JP2017227788A - 顕微鏡および顕微鏡画像取得方法 - Google Patents

Abstract

【課題】シート照明方式により、複雑で高価な調整機構を用いずに簡易な構成で鮮明な蛍光画像を取得する。【解決手段】標本Ｓから発せられる蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出光学系１７と、検出光学系１７の検出光軸に沿う方向に所定間隔をあけた平行な複数の入射平面に沿って、それぞれ異なる方向から平面状の励起光を標本Ｓに入射可能な照明装置５と、励起光ごとに、各入射平面と検出光学系１７の焦点面とを一致させた状態で、検出光学系１７および照明装置５と標本Ｓとを検出光軸に沿う方向に相対移動させる駆動部１５と、駆動部１５により相対移動させて異なる時刻に同一の入射平面に沿って異なる方向から各励起光が入射されたときに取得された蛍光画像どうしを合成する画像処理部４５とを備える顕微鏡１を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡および顕微鏡画像取得方法に関するものである。

従来、標本からの蛍光を検出する検出光学系の検出光軸に交差する入射平面に沿って、標本を挟んで対向する２方向から平面状の励起光を標本に入射させて、各方向からの励起光ごとに標本から発せられる蛍光に基づいて得られる蛍光画像を合成するシート照明方式の顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。

落射照明方式あるいは透過照明方式は、１点または複数点に集光させた励起光を２次元的に走査させることにより、２次元的な画像を取得する。これに対し、シート照明方式は、励起光を検出光軸に沿う方向の厚さが検出光学系の焦点深度に略等しいかまたは焦点深度より小さくなるように平面状に集光し、かつ広い範囲にわたって励起光の厚さがほぼ一定とみなせるために、焦点深度以下の広い範囲が一度に励起され、かつそれ以外の部分は励起されないために、画像の取得に要する時間を短縮することができる。

米国特許出願公開第２０１１／１１５８９５号明細書

ところで、従来のシート照明方式の顕微鏡のように、異なる方向から入射された励起光ごとに取得される蛍光画像を合成する場合、鮮明な合成画像を生成するためには各方向から同一の入射平面に沿って励起光を入射させる必要がある。しかしながら、励起光の検出光軸に沿う方向の厚さを非常に薄くするため、対向する２方向からの励起光の入射平面が互いに一致するように光学系を調整するには、複雑で高価な調整機構が必要になるという問題がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、シート照明方式により、複雑で高価な調整機構を用いずに簡易な構成で鮮明な蛍光画像を取得することができる顕微鏡、および、シート照明方式により、複雑で煩雑な調整を要せず簡易に鮮明な蛍光画像を取得することができる顕微鏡画像取得方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１態様は、標本から発せられる蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出光学系と、該検出光学系の検出光軸に沿う方向に所定間隔をあけた平行な複数の入射平面に沿って、それぞれ異なる方向から平面状の励起光を前記標本に入射可能なシート照明光学系と、前記励起光ごとに、各前記入射平面と前記検出光学系の焦点面とを一致させた状態で、前記検出光学系および前記シート照明光学系と前記標本とを前記検出光軸に沿う方向に相対移動させる移動機構と、該移動機構により相対移動させて異なる時刻に同一の前記入射平面に沿って前記異なる方向から各前記励起光が入射されたときに取得された前記蛍光画像どうしを合成する画像合成部とを備える顕微鏡である。

本態様によれば、シート照明光学系により、検出光学系の検出光軸に沿う方向に所定間隔をあけた平行な複数の入射平面に沿って平面状の励起光が標本に入射させるので、その入射平面に検出光学系の焦点面を一致させることにより、焦点面に沿う広い範囲において発生した蛍光を検出光学系によって１度に検出することができる。また、それぞれ異なる方向から標本に励起光を入射させることにより、各方向からの励起光の標本への入射深度を浅くして標本における散乱の影響を抑制し、鮮明な蛍光画像を取得することができる。

この場合において、移動機構により、異なる方向から標本に入射させる励起光ごとに、入射平面と検出光学系の焦点面とを一致させた状態で、検出光学系およびシート照明光学系と標本とを検出光軸に沿う方向に相対移動させることで、検出光学系により、異なる時刻に異なる方向から標本に入射される励起光の入射平面が互いに一致する画像を含む複数の蛍光画像を取得することができる。

これにより、各入射方向の励起光の入射平面を互いに一致させるようにシート照明光学系を調整することなく、画像合成部により、異なる時刻に同一の入射平面に沿って異なる方向から各励起光が入射されたときに取得された蛍光画像どうしを合成するだけで、鮮明な合成画像を生成することができる。したがって、シート照明方式により、シート照明光学系の調整のための複雑で高価な調整機構を用いずに、簡易な構成で鮮明な合成画像を取得することができる。

