JP2003167198A - 顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ポンプ光とイレース光とを光路分岐すること
なく、一貫して同じ光軸上を進行させて試料面まで到達
させることにより、光の利用効率に優れ、簡単な光学系
の構成で観察分解能に優れた顕微鏡を提供する。 【解決手段】 レーザー光源１からのレーザー光を波長
変換素子２に入射させて同軸上で基本波とその２倍波と
を得、これらの光を位相変調素子４に入射させて、２倍
波はビーム整形することなく出射させ、基本波はビーム
中央部の強度が周辺部よりも弱くなるように位相変調し
て出射させて、基本波をイレース光として、２倍波をポ
ンプ光として集光光学系８により観察試料９に集光させ
ることにより、ポンプ光により観察試料９内の分子を基
底状態から第１電子励起状態に励起し、イレース光によ
り第１電子励起状態から他の電子状態へ遷移させて、観
察試料９からからの発光を検出光学系１０〜１４で検出
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、顕微鏡、特に染色
した試料を機能性の高いレーザー光源からの複数の波長
の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ
高機能の新しい光学顕微鏡に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプ
の顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザー
技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩
により、更に高機能の顕微鏡システムが開発されてい
る。

【０００３】このような背景の中、例えば特開平８−１
８４５５２号公報において、複数波長の光で試料を照明
することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得ら
れる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可
能にした高機能な顕微鏡が提案されている。

【０００４】この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定
の分子を選択し、特定の光学遷移に起因する吸収および
蛍光を観測するものである。この原理について、図７〜
図１０を参照して説明する。図７は、試料を構成する分
子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図７に
示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電
子を波長λ１の光により励起して、図８に示す第１電子
励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光
により同様に励起して図９に示す第２電子励起状態（Ｓ
２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光ある
いは燐光を発光して、図１０に示すように基底状態に戻
る。

【０００５】二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、
図８の吸収過程や図１０の蛍光や燐光の発光を用いて、
吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初に
レーザー光等により共鳴波長λ１の光で図８のように試
料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、
単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度
が増加するに従って増加する。

【０００６】ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸
収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられる
ので、図９のような励起過程においては、続いて照射す
る共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した
波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、
波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で
制御できることになる。このことは、波長λ１および波
長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透
過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の
光で完全に制御できることを示している。

【０００７】また、図９の励起状態での蛍光または燐光
による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度
はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光
顕微鏡として利用する場合には画像コントラストの制御
が可能となる。

【０００８】さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡
法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化
学分析も可能にする。すなわち、図７に示される最外殻
価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持
つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同
時に波長λ２も分子固有のものとなる。

【０００９】ここで、従来の単一波長で照明する場合で
も、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察
することが可能であるが、一般にはいくつかの分子にお
ける吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成
の正確な同定までは不可能である。

【００１０】これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕
微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸
収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも
正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電
子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトル
をもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波
長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれ
ば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。

【００１１】また、最近では、例えば特開２００１−１
００１０２号公報において、二重共鳴吸収過程を用いて
回折限界を越える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提
案されている。

【００１２】図１１は、分子における二重共鳴吸収過程
の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第
１電子励起状態であるＳ１に励起され、更に波長λ２の
光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子
を示している。なお、図１１はある種の分子のＳ２から
の蛍光が極めて弱いことを示している。

【００１３】図１１に示すような光学的性質を持つ分子
の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１２は、
図１１と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ
軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射
した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領
域Ａ０とを示している。

【００１４】図１２において、空間領域Ａ０では波長λ
１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、そ
の際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見
られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照
射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位の
Ｓ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくな
る。このような現象は、幾つかの分子により確認されて
いる。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光
は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもとも
とないので、空間領域Ａ１では蛍光自体が完全に抑制さ
れ（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発す
ることになる。

【００１５】このことは、顕微鏡の応用分野から考察す
ると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来
の走査型レーザー顕微鏡等では、レーザー光を集光レン
ズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査す
るが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズ
の開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそ
れ以上の空間分解能は期待できない。

【００１６】ところが、図１２の場合には、波長λ１と
波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせ
て、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制すること
で、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光
領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よ
りも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが
可能となる。したがって、この原理を利用することで、
回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微
鏡、例えば蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。

【００１７】さらに、顕微鏡の超解像性を高めるため、
例えば特開平１１−９５１２０号公報において、超解像
顕微鏡の機能を十分に活かすための蛍光ラベラー分子
や、利用する波長λ１および波長λ２の２つの光の試料
への照射タイミング等が開示されている。この先行技術
では、少なくとも基底状態を含む３つの量子状態を有
し、第１電子励起状態を除く高位のエネルギー状態から
基底状態へ脱励起するときの遷移が蛍光による緩和過程
よりも熱緩和過程が支配的である各種分子を染色する蛍
光ラベラー分子と、生化学的な染色技術を施した生体分
子とを化学結合させた試料を、染色する分子を励起する
波長λ１の光でＳ１状態に励起し、続いて波長λ２の光
により即座に高位の量子準位に励起することで、Ｓ１状
態からの蛍光を抑制するようにしている。このように分
子の光学的性質を利用して、空間的な蛍光領域を人為的
に抑制することで、空間分解能の向上を図ることができ
る。

