ES2635094T3 - Procedimientos y aparatos para la formación confocal de imágenes - Google Patents

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ES2635094T3 ES13155085.7T ES13155085T ES2635094T3 ES 2635094 T3 ES2635094 T3 ES 2635094T3 ES 13155085 T ES13155085 T ES 13155085T ES 2635094 T3 ES2635094 T3 ES 2635094T3
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Mark Wang
Alexander Triener
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Abstract

Un aparato de formación de imágenes, que comprende: (a) una fuente de radiación (120), (122) situada para enviar radiación de excitación a al menos una porción (14) de una región de muestra; (b) un conjunto de detectores rectangular (164), (166) que tiene elementos que convierten la energía de los fotones en contacto en una respuesta eléctrica, estando dichos elementos en una disposición ortogonal bidimensional en la que una primera dimensión es más larga que una segunda dimensión; (c) un generador de línea (94) colocado para recibir radiación de excitación procedente de dicha fuente de radiación y para enviar una línea de radiación a dicha región de muestra; (d) una óptica de formación de imágenes (160) colocada para dirigir una imagen rectangular de dicha porción a dicho conjunto de detectores rectangulares; y (e) un dispositivo de exploración (140), (142), (144) configurado para explorar dicha región de muestra en una dimensión de eje de exploración, por lo que la porción de dicha región de muestra que forma una imagen rectangular en dicho conjunto de detectores rectangular se cambia, en el que la menor de las dos dimensiones rectangulares para dicho conjunto de detectores rectangular y la menor de las dos dimensiones rectangulares para dicha imagen están en dicha dimensión del eje de exploración, en el que dicha menor de las dos dimensiones rectangulares para dicho conjunto rectangular de detectores es lo suficientemente corta para conseguir confocalidad en un solo eje de dicho conjunto de detectores rectangulares, en el que dicho eje único es dicha menor de las dos dimensiones rectangulares para dicho conjunto de detectores rectangular y en el que la relación de las dos dimensiones rectangulares menores para dicha línea de radiación a la resolución de Rayleigh de la óptica de formación de imágenes está en el intervalo de 0,1 a 10.

Description

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DESCRIPCION
Procedimientos y aparatos para la formacion confocal de imagenes
La presente invencion se refiere de manera general al sector de formacion de imagenes opticas. De manera espedfica, la presente invencion se refiere a sistemas de formacion de imagenes para su utilizacion en la deteccion de microconjuntos de muestras.
Los microscopios opticos proporcionan una potente herramienta para investigar muestras con resolucion submicronica. Por ejemplo, en biologfa y medicina, se utilizan etiquetas moleculares apropiadas, tales como etiquetas fluorescentes e inmunofluorescentes, para marcar moleculas individuales y se detectan senales exclusivas procedentes de las etiquetas por el microscopio optico para identificar su presencia. La deteccion con resolucion submicronica permite, no solamente la determinacion de la presencia de moleculas marcadas, sino tambien su localizacion en las celulas o tejidos y alrededor de los mismos.
Dos objetivos en conflicto de los sistemas de inspeccion mediante microscopfa optica se refieren a conseguir formacion de imagenes de alta velocidad y de alta resolucion. De manera tfpica, la resolucion de un microscopio optico es inversamente proporcional a la velocidad de formacion de imagenes. Por esta razon, se consigue frecuentemente una mayor resolucion con el sacrificio de una tasa de inspeccion mas baja. Una tecnica para acomodar el conflicto antes mencionado consiste en escoger selectivamente la resolucion del sistema de acuerdo con caractensticas espedficas de la muestra que esta siendo observada u otras condiciones del experimento. De este modo, se puede utilizar una resolucion mas baja para conseguir velocidades mas altas mientras se busca un area de interes en una muestra y a continuacion, una vez se ha encontrado una localizacion de interes, la formacion de imagenes puede ser llevada a cabo con una resolucion mas elevada a pesar del coste de incrementar el tiempo de adquisicion de la imagen.
Se han realizado avances significativos en la capacidad de los microscopios para investigar muestras en tres dimensiones. La aparicion de los microscopios confocales y mejoras conseguidas mediante la tecnologfa relacionada con los mismos, permiten la deteccion de un punto individual en el espacio tridimensional en alta resolucion rechazando al mismo tiempo senales no deseadas procedentes del volumen que rodea dicho punto. La microscopfa confocal de exploracion se puede llevar a cabo para desplazar de manera efectiva el punto de deteccion mediante la muestra, y recoger una senal de cada punto para reconstruir una imagen tridimensional precisa de la muestra.
La tecnologfa desarrollada para microscopfa optica ha sido ampliada tambien a otros campos de la deteccion de imagenes. Por ejemplo, la tecnologfa ha sido utilizada para obtener imagenes de microconjuntos de muestras que contienen miles de muestras moleculares acopladas a la superficie de un sustrato. La formacion de imagen de la superficie de los microconjuntos de muestras despues de exposicion a una muestra biologica de interes permite la evaluacion simultanea de miles de moleculas objetivos, proporcionando de esta manera grandes cantidades de informacion con respecto a la muestra. Por ejemplo, se pueden utilizar los microconjuntos de muestras para determinar el numero y tipo de genes que son expresados en condiciones espedficas que, a su vez, proporcionan una vision holfstica de la respuesta biologica al estado. Ademas, se pueden evaluar similitudes y diferencias entre la constitucion genetica de individuos utilizando microconjuntos de muestras tales que la base genetica para trazos espedficos puede ser determinada. Se puede utilizar informacion con respecto a las respuestas de expresion de genes y constitucion genetica de individuos para objetivos de diagnostico y de pronostico, por ejemplo, para determinar la susceptibilidad a cierta enfermedad o la respuesta a un medicamento espedfico.
Si bien la deteccion por microconjuntos de muestra se ha beneficiado de avances en la microscopfa optica, hay una serie de areas que no se han enfocado adecuadamente con respecto a la formacion de imagenes de microconjuntos de muestras. En particular, se han conseguido avances dirigidos a aumentar la resolucion de las imagenes y a la eficiencia de la captacion en microscopfa optica al mejorar la deteccion confocal tridimensional y alterar los niveles de ampliacion. No obstante, la deteccion tfpica de microconjuntos de muestra es llevada a cabo solamente en dos dimensiones y para un nivel de ampliacion fijo. Ademas, muchos de los avances en microscopfa optica de alta resolucion han favorecido mejoras en la resolucion con respecto a la velocidad de escaneado. Estos avances son favorables para la formacion de imagen de muestras pequenas, del orden de una o unas pocas celulas biologicas; no obstante, los avances no han beneficiado necesariamente el escaneado de alta resolucion de muestras sustancialmente mas grandes, tales como los microconjuntos de muestras.
El documento WO 99/47963 A1 divulga un sistema de formacion de imagenes por microscopfa confocal en el que se utiliza o bien un detector de lmea o una mascara de ranura combinada con un conjunto detector bidimensional.
El documento EP 1 586 931 A2 divulga un microscopio confocal de ranura que comprende un dispositivo detector lineal monodimensional sobre el que se dirige una imagen mediante una mascara de ranura.
El documento WO 02/075232 A2 divulga un aparato de espectroscopia en el que se forma una imagen de una parte de una muestra sobre un dispositivo detector bidimensional. Ciertas areas de la parte de la muestra son
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seleccionadas para el proceso adicional desplazando una mascara de ranura en una direccion y combinando las senales de todos los dispositivos detectores entre la ranura y una cierta dimension perpendicular a la ranura.
Por lo tanto, existe la necesidad de dispositivos y procedimientos de escaneado que permiten formar imagenes de microconjuntos de muestras y otros sustratos bidimensionales en alta resolucion y elevada velocidad. La presente invencion satisface esta necesidad y proporciona tambien otras ventajas.
La presente invencion da a conocer un nuevo enfoque para formacion de imagenes y analisis de microconjuntos de muestras para satisfacer las necesidades indicadas. La tecnica puede ser utilizada con un amplio intervalo de tecnologfas de microconjuntos de muestras, incluyendo conjuntos constituidos por microcuentas, fotolitograffa, tecnicas de impresion, electroqmmica, y otros. La tecnica se basa en escaneado confocal de lmea del microconjunto de muestras para formar una imagen de lugares individuales sobre un sustrato. Las lmeas escaneadas pueden comprender mas de una longitud de onda de luz, tal como un par de longitudes de onda complementarias para la lectura de diferentes colores en un retro-haz, resultando de la excitacion por longitudes de onda combinada de laseres, dirigidos confocalmente hacia lmeas sucesivas en lugares sobre los microconjuntos de muestras. La utilizacion de escaneado de lmea confocal mejora notablemente la velocidad de formacion de imagen de los microconjuntos de muestras, reduciendo al mismo tiempo significativamente el potencial de interferencia como resultado de excitacion no deseada de lugares adyacentes en el conjunto.
La invencion proporciona un aparato de formacion de imagenes que comprende todas las caractensticas indicadas en la reivindicacion 1. Realizaciones adicionales se definen en las reivindicaciones dependientes.
Estas y otras caractensticas, aspectos y ventajas de la presente invencion quedaran evidentes por la lectura de la siguiente descripcion detallada con referencia a los dibujos adjuntos en los que iguales caractensticas representan iguales partes en todos los dibujos, en los que:
La figura 1 es una vista esquematica de un sistema de escaneado de microconjuntos para escaneado de lmea confocal de un microconjunto de muestras, de acuerdo con aspectos de la presente tecnica;
La figura 2 es una vista en perspectiva esquematica de la parte de un microconjunto que muestra una forma a tftulo de ejemplo en la que una lmea de radiacion es dirigida hacia partes del microconjunto en las que estan situados lugares de los que se deben formar imagenes;
La figura 3 es una representacion esquematica mas detallada de una parte de un microconjunto que esta iluminado por una lmea de radiacion confocal para obtener imagen de los lugares del microconjunto de acuerdo con la presente tecnica;
La figura 4 es una vista en perspectiva esquematica de una lmea de radiacion combinada dirigida hacia una superficie de un microconjunto para irradiar confocalmente lugares sobre el conjunto, y para devolver confocalmente radiacion a un detector, de acuerdo con aspectos de la presente tecnica;
La figura 5 es una vista en perspectiva esquematica similar que muestra una serie de haces dirigidos confocalmente de radiacion a lo largo de una lmea para irradiar de manera similar lugares de un microconjunto de acuerdo con la presente tecnica;
La figura 6 es una vista lateral esquematica de una tecnica para convertir la salida de un laser en una lmea de radiacion para escanear por lmea confocal un microconjunto;
La figura 7 es una vista similar, en planta de la conversion de la salida de un laser en una lmea de radiacion a utilizar en la presente tecnica de escaneado por lmea confocal;
La figura 8 es una representacion grafica de un perfil de intensidad para una lmea de radiacion producida por los dispositivos de las figuras 6 y 7;
La figura 9 es una representacion esquematica de una primera configuracion a tftulo de ejemplo para un conjunto modular utilizado en la conversion de un laser a una lmea de radiacion para escaneado de lmea confocal, de acuerdo con una realizacion de la invencion;
La figura 10 es una disposicion alternativa para conversion de una salida de laser en una lmea de radiacion, de acuerdo con una realizacion de la presente invencion;
La figura 11 es otra realizacion alternativa para convertir una salida de laser en una lmea de radiacion, de acuerdo con una realizacion de la invencion;
La figura 12 es otra configuracion alternativa para convertir una salida de laser para alinear una radiacion;
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La figura 13 es una vista en seccion de un modulo generador de lmea a tftulo de ejemplo, adecuado para su utilizacion de acuerdo con una realizacion de la invencion;
La figura 14 es una vista esquematica de un sistema de escaneado que incluye dos haces de laser, cuya salida es combinada para escaneado por lmea confocal de un microconjunto;
La figura 15 es una vista esquematica de un conjunto alternativo para escaneado por lmea confocal de multiple longitud de onda, de un microconjunto de muestras;
La figura 16 es una representacion esquematica opto-mecanica de una implementacion prevista en la actualidad para escaneado de lmea confocal de multi-longitudes de onda de un microconjunto de muestras;
La figura 17 es una vista esquematica de una serie de lugares individuales sobre un microconjunto de muestras biologicas mostrando la forma en la que el escaneado de lmea confocal de la presente invencion mejora la exactitud al reducir el cruzamiento potencial, particularmente en ciertos tipos de disposicion de los lugares sobre el microconjunto de muestras con respecto a las lmeas de radiacion utilizadas en la formacion de imagenes;
Las figuras 18 a 21 muestran esquematicamente vistas de generadores de lmea de radiacion a tftulo de ejemplo que se pueden utilizar de manera adecuada en la invencion;
Las figuras 22 y 23 son vistas esquematicas de generadores de lmea en un sistema de formacion de imagenes de fluorescencia, adecuado para su utilizacion en la invencion;
Las figuras 24 (a)-(c) son diagramas que muestran la proyeccion de un punto de laser sobre una camara de escaneado por lmeas e implementaciones binarias y TDI de acuerdo con ciertas realizaciones de la invencion;
La figura 25 es una vista esquematica de un sistema de escaneado de imagenes que esta configurado para llevar a cabo formacion de imagenes por fluorescencia multiespectral, de acuerdo con ejemplos de la invencion;
La figura 26 es un diagrama de bloques de un sensor de formacion de imagenes por escaneado de lmea a utilizar con el sistema mostrado en la figura 25;
La figura 27 es una vista esquematica de otro sistema de escaneado de imagen que esta configurado para llevar a cabo formacion de imagen por fluorescencia multi-espectral;
La figura 28 es un diagrama de bloques de un sensor de formacion de imagenes por escaneado de lmeas, a tftulo de ejemplo mostrado en la figura 27;
La figura 29 es un diagrama de bloques de un detector de imagenes por escaneado de lmeas para su uso con la invencion; y
Las figuras 30 (a)-(b) son diagramas de bloque de otros detectores de formacion de imagenes de exploracion de lmeas.
La presente invencion da a conocer un sistema y arquitectura de escaneado de imagenes que tiene tiempos de escaneado rapidos, manteniendo al mismo tiempo una elevada resolucion y calidad de la imagen. Estas y otras ventajas resultan de la configuracion de un detector para conseguir confocalidad en el eje de escaneado al restringir la dimension segun el eje de escaneado del conjunto detector. Tal como se indica mas adelante de forma detallada, un aparato segun la invencion puede ser configurado para conseguir confocalidad en un solo eje de un conjunto detector, de manera que la confocalidad solamente tiene lugar en aquella dimension.