上記態様においては、前記移動機構が、前記検出光学系および前記シート照明光学系の位置を固定して、前記標本を前記検出光軸に沿う方向に移動させることとしてもよい。
このように構成することで、標本を検出光学系の検出光軸に沿う方向に移動させるだけの簡易な構成で、標本の検出光軸に沿う方向の位置が異なる複数のスタック画像を取得することができる。

上記態様においては、前記移動機構が、前記標本の位置を固定して、前記検出光学系および前記シート照明光学系を一体的に前記検出光軸に沿う方向に移動させることとしてもよい。
このように構成することで、標本を動かさずに標本の検出光軸に沿う方向の位置が異なる複数のスタック画像を取得することができる。標本を動かすことができないような場合に有効である。

本発明の第２態様は、検出光学系の検出光軸に沿う方向に所定間隔をあけた平行な複数の入射平面に沿って互いに異なる方向から標本に入射させる平面状の励起光ごとに、前記入射平面と前記検出光学系の焦点面とを一致させる焦点合わせステップと、該焦点合わせステップにより前記励起光ごとに前記入射平面と前記検出光学系の焦点面とが一致させられた状態で、前記検出光学系の焦点面および前記励起光の前記入射平面と前記標本とを前記検出光軸に沿う方向に相対移動させる移動ステップと、該移動ステップにより相対移動させながら、前記異なる方向から各前記励起光を前記標本に入射させる入射ステップと、該入射ステップにより前記励起光が入射されることによって前記標本から発せられる蛍光を前記検出光学系により検出して蛍光画像を取得する画像取得ステップと、該画像取得ステップにより取得された前記蛍光画像の内、異なる時刻に同一の前記入射平面に沿って前記異なる方向から各前記励起光が入射されたときに取得された前記蛍光画像どうしを合成する合成ステップとを含む顕微鏡画像取得方法である。

本態様によれば、焦点合わせステップにより、異なる方向から標本に入射させる励起光ごとに入射平面と検出光学系の焦点面とを一致させ、入射ステップにより、検出光学系の検出光軸に沿う方向に所定間隔をあけた平行な複数の入射平面に沿って平面状の励起光を標本に入射させることで、画像取得ステップにより、焦点面に沿う広い範囲において発生した蛍光を１度に検出することができる。また、互いに異なる方向から標本に励起光を入射させることで、各方向からの励起光の標本への入射深度を浅くして標本における散乱の影響を抑制し、鮮明な蛍光画像を取得することができる。

この場合において、移動ステップにより、励起光ごとに入射平面と検出光学系の焦点面とを一致させた状態で、検出光学系の焦点面および励起光の入射平面と標本とを光軸方向に沿う方向に相対移動させながら、入射ステップにより各入射方向から標本に励起光を入射させることで、画像取得ステップにより、異なる時刻に異なる方向から標本に入射される励起光の入射平面が互いに一致する画像を含む複数の蛍光画像を取得することができる。

これにより、各入射方向の励起光の入射平面を互いに一致させるように光学系を調整することなく、合成ステップにより、異なる時刻に同一の入射平面に沿って異なる方向から各励起光が入射されたときに取得された蛍光画像どうしを合成するだけで、鮮明な合成画像を生成することができる。したがって、シート照明方式により、複雑で煩雑な調整を要せず簡易に鮮明な蛍光画像を取得することができる。

上記態様においては、前記合成ステップが、前記所定間隔の距離と前記相対移動の移動量とに基づいて前記入射平面が一致すると特定される前記蛍光画像どうしを合成することとしてもよい。
このように構成することで、所定間隔の距離を予め測定しておくだけで、入射方向ごとの各励起光の入射平面が互いに一致する蛍光画像を容易に特定して合成することができる。

上記態様においては、前記移動ステップが、前記検出光学系の焦点面および前記励起光の入射平面を固定して、前記標本を前記検出光軸に沿う方向に移動させることとしてもよい。
このように構成することで、標本を検出光学系の検出光軸に沿う方向に移動させるだけの簡易な操作で、標本の検出光軸に沿う方向の位置が異なる複数のスタック画像を取得することができる。

上記態様においては、前記移動ステップが、前記標本の位置を固定して、前記検出光学系の焦点面および前記励起光の入射平面を一体的に前記検出光軸に沿う方向に移動させることとしてもよい。
このように構成することで、標本を動かさずに標本の検出光軸に沿う方向の位置が異なる複数のスタック画像を取得することができる。

