明の目的は、上記の問題を解決し、横方向および軸方向の分解能を改善す るために本発明の原理を（顕微鏡）画像およびパターン認識の分野に適用するこ とにある。分解能の改善度は、徐々に調整でき、横方向および軸方向の寸法で別 々に使用できる。 本発明の他の目的は、１つ以上の光集束素子からなるシステムの“実時間”検 査および整列を可能にする光集束素子、すなわちレンズの固有特性を測定する方 法を示すことにある。 本発明の他の目的は、光集束素子および／または外部要因によって誘起される 波面収差を決定し、これらのデータに基づいて、波面の（相互に）作用する制御 を達成することにある。 これは、光集束素子の焦点の少なくとも２つの電磁ビームの焦点フィールドの 少なくとも空間内で自己相関を実現する方法を使って、方法が焦点で焦点フィー ルドに基づいて結合された焦点フィールドの振幅、位相および偏光の固有空間分 布の発生工程および焦点に置かれたサンプルでの発生視界に対する物理的応答の 測定工程からなる発明により得られる。他の実施形態では、この方法も、結合焦 点フィールドの前記振幅、位相および偏光の時間分布の発生工程からなる。 前述の方法において、空間自己相関技術は、時間相関と任意に組合せて、光集 束素子のポイントスプレッド自己相関関数（ＰＳＡＦ）を示すために関数応答を 決定するために使用される。光集束素子は、レンズ素子の組合せあるいは（顕微 鏡）結像システムからなる任意のレンズ、すなわちレンズシステムであると理解 される。 本発明によれば、これは、少なくとも１つの電磁ビームを発生する少なくとも 電磁発生源、少なくとも１つの電磁ビームを少なくとも２つの部分ビームに分割 し、これらを再結合する機構、他の部分ビームの焦点に対して少なくとも部分ビ ームの中の１つの焦点の少なくとも１つの相対１次元あるいは多次元空間シフト および少なくとも１つの検出器を導入する機構を装備し、システムが、部分ビー ムの焦点がそれの中に形成され、結合焦点フィールドが前記焦点フィールドの振 幅、位相および偏光を含むグループからの少なくとも１つに関連がある物理的応 答をそこに発生するようにサンプルが光集束素子の向こうに配置され、物理的応 答の測定のための少なくとも１つの検出器が前記焦点の外側に置かれていること を特徴とする前述の方法を行うシステムを使っても得られる。 光集束素子のＰＳＡＦの決定に関しては、任意の波長で、任意の光源（放電ラ ンプ、連続波レーザあるいはフェムト秒パルスレーザシステムに及ぶどれでも） によって発生される入来電磁ビームは２つの制御部分に分割される。入来電磁ビ ームの２つの部分は、それぞれ“基準”ビームおよび“目標”ビームと示されて いる。目標ビームは、基準ビームと結合する前に可変遅延線を通る。可変遅延線 は、再結合する前に２つのビームの相対時間一致あるいは同時性を制御するため に使用することができる。２つのビームは、適切な方法で（例えば、好ましい実 施形態では同一直線上に）結合され、検査中の光集束素子によってサンプルで集 束される。直交（例えば、“シータ”［イー・エッチ・ケー・ステッルツアー(E .H.K．Stelzer)、エス・リンデック(S．Lindek)共著「照明軸に直交な検出によ る遠視野光顕微鏡法における観察量の基本的な減少：共焦点シータ顕微鏡法(Fun damental reduction of the observation volume in far-field light microsco py by detection orthogonal to the illumination axis:confocal theta micro scopy)」(J.Microsc．111，1994，pp.536-547)］照明条件は軸方向のＰＳＡＦに おける非対称の決定のために使用することができる。ここに記載された印加モー ドでは、サンプルは、入来電磁場に一致する吸収スペクトルを有する一方あるい は他方の蛍光物質の溶液からなる。異なる構造のサンプルは、同様に、例えば、 集束素子の焦点フィールドの典型的な寸法よりも著しく小さい半径を有する蛍光 球体、薄い蛍光層、あるいはより複雑な構造を有するサンプルのように使用する ことができる。 振幅、位相および偏光によって規定された光集束素子の焦点の電磁場の３次元 構造は、焦点フィールドをそれ自体と相関することによって決定される。この自 己相関は、基準視界（“焦点基準視界”として示されている）の焦点に対して目 標視界（“焦点目標視界”として示されている）の焦点の空間シフトを誘起し、 光集束素子の焦点の結合視界（“全焦点フィールド”として示される）を測定す ることによって実現される。 視界の複合量が実際量に変換されるときにこの測定が行われる。これは、任意 の物理的工程（蛍光、４波動混合等が続く１つ、２つあるいは多数のフォトン吸 収）によって行うことができる。両方の場合、物理的応答は、特定の収集関数に よって検出され、サンプルから伝搬する１つ以上の電磁場からなる。前記収集関 数は、１つの検出器あるいは検出器の組合せ上の直接像のいずれかを使用するこ とによって特に形成することができるので、数量が測定されるべき光集束素子の 焦点の物理量の特定空間／時間分布の像である収集関数が発生される。