El conjunto detector tiene dimensiones rectangulares, de manera que la dimension mas corta del detector tiene lugar en la dimension del eje de escaneado. Un dispositivo optico de formacion de imagenes esta situado para dirigir una imagen rectangular de una parte de muestra al conjunto detector, de manera que la dimension mas corta de la imagen es tambien la dimension en el eje de escaneado. De esta manera, el conjunto detector forma una ranura virtual. Una configuracion de ranura virtual proporciona varias ventajas con respecto a la utilizacion de una ranura tfpica situada delante de un detector. Por ejemplo, la configuracion de un conjunto detector como ranura virtual reduce el numero de elementos del conjunto no utilizados en comparacion con una configuracion en la que un conjunto detector, que tiene dimensiones estandar, es utilizado con una ranura. La reduccion del numero de elementos no utilizados aumenta la eficiencia de la captacion de datos y reduce el tiempo de proceso de la imagen. Ademas, el utilizar una ranura virtual permite, tanto al detector como a la ranura, que se encuentren en el plano focal de las lentes de proyeccion eliminando cualquier compromiso de foco de posicion o la exigencia de una lente de reenvm entre la ranura y el detector.
Un conjunto detector configurado de manera que tenga una ranura virtual es particularmente util cuando se utiliza en un aparato para la formacion de imagenes que esta configurado, ademas, para dirigir una lmea de radiacion a una
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muestra. La lmea de radiacion puede tener dimensiones rectangulares, en la que la dimension mas corta es suficientemente corta para conseguir confocalidad en un solo eje correspondiente a la dimension mas corta del conjunto detector. De esta manera, la confocalidad puede ser conseguida para excitacion, deteccion o ambos. Un instrumento puede ser configurado para limitar el error de excitacion en el eje confocal, de manera que, predominantemente, la totalidad de la radiacion de excitacion esta contenida dentro de un punto comparable con la resolucion del instrumento.
Un aparato que incluye un conjunto detector que forma una ranura virtual puede estar configurada para obtener una imagen de la muestra con alta resolucion, por ejemplo, en el intervalo comprendido entre pocas micras hasta valores submicronicos. En realizaciones espedficas, se puede obtener una imagen con una resolucion Rayleigh entre 0,2 y 10 micras. Ademas, la proporcion de la dimension mas corta de las dos dimensiones rectangulares para el conjunto detector rectangular y el producto de la resolucion Rayleigh del dispositivo optico de formacion de imagenes multiplicado por la ampliacion del conjunto optico de formacion de imagen se puede utilizar para determinar el tamano y dimensiones de la ranura virtual para conseguir confocalidad en un eje unico. En caso deseado, la proporcion de la dimension mas corta de las tres dimensiones rectangulares para una lmea de radiacion con respecto a la resolucion Rayleigh del dispositivo optico de formacion de imagen se puede seleccionar para conseguir confocalidad en un eje unico.
De acuerdo con ello, un aparato para la formacion de imagenes, segun la invencion, puede ser configurado para que tenga resolucion, segun la longitud de la lmea perpendicular al eje de escaneado que se corresponde con el sistema de resolucion. Por ejemplo, en el dispositivo CCD se pueden utilizar 4000 elementos CCD segun la longitud de una lmea de radiacion de 2mm (eje horizontal) resultando en una resolucion de 0,5|im pixel en una muestra. El numero de elementos CCD “n” de la direccion perpendicular a la lmea de radiacion (eje vertical) se puede escoger para recoger sustancialmente la totalidad de radiacion emitida reduciendo al mismo tiempo la cantidad de radiacion de fondo no deseada.
Un aparato de formacion de imagenes, segun la invencion, puede ser configurado ademas de manera que todos los elementos de pfxeles en el eje vertical seran recogidos en una “cubeta” comun y lefdos como un valor individual. Las ventajas del enfoque binario en comparacion con un diseno de Integracion de Retraso de Tiempo (TDI) son que la velocidad de lectura puede ser reducida en un factor de “n”, el sistema tiene confocalidad en un eje, y la tolerancia de la temporizacion de sincronizacion de la lectura con el movimiento en la etapa y se puede reducir. Se comprendera que un diseno TDI puede ser configurado de manera que tenga una ranura virtual limitando el numero de pfxeles verticales. Una ventaja adicional con respecto a los disenos de sistema en los que n=1 son que la eficiencia de la recogida del sistema se puede incrementar, y la sensibilidad a pequenos desplazamientos de alineacion optica se puede disminuir.
Haciendo referencia nuevamente a los dibujos y haciendo referencia en primer lugar a la figura 1, el sistema de formacion de imagenes 10 se ha mostrado esquematicamente incluyendo un escaner 12, en el que se puede insertar una muestra o microconjunto de muestras 14 a efectos de formacion de imagen. Tal como se describe de manera mas completa mas adelante, el microconjunto 14 incluye un sustrato o soporte en el que se forma un conjunto de lugares. Cada lugar incluye un fragmento molecular acoplado, tal como un gen o un fragmento de gen, que puede llevar acoplada al mismo una molecula, que puede ser una molecula complementaria en el caso de sondas de ADN o ARN de una muestra espedfica. En las presentes realizaciones, muchos miles de dichos lugares pueden ser dispuestos en alineaciones o en un dibujo de rejilla en partes o segmentos del microconjunto. El microconjunto en si mismo puede estar formado por varias tecnologfas incluyendo, igual que en la presente realizacion, microcuentas. Otros microconjuntos que pueden ser sometidos a formacion de imagen de acuerdo con las presentes tecnicas pueden incluir microconjuntos formados por fotolitograffa y otros procesos conocidos o desarrollados en esta tecnica.
El escaner 12 incluira elementos opticos, descritos en mayor detalle a continuacion, para escaneado de lmea confocal de los lugares del microconjunto 14. En la realizacion mostrada, el escaner es un dispositivo de sobremesa que tiene una bandeja de muestras 16 en la que se puede disponer el microconjunto o una serie de microconjuntos. La bandeja puede ser configurada para hacer avanzar al microconjunto 14 hacia dentro de la posicion de escaneado, y a continuacion desplazar lentamente el microconjunto, tal como se describe mas adelante, para permitir la radiacion de lmeas sucesivas del microconjunto, y devolver radiacion o retro-haces provocados por fluorescencia de lugares individuales. Los retro-haces estan enfocados sobre un detector para formacion de imagenes y analizar los lugares, que tambien se describe mas adelante. En realizaciones espedficas, se pueden enfocar multiples retro-haces a multiples diferentes detectores. Por ejemplo, un retro-haz de una primera longitud de onda puede ser enfocado a un primer detector, y un retro-haz de un segundo retro-haz puede ser enfocado a un segundo detector, tal como se indica mas adelante de manera mas detallada.
Las senales de control para el funcionamiento del escaner 12 se originan de un controlador o estacion de trabajo 18. La estacion de trabajo 18 comprende tambien software para recibir las senales de formacion de imagenes del escaner 12. El software de formacion de imagenes de la estacion de trabajo 18 estara incorporado de manera tfpica en un ordenador de tipo general o espedfico de la aplicacion 20 que, asimismo, controla y recibe senales de componentes de interfaz 22 que incluiran de manera tfpica un monitor 24 y dispositivos de entrada 26. El software
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de formacion de imagenes que puede funcionar en la estacion de trabajo 18 proporcionara preferentemente un interfaz intuitivo para cargar e inicializar el escaner, para llevar a cabo escaneados de imagen sobre microconjuntos y para archivar los datos. Durante el proceso de escaneado, el sistema 10 crea archivos individuals para diferentes longitudes de onda de radiacion utilizadas para la formacion de imagenes de los microconjuntos, a las que se pueden hacer referencia como canales rojo y verde. Estos pueden ser dispuestos en un archivo consolidado.
Entonces, los datos y las imagenes asociadas pueden ser archivados en un formato conveniente, tal como un formato convencional TIFF o cualquier otro formato de datos o protocolo de imagen adecuado. La estacion de trabajo 18 puede estar acoplada a otros componentes de la red, incluyendo software de proceso en el sentido de avance, y espedfico de la aplicacion, para analisis de alto nivel y de datos, tal como mediante una red indicada de manera general o del numero de referencia 28 en la figura 1.
Tal como se ha observado en lo anterior, el microconjunto 14 incluira una serie de lugares dispuestos en partes o regiones de un sustrato, por ejemplo, tal como se ha indicado de manera general en la figura 2. Tal como se ha mostrado en la figura 2, el microconjunto 14 puede incluir un soporte o sustrato 30 que puede ser de vidrio, plastico, o semiconductor, o cualquier otro soporte conveniente, tal como los descritos en otros lugares de esta descripcion. Sobre este soporte 30 se disponen una o varias areas 32, en las que se formaran lugares individuales, dotado cada uno de ellos tfpicamente con una correspondiente molecula-sonda utilizada para la comprobacion de una muestra. En la presente realizacion, el area de muestras 32 es escaneada para la formacion de imagen por una lmea de radiacion, indicada en general por el numero 34 en la figura 2. La lmea de radiacion es formada por radiacion de excitacion dirigida confocalmente a lo largo de la lmea 34 para irradiar una serie de lugares simultaneamente, tal como se ha indicado de manera general por las fechas 36 de la figura 2. Los lugares individuales en los que las moleculas objetivo (por ejemplo, fragmentos geneticos) se habran unido, cobran fluorescencia debido a la presencia de colorantes indicativos de interaccion de una diana con el lugar, devolviendo radiacion, tal como se ha indicado por las lmeas 38 en la figura 2. Tal como se describe mas adelante, esta radiacion devuelta o retro-haz, sera dirigida confocalmente hacia un detector de formacion de imagen en el que se realizara una imagen de la lmea para proceso y analisis adicional. Para permitir la formacion de imagen sucesiva de los lugares, la totalidad del microconjunto puede ser desplazada lentamente, tal como se ha indicado de manera general por el numero de referencia 40. La lmea 34, a lo largo de la cual son irradiados los mencionados lugares, avanzara de manera general a lo largo de localizaciones paralelas sucesivas sobre el microconjunto, al ser desplazado este.
Una parte, a tftulo de ejemplo, de un microconjunto del que se forma imagen, de acuerdo con dicho escaneado de lmea confocal, se muestra en la figura 3. Tambien, en este caso, el numero de referencia 14 se refiere al microconjunto, mientras que el numero de referencia 32 se refiere a una de las areas de muestra en las que los lugares individuales 42 estan dispuestos. En la realizacion que se ha mostrado, los lugares estan dispuestos en un modelo general hexagonal. La exploracion por lmea 34 avanza por lmeas sucesivas 44 de los lugares 42. Tal como se describe mas adelante de forma mas detallada, si bien se puede utilizar el presente enfoque de escaneado de lmea confocal con diferentes disposiciones o modelos de rejilla de lugares del microconjunto, una forma hexagonal es particularmente util con el escaneado de lmea confocal en tanto que proporciona una probabilidad reducida de interferencias debido a la colocacion y separacion entre los lugares o bordes de los lugares. El envase hexagonal designado de manera general con el numero de referencia 46 en la figura 3 se cree que proporciona un grado optimo de exactitud debido a dicha reduccion de la interferencia, completado con una densidad de condensacion superior de los lugares.
Tal como se ha descrito mas adelante y se ha mostrado tambien en la figura 3, al avanzar el microconjunto 14, tal como se ha indicado por el numero de referencia 40, la lmea de radiacion confocal 34 irradia una serie de lugares situados a lo largo de la lmea. La lmea es mas ancha que alta en la direccion mostrada en la figura 3. Por lo tanto, la lmea puede irradiar sitios adyacentes en una lmea o alineacion de lugares sin irradiar lugares en lmeas adyacentes. No obstante, en la presente realizacion, la lmea de radiacion 34 es suficientemente delgada al nivel de los lugares o de suficiente altura vertical en la disposicion mostrada en la figura 3, para permitir iluminar menos del area total ocupada por los mencionados sitios. En una realizacion prevista actualmente, la lmea de radiacion 34 es, por ejemplo, de 2 mm de longitud (dimension horizontal) y menos de 3 mm de altura (dimension vertical). Por lo tanto, el software proporcionado para la formacion de imagen que se ha mencionado anteriormente puede utilizar tecnicas tales como formacion de imagenes con retraso de tiempo en la que la lectura del detector que se describe mas adelante es desplazada con el movimiento de la muestra para proporcionar representaciones mas precisas de los sitios individuales en cada fila o lmea.
A efectos explicativos, se han indicado como ejemplos varias realizaciones de la invencion con respecto al desplazamiento de un microconjunto por delante de la lmea de radiacion. Se comprendera que se pueden utilizar tambien realizaciones en los que la lmea de radiaciones desplazada, ademas de desplazar el microconjunto o de forma alternativa al mismo. Por lo tanto, el escaneado de lmea se puede llevar a cabo por desplazamiento relativo de una lmea de radiacion y/o microconjunto, uno con respecto al otro. Una parte de la muestra citada por la lmea de radiacion puede formar una imagen rectangular sobre el conjunto detector (descrito mas adelante).
La figura 4 es una representacion esquematica adicional del presente enfoque de escaneado de lmea confocal para formacion de imagen de los microconjuntos 14. Tal como se ha indicado anteriormente, el microconjunto es radiado
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a lo largo de una lmea 34 al desplazar lentamente el soporte 30, tal como se ha indicado por el numero de referencia 40. Tal como se ha mostrado en la figura 4, la lmea 34 es formada por radiacion desde una fuente 48 dirigida hacia la optica direccional, y desde ad a la optica de enfoque 52. Tal como se ha descrito mas adelante de manera mas completa, la fuente de radiacion 48 sera un haz con una seccion transversal lineal o una lmea de radiacion, incluyendo una serie de longitudes de onda de luz utilizadas para provocar fluorescencia en longitudes de onda correspondientemente distintas de la muestra, dependiendo de los colorantes espedficos utilizados. La optica de enfoque 52 dirigira confocalmente la lmea de radiacion hacia el sustrato 30 para irradiar los lugares, tal como se ha descrito anteriormente a lo largo de la lmea 34. Se debe observar, que los lugares pueden estar dispuestos en la superficie del sustrato 30 o ligeramente por debajo de la superficie (por ejemplo, por debajo de una pelmula o capa protectora). La irradiacion confocal a lo largo de la lmea 34 enfocara esencialmente la radiacion hacia los propios lugares en cualquier nivel que se encuentren en el microconjunto.