本発明に係る顕微鏡によれば、シート照明方式により、複雑で高価な調整機構を用いずに簡易な構成で鮮明な蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。また、本発明に係る顕微鏡画像取得方法によれば、シート照明方式により、複雑で煩雑な調整を要せず簡易に鮮明な蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡を示す概略構成図である。 （ａ）は図１の照明装置から左側光路により標本に励起光を入射させる様子を検出光軸に沿う方向に見た平面図であり、（ｂ）は図１の照明装置から右側光路により標本に励起光を入射させる様子を検出光軸に沿う方向に見た平面図である。 本発明の一実施形態に係る顕微鏡画像取得方法を説明するフローチャートである。 標本を検出光軸に沿う方向に移動させながら左側光路により標本に励起光を照射する様子を示す側面図である。 左側光路からの平面状の励起光の入射平面と右側光路からの平面状の励起光の入射平面をそれぞれ検出光軸に沿う方向に所定の間隔をあけて検出光学系の焦点面に一致させた様子を示す側面図である。 標本を検出光軸に沿う方向に移動させながら右側光路により標本に励起光を照射する様子を示す側面図である。 標本の広範囲に亘る複数の観察領域と観察視野の一例を検出光軸に沿う方向に見た平面図である。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡および顕微鏡画像取得方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、顕微鏡本体３と、顕微鏡本体３に接続される照明装置（シート照明光学系）５と、顕微鏡本体３および照明装置５を制御する制御装置７とを備えている。制御装置７には、ユーザに指示を入力させるマウスやキーボード等の入力装置９と、顕微鏡本体３により取得された画像等を表示するモニタ１１とが接続されている。

顕微鏡本体３は、標本Ｓを載置するステージ１３と、ステージ１３を駆動する駆動部（移動機構）１５と、ステージ１３に載置された標本Ｓから発せられる蛍光を検出する検出光学系１７とを備えている。

標本Ｓは、ステージ１３に搭載された容器１９に収容されている。容器１９には水などの液体Ｗが充填されており、液体Ｗに標本Ｓが浸漬されている。容器１９は、照明装置５から入射される励起光を透過可能な材質で形成されており、検出光学系１７に対向する方向が開口している。液体Ｗとしては、例えば、標本Ｓと屈折率が略同一のものが好ましい。

駆動部１５は、制御装置７の制御により、検出光学系１７の検出光軸Ｑに沿う方向およびこれに直交する２次元方向にそれぞれステージ１３を移動させることができるようになっている。

検出光学系１７は、ステージ１３の鉛直上方に対向して配置される対物レンズ２１と、対物レンズ２１を保持するレボルバ２３と、対物レンズ２１により集光された標本Ｓからの蛍光を結像させる結像レンズ２５と、結像レンズ２５により結像された蛍光を撮影して蛍光画像を取得するＣＣＤのような撮像素子２７とを備えている。図中、符号２９は、蛍光に含まれる励起光を除去するバリアフィルタを備えるフィルタホイールである。

レボルバ２３は、複数の対物レンズ２１を検出光軸Ｑ上に択一的に配置可能に保持するようになっている。また、レボルバ２３は、制御装置７の制御により、検出光軸Ｑ上に配置した対物レンズ２１を検出光軸Ｑに沿う方向に移動させることができるようになっている。

照明装置５は、図２（ａ），（ｂ）に示されるように、略平行光からなる励起光を照明光軸Ｐに沿って射出する励起光源３１と、励起光源３１から射出された励起光を２つの光路に分岐するハーフミラー３３と、ハーフミラー３３により分岐された２つの光路を経由した励起光を標本Ｓを挟んで対向する２方向から標本Ｓに入射させる２つのシリンドリカルレンズ３５Ａ，３５Ｂとを備えている。図中、符号３７は光路を形成するミラーであり、符号３９は２つの光路にそれぞれ設けられたシャッタである。

シリンドリカルレンズ３５Ａ，３５Ｂは、照明光軸Ｐに直交する一方向にパワーを有し、略平行光からなる励起光をその光束径寸法と同じ所定の幅寸法を有する平面状に集光させるようになっている。また、これらシリンドリカルレンズ３５Ａ，３５Ｂは、検出光軸Ｑに沿う方向に所定間隔をあけた平行な複数の入射平面に沿って、それぞれ異なる方向から平面状の励起光を容器１９を介して標本Ｓに入射させることができるようになっている。

制御装置７は、ＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ、図示略）と、ＰＣと顕微鏡本体３および照明装置５の各種電動部との間で信号の入出力を行う制御基板（図示略）とを備えている。