さらに、 検出において、物理的応答（例えば、蛍光ビーム）の（周期的）位相変化および 多次元空間シフトを印加する機構を含む単一あるいは複数の分割および結合の焦 点フィールドにおける振幅、位相および偏光の特定空間／時間分布を形成するた めに使用されるのと同じように使用を行うことができる。 例えば、吸収工程による、あるいは適切に配置、分析された検出器を利用する ことによる散乱の場合のような物理的応答を発生するサンプルの使用は、この場 合、各空間位置における（複合）全視界を正方形にすることによって局部検出器 を形成する。複合視界を正方形にすることが検出器でのみ行われる従来の方式に 比べて、この応用は、応答がそれの積分値に関連がある代わりに、集束素子の焦 点フィールドにおける各空間位置の局部量に関連がある顕著な長所をもたらす。 換言すると、合計の平方の代わりに、本発明では平方の合計が測定される。 さまざまな位相の結果は光集束素子によって発生されるような集束視界の空間 範囲を飛び越えるので、焦点目標視界が焦点基準視界を越えてシフトされる場合 、特定の干渉パターンが発生される。光集束素子の焦点フィールドの３次元構造 の測定の基本原理は、本発明によれば、焦点フィールドのコピーの空間シフト、 あるいは規定された方法でそれに関連がある焦点フィールド、すなわち、（前述 のＯＴＦあるいはＰＳＦ決定のための方法におけるよりもかなり少ない限定形式 の）ある程度の同一平面状態および焦点フィールドにおける各点の局部視界力に 敏感である検出器としての物理的工程の使用がある条件に基づいて同じ最初の電 磁ビームあるいは最初の電磁ビームに対する他の電磁ビームからなる。 多数の可能な基本測定は、本方法に含まれる。すなわち、 (i) 基準視界に対する目標視界のさまざまな空間シフトに対する基準視界およ び目標視界の時間一致の間、光集束素子の焦点の空間範囲にわたって積分された 局部電磁場強度、 (ii) 基準視界に対する目標視界のさまざまな空間シフトに対するシステムの 物理的応答の最大強度と最小強度との差。これに関連して、この基本的測定の形 式の物理的応答は、例えば、基準視界に対する目標視界の変化する光路長によっ て誘起される適切な変化する位相変化の印加のために、正負の干渉の結果、光集 束素子の焦点の空間範囲にわたって積分された交互の局部電磁場強度から成る。 (iii) 基準視界に関する目標視界のさまざまな空間シフトに対する印加位相変 化の位相に対するシステムの物理的応答の相対位相。これに関連して、この基本 的測定の形式の物理的応答は、例えば、基準視界に対する目標視界の変化する光 路長によって誘起される適切な変化する位相変化の印加から生じる、正負の干渉 の結果、光集束素子の焦点の空間範囲にわたって積分された交互の局部電磁場強 度から成る。変化の位相は、時間一致に対する目標ビームと基準ビームとの間の 経路長の差によって決定される。 (iv) 基準視界に対する目標視界のさまざまな空間シフトに対するシステムの 物理的応答の一定部分。これに関連して、この基本的測定の形式の物理的応答は 、例えば、基準視界に対する目標視界の変化する光路長によって誘起される適切 な変化する位相変化の印加から生じる、正負の干渉の結果、光集束素子の焦点の 空間範囲にわたって積分された交互の局部電磁場強度から成る。変化の位相は、 時間一致に対する目標ビームと基準ビームとの間の経路長の差によって決定され る。 測定からの結合情報は、“実時間”に、本発明により、ＰＳＦを使って可能で ある方法に匹敵できるように、振幅、位相および偏光に関して、光集束素子の焦 点フィールドの特徴化に適している多数のパラメータを生じる。これは全て３つ の空間座標の特性把握に応用する。この方法の基本的な実施形態では、基準視界 に対する目標視界の空間焦点シフトを誘起する簡単な走査ユニットだけおよび正 しい屈折率を有する媒体における適切な蛍光物質の溶液が必要とされる。この方 法の速度およびサンプル作成の簡単さは、光集束素子の検査および測定、複合結 像システムの整列および最適化、光集束素子そのものによって誘起された波面収 差の測定が行われる媒体あるいは外部要因による決定、および画像およびパター ン認識に適している技術を際立たせる。 レンズの品質に関連する情報を供給する応答を決定する他の方法はＦ.Ｐ.Ｇ.L acosteの米国特許第4,347,000号に開示されている。この場合、光源および光ビ ームを２つの部分に分割するビームスプリッタからなる干渉測定システムが使用 される。検査されるレンズは２つの光路の中の１つに配置されている。２つの光 ビームは、その共同効果が光検出器を使って測定される前に反射され、同じビー ムスプリッタに再び結合される。レンズが配置される光路以外の光路における反 射器は、光ビームの軸に沿っての並進および前記軸に垂直な回転の両方の形で移 動できる。検出される応答はレンズの複合ＰＳＦを示している。本発明は、(i) 視界の複合量の実際量の変換が検出器そのもの代わりにサンプルにおけるローカ ルレベルで行われるサンプル、(ii)相互相関の代わりに焦点フィールドの自己相 関、(iii)その結果、レンズのポイントスプレッドファンクションの全３次元が 利用できる異なる収集関数を利用するだけ前記特許と異なる。 本発明は、図面に関するわずかの実施形態を使ってより詳細に説明される。 図１は、ＰＳＡＦの決定のための実施形態の概略図を示している。 図２は、ビームスプリッタの回転と焦点基準視界に対する焦点目標視界の３次 元シフトが実現できることを示すレンズの移動に基づいた他の実施形態の概略図 を示す。 