La trayectoria de excitacion 54, en la presente realizacion, es coplanaria con una trayectoria de retro-haz 56 para radiacion de vuelta desde la muestra por fluorescencia de los colorantes asociados con moleculas acopladas a las sondas en lugares individuales del microconjunto. La radiacion de vuelta es enfocada nuevamente por la optica de enfoque 58, de manera que impacta en un detector 60 para crear senales de formacion de imagen utilizadas para reconstruir una imagen del microconjunto y de lugares individuales en el microconjunto. Se describen realizaciones espedficas para crear el haz de radiacion, dirigir el haz al microconjunto y para detectar radiacion de vuelta con mayor detalle mas adelante.
Se debe observar que, tal como se ha mostrado de manera general en la figura 5, la lmea de radiacion utilizada para la formacion de imagen de forma simultanea de los lugares, de acuerdo con la presente realizacion, puede ser una lmea continua o discontinua. La figura 5 representa esquematicamente una lmea discontinua constituida por una serie de haces de luz dirigidos de forma confocal que, no obstante, irradian una serie de puntos a lo largo de una lmea 34. En la realizacion mostrada en la figura 5, se crean haces discontinuos 62 a partir de fuentes de radiacion separadas pero adyacentes 48. Estos haces, igual que antes, son dirigidos confocalmente hacia el microconjunto e irradian puntos adyacentes 64 a lo largo del microconjunto en una lmea 34. Igual que con el escaneado de lmea confocal continua descrito anteriormente, el microconjunto sera avanzado de manera tfpica, lentamente, tal como se ha indicado por la flecha 40 para irradiar lmeas sucesivas a lo largo del microconjunto, y de esta manera alineaciones o lmeas sucesivas de lugares.
De manera tfpica, la invencion es utilizada para excitar y detectar una lmea simultaneamente. En algunas realizaciones, se puede utilizar el escaneado de puntos confocal de la lmea, de manera que el sistema optico dirige un punto de excitacion a traves de una muestra por escaneado del haz de excitacion a traves de una lente objetivo. El sistema de deteccion forma la imagen de la emision desde el punto excitado en el detector sin “desescanear” el retro-haz. Esto ocurre dado que el retro-haz es recogido por la lente del objetivo y es dividido fuera de la trayectoria optica del haz de excitacion antes de volver a traves del dispositivo de escaneado. Por lo tanto, el retro-haz aparecera en el detector en diferentes puntos dependiendo del angulo de campo del punto de excitacion original en la lente objetivo. La imagen del punto de excitacion, en el detector, aparecera en forma de una lmea al ser escaneado el punto de excitacion sobre la muestra. La arquitectura utilizada es util, por ejemplo, si el dispositivo de escaneado no puede, por alguna razon, aceptar el retro-haz de la muestra. Como ejemplo, se pueden citar medios de escaneado holograficos y acustico-opticos que son capaces de escanear un haz a muy alta velocidad pero que utilizan la difraccion para crear el escaneado. Por lo tanto, las propiedades de escaneado son una funcion de la longitud de onda. El retro-haz en fluorescencia se encuentra a una longitud de onda distinta con respecto al haz de excitacion.
Las figuras 6 y 7 muestran una linealizacion a tftulo de ejemplo de un haz de laser de entrada para escaneado de lmea confocal de un microconjunto, de acuerdo con la realizacion prevista. La figura 6 representa lo que se puede considerar una vista en alzado de la conversion o linealizacion del haz de entrada, mientras que la figura 7 se puede considerar que muestra una vista en planta, si bien estas orientaciones son comprensiblemente intercambiables, dependiendo de la orientacion de la lmea y del microconjunto a escanear, tal como se describe mas adelante. Tal como se muestra en la figura 6, un haz de entrada 66 de un laser (no mostrado) adoptara tfpicamente la forma de un haz de Gauss circular 66. Una lente asferica 68, tal como una lente Powell convierte el haz de entrada en una lmea 70 de radiacion, que es dirigida hacia una lente objetivo 72. Tal como se ha mostrado en la vista en planta de la figura 7, la lente asferica 68 produce de manera efectiva una lmea de radiacion de forma general plana que es convertida adicionalmente en un haz concentrado confocalmente 74 por la lente objetivo 72.
Tal como se ha mostrado en la figura 8, el dispositivo mostrado en las figuras 6 y 7 produce una region lineal de radiacion que puede ser utilizada para irradiar simultaneamente una serie de lugares en el microconjunto. La figura 8 es una representacion grafica de la iluminacion simulada a lo largo de una lmea de radiacion producida por una lente asferica, tal como se ha descrito con referencia a las figuras 6 y 7. La iluminacion relativa del haz esta indicada por un eje vertical 76 mientras que la coordenada de la imagen en mdmetros esta representada por el eje horizontal 78. En la realizacion mostrada, la intensidad de iluminacion aumenta rapidamente cerca de un borde de la lente asferica, tal como se ha indicado por el numero de referencia 80, y desciende rapidamente cerca de un borde opuesto, tal como se ha indicado con el numero de referencia 82. Entre los bordes, un segmento util de radiacion 84 tiene un nivel de iluminacion relativa sustancialmente constante. En una realizacion presente, la anchura util 86 de la lmea de
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radiacion es utilizada para irradiar lmeas de hileras de lugares en el microconjunto de manera simultanea. La simulacion mostrada en la figura 8, por ejemplo, proporciona una longitud de exploracion util 86 de aproximadamente 1024 mm, si bien una serie de factores, incluyendo la optica involucrada, puede proporcionar otras longitudes de lmea de radiacion utiles.
Para la formacion de imagen en una serie de longitudes de onda, un sistema de formacion de imagenes por fluorescencia de escaneado de lmea confocal, de acuerdo con la tecnica presente, proporcionara lmeas de longitudes de onda multiples con la anchura limitada de difraccion y distribucion uniforme segun la longitud para irradiar lugares de la muestra y, por lo tanto, excitar multiples colorantes fluorescentes. El enfoque generador de lmea de las figuras 6, 7 y 8 proporciona un mecanismo a tttulo de ejemplo para dicha linealizacion de irradiacion de luz de multiples longitudes de onda. La disposicion de multiples longitudes de onda en la lmea de radiacion se describira en mayor detalle a continuacion. Efectivamente, la disposicion mostrada en las figuras 6, 7 y 8 forma un haz de entrada colimado en una dimension y mantiene el haz colimado en dimension perpendicular. El haz es enfocado a continuacion por la lente objetivo 72 a una lmea de difraccion limitada en un plano focal de la lente.
Basandose en la deformacion de la lente asferica, es preferible un haz de entrada Gaussiano puro colimado con un diametro de haz definido para generar una lmea de distribucion uniforme. Una tecnica que se preve en la actualidad para una distribucion gaussiana casi pura es la utilizacion de una fibra de modalidad unica o cable de fibras para proporcionar entrada a la lente asferica.
Se pueden prever varias disposiciones para la utilizacion de dicha fibra de modalidad unica o cable de fibra. La figura 9 muestra una primera realizacion a tttulo de ejemplo en la que una fuente de radiacion lineal 88 incluye un laser 90 acoplado a una fibra de modalidad unica 92 y con intermedio de la misma a un modulo generador de lmea 94. La lente objetivo situada mas abajo de la lente asferica se ha omitido de la ilustracion de la figura 9. El perfil de lmea generado no es solamente sensible al perfil del haz de entrada, sino tambien sensible al diametro del haz de entrada, caractensticas de colimacion y centrado del haz con respecto a la lente asferica. Es decir, la lente asferica puede ser disenada para un diametro definido de haz de entrada y el conjunto, particularmente los componentes de un modulo generador de lmea 94, esta alineado para conseguir el comportamiento deseado.
En la realizacion mostrada, el generador de lmea 94 comprende varios componentes opticos que estan pre- alineados en un conjunto modularizado para facilitar, tanto su control de calidad como la condensacion en el escaner. En particular, el modulo generador de lmea 94 puede incluir un colimador 96 que colima el haz de entrada de la fibra de modalidad unica 92 y dirige el haz colimado a una lente asferica 100. Un filtro de lmea laser 98 puede ser utilizado tambien, especialmente para aplicaciones de formacion de imagenes fluorescentes, para reducir el ruido de fondo. La ilustracion de la figura 9 puede proporcionar en pre-acoplamiento o terminacion de la fibra de modalidad unica 92 por ambos extremos, es decir, en el laser 90 y en el modulo 94 generador de lmea.
De manera alternativa, la fuente de radiacion lineal 88 puede proporcionar el acoplamiento de un par de elementos de fibra optica, tal como se ha mostrado de manera general en la figura 10. En la realizacion de la figura 10, el elemento de fibra 92 es pre-acoplado al laser 90 mientras un segundo elemento de fibra 102 es pre-acoplado al modulo generador de lmea 94. Las dos fibras son conectadas a continuacion en un punto intermedio, tal como se ha indicado de manera general con el numero de referencia 104.
En otra configuracion alternativa, mostrada en la figura 11, un unico elemento de fibra 102 puede ser utilizado tambien pudiendo ser pre-ensamblado con el modulo generador de lmea 94. En esta realizacion, no obstante, el laser 90 proporciona entrada al elemento de fibra 92 por acoplamiento activo, tal como se ha indicado con el numero de referencia 106.
En otra configuracion alternativa, mostrada de manera general en la figura 12, un elemento de fibra 102 puede ser tambien pre-ensamblado con el laser 90. En vez de proporcionar un colimador en el modulo generador de lmea 94, tal como se ha descrito anteriormente, un expansor de haz validable 108 puede ser utilizado para proporcionar entrada a un modulo modificado 110 que incluye, igual que antes, una lente asferica. La realizacion de la figura 12 puede requerir que el diametro del haz de entrada corresponda con un diametro deseado en virtud del expansor de haz radiable 108.
Un modulo generador de lmea 94 a tttulo de ejemplo, se ha mostrado de manera general en la figura 13. Tal como se ha indicado anteriormente y tal como se ha mostrado en la implementacion ffsica de la figura 13, el modulo 94 puede recibir un haz de entrada designado de manera general con el numero de referencia 112, mediante una fibra de modalidad unica 92. Una lmea de radiacion de salida 114 es emitida por el modulo. En la realizacion mostrada, un conector de fibra optica 116 sirve para unir la fibra de modalidad unica 92 a la de la entrada del modulo 94. Desde allf, el haz se propaga a traves del colimador 96, filtro de lmea laser 98 (en caso de que exista) y lente asferica 100. Tambien, en este caso, la modularizacion de los componentes opticos utilizados para convertir la salida del laser a una lmea de radiacion, esta favorecida al facilitar el ensamblaje del sistema en general, la alineacion de la optica y el servicio y sustitucion posteriores de los componentes opticos, si fuera necesario.
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Tal como se ha indicado anteriormente, en ciertas realizaciones previstas, la fuente de radiacion es un laser. Otras fuentes de radiacion utilizables pueden incluir, por ejemplo, una lampara, tal como una lampara de arco, una lampara de alogeno de cuarzo, y diodos emisores de luz. Cualquiera de una variedad de otras fuentes de radiacion puede ser utilizada, segun deseo, para explicar una muestra en una longitud de onda particular. Segun deseo para una aplicacion particular, la fuente de radiacion puede generar radiacion en varias longitudes de onda, incluyendo, por ejemplo, una longitud de onda en los intervalos UV, VIS o IR. Por ejemplo, un aparato, segun la invencion, puede incluir un laser que genera luz a 405 nm, 488 nm, 532 nm o 633 nm.
Ademas, tal como se indica a continuacion, el sistema puede incluir mas de una fuente de radiacion. Las fuentes de radiacion multiples pueden ser laseres, cada uno de ellos capaz de generar radiacion a diferentes longitudes de onda. La utilizacion de multiples fuentes de radiacion que generan radiacion a diferentes longitudes de onda puede ser util, por ejemplo, en aplicaciones en las que una muestra incluye uno o mas fluoroforos que producen diferentes senales de emision cuando son excitados a diferentes longitudes de onda. Se pueden recoger simultaneamente diferentes senales de emision, por ejemplo, utilizando multiples brazos de deteccion, tal como se ha indicado mas adelante de forma detallada. De manera alternativa o adicionalmente, se pueden recoger, secuencialmente, diferentes senales de emision, permitiendo la excitacion secuencial en diferentes longitudes de onda.
Tal como se ha indicado anteriormente, ciertas realizaciones de la invencion pueden incluir, ademas, un expansor dispuesto para recibir radiacion de excitacion procedente de una fuente de radiacion y enviar un haz expandido de radiacion a un generador de lmea. En ejemplos espedficos, el diametro del haz de excitacion generado por la fuente de radiacion tiene, aproximadamente, 1 mm de diametro. Un primer expansor es capaz de expandir el diametro del haz. Por ejemplo, el expansor expande el haz de excitacion a un diametro de 4 mm. Otros expansores de haz utilizables pueden llevar el diametro del haz de radiacion, como mmimo, a 0,5 mm, 1 mm, 2 mm, 5 mm, 10 mm, 15 mm, 20 mm aproximadamente o mas.
Tal como se ha explicado anteriormente, un generador de lmea utilizable en la invencion puede incluir un elemento difractivo configurado para generar una lmea de difraccion limitada con distribucion de intensidad uniforme. Por ejemplo, se puede utilizar un conjunto de microlentes cilmdrico y un condensador. El conjunto de microlentes cilmdrico puede estar configurado para enfocar radiacion de excitacion sobre el plano focal frontal del condensador para generar una lmea de difraccion limitada con distribucion uniforme de intensidad. Otro ejemplo de generador de lmea es un difusor monodimensional que tiene uniformidad angular y un condensador, en el que el difusor monodimensional esta situado en el plano frontal focal del condensador para generar una lmea de difraccion limitada con distribucion uniforme de intensidad. En caso deseado, el generador de lmea puede incluir ademas una lente refractiva asferica para generar una lmea de difraccion limitada con distribucion uniforme de intensidad. Una lente retroactiva asferica a tftulo de ejemplo es una lente Powell.
En un ejemplo particular, el generador de lmea puede estar configurado para recibir un haz de excitacion de entrada con un diametro de 4 mm para obtener un angulo de apertura de 6 grados. Otras configuraciones utiles incluyen, sin que sea limitativa, aquellas que reciben una verificacion de entrada con un diametro, como maximo, de 0,1 a 50 mm. Un generador de lmea puede obtener un angulo de apertura de, como mmimo 0,1 grados a como maximo 80 grados de amplitud completa. El diametro del haz y el angulo de apertura se pueden seleccionar para conseguir la forma deseada para la lmea de radiacion. De modo general, la amplitud de la lmea de radiacion depende del diametro del haz, de manera que un diametro de haz mas grande proporciona una lmea de radiacion mas ancha en la dimension vertical y la longitud de la lmea de radiacion depende del angulo de apertura, de manera que un angulo de apertura mayor proporciona una lmea de radiacion mas larga en dimension horizontal. Tfpicamente, la lmea debe parecer que se origine en la pupila del objetivo, no obstante, ello no es una exigencia.