ＰＣは、各種プログラムが記憶されたメモリ（図示略）と、入力装置９により入力されるユーザの指示に基づき、メモリに記憶されているプログラムを読み込んで、各プログラムを実行する演算処理装置（図示略）とを備えている。

ＰＣのメモリには、例えば、画像処理プログラム、顕微鏡制御プログラムおよび照明制御プログラムが記憶されている。また、メモリには、ユーザが事前に測定した照明装置５の２つの光路の各入射平面間に生じる検出光軸Ｑに沿う方向のずれ量を記憶させることができるようになっている。

ＰＣの演算処理装置は、顕微鏡制御プログラムの実行により顕微鏡本体３を制御する顕微鏡制御部としての機能と、照明制御プログラムの実行により照明装置５を制御する照明制御部としての機能と、画像処理プログラムの実行により蛍光画像を処理する画像処理部としての機能とを有している。以下、図１に示すように、ＰＣの演算処理装置の構成要素を顕微鏡制御部４１、照明制御部４３および画像処理部（画像合成部）４５とする。

顕微鏡制御部４１は、顕微鏡制御プログラムの実行により、レボルバ２３を作動させて対物レンズ２１を交換や移動したり、フィルタホイール２９を作動させてフィルタを交換したりするようになっている。また、顕微鏡制御部４１は、顕微鏡制御プログラムの実行により、ステージ１３を検出光軸Ｑに直交する方向に２次元的に移動させたり、ステージ１３を検出光軸Ｑに沿う方向に一定の速度で連続的にまたは所定のピッチで段階的に移動させたりするようになっている。また、顕微鏡制御部４１は、顕微鏡制御プログラムの実行により、撮像素子２７により一定の間隔で蛍光画像を取得させるようになっている。

照明制御部４３は、照明制御プログラムの実行により、シャッタ３９を択一的に開閉させるようになっている。具体的には、照明制御部４３は、図２（ａ）に示されるように、シャッタ３９を択一的に開閉することにより、標本Ｓに対して一方向（図２（ａ）の紙面に対して標本Ｓの左側）からシリンドリカルレンズ３５Ａを介して励起光を入射させる光路（以下、左側光路Ｌという。）と、図２（ｂ）に示されるように、標本Ｓに対して他方向（図２（ｂ）の紙面に対して標本Ｓの右側）からシリンドリカルレンズ３５Ｂを介して励起光を入射させる光路（以下、右側光路Ｒという。）とを切り替えることができるようになっている。

画像処理部４５は、撮像素子２７から送られてくる蛍光画像を一時的に保存可能なＦＩＦＯ画像バッファを有している。この画像処理部４５は、撮像素子２７から送られてくる蛍光画像を処理してモニタ１１に表示させるようになっている。また、画像処理部４５は、画像処理プログラムの実行により、ＦＩＦＯ画像バッファに保存している蛍光画像の内、異なる時刻に同一の入射平面に沿って左側光路Ｌおよび右側光路Ｒから各励起光が入射されたときに撮像素子２７により取得された蛍光画像どうしを合成するようになっている。

例えば、画像処理部４５は、標本Ｓに対して左側光路Ｌから励起光を照射した場合と右側光路Ｒから励起光を照射した場合とで同一の観察領域の蛍光画像を取得し、その同一範囲の蛍光画像どうしを合わせて１枚の合成画像を生成することとしてもよい。また、例えば、画像処理部４５は、標本Ｓに対して左側光路Ｌから励起光を照射した場合と右側光路Ｒから励起光を照射した場合とで同一の観察領域の蛍光画像を取得した後に、各光路Ｌ，Ｒごとに照明光軸Ｐに沿う方向の入射側半分の領域をそれぞれ切り出して、それらを貼り合わせて１枚の合成画像を生成することとしてもよい。

次に、本実施形態に係る顕微鏡画像取得方法について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡画像取得方法は、図３のフローチャートに示されるように、検出光学系１７の検出光軸Ｑに沿う方向に所定間隔をあけた平行な複数の入射平面に沿って互いに異なる方向から標本Ｓに入射させる平面状の励起光ごとに、入射平面と検出光学系１７の焦点面とを一致させる焦点合わせステップＳ１，Ｓ５と、焦点合わせステップＳ１，Ｓ５により励起光ごとに入射平面と検出光学系１７の焦点面とが一致させられた状態で、検出光学系１７の焦点面および励起光の入射平面と標本Ｓとを検出光軸Ｑに沿う方向に相対移動させる移動ステップＳ２、Ｓ６と、移動ステップＳ２、Ｓ６により相対移動させながら、異なる方向から各励起光を標本Ｓに入射させる入射ステップＳ３，Ｓ７と、入射ステップＳ３，Ｓ７により励起光が入射されることによって標本Ｓから発せられる蛍光を検出光学系１７により検出して蛍光画像を取得する画像取得ステップＳ４，Ｓ８と、画像取得ステップＳ４，Ｓ８により取得された蛍光画像の内、異なる時刻に同一の入射平面に沿って異なる方向から各励起光が入射されたときに取得された蛍光画像どうしを合成する合成ステップＳ９とを含んでいる。