図３は、焦点基準視界に対する焦点目標視界の３次元シフトが実現できること を示すレンズの３次元移動に基づいたさらに他の実施形態の概略図を示す。 図４は、２つの電磁ビーム間の路長の差を導入する簡単な装置の概略図を示し ている。 図５は、焦点基準視界に対する焦点目標視界の３次元シフトおよび目標ビーム と基準ビームとの間の路長の調整可能な差の両方を意味する図２〜図４の実施形 態に示されるような原理の組合せの概略図を示している。 図６は、３次元（顕微鏡）結像の実現のための実施形態の概略図を示している 。 図７〜図９は、理論的に計算されたＰＳＡＦおよびＰＳＦと比較された多様な 実験的に決定されたＰＳＡＦの図を示している。 本発明による手順あるいは方法のより詳細な説明のために、可能な実施形態の 概略図が図１に示されている。低電力連続波レーザ１によって発生された電磁ビ ームは、ビーム幅が光集束素子９の口径を完全に埋めることを確実にし、事実上 平行ビームが与えられることも確実にする望遠鏡２を通過する。それから、この ビームは、５０％ビームスプリッタ４によって２つの部分に分割される。一方の 部分、すなわち“基準”ビーム１３は、２つのミラー３ａ、３ｂを通過するのに 対して、一方の部分、すなわち、“目標”ビーム１２は、可変遅延線５上に取り 付けられる２つの同様なミラー３ｃ、３ｄを通過する。２つの部分は、第２のビ ームスプリッタ６を使って再び結合される。可変遅延線の移動の結果、基準ビー ムに対する目標ビームの路長が変化するので、結合点での相対時間一致あるいは 同時性が制御できる。結合後、結合ビームの一方の部分がビームストッパ７によ って収集されるのに対して、他方の部分が光集束素子９によってサンプル１０に 集束される。このサンプルは、一方あるいは他方の溶剤の中の蛍光物質の溶液か ら成る。蛍光物質あるいは溶剤のいずれかに関する特定の制約は全然ない。両方 は、測定の目的に最も良く適合するように選択することができる。これは、蛍光 物質の吸収および蛍光特性に関する選択の自由および特定の屈折率を有する溶剤 あるいは溶剤の適切な混合物の使用のための選択の自由を含んでいる。放出され る蛍光は、“光電子増倍管”検出器１１によって後方散乱方向で測定され、ダイ クロイックミラー８によってレーザ波長の散乱光から分離される。 図２および図３は、焦点基準視界に関する焦点目標視界にシフトを導入する２ つの他の実施形態を示している。 図２の方法は、両方のビームの伝搬の方向に垂直な平面に焦点基準視界に関す る焦点目標視界の２次元シフトを導入する結合ビームスプリッタ６の回転を使用 する。この回転は、例えば、モータを付けられた工程モータ、圧電子駆動装置あ るいは何か同様なものを使用することによって行うことができる。遠距離中心条 件が満たされるように光集束素子９の口径に対して前記束スプリッタを配置する ことによって、目標ビームのシフト中、適切な口径の充填が保持される。第３の 次元は、２つのレンズ１４、１５、一つは基準ビームに、一つは目標ビームに加 えることによって焦点基準視界に対する焦点目標視界のシフトに加えられる。伝 搬の方向に平行な方向にレンズ１４を移動させることによって、目標ビームの焦 点は伝搬方向に平行な方向にもシフトされる。この方法は、両方のビームに対す る同一の光学条件を確実にするために両方のビームにレンズを使用する。レンズ １４の移動は、例えば、モータを付けられた工程モータあるいは圧電子駆動装置 を使用することによって再び行うことができる。前述と同様な効果は、目標ビー ムおよび基準ビームのそれぞれの伝搬の軸に沿ってレンズ１４および１５の両方 の結合された反対方向の移動によって得ることができる。 焦点基準視界に対する焦点目標視界の３次元シフトは、図３に示されるように 、レンズ１４の一方の並進で統合することができる。この場合、レンズ１４は、 焦点基準視界に対する焦点目標視界の対応する３次元シフトを生じる３次元で移 動される。もう一度、レンズの移動を駆動するモータを付けられた工程モータ、 圧電子駆動装置あるいは何か同様なもの使用を行うことができる。前記装置は、 “実時間”で高速データ収集および測定を可能にする高速度で、図２および図３ に示されるように、レンズ１４あるいはビームスプリッタ６の移動を駆動できる 。 基準ビームおよび目標ビームの両方の検査される光集束素子の口径にわたって 特定の位相および振幅分布を加えるより複雑な方法は、例えば、異なる形状（円 形、正方形等）、環帯の口径を利用することによる異なるアポディゼーション条 件および／または、例えば、液晶マトリックスを使用して得ることができるよう な光集束素子の口径にわたるより一般的な局部振幅、位相および偏光の条件の調 整を使用することによって使用することができる。 結合ビームがサンプルで集束された後、誘起された吸収工程から生じ、焦点の 空間範囲にわたって積分された蛍光が測定される。この方法では、吸収工程は、 局部“正方形検出器”の役目を果たす。すなわち、全焦点フィールド（基準およ び目標）の局部振幅および位相は、局部強度‐その振幅が空間にわたって積分後 に測定される電磁場振幅の複素数平方に変換される。この節の残りで述べられる この原理の最も簡単な実行は、蛍光の単一フォトン吸収および検出を含んでいる 。