Tal como se ha indicado anteriormente, cualquiera de una serie de elementos opticos capaces de generar una lmea puede ser situado en la trayectoria optica entre una fuente de radiacion y una zona de muestra a irradiar. Por ejemplo, una lampara de arco enfocada en una ranura y colimada a continuacion puede ser utilizada para generar una lmea. Otro ejemplo es un laser de diodo emisor de borde que tiene un haz anamorfico que genera una lmea cuando se enfoca. Se comprendera que una fuente de radiacion utilizada para irradiar una zona de muestra puede ser capaz, por sf misma, de generar una lmea. De este modo, una fuente de radiacion utilizable en la invencion puede incluir un generador de lmea.
Cualquiera de una serie de procedimientos y aparatos que incluyen, sin que esten limitados a los ejemplos indicados, se puede utilizar para dirigir una lmea de radiacion a una zona de muestra. Las dimensiones de la lmea de radiacion pueden ser seleccionadas para conseguir confocalidad en un eje unico de un conjunto detector rectangular. De manera mas espedfica, la dimension vertical de la lmea de radiacion puede ser suficientemente corta para conseguir confocalidad en la dimension vertical del conjunto detector rectangular.
Un generador de lmea util en la invencion esta configurado de manera tfpica para producir una lmea de radiacion que tiene una forma en la region de muestra que es rectangular o alargada. Entre las formas a tftulo de ejemplo se incluyen, sin que ello sea limitativo, una forma rectangular, una forma eftptica u ovalada. Un generador de lmea puede estar configurado para producir una lmea de radiacion que tenga una o varias de las propiedades que se indican mas adelante.
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Una lmea de radiacion que establece contacto con una pared de muestra puede tener una proporcion de 1/e2 de la anchura de la dimension vertical para la lmea de radiacion con respecto al cociente de la dimension vertical para el conjunto detector rectangular divido por la ampliacion de la optica de formacion de imagen que resulta en la confocalidad en una dimension. Por ejemplo, la proporcion puede ser, como mmimo, de 0,5, 1, 1,5, 3 o superior. Un aparato de la invencion puede estar configurado para tener un borde superior para la proporcion que es, como maximo, aproximadamente 2, 1,5, 1, 0,5, o inferior. La proporcion puede encontrarse fuera o dentro de los intervalos anteriores, segun deseo, incluyendo, por ejemplo, el intervalo de 0,5 a 3.
Una lmea de radiacion que establece contacto con la zona de muestra puede tener una proporcion de la dimension vertical para la lmea de radiacion con respecto al cociente para la dimension vertical para el conjunto detector rectangular dividido por la amplificacion de la optica de formacion de imagen que resulta en confocalidad en una dimension. Por ejemplo, la proporcion puede ser, como mmimo, aproximadamente de 0,1, 0,5, 1, 5, 10, o superior. El extremo superior de la proporcion puede ser, como maximo aproximadamente 10, 5, 1, 0,5, 0,1 o inferior. La proporcion puede encontrarse fuera o dentro de los intervalos indicados, segun deseo, incluyendo, por ejemplo, el intervalo de 0,1 a 10.
Ademas, la proporcion de la dimension vertical para la lmea de radiacion a la resolucion Rayleigh de la logica de formacion de imagen, puede ser, como mmimo, aproximadamente 0,1, 0,5, 1,5, 10, o superior. El extremo superior de la proporcion puede ser, como maximo, aproximadamente 10, 5, 1, 0,5, 0,1, o inferior. La proporcion puede encontrarse fuera o dentro de los intervalos anteriores segun deseo, incluyendo, por ejemplo, que se encuentre en el intervalo de 0,1 a 10.
Aunque la invencion se ha indicado como ejemplo con respecto a realizaciones en las que una zona de muestra establece contacto con una lmea de radiacion, se comprendera que la radiacion que establece contacto con la zona de muestra puede tener otras formas incluyendo, por ejemplo, una forma cuadrada o de drculo.
Tal como se describe mas adelante, un aparato de la invencion puede incluir un objetivo dispuesto para recibir radiacion a traves del mismo para iluminar una zona de muestra. El objetivo puede quedar dispuesto ademas para recoger radiacion que procede de una region de muestra y dirigirla a un conjunto detector. El aparato puede incluir un segundo expansor dispuesto para recibir la radiacion de excitacion desde el generador de lmea y enviar un haz expandido de la radiacion al objetivo. El segundo expansor puede estar configurado, ademas, para disminuir el angulo de campo de la lmea de radiacion. Por lo tanto, despues de que el haz de excitacion ha pasado a traves del generador de lmea y/o un segundo expansor, puede ser dirigido a un objetivo por un divisor de haz. En realizaciones espedficas, el objetivo tiene una pupila externa dispuesta para recibir la lmea de radiacion de manera pasante para iluminar la zona de muestra. Preferentemente, el divisor del haz puede estar situado cerca de la pupila de entrada de la lente del objetivo el divisor del haz puede estar situado en una posicion axial o lateral con respecto al objetivo. En caso deseado, el objetivo puede tener una propiedad de correccion de color, elevada apertura numerica, telecentricidad, afocalidad en el plano posterior, o una combinacion de estas propiedades.
El divisor de haz dirige la lmea de radiacion a un objetivo. El objetivo puede ser un objetivo de microscopio. El objetivo puede tener una longitud focal de 20 mm. De acuerdo con ello, el objetivo puede poseer una apertura numerica de 0,366. Ademas, el objetivo puede tener un angulo de campo de +/- 3 grados y una pupila de entrada que tiene un diametro de 16 mm. Preferentemente, el objetivo es telecentrico. Son lentes objetivo telecentricas, a tftulo de ejemplo, utilizables en la invencion las que se describen en el documento US. 5.847.400.
La figura 14 muestra una disposicion optica global para los diferentes componentes descritos anteriormente en un escaner 118 de longitud de onda multiple. El escaner 118 puede incluir una serie de fuentes de luz laser con dos de dichas fuentes mostradas en la realizacion de la figura 14. Estos incluyen un primer laser 120 y un segundo laser 122. El primer laser 120 en las realizaciones previstas actualmente, puede ser un laser de 658 nm, un laser de 750 nm o un laser de 635 nm dependiendo de la aplicacion deseada. El segundo laser 122 puede ser, por ejemplo, un laser de 488 nm, un laser de 594 nm o un laser de 532 nm. Por supuesto, se pueden utilizar laseres de diferentes longitudes de onda. En la presente realizacion, el primer laser 120 es un laser de 635 nm siendo el segundo laser 122 un laser de 488 nm o bien el primer laser 120 es un laser de 750 nm cuando el segundo laser 122 es un laser de 594 nm, o bien el primer laser 120 es un laser de 658 nm cuando el segundo laser 122 es un laser de 532 nm. La seleccion de la longitud de onda para cada laser dependera, desde luego, de las propiedades de fluorescencia de los colorantes utilizados en el microconjunto, si bien las longitudes de onda de los laser utilizados al umsono para cualquier secuencia de formacion de imagen espedfica seran distintas entre si para permitir diferenciacion de los colorantes en los diferentes lugares del microconjunto.
Cada laser 120 y 122 esta acoplado a una fibra de modalidad unica 124 y 126, respectivamente, tal como se ha descrito anteriormente. Ademas, esta fibra 124 y 126 alimenta un modulo generador de lmea 94 del tipo descrito anteriormente. Mas abajo de cada modulo 94 se puede disponer una rueda de filtro 128 y 130. Las ruedas de filtro sirven para bloquear, pasar o atenuar la luz dependiendo de la funcion deseada.
La salida de cada uno de los laseres 120 y 122 sera convertida en una distribucion gaussiana casi pura por las respectivas fibras de modalidad unica 124 y 126 y los haces resultantes seran convertidos en haces con secciones
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transversales lineales a las que se hace referencia tambien como lmeas de radiacion por los modulos generadores de lmea 94. Mas abajo de las ruedas de filtro 128 y 130, las dos lmeas de radiacion seran combinadas por un combinador de haz 132. La lmea de radiacion combinada 134 comprendera entonces luz a dos diferentes longitudes de onda para irradiar el microconjunto. La lmea de radiacion combinada 134 es dirigida entonces a un divisor de haz dicroico 136 que dirige el haz hacia la optica de enfoque 138. La optica de enfoque 138 constituye un objetivo de microscopio que dirige confocalmente y concentra la lmea de radiacion a lo largo de la lmea del microconjunto 14, tal como se ha descrito anteriormente. Si bien la invencion se ha representado a tttulo de ejemplo con respecto a una lmea de radiacion combinada que forma una lmea de radiacion unica, se comprendera que las dos lmeas de radiacion pueden estar combinadas de manera que dos lmeas son casi colineales. De este modo, una parte del microconjunto que es irradiada con la lmea de radiacion combinada, sera irradiada con las lmeas casi colineales de radiacion. Las dos lmeas estan tfpicamente separadas por una distancia equivalente a la anchura de cada lmea, a efectos de minimizar la interferencia entre canales.
Tal como se ha mostrado esquematicamente en la figura 14, el microconjunto 14 puede estar soportado sobre un marco que permite el enfoque adecuado y movimiento del microconjunto antes y durante la formacion de imagen. El marco puede estar configurado para desplazar la muestra, cambiando de esta manera las posiciones relativas de la imagen rectangular y el conjunto detector rectangular en la direccion de escaneado (vertical). El movimiento de la platina de dilatacion puede tener lugar en una o varias dimensiones, incluyendo, por ejemplo, una o ambas de las dimensiones ortogonales a la direccion de propagacion para la lmea de radiacion e indicadas de manera tfpica como dimensiones X e Y. En realizaciones espedficas, la platina de traslacion puede ser configurada para desplazarse en la direccion perpendicular al eje de escaneado para un conjunto detector. Una platina utilizable en la invencion puede ser configurada ademas para el movimiento en la dimension a lo largo de la que se propaga la lmea de radiacion, indicada tfpicamente como dimension Z. El movimiento de la dimension Z puede ser utilizado para enfocar el aparato. En la configuracion de la figura 14, los componentes de la platina incluyen accionadores de basculacion 140, utilizados tfpicamente para enfocar la lmea de radiacion, accionadores en direccion Y y componentes de expulsion 142 para colocar en otro conjunto en posicion de escaneado y para movimientos groseros de microconjunto entre escaneados y accionadores 144 en direccion X para movimientos de afino de microconjunto durante el escaneado.
Lugares del microconjunto 14 pueden mostrar fluorescencia en longitudes de onda que corresponden a las del haz de excitacion, devolviendo radiacion para la formacion de imagen. La longitud de onda a la que son excitados los colorantes de la muestra y las longitudes de onda a la que tienen efecto fluorescente dependera de los espectros de absorcion y emision de los colorantes espedficos. Dicha radiacion de vueltas se propagara a traves del divisor de haz 136, tal como se ha indicado de manera general por el retrohaz 146 de la figura 14. Este retrohaz sera dirigido de manera general hacia uno o varios detectores a efectos de formacion de imagen. En la realizacion mostrada, por ejemplo, el haz es dirigido hacia un espejo 148 y desde allf a un segundo divisor de haz dicroico 150. Una parte del haz, tal como ha sido indicado por el numero de referencia 154, es dirigida a continuacion por espejos 152 a una rueda 158 de filtro paso banda que filtra el haz para obtener la longitud de onda de salida deseada que corresponde a uno de los colorantes fluorescentes de los lugares del microconjunto. En realizaciones espedficas, las partes del haz que estan dirigidas a diferentes espejos, pueden ser correspondientes lmeas de un haz combinado que forma dos lmeas casi colineales. Una lente de proyeccion 160 dirige entonces el haz filtrado a un sensor 164 de un dispositivo acoplado por carga (CCD) que produce senales de salida correspondientes a localizaciones de la radiacion en el haz recibido. De modo similar, una segunda parte 156 del haz procedente del divisor de haz 150 es dirigida a otro espejo a traves de una rueda distinta de filtro paso banda 158 y lente de proyeccion 160. El segundo haz 156 puede ser dirigido tambien a traves de un dispositivo opcional 162 de compensacion de aberracion cromatica que puede estar accionado a motor. El dispositivo 162 de compensacion de aberracion cromatica sirve para llevar a confocalidad ambos canales de longitud de onda. Finalmente, el haz 156 centrado y enfocado por la rueda de filtro 158 y la lente 160 es dirigido a un segundo sensor CCD 166. La recepcion en proceso de senales procedentes de los sensores 154 y 166 sera controlada por un panel de control 168.
Un conjunto detector angular, segun la invencion, puede ser configurado para formar una ranura vertical, tal como se ha indicado anteriormente en esta descripcion. En realizaciones espedficas, el tamano y dimensiones de la ranura virtual se pueden determinar a partir de la relacion de la dimension vertical para el conjunto de detector angular y el producto de la resolucion Rayleigh de la optica de formacion de imagen multiplicado por la ampliacion de la optica de formacion de imagen. Por ejemplo, la relacion de la dimension vertical para el conjunto detector rectangular y el producto de la resolucion de Rayleigh de la optica de formacion de imagen multiplicado por la ampliacion de la optica de formacion de imagen pueden encontrarse en un intervalo de 0,1 a 10 o en un intervalo de 0,5 a 3. Un aparato, segun la invencion puede estar configurado para obtener una imagen de una muestra a una resolucion deseada u optima de Rayleigh, incluyendo, por ejemplo, una resolucion de Rayleigh comprendida entre 0,2 y 10 micras.