合成ステップＳ９は、照明装置５の２つの光路Ｌ，Ｒの入射平面間に生じるずれ量（所定間隔の距離）と、駆動部１５による標本Ｓの検出光軸Ｑに沿う方向の移動量とに基づいて、入射平面が一致すると特定される蛍光画像どうしを合成するようになっている。

このように構成された顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法の作用について、図３のフローチャートを参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法により標本Ｓを観察するには、まず、照明装置５の左側光路Ｌと右側光路Ｒの励起光の入射平面のずれ量をユーザが事前に測定して、入力装置９により制御装置７のメモリに記憶させる。

次に、ユーザは、照明制御部４３により、例えば、図２（ａ）に示すように、照明装置５のシャッタ３９を択一的に開閉し、左側光路Ｌを開放して右側光路Ｒを閉鎖する。そして、励起光源３１から励起光を発生させる。

次いで、顕微鏡制御部４１により、レボルバ２３を作動させて対物レンズ２１を検出光軸Ｑに沿う方向に移動させ、図４に示すように、検出光学系１７の焦点面を左側光路Ｌの入射平面に一致させる（焦点合わせステップＳ１）。

次いで、顕微鏡制御部４１により、左側光路Ｌの入射平面と検出光学系１７の焦点面とが一致させられた状態で、顕微鏡制御部４１により駆動部１５を作動させ、ステージ１３を検出光軸Ｑに沿ってＺ０位置からＺ０＋Ｈ位置に向かって上昇させる（移動ステップＳ２）。

図２（ａ）に示されるように、励起光源３１から射出されてハーフミラー３３を透過した励起光は、シリンドリカルレンズ３５により平面状に集光され、ステージ１３と共に検出光軸Ｑに沿う方向に移動する標本Ｓに左側光路Ｌから入射平面に沿って入射される（入射ステップＳ３）。標本Ｓに平面状の励起光が入射することにより、励起光の入射平面に沿って標本Ｓ内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。

左側光路Ｌから励起光が入射されることにより標本Ｓにおいて発生した蛍光の内、検出光軸Ｑに沿う方向に放射された蛍光は、対物レンズ２１により集光されてフィルタホイール２９のバリアフィルタを通過した後、結像レンズ２５により結像されて撮像素子２７により撮影される。そして、顕微鏡制御部４１により撮像素子２７が制御され、一定の時間間隔で蛍光画像が取得される（画像取得ステップＳ４）。これにより、左側光路Ｌからの励起光の照射によって、ステージ１３のＺ０位置からＺ０＋Ｈまでの範囲で一定の間隔で複数の蛍光画像、すなわち、スタック画像が取得される。

左側光路Ｌからの励起光の照射により取得された標本Ｓの複数の蛍光画像を、例えば、Ｚ０位置側から時系列順にＬｅｆｔ［０］，Ｌｅｆｔ［１］，・・・Ｌｅｆｔ［ｍ］とする。［０］，［１］，・・・［ｍ］は配列番号を示している。これらの蛍光画像は、画像処理部４５のＦＩＦＯ画像バッファに保存される。

次に、ユーザは、照明制御部４３により、例えば、図２（ｂ）に示すように、照明装置５のシャッタ３９の開閉を切り替え、左側光路Ｌを閉鎖して右側光路Ｒを開放する。

次いで、顕微鏡制御部４１により、レボルバ２３を作動させて対物レンズ２１を検出光軸Ｑに沿う方向にずれ量Ａだけ移動させ、図５に示すように、検出光学系１７の焦点面を右側光路Ｒの入射平面に一致させる（焦点合わせステップＳ５）。図５に示す例では、右側光路Ｒの入射平面の方が左側光路Ｌの入射平面よりも鉛直方向下方にずれ量Ａだけずれているものとする。