しかしながら、多数の他の光学処理は、飽和吸収、２つのフォトン吸収、多数 のフォトン吸収、４波動混合、適切に配置され、分析された検出器等を使用する 散 乱のような同じ効果のために使用できる。いわゆる“プログラム化”の光パルス の使用も行うことができ、その場合、パルスの周波数／時間パルスは、特定の方 法で形成され、時間分解測定の使用を行うことができる。 好ましい実施形態では、可変遅延線５の周期的移動は基準ビームに対して目標 ビームの相対時間遅延に影響を及ぼす。ある結果、多数の交互の建設的な干渉お よび破壊的な干渉は可変遅延線の各移動中の吸収レベルで発生される。順に、こ れは検出蛍光信号の変動（すなわち、振動）を生じる。これらの振動の振幅は、 重なりの度合い、それぞれの偏光状態、相対コヒーレンスおよび２つの焦点フィ ールド間の位相関係に関連がある。焦点フィールドの自己相関は、焦点基準視界 に対する焦点目標視界の誘起焦点フィールドシフトの関数としてこれらの振動の 振幅を測定することによって測定される。可変遅延線の連続移動がこの方法を基 準ビームあるいは目標ビームのいずれかの光路長を変える外部影響に比較的に鈍 感にする事実は、干渉測定情報内容が保持されている間、光集束素子の特性のた めの“ユーザフレンドリ”測定ツールとしてこの方法の応用にとって非常に価値 がある。 図４は、例えば、目標ビームと基準ビームとの間の変わる光路長によって誘導 される変わる位相変化を導入する簡単な方法および装置の概略図である。この方 法では、２つのミラー３ｅ、３ｆのみおよびビームの分割およびビームの結合の 両方をするために使用される１つのビームスプリッタ１６の使用が行われる。結 合後、結合ビームの一方の出現する部分は先の図面におけるようにビームストッ パ７によって収集される。可変遅延線１７上に取り付けられるビームスプリッタ １６の移動の結果、相対経路長は他方の部分に対するビームの一方の部分に対し て変わる。ビームスブリッタの特定の移動は、分割ビームの２つの部分の相対経 路長が４倍以上大きい変化を生じる。自己相関システム技術に時間遅れを導入す る通常の技術よりも優れているこの方式の長所は、より少ない光学素子および可 変遅延線のためのドライバのより少ない移動が所与の同一の時間遅れのために必 要とされることである。より短い光路は、よりコンパクトで、本来より安定であ る構成を可能にする。図４に示されるような構成は、１センチメートルよりも小 さい寸法を有する構成素子で実現することができる。当業者に公知であるような 、 可変遅延線１７を駆動する多様な技術の使用を行うことができる。図４に示され るようなここに記載されたシステムは、前述された応用に適していることに加え て、光パルスの持続時間を測定する標準自己相関技術の使用にも際立って適して いる。 図５は、図２〜図４の実施形態に示されるような多様な原理が単一のモジュー ルを形成するためにいかに結合することができるかを概略的に示している。入射 ビームは可変遅延線１９上に実装されているビーム分割器１８によって分割され る。ビームの両方の部分は、形状の変化を誘起する（相互に）作用する素子が装 備することができる特定の曲率を有するミラー３ｇ、３ｈを通る。異なる曲率は 、光集束素子を越える基準ビーム１３および目標ビーム１２の特定の焦点フィー ルドの軸方向の位置を与える。焦点基準視界に対する焦点目標視界の付加的横方 向のシフトは２つのミラー３ｇの中の一つの二次元傾斜によって得られる。 蛍光振動の振幅は、信号の振動周波数に一致した電子帯域通過フィルタを使用 して、あるいはロックイン増幅器によって測定される。蛍光振動の振幅とは別に 、この方法に対して関連がある多数の他のパラメータが測定することができる。 これらは、蛍光信号の一定の（非振動）部分、時間遅れがゼロの時（すなわち、 光路長が基準ビームおよび目標ビームに対して同じであるとき）の蛍光強度、お よび時間遅れゼロに対する蛍光の振動部分の位相がある。これらの信号の全ては “実時間”で測定することができ、レンズの高速のきまりきった検査に対する応 用のこの応用の結果、３次元イメージングあるいはパターン認識の場合のレンズ あるいはレンズシステムおよび高速データ収集のアライメントが可能になる。 前述の方法は、有利なことには、図６に概略的に示されるように増加された横 方向および／または軸方向の分解能を有する、ある方法あるいは他の方法で構成 されたサンプルの（顕微鏡）結像のために使用することができる。この場合、物 理的な応答は、ページ６およびページ７に記載されたような基本測定の中の一つ により、およびとりわけ図２および図３に関して記載されたように得られた基準 ビーム１３の焦点フィールドおよび目標ビーム１２の焦点フィールドの特定位置 に対するサンプル１０の３次元位置の関数として測定される。前記測定は、全視 界に対してサンプルを移動させるかあるいはサンプルに対して全視界を移動させ る（走査する）のいずれかによって行うことができる。物理的応答、例えば、サ ンプルの蛍光は、検出器によって、あるいは特定の収集関数を使って直接測定す ることができる。その動作中サンプルにおける空間周波数を増幅できるこの手順 は、目標ビームおよび基準ビームの焦点フィールドの異なる位置に対して繰り返 すことができる。この収集関数は、例えば、共焦点検出を使用することによって 発生することができ［ジー・ジェー・ブレーケンホッフ(G.J．Brakenhoff)、ピ ー・ブロム(P．Blom)、ピー・バーレンズ(P．