En ejemplos particulares, la relacion de aspecto del numero de elementos de deteccion en una primera dimension al numero de elementos de deteccion en la dimension del eje de escaneado para un conjunto detector rectangular puede ser superior a 2, 10, 20, 50, 100, 1000 o mas elevada. Por ejemplo, una camara cCd de escaneado de lmea puede estar configurada para captar cuatro mil (4.000) pfxeles en la primera dimension y n pfxeles en la dimension del eje de escaneado (vertical). La camara de escaneado de lmeas CCD puede ser disenado de manera que la resolucion, segun la longitud de la lmea, se corresponde a la resolucion del sistema. En este caso, el eje horizontal
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comprende, aproximadamente, 4.000 elementos CCD, segun la longitud de una lmea de radiacion de 2 mm, con el resultado de una resolucion de 0,5 |im p^xeles en el objeto. El numero de elementos CCD “n” en la direccion perpendicular al eje horizontal, a la cual se hace referencia tambien como eje vertical, se puede escoger para recoger sustancialmente toda la radiacion emitida, reduciendo al mismo tiempo la cantidad de radiacion de fondo recogida. De acuerdo con un ejemplo de la invencion, el CCD tiene 4.096 pfxeles, cada uno de ellos de 12 |im de tamano. Para formar la imagen de una lmea de 2mm a esta dimension de CCD, requiere un aumento de 25x. De acuerdo con ello, n puede encontrarse dentro de un intervalo de 6 a 8 pfxeles. La arquitectura de diseno limita el error de excitacion en el eje confocal, de manera que, de forma predominante 100 % de la radiacion de excitacion esta contenida dentro de un punto comparable con la resolucion del sistema. En este caso, las dimensiones del punto senan aproximadamente 1,0 |im.
Si bien el aparato se ha mostrado a tftulo de ejemplo en lo anterior con respecto a una camara de escaneado de lmea CCD, se comprendera que se puede utilizar cualquiera de una serie de otros detectores, incluyendo, sin que ello sea limitativo, un conjunto detector configurado para funcionamiento TDI, un detector CMOS, un detector APD, un contador de fotones de modalidad Geiger, u otro detector previsto en otros lugares de esta descripcion.
En general, el funcionamiento de los diferentes componentes mostrados en la figura 14 se puede coordinar por el controlador del sistema 170. En una aplicacion practica, el controlador del sistema comprendera hardware, firmware y software, disenados para controlar el funcionamiento de los laseres, de movimiento y enfoque del objetivo 138, y el soporte del microconjunto, y la captacion y proceso de senales desde los sensores 164 y 166. El controlador del sistema puede almacenar, por lo tanto, datos procesados y procesar de forma adicional los datos para generar una imagen reconstruida de los lugares irradiados que presentan fluorescencia en el microconjunto.
La figura 15 muestra la disposicion alternativa para el escaner de longitud de onda multiple, designada de manera general con el numero de referencia 172. En esta disposicion alternativa, se combinan haces de laseres separados y la seccion transversal del haz combinado es convertido posteriormente en una forma lineal con una lente asferica. De este modo, igual que en la realizacion anterior resumida haciendo referencia a la figura 14, los laseres de entrada 120, 122 proporcionan longitudes de onda de la luz correspondientes a los colorantes utilizados en varios lugares sobre el microconjunto 14. En la realizacion 172, no obstante, un primer laser 120 emite su haz a una fibra de modalidad unica 124, seguido de un colimador 174 que colima esta salida. La salida colimada puede ser dirigida a continuacion a una rueda de filtro 130, y el haz resultante 176 es dirigido por los espejos 152 a un expansor de haz variable 180 del tipo descrito anteriormente con referencia a la figura 12.
De manera similar, la salida del segundo laser 122 es dirigida a traves de una segunda rueda de filtro 130 y el haz resultante 178 es dirigido, tal como a traves de los espejos 152 a un segundo expansor de haz variable 182. La salida de los expansores de haz variable es reunida a continuacion por un combinador de haz 132. El haz combinado 182, que incluira luz en las longitudes de onda deseadas para radiacion del microconjunto es convertido en una lmea por una lente asferica 100. Como antes, entonces, una lmea de radiacion combinada 134 que incluye luz en las longitudes de onda deseadas, sera producida y dirigida al microconjunto 14 por el divisor de haz 136. Los componentes restantes del sistema pueden ser esencialmente identicos a los descritos anteriormente con respecto a la figura 14.
La figura 16 proporciona una representacion esquematica algo mas detallada optomecanica de un escaner de longitud de onda multiple, de acuerdo con aspectos de la realizacion prevista actualmente. El escaner 184 puede incluir un primer conjunto de laser 186 que, por su parte, incluye multiples laseres. En la realizacion mostrada, por ejemplo, el conjunto de laser 186 incluye un primer laser 188 que puede ser un laser de 488 nm, y un segundo laser 190 que puede ser un laser de 658 nm. El sistema puede incluir, ademas, un segundo laser 192 que puede incluir, por ejemplo, un laser 194 de 594 nm y un laser 196 de 750 nm. La inclusion de multiples conjuntos de laser 190 y 192 podran permitir llevar a cabo diferentes tipos de operaciones de escaneado con un escaner unico, tal como decodificar funciones, funciones analfticas, y otras. Por ejemplo, los laseres 188 y 190 pueden ser utilizados conjuntamente entre sf para ciertos tipos de operaciones de decodificacion, mientras que los laseres 194 y 196 pueden ser utilizados conjuntamente entre sf para otros tipos de decodificacion. Los conjuntos pueden incluir otros laseres que pueden ser utilizados alternativamente, o se pueden prever otros conjuntos, tales como en conjunto que utiliza un laser de 635 nm y un laser de 532 nm, por ejemplo, para ciertas operaciones analfticas.
Los conjuntos laser 190 y 192 estan acoplados a las fibras de modalidad unica 122 y 124 que, tal como se ha descrito anteriormente, convierten la salida de los laseres a distribuciones Gaussianas casi puras. La luz transmitida a traves de las fibras 122 y 124 es introducida en los modulos generadores de lmea 94 para producir lmeas de radiacion. Los haces de radiacion son dirigidos, a continuacion, a los filtros de excitacion 128 y combinados por el combinador 132 para formar una lmea de radiacion combinada 134. Una rueda filtro 130 puede filtrar esta lmea de radiacion combinada a efectos de bloquear, pasar o atenuar el haz, segun deseo.
Como en las realizaciones y ejemplos descritos anteriormente, la lmea de radiacion combinada filtrada es dirigida a continuacion al divisor de haz 136 y desde allf al objetivo 138. En la realizacion mostrada en la figura 16, el objetivo esta dotado de un sistema de autoenfoque 198 que puede incluir uno o mas dispositivos de accionamiento, tales como una bobina de voz, una etapa de motor lineal, una etapa de motor piezoelectrico, o una etapa de flexion
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piezoelectrica. Los sensores 200 proporcionan la deteccion de la distancia o foco del sistema en el microconjunto 14, y sirven para proporcionar realimentacion para enfoque dinamico de la lmea de radiacion dirigida confocalmente sobre la profundidad apropiada a lo largo de los microconjuntos 14.
La figura 16 proporciona tambien algun detalle adicional respecto a una disposicion prevista actualmente para desplazar el microconjunto 14 antes y durante el escaneado. Por ejemplo, una bandeja de manipulacion de muestras 202 es dispuesta junto con un motor 204 para desplazar la bandeja hacia dentro y hacia fuera de una posicion de formacion de imagen. Una placa de adaptacion 206 permite el posicionado del microconjunto en una estacion de espera 208. Los accionadores 210 proporcionan posicionado adecuado del microconjunto en la estacion de espera. Una etapa de aproximacion 212 controlada por un motor paso a paso 214, permite un control aproximado de la posicion del microconjunto con respecto a la lmea de radiacion combinada dirigida confocalmente hacia los microconjuntos. La etapa de aproximacion 212 puede ser utilizada, por ejemplo, para posicionar apropiadamente una parte del microconjunto, en los que estan situados los lugares de los que se tiene que obtener imagen. Una etapa de precision 216 que puede incluir un motor lineal 218 y un codificador lineal 220 sirven para proporcionar el posicionado preciso y el movimiento del microconjunto antes y durante el escaneado.
Igual que antes, la radiacion resultante del efecto fluorescente de lugares individuales en el microconjunto es devuelta a traves del divisor de haz 136 a espejos u otros dispositivos opticos utilizados para dirigir el retro-haz a traves de filtros paso-banda 158, lentes de proyeccion 160 y, finalmente, a detectores CCD 164 y 166.
Las siguientes disposiciones proporcionan una formacion de imagen extremadamente rapida y precisa de multiples lugares en unos microconjuntos por la utilizacion de una lmea de radiacion que excita dichos lugares simultaneamente. Se ha descubierto que la tecnica de escaneado de lmea confocal de la presente invencion es particularmente util en aplicaciones en las que los lugares en el microconjunto estan separados entre sf a efectos de reducir, en combinacion con el escaneado lineal anteriormente descrito, el potencial de interferencia entre la radiacion devuelta de los lugares individuales. La figura 17 muestra una disposicion prevista actualmente de lugares en una rejilla hexagonal para aprovechar este aspecto de la tecnica de escaneado de lmea confocal de la invencion.
Tal como se ha mostrado en la figura 17, una seccion 222 de los conjuntos, incluira una serie de lugares 42 dispuestos segun un modelo predeterminado. Un ejemplo actual dispone un modelo de condensacion hexagonal, tal como se ha mostrado. El modelo incluye lo que se puede designar alineaciones adyacentes o lmeas de lugares designadas por los numeros de referencia 224 y 226 en la figura 17. La orientacion de las lmeas se referira de manera general con respecto a la direccion de exploracion por la lmea de radiacion dirigida confocalmente que se ha descrito anteriormente. dado que las radiaciones dirigidas segun lmeas paralelas a las lmeas de lugares 224 y 226, entonces, una parte de las lmeas de lugares sera iluminada por la radiacion, y devolveran un retro-haz que sera brillante en las zonas que presentan fluorescencia. Los lugares adyacentes 228 y 230 de cada alineacion o lmea de lugares estaran separados entre sf y ambos lugares estaran separados del lugar adyacente mas proximo, tal como el lugar 232 de una alineacion o lmea adyacente 226. La distancia entre lmeas o lugares sucesivos o adyacentes se puede designar de manera general por el numero de referencia 234, por ejemplo, haciendo referencia al centro de los lugares de cada lmea. Se observara que, con el modelo de condensacion hexagonal de la figura 17, la distancia entre los centros de los lugares adyacentes en la misma lmea, no obstante, es superior a la distancia entre lmeas o lugares adyacentes. Ademas, en la orientacion de la figura 17, la distancia entre centros de lugares adyacentes en la misma lmea es mayor que la distancia mas proxima 236 entre lugares en las lmeas adyacentes. En particular, para un modelo de condensacion hexagonal del tipo mostrado en la figura 17, la distancia 234 sera aproximadamente de 0,866 (el coseno de 60 grados) de la distancia 236.
Ademas, si los lugares 228, 230 y 232 se considera que tienen bordes 238, estos bordes estaran separados entre sf en una distancia superior a la que resultana si los lugares estuvieran dispuestos segun un modelo rectilmeo, es decir, la variacion de la distancia entre los bordes 238 de los lugares 228 y 232 a lo largo del eje de escaneado, se puede indicar por el numero de referencia 240. No obstante, la distancia real entre los bordes sera superior, tal como se ha indicado por el numero de referencia 242. Tambien en este caso, para el modelo hexagonal que se ha mostrado en la figura 17, la distancia 242 sera aproximadamente 15 % superior a la distancia 240.
Al aumentar la densidad de los lugares sobre los microconjuntos disminuyendo por consiguiente la separacion entre los lugares, se presentan exigencias crecientes en cuanto a la capacidad de enfocar cuidadosamente el haz de luz de irradiacion sobre los lugares, y enfocar de manera apropiada el retro-haz para el objetivo de formacion de imagen. La presente tecnica proporciona excelentes resultados en cuanto a la capacidad de irradiar confocalmente una lmea de lugares, en el caso en que existe confocalidad en el eje paralelo a la anchura de la lmea de radiacion y no segun la longitud de la lmea de radiacion. No obstante, la interferencia entre los lugares puede ser considerada como incapacidad relativa en distinguir entre los lugares, dado que las imagenes producidas a partir de lugares de alta intensidad se desvfan en el eje no confocal a lugares adyacentes. Esto puede ser problematico, por ejemplo, cuando lugares de alta intensidad estan localizados inmediatamente adyacentes a lugares de intensidad muy baja. La combinacion de escaneado de lmea confocal con lugares empaquetados de forma no rectilmea, en particular en combinacion con lugares empaquetados de forma hexagonal, se cree que proporciona una distincion muy superior entre lugares irradiados y lugares de formacion de imagen, debido a la reduccion de interferencia y efecto borroso entre los lugares de los que se ha sacado imagen.
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La combinacion de una disposicion hexagonal de lugares y la orientacion de lmea de radiacion anteriormente indicada es un ejemplo, en la que las distancias entre los lugares mas proximos que son irradiados simultaneamente por una lmea de radiacion en una primera posicion de escaneado, es superior que la distancia entre los lugares adyacentes mas proximos que son irradiados en diferentes momentos de tiempo por la lmea de radiacion de escaneado. Se comprendera que tambien se pueden utilizar otras combinaciones de condensacion de lugares y orientacion de lmea para conseguir ventajas similares. Por ejemplo, si bien lugares circulares en una reticula rectilmea no estan empaquetados tan mtimamente como en una reticula hexagonal, la orientacion para una lmea de radiacion y su direccion de escaneado se pueden seleccionar para la reduccion deseada de interferencia. De manera mas espedfica, la lmea de radiacion se puede orientar diagonalmente con respecto a las filas y columnas de lugares en la reticula rectilmea y la lmea de radiacion puede ser escaneada a traves de la reticula en direccion diagonal para conseguir menos interferencia entre los lugares que si la lmea de radiacion estuviera orientada ortogonalmente con respecto a las filas y columnas de lugares en la reticula rectilmea y escaneados en la direccion ortogonal. Una ventaja es que la lmea esta orientada de manera tal que la mayor separacion entre lugares adyacentes tiene lugar en el no confocal, paralelo a la lmea de radiacion.
Las disposiciones de condensacion descritas anteriormente son particularmente utiles cuando se utilizan con una lmea de radiacion que es sustancialmente mas estrecha que la anchura de los lugares que son irradiados. En ejemplos particulares, la anchura de la lmea de radiacion (es decir, la dimension mas corta de la lmea) sera como maximo 75 %, 66 %, 50 %, 30 %, 25 %, o 10 % de la anchura de los lugares que estan siendo irradiados. De modo general, son preferibles los lugares que tienen una forma regular, por ejemplo, lugares que tienen simetria de reflexion o simetna de rotacion. No obstante, se pueden utilizar lugares con formas irregulares en caso deseado para una aplicacion particular. Siempre que un lugar es regular o irregular en su forma, la anchura del lugar se medira tipicamente en la dimension mas ancha, por ejemplo, la anchura se mide como el diametro de un lugar que tiene seccion circular.