次いで、ユーザは、右側光路Ｒの入射平面と検出光学系１７の焦点面とが一致させられた状態で、顕微鏡制御部４１により駆動部１５を作動させて、図６に示すように、ステージ１３を検出光軸Ｑに沿ってＺ０−Ａ位置からＺ０−Ａ＋Ｈ位置に向かって上昇させる（移動ステップＳ６）。

図２（ｂ）に示されるように、励起光源３１から射出されてハーフミラー３３により反射された励起光は、ミラー３７を介してシリンドリカルレンズ３５Ｂにより平面状に集光され、ステージ１３と共に検出光軸Ｑに沿う方向に移動する標本Ｓに右側光路Ｒから入射平面に沿って入射される（入射ステップＳ７）。標本Ｓに平面状の励起光が入射することにより、励起光の入射平面に沿って標本Ｓ内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。

右側光路Ｒからの励起光が入射されることにより標本Ｓにおいて検出光軸Ｑに沿う方向に発生した蛍光は、左側光路Ｌからの励起光により発生する蛍光と同様に、対物レンズ２１により集光されてフィルタホイール２９および結像レンズ２５を介して、撮像素子２７により撮影される。そして、顕微鏡制御部４１により撮像素子２７が制御され、一定の時間間隔で蛍光画像が取得される（画像取得ステップＳ８）。これにより、右側光路Ｒからの励起光の照射によって、ステージ１３のＺ０−Ａ位置からＺ０−Ａ＋Ｈまでの範囲で一定の間隔で複数の蛍光画像、すなわち、Ｚスタック画像が取得される。

右側光路Ｒからの励起光の照射により取得された標本Ｓの蛍光画像を、例えば、Ｚ０−Ａ位置側から時系列順にＲｉｇｈｔ［０］，Ｒｉｇｈｔ［１］，・・・Ｒｉｇｈｔ［ｍ］とする。これらの蛍光画像も、画像処理部４５のＦＩＦＯ画像バッファに保存される。

次いで、画像処理部４５により、ＦＩＦＯ画像バッファに保存されている複数の蛍光画像の内、同じ配列番号の蛍光画像どうし、例えば、Ｌｅｆｔ［０］とＲｉｇｈｔ［０］，Ｌｅｆｔ［１］とＲｉｇｈｔ［１］，・・・Ｌｅｆｔ［ｍ］とＲｉｇｈｔ［ｍ］が合成される（合成ステップＳ９）。合成された標本Ｓの蛍光画像はモニタ１１に送られて表示される。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法によれば、平面状の励起光の入射平面に検出光学系１７の焦点面を一致させることにより、焦点面に沿う広い範囲において標本Ｓから発せられる蛍光を検出光学系１７によって１度に検出することができる。また、それぞれ異なる方向から標本Ｓに励起光を入射させることにより、各方向からの励起光の標本Ｓへの入射深度を浅くして標本Ｓにおける散乱の影響を抑制し、鮮明な蛍光画像を取得することができる。

この場合において、左側光路Ｌおよび右側光路Ｒから標本Ｓに入射される励起光ごとに、入射平面と検出光学系１７の焦点面とを一致させた状態で、標本Ｓを検出光軸Ｑに沿う方向に移動させることで、検出光学系１７により、異なる時刻に左側光路Ｌおよび右側光路Ｒから標本Ｓに入射される励起光の入射平面が互いに一致する画像を含む複数の蛍光画像を取得することができる。

これにより、各入射方向の励起光の入射平面を互いに一致させるように照明装置５を調整することなく、異なる時刻に同一の入射平面に沿って左側光路Ｌおよび右側光路Ｒから各励起光が入射されたときに取得された蛍光画像どうしを合成するだけで、鮮明な合成画像を生成することができる。したがって、シート照明方式により、照明装置５の調整のための複雑で高価な調整機構を用いずに、また、煩雑な調整を要せず、簡易な構成で鮮明な合成画像を容易に取得することができる。

本実施形態においては、標本Ｓの１つの観察領域を観察する場合を例示して説明したが、例えば、標本Ｓの広範囲に亘る複数の観察領域を観察することしてもよい。
以下、図７を参照して、標本Ｓの検出光軸Ｑに交差する方向に隣接する３つの観察領域Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３を観察する場合を例示して説明する。検出光軸Ｑに沿う方向をＺ方向とし、検出光軸Ｑに交差する方向をＸＹ方向とする。

まず、標本Ｓの観察領域Ｐ１を観察する場合は、照明制御部４３により照明装置５のシャッタ３９を択一的に開閉して、左側光路Ｌを開放して右側光路Ｒを閉鎖し、左側光路Ｌからの励起光のみを照射する。そして、顕微鏡制御部４１によりステージ１３をＸＹ方向に移動させ、顕微鏡１の観察視野内に観察領域Ｐ１を移動させる。