Barends)共著「高開口浸漬レンズ を有する共焦点の走査光顕微鏡法」(J．Microsc．117，1979，pp．219-232)］、 対の検出分布は、標準ビームおよび目標ビームの焦点フィールドに対して特定の 位置に配置されている。目標ビームおよび基準ビームの焦点フィールドの（空間 および時間における）合致の限界において、従来の共焦点の顕微鏡法に相当する イメージングの方法は、例えば、材料科学からの生物学的サンプルの３次元構造 の測定のために使用することができる。より複雑な収集関数は、測定されるべき 集束素子の焦点の物理量の特定空間／時間分布の像である収集関数が得られるよ うにいくつかの検出器を利用することによって発生することができる。 多様な信号における情報内容は、それにより光集束素子の焦点フィールド（あ るいは前記素子の特性把握および最適化に適している得られたパラメータ）が一 般的な条件の下で計算することができるスカラーあるいはベクトルの回折理論に 基づいた理論的モデルを利用することによって分析することができる。したがっ て、異なる集束条件は、異なるアポディゼーション条件の下での口径に対してお よびオン光軸あるいはオフ光軸のいずれの口径の後部の幾何学的焦点の異なる位 置に対して焦点フィールドを計算することによってモデル化することができる。 基準視界および目標視界に対する位相ひずみは、これらの計算における適切な位 相関数および振幅関数を利用することによってモデル化することができる。視界 の各々の偏光状態は視界のベクトル特性を説明に組み入れることによってモデル 化することができる。 この方法を使用して得られるような実験的結果および理論上の結果の例は、図 ７〜図９に示されている。十分補正された顕微鏡の対物レンズの３つの異なる開 口数（ＮＡ）に対するＰＳＡＦの実験的測定点は、図７〜図９の三角形によって 示されている。したがって、ＰＳＡＦは各開口数に対して理論的に計算されてい る。これらの曲線、すなわち前記図における連続線は、適切なパラメータ、つま り実験との最適な一致が得られるように理論上の計算における所定のパラメータ を調整しないで計算されている。比較するために、理論的に計算されたＰＳＦは 、破線によって図面にも示されている。特に、実験の理論的なシミュレーション において適切なパラメータがないことを考慮する実験と理論との優れた一致は、 この技術がＰＳＡＦの決定および(i)解像力、第一次レンズ収差および高次レン ズ収差のような光集束素子の特性、および理論的なモデルと組合せて、(ii)光学 システム、例えば、溶剤の（変わる）屈折率によって誘起された位相収差の解析 の定性および定量測定に対して与える可能性を示している。したがって、ＰＳＡ Ｆは、ＰＳＦに匹敵できるように、およびＰＳＦに関連があるように、光集束素 子の特性把握のための新しい関数である。 前述された好ましい実施形態は、多様な方法において修正および拡張すること ができる。これに関連して、例えば、異なる波長の電磁ビームの組合せの使用を 例えば考察することが可能である。異なる波長の各々は、サンプルに集束される 前にそれ自身のあるいは部分的結合されたビームスプリッタおよび遅延線の組合 せを通過する。この種の実施形態は、光集束素子あるいはサンプルで結像された 目標のいずれかのスペクトル特性の測定のために使用することができる。 例えば、共焦点の顕微鏡法を使用して得られた３次元画質は、画像復元技術［ エッチ・ティー・エム・ブィ・デー・ブート(H.T.M.v.d．Voort)、ケー・シー・ ストラスターズ(K.C．Strasters)共著「定量画像分析のための共焦点画像の復元 (Restoration of confocal images for quantitative Image analysis)」(J．Mi crosc.，178(2)，pp．165-181(1995)］を使ってかなり改良することができる。 これらの技術は、イメージングシステムのＰＳＦの正確な知識を必要とする。本 発明に記載されたような方法は、前記ＰＳＦが非常に高速度（“実時間”）で得 ることができるデータを発生することができる。さらに、照明波長、蛍光物質、 放出波長、媒体の屈折率およびイメージングが生じるサンプルにおける深さに関 してさえ、イメージングが生じる条件と事実上と同じである条件の下で測定が行 うことができる。 パターン認識に関しては、目標を照明する１つ以上の電磁ビームのプロフィー ルにわたる高精度の小さい振幅変化および位相変化で検出することが重要である 。これは、電磁ビームが目標を通過するモード、電磁ビームが目標によって反射 されるモード、および電磁ビームが目標によって、例えば、蛍光に変換されるモ ードに対して適用する。本発明に記載されたような方法は、高精度で、簡単で安 定な構成で“実時間”で、電磁ビームにおける任意の点あるいはそれの焦点の振 幅、位相および／または偏光を決定する可能性がある。 本発明で記載されたような方法は、図６に関して既に述べたようなイメージン グ技術としても使用できる。空間および時間の両方における焦点基準視界に対す る焦点目標視界の適切なシフトを適用することによって、サンプルにおける振幅 、位相および偏光に関して特定の、制御できる励起あるいは照明プロフィールを 応用できる。同様な方法は、１つ以上の検出器上に特定の方法で物理的応答を結 像することによって検出で使用することができる。