Tal como se ha mostrado en las figuras 18-23, se puede generar una lmea de difraccion limitada con distribucion uniforme de intensidad utilizando una serie de arquitecturas. En uno de dichos ejemplos, mostrado en la figura 18, el generador de lmea 244 puede estar formado con un conjunto de microlentes cilmdricas 246 y un condensador 248. Un conjunto de microlentes cilmdricas 246 es utilizado para enfocar el haz de excitacion 250 al plano focal frontal de un condensador 248 en una dimension, dejando una segunda dimension sin afectar. Una lmea de difraccion limitada 252 con distribucion de intensidad uniforme sera generada en el plano focal posterior del condensador 248. La uniformidad de la lmea esta relacionada con el numero de microlentes cilmdricas 246 que cubren la pupila de entrada del condensador 248. Cuanto mayor es el numero de conjuntos de microlentes cilmdricas 246, mas uniforme sera la distribucion de intensidad de lmea.
De acuerdo con otro ejemplo, y no como se ha mostrado en la figura 19, el generador de lmea 244 puede estar formado con un difusor monodimensional 254 y un condensador 248. Un difusor monodimensional 254 que tiene uniformidad angular es situado en el plano focal frontal de un condensador 248. El difusor 254 abarca el haz colimado de entrada 250 en una dimension que deja otra dimension sin afectar. Una lmea de difraccion limitada 252 con distribucion de intensidad uniforme sera generada en el plano focal posterior del condensador 248. Dado que el difusor 254 tiene uniformidad angular, la lmea generada sera uniforme.
En otro ejemplo adicional, se utiliza un objetivo 256 como condensador 248. Preferentemente, la lente objetivo 256 es una lente telecentrica con un tamano de pupila externo de 15,75 mm. Preferentemente, este tamano esta configurado para corresponder con el diametro del haz de excitacion de entrada colimado 250. De forma adicional, el angulo del campo de entrada de la lente es de +/- 3 grados, que corresponde a un campo de vision de 2mm.
La figura 20 muestra un difusor monodimensional 254 que se utiliza con el objetivo 256 antes descrito. Tal como se ha mostrado en la figura 20, un difusor monodimensional 254 esta situado en el tope de pupila del objetivo 256. El objetivo 256 difunde el haz de entrada colimado 250 a diferentes angulos en un intervalo determinado en una dimension y deja otra dimension sin afectar. El difusor 254 tiene uniformidad angular, es decir, las intensidades de haces difundidos a diferentes angulos son las mismas. La lente 256 enfoca el haz en cada angulo particular a un punto de la lmea. La uniformidad de la lmea es determinada por la sensibilidad angular del difusor 254. Ademas, la longitud de la lmea de radiacion 268 es determinada por el angulo de apertura del difusor 254. Cuanto mayor es el angulo abarcado, mas larga sera la lmea de radiacion generada 268. Si el angulo abarcado del difusor 254 es +/- 3 grados, la longitud de la lmea generada sera de 2mm. Si bien la longitud de la lmea de radiacion 268 puede ser mas larga de 2mm, la uniformidad deseada puede ser obtenida por una lmea de 2mm de longitud.
De acuerdo con otro ejemplo, la figura 21 muestra un conjunto de microlentes cilmdricas 246 que se utiliza con el objetivo antes descrito 256. Cada microlente cilmdrica 246 rastrea una parte del haz de entrada colimado 250, lo enfoca al tope de pupila del objetivo 256 en una dimension, y deja la segunda dimension sin afectar. El conjunto de microlentes cilmdricas 246 abarca el haz 250 a diferentes angulos en un cierto intervalo en una dimension. El angulo abarcado esta determinado por el numero f de las microlentes cilmdricas 246. La lente objetivo 256 enfoca el haz 250 en cada angulo hasta el punto de la lmea. Dado que cada punto de la lmea enfocada tiene contribucion de todas las microlentes cilmdricas 246, la uniformidad de la lmea esta relacionada con el numero de microlentes cilmdricas
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246 que cubre la pupila de entrada de la lente objetivo 256. Por ejemplo, de acuerdo con un ejemplo, se utilizan 158 microlentes para cubrir el tope de pupila a efectos de generar una excitacion de lmea uniforme 268.
Las figuras 22 y 23 muestran otros ejemplos adicionales de telescopios relevadores, configurados para tomar imagenes fluorescentes. Un telescopio relevador 258 esta dispuesto entre el difusor monodimensional 254 (ver figura 22) o el conjunto de microlentes cilmdricas 246 (ver figura 23) y un divisor dicroico de haz 260. El divisor dicroico de haz 260 esta configurado para separar la trayectoria de formacion de imagen fluorescente (retro-haz) 262 de la trayectoria de excitacion 250.
Una camara CCD u otro conjunto detector utilizado en la invencion, puede ser configurado para acumulacion o “binado” (“binning”). El “binado” aumenta la sensibilidad del conjunto detector al sumar las cargas de multiples pfxeles del conjunto en un pixel. Entre los tipos de “binado” a tftulo de ejemplo que pueden ser utilizados, se incluyen binado horizontal, vertical o completo. Con el binado horizontal, se suman pares de pfxeles adyacentes en cada lmea en un conjunto detector. Con el binado vertical, se suman pares de pfxeles adyacentes de dos lmeas en el conjunto. El binado completo es una combinacion de binado horizontal y vertical en el que se suman cuatro pfxeles adyacentes.
El binado puede ser llevado a cabo con conjuntos mas grandes de elementos sensores. Tal como se ha mostrado en la figura 24(a), la camara de escaneado de lmea CCD y la electronica de control correspondiente, pueden estar configurados de manera tal que todos los elementos de pixel en el eje vertical estan recogidos en un “bin” comun y se leen como valor unico, por lo tanto, el binado no debe ser limitado a pares adyacentes o a grupos adyacentes de elementos del conjunto. De acuerdo con ello, un conjunto de mas de dos elementos sensores, tales como pfxeles de una camara CCD, pueden ser binados, incluso si el conjunto incluye elementos sensores no adyacentes. Los elementos sensores no adyacentes tienen lugar, por ejemplo, en una disposicion lineal de tres elementos sensores en la que el primer y el tercer elemento estan separados entre sf por el segundo elemento sensor.
Tal como se ha mostrado en la figura 24(b), en el binado, todos los pfxeles de una fila son desplazados de una vez despues de un tiempo unico de integracion. La ventaja de este enfoque cuando se utiliza en un aparato de la invencion es que, en comparacion con un diseno comun TDI, la tasa de lectura es menos sensible a oscilaciones. Ademas, el aparato tendna confocalidad en un eje, y la tolerancia de la temporizacion de sincronizacion de la lectura con el movimiento de la platina en Y, se reducina. La figura 24(b) muestra la proyeccion de un punto de laser de 1|im sobre una camara CCD de escaneado de lmea. La proyeccion es simetrica, tanto en el eje X como en el eje Y. La limitacion del numero de pfxeles del CCD a 6 en el eje vertical crea una ranura vertical en dicho eje. El mismo efecto puede ser alcanzado con una camara TDI, siendo la exigencia principal que el numero de pfxeles en el eje vertical sea optimizado para pasar una senal, mientras rechaza, simultaneamente el ruido de fondo. Para conseguir este efecto, la dimension del punto de laser se dispone para que corresponda a la resolucion del sistema conjuntamente con la limitacion del numero de pfxeles verticales.
Otro ejemplo utiliza un diseno TDI que limita el numero de pfxeles verticales de manera tal que se crea todavfa la ranura virtual. Tal como se ha mostrado en la figura 24(c) en TDI, los pfxeles son desplazados en sincronismo con la salida de codificador de la platina Y. Ademas, la ventaja con respecto a disenos de sistema en los que n=1 son que la eficiencia de captacion del sistema se incremental y se disminuina la sensibilidad a pequenos desplazamientos de alineacion optica. Se describen disenos y metodos de TDI a tftulo de ejemplo que pueden ser utilizados en la invencion en el documento US 5.754.291.
De acuerdo con otro ejemplo, la arquitectura del presente sistema de escaneado esta configurada para utilizar formacion de imagen por fluorescencia multiespectral utilizando sensores de formacion de imagen de escaneado de lmea. Tal como se ha mostrado en la figura 25, la lmea de radiacion 134 es utilizada para excitar moleculas fluorescentes en un intervalo espectral completo y un elemento de dispersion cromatica 264 es utilizado para extender la imagen de fluorescencia de lmea 262 a multiples sensores de formacion de imagenes de escaneado de lmeas 266. El sistema puede ser implementado utilizando iluminacion lateral o iluminacion colineal. De acuerdo con este ejemplo, un conjunto de filtro de banda multiple 268 es utilizado para excitar y detectar multiples moleculas de fluorescente. Tal como se ha representado en la figura 26, cada uno de una serie de sensores 266 esta mapeado a un intervalo espectral de banda estrecha. Los sensores 266 pueden ser sensores de formacion de imagen tales como CCD de escaneado de lmea de tipo lineal o un CCD de escaneado de lmea TDI. Los sensores son designados tambien como detectores.
Tal como se ha mostrado en la figura 27, de acuerdo con otro ejemplo, la arquitectura del sistema de escaneado se puede configurar para utilizar una tecnica de iluminacion de lmeas multiples. El sistema puede ser implementado utilizando iluminacion lateral o iluminacion colineal. En este caso, cada lmea 268 excita una zona de muestra a una longitud de onda distinta, por ejemplo, para excitar diferentes moleculas fluorescentes. La imagen de fluorescencia de lmeas multiples resultantes es captada por un detector 266 con sensores 266 de formacion de imagen de escaneado de multiples lmeas. Cada sensor 266 genera la correspondiente imagen fluorescente. Dado que la fluorescencia con diferentes intervalos espectrales ya esta separada espacialmente, no se requiere ningun elemento 264 de dispersion cromatica. Un filtro 270 de ranuras multiples es utilizado para bloquear de manera efectiva la radiacion dispersa residual de Rayleigh y Raman.
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Ademas, si se utiliza un elemento de dispersion cromatica en el sistema de la figura 27, se pueden captar imagenes con resolucion espectral mas elevada. Tal como se ha mostrado en la figura 28, cada grupo de sensores 266 de la figura, puede funcionar tambien en modalidad TDI para generar una imagen integrada unica que proporciona imagenes con resolucion espectral jerarquica.
La arquitectura del sistema de escaneado se puede disenar para excitar fluorescencia de multiples colorantes en diferentes intervalos espectrales simultaneamente. Las arquitecturas, a titulo de ejemplo, incluyen una lmea unica con multiples colores utilizada en el sistema de la figura 25 o lmeas multiples espaciadas, con multiples colores, utilizadas en el sistema de la figura 27. La fuente de radiacion puede ser una lampara de luz blanca con un filtro de excitacion de bandas multiples o una combinacion de laseres multiples. El filtro de excitacion del conjunto 268 de filtros de bandas multiples del sistema de la figura 25 no es necesario, por ejemplo, si se utiliza como fuente de radiacion la combinacion de laser multiple. Ademas, la iluminacion puede ser iluminacion colineal (la iluminacion comparte la misma lente objetivo 138 que la captacion), tal como se ha mostrado en la figura 24 o iluminacion de platina (campo oscuro), tal como se ha mostrado en la figura 28. Un divisor de haz dicroico de banda multiple 136 (mostrado en la figura 25) puede ser utilizado para la iluminacion colineal y puede ser omitido para la realizacion de iluminacion lateral. Asimismo, tal como se ha mostrado en la figura 25, un filtro 272 de emision de banda multiple del conjunto 82 de filtro de banda multiple puede ser utilizado para bloquear selectivamente la radiacion de excitacion mientras pasa por bandas de fluorescencia. Para iluminacion con laseres multiples, se puede utilizar tambien un filtro 270 de ranura multiple para bloquear selectivamente la radiacion de aplicacion mientras pasan bandas de fluorescencia, lo que proporciona una deteccion de fluorescencia todavfa mas eficiente.
De acuerdo con realizaciones espedficas, los filtros de emision 272 pueden ser integrados con el sensor de imagen 266. Una orientacion, a titulo de ejemplo, es la mostrada en la figura 29. Una orientacion diferente para bloqueo de la iluminacion multibanda e iluminacion laser multiple es demostrada en las figuras 30(a) y 30(b), respectivamente.
Un aparato o procedimiento del presente ejemplo es particularmente util para obtener una imagen de un area bidimensional de una muestra. De este modo, en caso deseado, la deteccion puede ser sustancialmente restringida para obtener una imagen en dos de las tres dimensiones posibles para una muestra. De acuerdo con ello, se puede detectar o tomar imagen de una superficie para una muestra de interes. Una muestra especialmente relevante es un microconjunto de muestras. Utilizando el ejemplo se puede detectar o tomar imagen de la superficie de un microconjunto de muestras para determinar una o varias propiedades del microconjunto. Entre las propiedades a titulo de ejemplo de un microconjunto que pueden ser detectadas se incluyen, sin que ello sea limitativo, la presencia o ausencia de una etiqueta, la localizacion de una etiqueta en una localizacion particular, tal como una localizacion en la que reside una sonda espedfica, o una caractenstica espedfica de una etiqueta tal como emision de radiacion a una longitud de onda espedfica o intervalo de longitudes de onda.
La deteccion de dichas propiedades por el microconjunto de muestras puede ser utilizada para determinar la presencia o ausencia de una molecula objetivo espedfica en una muestra a la que se ha establecido contacto con el microconjunto. Esto puede ser determinado, por ejemplo, basandose en la union de un analito objetivo marcado a una sonda espedfica de un microconjunto o debido a una modificacion dependiente del objetivo de una sonda espedfica para incorporar, eliminar o alterar una etiqueta en la localizacion de la sonda. Se puede utilizar cualquiera de varios ensayos para identificar o caracterizar objetivos utilizando un microconjunto de muestras, tal como se describe, por ejemplo, en las publicaciones de solicitudes de patentes US No. 2003/0108867, 2003/0108900, 2003/0170684, 2003/0207295 o 2005/0181394.