次いで、顕微鏡制御部４１により、検出光学系１７の焦点面を左側光路Ｌの入射平面に一致させ、駆動部１５によりステージ１３をＺ０位置からＺ０＋Ｈ位置まで移動させながら、励起光源３１から左側光路Ｌにより平面状の励起光を標本Ｓに入射させる。そして、撮像素子２７により標本Ｓからの蛍光を撮影し、一定の時間間隔でｍ枚のスタック画像（蛍光画像）を取得する。観察領域Ｐ１のスタック画像をＺ０位置側から時系列順にＰ１［０］，Ｐ１［１］・・・Ｐ１［ｍ］とする。これらのスタック画像は、画像処理部４５のＦＩＦＯ画像バッファに保存される。

次に、観察領域Ｐ２を観察する場合は、照明制御部４３により照明装置５のシャッタ３９を択一的に開閉し、左側光路Ｌからの励起光と右側光路Ｒからの励起光を切り替えて照射する。そして、顕微鏡制御部４１により駆動部１５を作動させて、ステージ１３をＸＹ方向に移動させ、顕微鏡１の観察視野内に観察領域Ｐ２を移動させる。

左側光路Ｌの場合は、顕微鏡制御部４１により、レボルバ２３を作動させて検出光学系１７の焦点面を左側光路Ｌの入射平面に一致させ、駆動部１５によりステージ１３をＺ０位置からＺ０＋Ｈまで移動させながら、励起光源３１から左側光路Ｌにより平面状の励起光を標本Ｓに入射させる。そして、撮像素子２７により標本Ｓからの蛍光を撮影して、一定の時間間隔でｍ枚のスタック画像を取得する。

右側光路Ｒの場合は、顕微鏡制御部４１により、レボルバ２３を作動させて検出光学系１７の焦点面を右側光路Ｒの入射平面に一致させ、駆動部１５によりステージ１３をＺ０−Ａ位置からＺ０−Ａ＋Ｚ位置まで移動させながら、励起光源３１から右側光路Ｒにより平面状の励起光を標本Ｓに入射させる。そして、撮像素子２７により標本Ｓからの蛍光を撮影して、一定の間隔でｍ枚の画像を取得する。

次に、画像処理部４５により、異なる時刻に同一の入射平面に沿って左側光路Ｌおよび右側光路Ｒから各励起光が入射されたときに取得されたＬｅｆｔ［０］，Ｌｅｆｔ［１］，・・・Ｌｅｆｔ［ｍ］の蛍光画像と、Ｒｉｇｈｔ［０］，Ｒｉｇｈｔ［１］，・・・Ｒｉｇｈｔ［ｍ］の蛍光画像とをそれぞれ合成して、ｍ枚の合成画像を生成する。観察領域Ｐ２の合成画像をＺ０位置側から時系列順にＰ２［０］，Ｐ２［１］、・・・Ｐ２［ｍ］とする。これらの合成画像も画像処理部４５のＦＩＦＯ画像バッファに保存される。

次に、標本Ｓの観察領域Ｐ３を観察する場合は、照明制御部４３により照明装置５のシャッタ３９を択一的に開閉して、左側光路Ｌを閉鎖して右側光路Ｒを開放し、右側光路Ｒからの励起光のみを照射する。そして、顕微鏡制御部４１によりステージ１３をＸＹ方向に移動させて、顕微鏡１の観察視野内に観察領域Ｐ３を移動させる。

次いで、顕微鏡制御部４１により、検出光学系１７の焦点面を右側光路Ｒの入射平面に一致させ、駆動部１５によりステージ１３をＺ０−Ａ位置からＺ０−Ａ＋Ｈまで移動させながら、励起光源３１から右側光路Ｒにより平面状の励起光を標本Ｓに入射させる。そして、撮像素子２７により標本Ｓからの蛍光を撮影し、一定の時間間隔でｍ枚のスタック画像を取得する。観察領域Ｐ３のスタック画像をＺ０−Ａ位置側から時系列順にＰ３［０］，Ｐ３［１］・・・Ｐ３［ｍ］とする。これらのスタック画像も画像処理部４５のＦＩＦＯ画像バッファに保存される。