したがって、多様なこのよう な照明および／または検出ブロフィールのためのシステムの物理的応答の測定か らのデータの分析はサンプルにおける目標の像を発生するために使用することが できる。イメージングは、直接行うことができるかあるいはアナログ方法、ディ ジタル方法あるいは他の方法を使ってデータを適切に処理した後行うことができ る。これに関連して、例えば、照明のためのポイントモード、カーソルモード等 のような多様な照明モードの使用が行うことができる。さらに、例えば、振幅フ ィルタおよび位相フィルタ、あるいはホログラフィーシステムによって照明およ び検出の両方における波面の調整の使用を行うことができる。このシステムの物 理的応答は付加電磁ビームを使用することによってサンプルにおける分子の多様 なエネルギーレベルにわたる母集団およびコヒーレンス分布を変えることで影響 を及ぼすこともできる。任意には適切なコンピュータ解析技術と組合せるこれら の異なる実施形態の各々は、横方向および軸方向の両方におけるイメージングに 高分解能をもたらすことができる。 本発明の基本原理の適切な摘要によって、複雑な数学的処理を実現できること は任意である。したがって、数学関数は、光集束素子の焦点の振幅、位相および 偏光の特定分布によって抽象的な形で示すことができる。このように、異なる関 数は異なる電磁（部分）ビームを使用することによって表すことができる。サン プルにおける物理的処理は数学的（複素数）積を示すことに対して、検出は、１ つ以上の次元で特定あるいは非特定の積分を示している。このような摘要を行う ことによって、本発明に記載されたような方法を使って、特定の演算が実行され る数学的表現の複合多次元積分を非常に高速度に実現できる。（均質、ランダム あるいは構造化された）サンプルの選択およびサンプルにおける物理的（相互作 用）処理（散乱、単一のフォトン吸収、多数のフォトン吸収等）は、積分以前の 表現によって実行できる数学的操作を共同決定する。 本発明は若干の実施形態に関して記載されたけれども、変更および修正は、下 記の請求の範囲に示されるような本発明の本質およびその範囲に悪影響を及ぼさ ないで可能であることが当業者に明らかである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年５月２２日 【補正内容】 請求の範囲 １．光集束素子の焦点で少なくとも２つの電磁部分ビームの部分焦点フィール ドを少なくとも空間的に自動相関させることによって光集束素子の焦点フィール ドを結像および特性化する方法であって、前記部分焦点フィールドから組み合わ せられた焦点フィールドの振幅、位相、または偏光の少なくとも空間分布を前記 焦点で生成する工程と、前記焦点に標本を置いて前記焦点フィールドの振幅、位 相、および偏光の少なくとも１つに関連した物理応答を生成する工程と、前記焦 点の前方で少なくとも１つの検出器により前記物理応答を測定する工程とを含む 、結像特性化方法。 ２．前記電磁ビームの１つの焦点フィールドの中に、前記電磁ビームの他の１ つの焦点フィールドに関して相対的な一次元または複数次元の空間シフトを導入 した、請求項１に記載の方法。 ３．前記少なくとも２つの電磁ビームの相対位相が、前記電磁ビームの少なく とも１つに可変の光学通路長を導入することによって制御される、請求項１また は２に記載の方法。 ４．前記光学通路長が周期的に変更される、請求項３に記載の方法。 ５．前記組み合わせられた焦点フィールドの局所的複素数値を局所的実数物理 量へ変換する標本中の物理的処理の結果として物理応答が検出される、前記請求 項の一つに記載の方法。 ６．標本中で前記組み合わせられた焦点フィールドを散乱させる結果として前 記物理応答が検出される、請求項１ないし４の一つに記載の方法。 ７．前記物理応答が、応答が測定される光集束素子の焦点で前記物理応答の空 間／時間分布を１つの検出器で直接に結像するか複数の検出器で組み合わせて結 像することにより、所定の収集関数の助けを借りて検出される、請求項５または ６に記載の方法。 ８．前記物理応答を少なくとも空間的に相関させるために、前記物理応答を少 なくとも２つの部分応答に分割する工程と、前記部分応答の１つの中に他の部分 応答に関して相対的な一次元または複数次元のシフトを導入する工程と、これら の部分応答を結合する工程とを含む、請求項７に記載の方法。 ９．前記少なくとも２つの部分応答の相対位相が制御される、請求項８に記載 の方法。 １０．前記所定の収集関数が種々のアポディゼーション条件と組み合わせられ る、請求項７に記載の方法。 １１．前記振幅、位相、および偏光の少なくとも１つに関し、前記集束素子の 前記組み合わせられた焦点フィールドにおける空間および時間の量的構造が、ポ イント・スプレッド関数と関連させられて、光学軸上でまたはそれを離れて決定 される、請求項１ないし１０の一つに記載の方法。 １２．前記電磁ビームの波面が、前記集束素子の有効口径もしくはその焦点で 前記集束素子、前記標本、または外部要因によって引き起こされて前記波面に存 在する収差と共に決定される、請求項１ないし１０の一つに記載の方法。 １３．結像される物体の一次元または複数次元の分解および断面化を改善する ために前記振幅、位相、および偏光の少なくとも１つの空間／時間分布を前記組 み合わせられた焦点フィールドで決定し、所定の収集関数と組み合わせる、請求 項１ないし１０の一つに記載の方法。 １４．前述の請求項に記載された結像特性化方法に従って光集束素子の焦点フ ィールドを結像および特性化するシステムであって、電磁ビームを発生する電磁 源と、前記電磁ビームを少なくとも２つの部分ビームに分割しそれらの部分ブー ムを結合する機構と、前記部分ビームをフォーカスする光集束素子と、少なくと も１つの部分ビームの焦点に、他の部分ビームの焦点に関して相対的な一次元ま たは複数次元の空間シフトを導入する機構と、検出器とを備え、前記光集束素子 の前方に標本が置かれて前記部分ビームの焦点がその中に形成され、前記組み合 わせられた焦点フィールドがその振幅、位相、および偏光の少なくとも１つに関 連した物理応答を生成し、前記物理応答を測定するために前記検出器が前記焦点 の外側に置かれている、結像特性化システム。 １５．前記部分ビームの少なくとも１つのために可変の光学通路長を導入する 機構を備えた、請求項１４に記載のシステム。 １６．前記可変の光学通路長を導入する機構が周期的な変動を受ける、請求項 １５に記載のシステム。 １７．単一の電磁ビームから引き出された少なくとも２つの部分ビームの焦点 フィールドを少なくとも空間的に自動相関させるシステムであって、相互に対向 して平行に配置された２つのミラーと、前記２つのミラーと本質的に平行してそ れらミラーの間に配置され平行方向を横切る方向（図４）で移動可能な分割結合 機構とを備え、入射する前記単一の電磁ビームが前記分割結合機構によって２つ の部分ビームに分割され、その各々が前記ミラーの各々によって反射された後に 前記分割結合機構によって結合され、結合された２つの部分ビームが光集束素子 を介して導かれることによって、前記光集束素子の焦点で前記２つの部分ビーム の焦点フィールドが少なくとも空間的に自動相関させられる、自動相関システム 。 １８．前記分割結合機構が周期的な変動を受ける、請求項１７に記載のシステ ム。 １９．前記２つのミラーの各々が少なくとも２次元の回転（図５）のために所 定の曲率と機構を有する、請求項１７または１８に記載のシステム。 ２０．前記ミラーの形状をインタラクティブに変更する素子を備えた、請求項 １９に記載のシステム。 ２１．前記集束素子の有効口径に可変半径の環状開口が設けられた、請求項１ ４ないし１６の一つに記載のシステム。 ２２．前記電磁ビームの波面をインタラクティブに補正する素子を備えた、請 求項１４ないし１６と２０の一つに記載のシステム。 ２３．前記電磁ビームの波面を修正するために異なった形状の複数の有効口径 を設けられた、請求項１４ないし１６と２１と２２の一つに記載のシステム。 ２４．前記有効口径の少なくとも１つの上に振幅および位相フィルタを設けら れた、請求項２３に記載のシステム。 ２５．前記標本における分子の集団もしくは一貫性の状態に変化を起こさせる ために他の電磁源を備えた、請求項１４ないし２４の一つに記載のシステム。 ２６．パターン認識を行う、請求項１１と１２の一つに記載の方法。 ２７．顕微鏡結像を行う、請求項１ないし１３の一つに記載の方法および請求 項２３または２５に記載のシステムを使用する方法。 ２８．得られた像を使用して、さらに前記得られた像の一次元または複数次元 のデータ処理、レンダリング、再構成、もしくは復元を行う、請求項１ないし１ ３の一つに記載の方法。 ２９．前記光集束素子を最適化する、請求項１ないし１３の一つに記載の方法 および請求項２５に記載のシステムを使用する方法。 ３０．前記振幅、位相、および偏光の少なくとも１つの空間／時間分布を前記 光集束素子の焦点で適用し、数学関数の光学数式を実現する、請求項１ないし１ ３の一つに記載の方法および請求項２５に記載のシステムを使用する方法。 ３１．数学演算を施され、前記標本の構造と物理処理によって決定される少な くとも２つの数学関数の一次元または複数次元の積分が前記物理応答の検出によ って実行される、請求項３０に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── 【要約の続き】 特定されなくてもよい。さらに振幅、位相、または偏光 に関しては、集束素子の光学軸上またはそれに沿って、 集束素子の焦点フィールドの空間および時間量構造をポ イント・スプレッド関数に関連させて決定することがで きる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．光集束素子の焦点で少なくとも２つの電磁ビームの焦点フィールドを少な くとも空間的に相関させる方法であって、前記焦点フィールドから組み合わせら れた焦点フィールドの振幅、位相、および偏光における空間分布を前記焦点で生 成する工程と、前記焦点に置かれた標本で生成された焦点フィールドへの物理応 答を測定する工程とを含む、相関方法。 ２．前記電磁ビームの１つの焦点フィールドの中に、前記電磁ビームの他の１ つの焦点フィールドに関して相対的な一次元または複数次元の空間シフトを導入 した、請求項１に記載の方法。 ３．前記少なくとも２つの電磁ビームの相対位相が、前記電磁ビームの少なく とも１つに可変の光学通路長を導入することによって制御される、請求項１また は２に記載の方法。 ４．前記光学通路長が周期的に変更される、請求項３に記載の方法。 ５．