Las etiquetas a titulo de ejemplo que pueden ser detectadas, por ejemplo, cuando se encuentran presentes en un microconjunto de muestras, incluyen, sin que ello sea limitativo, un cromoforo; luminoforo, fluoroforo, nanoparticulas codificadas opticamente, particulas codificadas con una reticula de difraccion, etiqueta electroquimioluminiscente, tal como Ru(bpy)268+ o una fraccion que puede ser detectada basandose en una caractenstica optica. Los fluoroforos que son utiles incluyen, por ejemplo, complejos de lantanidos fluorescentes incluyendo los de europio y terbio, fluorescema, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, coumarina, metilcoumarinas, pireno, verde de malaquita, Cy3, Cy5, estilbeno, amarillo Lucifer, Cascade Blue™ Texas Red, colorantes Alexa, ficoeritina, “bodipy” y otros conocidos en esta tecnica, tales como los que se describen en la publicacion Haughland, Molecular Probes Handbook, (Eugene, OR) 6a edicion; catalogo de Synthegen (Houston, TX.), Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2a edicion, Plenum Press New York (1999), o WO 98/59066, todos ellos incorporados como referencia a la descripcion actual.
Cualquiera de una variedad de microconjuntos conocidos en la tecnica que incluyen, por ejemplo, los indicados en otras partes de esta descripcion, pueden ser utilizados como muestra en la invencion. Un microconjunto tipico contiene lugares, a los que algunas veces se hace referencia como caracteristicas, cada una de las cuales tiene una poblacion de sondas. La poblacion de sondas en cada lugar es tipicamente homogenea, teniendo una especie unica de sonda, pero en algunas realizaciones las poblaciones pueden ser heterogeneas. Los lugares o caractensticas de un conjunto son tipicamente discretos, estando separadas por espacios entre sf Las dimensiones de los lugares de la sonda y/o separacion entre los lugares pueden variar de manera que los conjuntos pueden tener elevada densidad, densidad media o densidad baja. Los conjuntos de alta densidad se caracterizan porque tienen lugares separados en menos de unos 15 |im. Los conjuntos de densidad media tienen lugares separados aproximadamente
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en 15 a 30 |im, mientras que los conjuntos de baja densidad tienen lugares separados en mas de 30 |im. Un conjunto util en la invencion puede tener lugares separados en menos de 100 |im, 50 |im, 10 |im, 5 |im, 1 |im o 0,5 |im. Un aparato o procedimiento de la presente invencion puede ser utilizado para tomar la imagen de un conjunto con una resolucion suficiente para distinguir lugares en las densidades antes mencionadas o intervalos de densidades.
Si bien la invencion ha sido ejemplificada anteriormente con respecto a la utilizacion de un microconjunto de muestras como muestra, se comprendera que otras muestras con caractensticas o lugares con las densidades antes indicadas pueden ser objeto de imagen en las resoluciones indicadas anteriormente. Otras muestras a tftulo de ejemplo incluyen, sin que ya sea limitativo, muestras biologicas tales como celulas o tejidos, chips electronicos tales como los utilizados en procesadores de ordenador o similares. Un microconjunto u otra muestra puede ser situada en una region de muestra de un aparato de la invencion por su colocacion sobre una platina de muestras, tal como las descritas en otras partes de esta descripcion.
Un aparato de la invencion puede incluir ademas un procesador conectado operativamente a un conjunto detector rectangular o configurado de otra manera para obtener datos del conjunto detector rectangular, de manera que el procesador esta configurado para llevar a cabo una serie de funciones en la imagen. El procesador puede incluir un sistema de ordenador de aplicacion general que esta programado con uno o varios modulos de programa o que tiene acceso a los mismos, involucrados en el analisis de datos de formacion de imagen. Los sistemas de ordenador a tftulo de ejemplo que son utiles en la invencion incluyen, sin que ello sea limitativo, sistemas de ordenador personal tales como los basados en los microprocesadores Lintel ®, IBM® o Motorola®; o estaciones de trabajo tales como la estacion de trabajo SPARC® o la estacion de trabajo UNIX®. Los sistemas utiles incluyen los que utilizan los sistemas operativos Microsoft® Windows®, UNIX o LINUX®. Los sistemas y procedimientos descritos pueden tambien ser implementados para su aprovechamiento en sistemas cliente-servidor o en redes de area amplia tales como Internet.
El procesador puede ser incluido en un sistema ordenador configurado para operar como cliente o servidor. El procesador puede ejecutar instrucciones incluidas en uno o varios modulos de programa. Los resultados de uno o varios modulos de programa, tales como una imagen de una muestra o region de muestra o el analisis de la muestra o region de muestra pueden ser informados al usuario mediante un interfaz grafico de usuario. Por ejemplo, los resultados pueden ser informados mediante un monitor o una impresora conectados operativamente al procesador. De este modo, se puede proporcionar al usuario una imagen de un conjunto u otra muestra mediante un interfaz grafico de usuario.
De acuerdo con ciertos aspectos de la invencion, se consiguen varias ventajas. El sistema de la presente invencion escanea muestras de manera mas rapida que otras tecnologfas y proporciona una calidad de datos mejorada a un coste mas bajo. De manera espedfica, la tasa de lectura de la presente invencion es incrementada por un factor n en comparacion con sistemas convencionales TRI. La confocalidad puede ser conseguida en uno o varios ejes. Ademas, la presente invencion es menos sensible a desplazamientos de alineacion optica.
Ademas, los ejemplos descritos combinan unas ventajas de excitacion/deteccion simultanea de multiples moleculas fluorescentes utilizando filtros de banda multiple y lectura paralela de multiples sensores de toma de imagenes de escaneado de ftnea en la misma muestra. Los ejemplos pueden generar simultaneamente imagenes fluorescentes multiespectrales a alta velocidad. En realizaciones espedficas, un aparato puede escanear una muestra a una velocidad minima de aproximadamente 0,01 mm2/segundo. Dependiendo de la aplicacion espedfica, tambien se pueden utilizar velocidades mas rapidas, incluyendo, por ejemplo, en terminos del area escaneada, una velocidad minima de aproximadamente 0,02 mirP/segundo, 0,05 mirP/segundo, 0,1 mirP/segundo, 1 mirP/segundo, 1,5 mm2/segundo, 5 mirP/segundo, 10 mirP/segundo, 50 mirP/segundo o 100 mirP/segundo o mas rapidas. En caso deseado, por ejemplo, para reducir ruidos, la velocidad de escaneado puede tener un ftmite superior aproximado de 0,05 mm2/segundo, 0,1 mirP/segundo, 1 mirP/segundo, 1,5 mirP/segundo, 5 mirP/segundo, 10 mirP/segundo, 50 mm2/segundo o 100 mirP/segundo. La velocidad de escaneado puede ser medida tambien en terminos de velocidad de movimiento relativo para una imagen y detector en el eje de escaneado (vertical) y puede ser, por ejemplo, como mmimo, aproximadamente 0,1 mm/segundo, 0,5 mm/segundo, 1 mm/segundo, 10 mm/segundo o 100 mm/segundo. Tambien en este caso, para reducir ruidos, la velocidad de escaneado puede tener un ftmite superior aproximado de 0,5 mm/segundo, 1 mm/segundo, 10 mm/segundo o 100 mm/segundo. Como resumen, el presente ejemplo puede ser utilizado para constituir formadores de imagen fluorescente multiespectrales que son mas eficientes y efectivos en cuanto a costes que otros sistemas de formacion de imagen.
Los siguientes son terminos utilizados en la presente explicacion y que estan destinados a que tengan la significacion que se describe a continuacion.
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “fuente de radiacion” esta destinado a significar un origen o generador de energfa electromagnetica propagada. El termino puede incluir una fuente de iluminacion que produce radiacion electromagnetica en el intervalo ultravioleta (UV) (aproximadamente 200 a 390 nm), visible (VIS) (aproximadamente 390 a 770 nm) o infrarrojo (IR) (aproximadamente 0,77 a 25 micras), u otros intervalos del espectro electromagnetico. Una fuente de radiacion puede incluir, por ejemplo, una lampara tal como la pantalla arco
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o una lampara halogena de cuarzo o un laser, tal como un laser de estado solido o un laser de gas, o un LED, tal como un sistema LED/fibra de modalidad unica.
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “radiacion de excitacion” esta destinado a significar energfa electromagnetica propagada hacia una muestra o region de muestras. La radiacion de excitacion puede adoptar la forma que induzca cualquiera de una serie de respuestas desde una muestra, incluyendo, sin que ello sea limitativo, absorcion de energfa, reflexion, emision de fluorescencia o luminiscencia.
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “region de muestra” esta destinado a significar una localizacion que tiene que ser detectada. La localizacion puede encontrarse, por ejemplo, en, encima o en las proximidades del dispositivo de soporte configurado para soportar o contener un objeto a detectar. La muestra puede ocupar una region de muestra permanentemente o temporalmente, de manera que la muestra puede ser retirada de la region de muestra. Por ejemplo, una region de muestra puede ser una localizacion sobre o cerca de una platina de traslacion, estando ocupada la localizacion por un microconjunto de muestras cuando se situa sobre la platina de traslacion.
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “conjunto detector” esta destinado a significar un dispositivo o aparato que tiene varios elementos que convierten la energfa de los fotones con que se ha tenido contacto en una respuesta electrica. Un conjunto detector a tftulo de ejemplo es un dispositivo acoplado por carga (CCD) en el que los elementos son lugares de captacion de carga fotosensible que acumulan carga como respuesta a los fotones que impactan. Otros ejemplos de conjuntos detectores incluyen, sin que ello sea limitativo, un conjunto detector de semiconductor de oxido de metal complementario (CMOS), un conjunto de detector fotodiodo de avalancha (APD) o un conjunto detector contador de fotones de modalidad Geiger. Los elementos de un conjunto detector pueden tener cualquiera de una variedad de disposiciones. Por ejemplo, un conjunto detector rectangular tiene elementos en una disposicion ortogonal, bidimensional, en el que una primera dimension a la que se hace referencia como dimension “horizontal” es mas larga que una segunda dimension a la que se hace referencia como dimension “vertical”. Un conjunto detector cuadrado tiene elementos en la disposicion bidimensional, ortogonal en la que la primera y segunda dimensiones de la disposicion tienen la misma longitud.
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “imagen rectangular” esta destinado a significar una representacion formada opticamente de una muestra, una parte de la muestra que tiene lugar dentro de una region bidimensional, ortogonal que tiene una dimension horizontal que es mas larga que la dimension vertical. La imagen rectangular puede representar la totalidad de una imagen que emana de una region de muestra, o bien de forma alternativa, puede ser una parte rectangular de una imagen mas grande, teniendo la imagen mas grande cualquiera de una variedad de formas.
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “dispositivo de escaneado” esta destinado a significar un dispositivo capaz de detectar secuencialmente diferentes partes de una muestra. Un dispositivo de escaneado puede funcionar cambiando la posicion de uno o varios componentes de un aparato de deteccion, incluyendo, por ejemplo, una muestra, fuente de radiacion, dispositivo optico que dirige radiacion de excitacion a una muestra, dispositivo optico que dirige radiacion que emana de una muestra o conjunto detector. Se incluyen entre los dispositivos de escaneado a tftulo de ejemplo, sin que ello sea limitativo, un galvanometro configurado para desplazar un haz o lrnea de radiacion sobre una muestra o una platina de traslacion configurada para desplazar una muestra a traves de un haz o lrnea de radiacion.
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “Resolucion de Rayleigh” es RR de la siguiente ecuacion
RR= ((1,22) (A)(f)/D
en la que X es la longitud de onda, f es la longitud focal y D es la distancia entre dos objetos detectados. El termino esta destinado a ser coherente con su utilizacion en la tecnica de optica, por ejemplo, tal como se indica en la publicacion Hecht, Optics, 4a edicion, Addison Wesley, Boston MA (2001).
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “ampliacion” esta destinado a significar la proporcion de la dimension de un objeto con respecto a la dimension de la imagen del objeto. Por ejemplo, una ampliacion se puede determinar a partir de la relacion de la dimension de la region de la muestra (es decir, el objeto) con respecto a la dimension de una imagen de la region de una muestra en un conjunto detector. En sistemas que incluyen una lente objetivo y de proyeccion, la ampliacion se puede determinar a partir de la proporcion de la longitud focal del objetivo a la longitud focal posterior de la lente de proyeccion.
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “lrnea de radiacion” esta destinado para significar un conjunto de ondas electromagneticas o partfculas propagadas en una direccion uniforme, de manera que la seccion transversal bidimensional ortogonal a la direccion de propagacion es rectangular o alargada. A tftulo de ejemplo, las secciones transversales bidimensionales de una lrnea de radiacion incluyen, sin estar limitadas a ello, una forma rectangular, eftptica u oval. La anchura en seccion transversal de una lrnea de radiacion puede tener una o ambas dimensiones en un intervalo de, por ejemplo, aproximadamente 0,05 |im, hasta unos 10|im. Por ejemplo, una dimension de la lrnea de radiacion puede ser, como mmimo, aproximadamente 0,05 |im, 0,1 |im, 0,5 |im, 1 |im, 5 |im, o 10 |im.
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Ademas, una dimension de una lmea de radiacion puede ser, por ejemplo, como maximo, aproximadamente, 0,1 |im, 0,5 |im, 1 |im, 5 |im o 10 |im. Se comprendera que estas dimensiones tienen simplemente caracter de ejemplo, y que se pueden utilizar en caso deseado lmeas de radiacion con otras dimensiones.
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “generador de lmea” esta destinado a significar un elemento optico que esta configurado para generar una lmea de difraccion limitada en cuanto a difraccion o casi limitada en cuanto a difraccion en el plano perpendicular al eje optico de propagacion con una distribucion de intensidad sustancialmente uniforme a lo largo del eje horizontal de la lmea. Entre los generadores de lmea a tttulo de ejemplo, se incluyen, sin que ello sea limitativo, un difusor monodimensional que tiene uniformidad angular, un conjunto de microlentes cilmdricas, elemento difractivo o lente refractiva asferica, tal como una lente Powell. El difusor monodimensional que tiene uniformidad angular o conjunto de lentes microcilmdricas puede ser colocado para dirigir la radiacion a un condensador.
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “divisor del haz” esta destinado a significar un elemento optico que pasa una primera parte de un haz de radiacion y refleja una segunda parte del haz. Por ejemplo, un divisor de haz puede estar configurado para pasar selectivamente radiacion en una primera longitud de onda y reflejar radiacion en un segundo intervalo de radiacion de onda distinto. Cuando se utiliza para deteccion de fluorescencia, el divisor de haz reflejara de manera tfpica la radiacion de excitacion con longitud de onda mas corta y transmitira la radiacion de emision con longitud de onda mas larga.