次に、画像処理部４５により、ＦＩＦＯ画像バッファに保存されている３つの観察領域Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３の複数の蛍光画像の内、異なる時刻に同一の入射平面に沿って各励起光が入射されたときに取得された配列番号が同じ蛍光画像どうし、例えば、Ｐ１［０］とＰ２［０］とＰ３［０］，Ｐ１［１］とＰ２［１］とＰ３［１］・・・Ｐ１［ｍ］とＰ２［ｍ］とＰ３［ｍ］とを貼り合わせる。これにより、観察領域Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３の連続する合成画像が生成される。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法によれば、標本Ｓの広範囲に亘る複数の観察領域Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３を観察する場合にも、シート照明方式により、照明装置５の調整のための複雑で高価な調整機構を用いずに、また、煩雑な調整を要せず、簡易な構成で鮮明な合成画像を容易に取得することができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。例えば、上記実施形態においては、対向する２方向から励起光を標本Ｓに入射させることとしたが、例えば、３方向以上から励起光を標本Ｓに入射させることとしてもよい。

また、上記実施形態においては、検出光学系１７および照明装置５の位置を固定して、標本Ｓを移動させることとしたが、検出光学系１７および照明装置５と標本Ｓとを相対移動させることとすればよい。例えば、標本Ｓの位置を固定して、励起光の入射平面と検出光学系１７の焦点面とを一致させた状態で、検出光学系１７および照明装置５を一体的に検出光軸Ｑに沿う方向に移動させることとしてもよいし、これら検出光学系１７および照明装置５と標本Ｓの両方を移動させることとしてもよい。

１ 顕微鏡
５ 照明装置（シート照明光学系）
１５ 駆動部
１７ 検出光学系
４５ 画像処理部（画像合成部）
Ｓ１，Ｓ５ 焦点合わせステップ
Ｓ２，Ｓ６ 移動ステップ
Ｓ３，Ｓ７ 入射ステップ
Ｓ４，Ｓ８ 画像取得ステップ
Ｓ９ 合成ステップ
Ｓ 標本

Claims (7)

1. 標本から発せられる蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出光学系と、
   該検出光学系の検出光軸に沿う方向に所定間隔をあけた平行な複数の入射平面に沿って、それぞれ異なる方向から平面状の励起光を前記標本に入射可能なシート照明光学系と、
   前記励起光ごとに、各前記入射平面と前記検出光学系の焦点面とを一致させた状態で、前記検出光学系および前記シート照明光学系と前記標本とを前記検出光軸に沿う方向に相対移動させる移動機構と、
   該移動機構により相対移動させて異なる時刻に同一の前記入射平面に沿って前記異なる方向から各前記励起光が入射されたときに取得された前記蛍光画像どうしを合成する画像合成部とを備える顕微鏡。
2. 前記移動機構が、前記検出光学系および前記シート照明光学系の位置を固定して、前記標本を前記検出光軸に沿う方向に移動させる請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記移動機構が、前記標本の位置を固定して、前記検出光学系および前記シート照明光学系を一体的に前記検出光軸に沿う方向に移動させる請求項１に記載の顕微鏡。
4. 検出光学系の検出光軸に沿う方向に所定間隔をあけた平行な複数の入射平面に沿って互いに異なる方向から標本に入射させる平面状の励起光ごとに、前記入射平面と前記検出光学系の焦点面とを一致させる焦点合わせステップと、
   該焦点合わせステップにより前記励起光ごとに前記入射平面と前記検出光学系の焦点面とが一致させられた状態で、前記検出光学系の焦点面および前記励起光の前記入射平面と前記標本とを前記検出光軸に沿う方向に相対移動させる移動ステップと、
   該移動ステップにより相対移動させながら、前記異なる方向から各前記励起光を前記標本に入射させる入射ステップと、
   該入射ステップにより前記励起光が入射されることによって前記標本から発せられる蛍光を前記検出光学系により検出して蛍光画像を取得する画像取得ステップと、
   該画像取得ステップにより取得された前記蛍光画像の内、異なる時刻に同一の前記入射平面に沿って前記異なる方向から各前記励起光が入射されたときに取得された前記蛍光画像どうしを合成する合成ステップとを含む顕微鏡画像取得方法。
5. 前記合成ステップが、前記所定間隔の距離と前記相対移動の移動量とに基づいて前記入射平面が一致すると特定される前記蛍光画像どうしを合成する請求項４に記載の顕微鏡画像取得方法。
6. 前記移動ステップが、前記検出光学系の焦点面および前記励起光の入射平面を固定して、前記標本を前記検出光軸に沿う方向に移動させる請求項４または請求項５に記載の顕微鏡画像取得方法。
7. 前記移動ステップが、前記標本の位置を固定して、前記検出光学系の焦点面および前記励起光の入射平面を一体的に前記検出光軸に沿う方向に移動させる請求項４または請求項５に記載の顕微鏡画像取得方法。

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