前記組み合わせられた焦点フィールドの局所的複素数値を局所的実数物理 量へ変換する標本中の物理的処理の結果として物理応答が検出される、前記請求 項の一つに記載の方法。 ６．標本中で前記組み合わせられた焦点フィールドを散乱させる結果として前 記物理応答が検出される、請求項１ないし４の一つに記載の方法。 ７．前記物理応答が、応答が測定される光集束素子の焦点で前記物理応答の空 間／時間分布を１つの検出器で直接に結像するか複数の検出器で組み合わせて結 像することにより、所定の収集関数の助けを借りて検出される、請求項５または ６に記載の方法。 ８．前記物理応答を少なくとも空間的に相関させるために、前記物理応答を少 なくとも２つの部分応答に分割する工程と、前記部分応答の１つの中に他の部分 応答に関して相対的な一次元または複数次元のシフトを導入する工程と、これら の部分応答を結合する工程とを含む、請求項７に記載の方法。 ９．前記少なくとも２つの部分応答の相対位相が制御される、請求項８に記載 の方法。 １０．前記所定の収集関数が種々のアポディゼーション条件と組み合わせられ る、請求項７に記載の方法。 １１．前記振幅、位相、および偏光の少な〈とも１つに関し、前記集束素子の 前記組み合わせられた焦点フィールドにおける空間および時間の量的構造が、ポ イント・スプレッド関数と関連させられて、光学軸上でまたはそれを離れて決定 される、請求項１ないし１０の一つに記載の方法。 １２．前記電磁ビームの波面が、前記集束素子の有効口径もしくはその焦点で 前記集束素子、前記標本、または外部要因によって引き起こされて前記波面に存 在する収差と共に決定される、請求項１ないし１０の一つに記載の方法。 １３．結像される物体の一次元または複数次元の分解および断面化を改善する ために前記振幅、位相、および偏光の少なくとも１つの空間／時間分布を前記組 み合わせられた焦点フィールドで決定し、所定の収集関数と組み合わせる、請求 項１ないし１０の一つに記載の方法。 １４．前記請求項の一つに記載の方法を実行するシステムであって、電磁ビー ムを発生する電磁源と、前記電ビームを少なくとも２つの部分ビームに分割しそ れら２つの部分ビームを結合する機構と、前記部分ビームをフォーカスする光集 束素子と、前記部分ビームの少なくとも１つの中に他の部分ビームの焦点に関し て相対的な一次元または複数次元の空間シフトを導入する機構と、検出器とを備 え、前記光集束素子の前方に標本が置かれて前記部分ビームの焦点が前記標本中 に形成され、前記組み合わせられた焦点フィールドが前記焦点フィールドの振幅 、位相、および偏光の少なくとも１つに関連した物理応答を生成し、前記検出器 が前記焦点の外側に置かれて前記物理応答を測定するように構成された、システ ム。 １５．前記部分ビームの少なくとも１つのために可変の光学通路長を導入する 機構を備えた、請求項１４に記載のシステム。 １６．前記可変の光学通路長を導入する機構が周期的な変動を受ける、請求項 １５に記載のシステム。 １７．単一のビームから引き出された少なくとも２つの電磁ビームの焦点フィ ールドを少なくとも空間的に相関させるシステムであって、相互に対向して配置 された２つのミラーと、これらのミラーの間に実質的に平行して配置された分割 結合機構とを備え、前記分割結合機構は横手方向（図４）に移動可能である、シ ステム。 １８．前記分割結合機構が周期的な変動を受ける、請求項１７に記載のシステ ム。 １９．前記２つのミラーの各々が少なくとも２次元の回転（図５）のために所 定の曲率と機構を有する、請求項１７または１８に記載のシステム。 ２０．前記ミラーの形状をインタラクティブに変更する素子を備えた、請求項 １９に記載のシステム。 ２１．前記集束素子の有効口径に可変半径の環状開口が設けられた、請求項１ ４ないし１６の一つに記載のシステム。 ２２．前記電磁ビームの波面をインタラクティブに補正する素子を備えた、請 求項１４ないし１６と２０の一つに記載のシステム。 ２３．前記電磁ビームの波面を修正するために異なった形状の複数の有効口径 を設けられた、請求項１４ないし１６と２１と２２の一つに記載のシステム。 ２４．前記有効口径の少なくとも１つの上に振幅および位相フィルタを設けら れた、請求項２３に記載のシステム。 ２５．前記標本における分子の集団もしくは一貫性の状態に変化を起こさせる ために他の電磁源を備えた、請求項１４ないし２４の一つに記載のシステム。 ２６．パターン認識を行う、請求項１１と１２の一つに記載の方法。 ２７．顕微鏡結像を行う、請求項１ないし１３の一つに記載の方法および請求 項２３または２５に記載のシステムを使用する方法。 ２８．得られた像を使用して、さらに前記得られた像の一次元または複数次元 のデータ処理、レンダリング、再構成、もしくは復元を行う、請求項１ないし１ ３の一つに記載の方法。 ２９．前記光集束素子を最適化する、請求項１ないし１３の一つに記載の方法 および請求項２５に記載のシステムを使用する方法。 ３０．前記振幅、位相、および偏光の少なくとも１つの空間／時間分布を前記 光集束素子の焦点で適用し、数学関数の光学数式を実現する、請求項１ないし１ ３の一つに記載の方法および請求項２５に記載のシステムを使用する方法。 ３１．数学演算を施され、前記標本の構造と物理処理によって決定される少な くとも２つの数学関数の一次元または複数次元の積分が前記物理応答の検出によ って実行される、請求項３０に記載の方法。