Tal como se utiliza en esta descripcion el termino “pupila externa” es utilizado en referencia a un objetivo en el que la pupila de entrada a la abertura posterior del objetivo se encuentra detras de las dimensiones ffsicas del objetivo en la trayectoria del haz de excitacion.
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “expansor” esta destinado a significar uno o varios elementos opticos configurados para ajustar el diametro y la colimacion de un haz de radiacion. Por ejemplo, un expansor puede estar configurado para incrementar el diametro de un haz de radiacion en una magnitud deseada, tal como, como mmimo, dos veces, cinco veces, diez veces, o mas. Los elementos opticos de un expansor pueden incluir, por ejemplo, uno o varios espejos o lentes.
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “lente de proyeccion” esta destinado a significar un elemento optico configurado para transferir la imagen de un objeto a un detector. Por ejemplo, una lente puede ser situada para transferir una imagen que emana de una lente objetivo a un conjunto detector.
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “filtro optico” esta destinado a significar un dispositivo para pasar o rechazar el paso selectivamente de radiacion en una longitud de onda, polarizacion, o forma dependiente de frecuencia. El termino puede comprender un filtro de interferencia en el que multiples capas de materiales dielectricos permiten el paso o reflejan la radiacion de acuerdo con la interferencia constructiva o destructiva entre reflexiones de diferentes capas. Los filtros de interferencia son conocidos tambien en la tecnica de los filtros dicroicos o filtros dielectricos. El termino puede incluir un filtro de absorcion que impide el paso de radiacion que tiene una longitud de onda o intervalo de longitudes de onda selectivo por absorcion. Los filtros de absorcion comprenden, por ejemplo, cristal o lfquido coloreado.
Un filtro puede tener una o varias caractensticas de transmision de filtro espedficas, incluyendo, por ejemplo, paso banda, paso corto, y paso largo. Un filtro de paso banda permite selectivamente el paso de la radiacion en un intervalo de longitud de onda definido por una longitud de onda central de maxima transmision de radiacion (Tmax) y una amplitud de banda y paso de bloques de radiacion fuera de este intervalo. Tmax define el porcentaje de radiacion transmitida en la longitud de onda central. La amplitud de banda es descrita tfpicamente como la amplitud completa a la mitad del maximo (FWHM) que es el intervalo de longitudes de onda que pasan por el filtro a un valor de transmision que es la mitad de Tmax. Un filtro paso banda puede tener un FWHM de 10 nanometros (nm), 20 nm, 30 nm, 40 nm o 50 nm. Un filtro paso banda permite el paso selectivamente de radiacion de longitud de onda mas larga, tal como se ha definido por un Tmax y un corte en la longitud de onda. El corte en la longitud de onda es la longitud de onda en la que la transmision de la radiacion es la mitad de Tmax; dado que la longitud de onda aumenta por encima del corte de longitud de onda, el porcentaje de transmision aumenta, y al disminuir la longitud de onda por debajo del corte en longitud de onda, el porcentaje de transmision disminuye. Un filtro de paso corto permite selectivamente el paso de radiacion de longitud de onda mas baja, tal como se define por Tmax y una longitud de onda de corte. La longitud de onda de corte es la longitud de onda en la que la transmision de radiacion es la mitad de Tmax; al aumentar la longitud de onda por encima del corte de longitud de onda, el porcentaje de transmision disminuye y, al disminuir la longitud de onda por debajo de la longitud de onda de corte, el porcentaje de transmision aumenta. Un filtro puede tener Tmax de 50-100 %, 60-90 % o 70-80 %.
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “microconjunto” se refiere a una poblacion de diferentes moleculas sonda que estan acopladas a uno o varios sustratos, de manera que las diferentes moleculas sonda pueden ser diferenciadas entre sf, de acuerdo con la localizacion relativa. Un conjunto puede incluir diferentes moleculas sonda o poblaciones de las moleculas sonda que estan situadas en una localizacion sobre un sustrato direccionable de forma distinta. De forma alternativa, un microconjunto puede incluir sustratos separados, cada uno de los cuales
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lleva una molecula sonda distinta, o poblacion de las moleculas sonda, que se puede identificar de acuerdo con las localizaciones de los sustratos sobre una superficie a la que estan acoplados los sustratos, o de acuerdo con las localizaciones de los sustratos en un lfquido. Conjuntos a tftulo de ejemplo en los que estan situados sustratos separados sobre una superficie incluyen, sin que ello sea limitativo, un conjunto Sentrix® o un conjunto Sentrix® BeadChip de la firma Illumina®, Inc. (San Diego, CA) u otros que incluyen cuentas en pocillos, tales como los descritos en las patentes US. No. 6.266.459, 6.355.431, 6.770.441, y 6.859.570; y publicacion PCT No. WO 00/63437. Otros conjuntos que tienen partfculas sobre una superficie incluyen los explicados en los documentos US 2005/0227252; WO 05/033681; y WO 04/024328.
Otros ejemplos de microconjuntos disponibles comercialmente que pueden ser utilizados en la invencion incluyen, por ejemplo, un microconjunto Affymetrix® GeneChip® u otros microconjuntos sintetizados, de acuerdo con tecnicas que se designan a veces como VLSIPS™ (Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis), tecnologfas que se describen, por ejemplo, en las patentes US Nos. 5.324.633; 5.744.305; 5.451.683; 5.482,867; 5.491.074; 5.624.711; 5.795.716; 5.831.070; 5.856.101; 5.858.659; 5.874.219; 5.968.740; 5.974.164; 5.981.185; 5.981.956; 6.025.601; 6.033.860; 6.090.555; 6.136.269; 6.022.963; 6.083.697; 6.291.183; 6.309.831; 6.416.949; 6.428.752 y 6.482.591. Un microconjunto con puntos (“spotted”) puede ser utilizado tambien en un procedimiento, segun la invencion. Un microconjunto con puntos a tftulo de ejemplo, es el conjunto CodeLink™, disponible de la empresa Amersham Biosciences. Otro microconjunto utilizable en la invencion es el fabricado utilizando procedimientos de impresion por chorro de tinta, tal como el SurePrint™ Technology que se puede conseguir de Agilent Technologies. Otros microconjuntos que pueden ser utilizables en la invencion incluyen, sin que ello sea limitativo, los descritos en Butte, Nature Reviews Drug Discov. 1:951-60 (2002) o U.S. Pat Nos. 5,429,807; 5,436,327; 5,561,071; 5,583,211; 5,658,734; 5,837,858; 5,919,523; 6,287,768; 6,287,776; 6,288,220; 6,297,006; 6,291,193; y 6,514,751; y WO 93/17126; WO 95/35505.
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “integracion con retraso de tiempo” o “TDI” esta destinada a significar la deteccion secuencial de partes diferentes de una muestra por diferentes subconjuntos de elementos de un conjunto detector, en el que la transferencia de carga entre los subconjuntos de elementos tiene lugar a una velocidad sincronizada con el movimiento aparente de la muestra de la que se toma imagen y en la misma direccion. Por ejemplo, la TDI puede ser llevada a cabo por escaneado de una muestra, de manera que un dispositivo de transferencia de platina produce una imagen de video continua de la muestra por medio de un apilamiento de conjuntos lineales alineados con el movimiento aparente de la muestra y sincronizados con la misma, de manera que, al desplazarse la imagen de una lmea a la siguiente, la carga almacenada se desplaza con la misma. La acumulacion de carga puede integrarse durante todo un tiempo requerido para que la alineacion de cargas se desplace de un extremo del detector al registro serie (o al area de almacenamiento del dispositivo en el caso de una CCD de transferencia de imagenes).
Tal como se utiliza en esta descripcion, el termino “brazo de captacion” esta destinado a significar un componente optico o un conjunto de componentes opticos dispuesto para dirigir la radiacion de una region de muestra a un detector.
Si bien solamente algunas caractensticas de la invencion han sido representadas y descritas, los tecnicos en la materia idearan muchas modificaciones y cambios. Por lo tanto, se debe comprender que las reivindicaciones adjuntas estan destinadas a cubrir todas las mencionadas modificaciones y cambios que queden incluidos dentro de la invencion, tal como se define por dichas reivindicaciones.

Claims (13)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un aparato de formacion de imagenes, que comprende:
    (a) una fuente de radiacion (120), (122) situada para enviar radiacion de excitacion a al menos una porcion (14) de una region de muestra;
    (b) un conjunto de detectores rectangular (164), (166) que tiene elementos que convierten la energfa de los fotones en contacto en una respuesta electrica, estando dichos elementos en una disposicion ortogonal bidimensional en la que una primera dimension es mas larga que una segunda dimension;
    (c) un generador de lmea (94) colocado para recibir radiacion de excitacion procedente de dicha fuente de radiacion y para enviar una lmea de radiacion a dicha region de muestra;
    (d) una optica de formacion de imagenes (160) colocada para dirigir una imagen rectangular de dicha porcion a dicho conjunto de detectores rectangulares; y
    (e) un dispositivo de exploracion (140), (142), (144) configurado para explorar dicha region de muestra en una dimension de eje de exploracion, por lo que la porcion de dicha region de muestra que forma una imagen rectangular en dicho conjunto de detectores rectangular se cambia,
    en el que la menor de las dos dimensiones rectangulares para dicho conjunto de detectores rectangular y la menor de las dos dimensiones rectangulares para dicha imagen estan en dicha dimension del eje de exploracion, en el que dicha menor de las dos dimensiones rectangulares para dicho conjunto rectangular de detectores es lo suficientemente corta para conseguir confocalidad en un solo eje de dicho conjunto de detectores rectangulares, en el que dicho eje unico es dicha menor de las dos dimensiones rectangulares para dicho conjunto de detectores rectangular y en el que la relacion de las dos dimensiones rectangulares menores para dicha lmea de radiacion a la resolucion de Rayleigh de la optica de formacion de imagenes esta en el intervalo de 0,1 a 10.
  2. 2. El aparato de la reivindicacion 1, en el que dicha optica de formacion de imagenes comprende un objetivo situado para recibir dicha lmea de radiacion a traves de la misma para iluminar dicha region de muestra, en el que dicho objetivo esta opcionalmente colocado ademas para recoger la radiacion que emana de dicha region de muestra, en el que dicha radiacion que emana de dicha region de muestra forma dicha imagen rectangular que esta dirigida a dicho conjunto de detectores rectangular.
  3. 3. El aparato de la reivindicacion 2, que comprende ademas un divisor de haz colocado para separar dicha lmea de radiacion de dicha radiacion que emana desde dicha region de muestra y para dirigir dicha radiacion que emana desde dicha region de muestra a la matriz de detectores rectangular.
  4. 4. El aparato de la reivindicacion 1, en el que dicha optica de formacion de imagenes comprende un objetivo situado para recibir dicha lmea de radiacion a traves de la misma para iluminar dicha region de muestra y que opcionalmente comprende ademas un primer expansor situado para recibir radiacion de excitacion procedente de dicha fuente de radiacion y para enviar un haz expandido de dicha radiacion a dicho generador de lmeas.
  5. 5. El aparato de la reivindicacion 4, que comprende ademas un segundo expansor colocado para recibir dicha
    radiacion de excitacion desde dicho generador de lmea y enviar un haz expandido de dicha radiacion a dicho
    objetivo, en el que dicho segundo expansor esta configurado ademas para disminuir el angulo de campo de dicha lmea de radiacion.
  6. 6. El aparato de la reivindicacion 1, en el que dicho generador de lmea tiene un angulo de ventilador completo de seis grados y esta configurado para recibir un haz de entrada que tiene un diametro de como maximo 4 mm.
  7. 7. El aparato de la reivindicacion 1, en el que dicho generador de lmea comprende ademas un elemento difractivo para generar una lmea limitada por difraccion con distribucion de intensidad uniforme.
  8. 8. El aparato de la reivindicacion 1, en el que la relacion de la menor de dos dimensiones rectangulares para dicha lmea de radiacion con el cociente de dicho menor de las dos dimensiones rectangulares divididas por la ampliacion de la optica de formacion de imagenes esta en el intervalo de 0,1 a 10.
  9. 9. El aparato de la reivindicacion 1, en el que la relacion de la anchura 1/e2 de la menor de dos dimensiones
    rectangulares para dicha lmea de radiacion respecto al cociente de dicha menor de las dos dimensiones
    rectangulares para dicha matriz rectangular de detectores dividida por el aumento de la optica de formacion de imagenes esta en el intervalo de 0,5 a 2.
  10. 10. El aparato de la reivindicacion 1, en el que dicha fuente de radiacion comprende al menos un laser.
  11. 11. El aparato de la reivindicacion 1, configurado para formar imagenes de un microconjunto, en el que
    dicha fuente de radiacion comprende una fuente de luz laser; dicho generador de lmea comprende un cable de fibra optica acoplado de modo unico a la fuente de luz laser para transmitir luz laser en transmision de modo unico; un iluminador de lmea para convertir la luz laser de la fuente a dicha lmea de radiacion, incluyendo el iluminador de
    lmea un colimador dispuesto para recibir la luz laser de la fuente y una lente asferica para convertir la luz colimada desde el colimador a dicha lmea de radiacion;
    y dicha optica de formacion de imagenes comprende un dispositivo de enfoque para dirigir dicha lmea de radiacion sobre un plano en la superficie de un microconjunto.
    5
  12. 12. El aparato de la reivindicacion 11, en el que el iluminador de lmea esta configurado para convertir la luz laser de la fuente de luz laser a dicha lmea de radiacion en una intensidad sustancialmente uniforme sobre una longitud de lmea deseada.
    10 13. El aparato de la reivindicacion 11, que comprende un segundo cable de fibra optica acoplado a la fuente de luz
    laser en un extremo del mismo y acoplado al cable de fibra optica de modo unico en un extremo opuesto del mismo.
  13. 14. El aparato de la reivindicacion 1, en el que
    la fuente de radiacion comprende una primera y una segunda fuentes de luz laser, estando cada fuente configurada 15 para emitir luz laser en una banda de frecuencia predeterminada diferente; comprendiendo dicho generador de lmea un primer y un segundo cables de fibra optica acoplados de modo unico a la primera y segunda fuentes de luz laser, respectivamente, para transmitir luz laser en transmision de modo unico; y un primer y segundo iluminadores de lmea acoplados al primer y segundo cables de fibra optica, respectivamente, para convertir la luz laser de la fuente respectiva en una lmea de radiacion, incluyendo cada uno de los iluminadores de lmea un colimador dispuesto para 20 recibir la luz laser desde la fuente y una lente asferica para convertir la luz colimada desde el colimador a la lmea de radiacion.
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