【００１８】このような分子の光学的性質は、量子化学
的な立場から説明することができる。すなわち、一般
に、分子はそれを構成する各原子がσまたはπ結合によ
って結ばれている。言い換えると、分子の分子軌道は、
σ分子軌道またはπ分子軌道を有していて、これらの分
子軌道に存在する電子が各原子を結合する重要な役割を
担っている。そのなかでも、σ分子軌道の電子は各原子
を強く結合し、分子の骨格である分子内の原子間距離を
決めている。これに対して、π分子軌道の電子は各原子
の結合にほとんど寄与しないで、むしろ分子全体に極め
て弱い力で束縛されている。

【００１９】多くの場合、σ分子軌道にいる電子を光で
励起すると、分子の原子間隔が大きく変化し、分子の解
離を含む大きな構造変化が起こる。その結果、原子の運
動エネルギーや構造変化のために、光が分子に与えたエ
ネルギーのほとんどが熱エネルギーに変化する。したが
って、励起エネルギーは蛍光という光の形態では消費さ
れない。また、分子の構造変化は極めて高速（ピコ秒よ
り短い）に起こるので、その過程で仮に蛍光が起きても
その寿命が極めて短い。

【００２０】これに対し、π分子軌道の電子は、励起し
ても分子の構造自体はほとんど変化せず、高位の量子的
な離散準位に長時間とどまり、ナノ秒オーダで蛍光を放
出して脱励起する性質を有している。

【００２１】量子化学によれば、分子がπ分子軌道をも
つことと、二重結合をもつこととは同等であり、用いる
蛍光ラベラー分子には、二重結合を豊富にもつ分子を選
定することが必要条件となる。このことは、二重結合を
もつ分子でもベンゼンやピラジン等の６員環分子におい
て、Ｓ２励起状態からの蛍光が極めて弱いことが確かめ
られている（例えば、M.Fujii et.al.Chem.Phys.Lett.1
71(1990)341）。

【００２２】したがって、ベンゼンやピラジン等の６員
環分子を含む分子を蛍光ラベラー分子として選定すれ
ば、Ｓ１状態からの蛍光寿命が長く、しかも光励起によ
りＳ１状態からＳ２状態に励起することで、分子からの
蛍光を容易に抑制できるので、超解像性を効果的に利用
することができる。すなわち、これら蛍光ラベラー分子
により染色して観察を行なえば、高空間分解能で試料の
蛍光像を観察することができるのみならず、その分子の
側鎖の化学基を調整することにより、生体試料の特定の
化学組織のみを選択的に染色できるので、試料の詳細な
化学組成までも分析可能となる。

【００２３】また、一般に、二重共鳴吸収過程は２つ光
の波長や偏光状態等が特定の条件を満たすときにのみ起
こるので、これを用いることで分子の構造を非常に詳細
に知ることができる。すなわち、光の偏光方向と分子の
配向方向とは強い相関関係があり、２つ波長の光のそれ
それの偏光方向と分子の配向方向とが特定の角度をなす
とき、二重共鳴吸収過程が強く起こる。したがって、２
つ波長の光を試料に同時に照射して、それぞれの光りの
偏光方向を回転することにより、蛍光の消失の程度が変
化するので、その様子から観測しようとする組織の空間
配向の情報も得ることができる。このことは、２つ光の
波長を調整することでも可能である。

【００２４】以上のように、上記の特開平１１−９５１
２０号公報記載の技術によると、超解像性以外にも、高
い分析能力を有していることがわかる。さらに、波長λ
１と波長λ２との２つの光の照射タイミングを工夫する
ことで、Ｓ／Ｎを改善し、かつ蛍光抑制を効果的に起こ
すことができ、超解像性をより効果的に発現することが
可能となる。

【００２５】このような超解像顕微鏡法の具体例とし
て、例えば特開２００１−１００１０２号公報には、蛍
光ラベラー分子をＳ０状態からＳ１状態へ励起する波長
λ１の光（特にレーザー光）をポンプ光とし、Ｓ１状態
からＳ２状態へ励起する波長λ２の光をイレース光とし
て、図１３に示すように、光源８１からポンプ光を、光
源８２からイレース光をそれぞれ放射させ、ポンプ光は
ダイクロイックミラー８３で反射させた後、輪帯光学系
８４により試料８５上に集光させ、イレース光は位相板
８６で中空ビーム化した後、ダイクロイックミラー８３
を透過させてポンプ光と空間的に重ね合わせて輪帯光学
系８４により試料８５上に集光させるようにしたものが
提案されている。

【００２６】この顕微鏡によると、イレース光の強度が
ゼロとなる光軸近傍以外の蛍光は抑制されるので、結果
的にポンプ光の広がりより狭い領域（Δ＜０．６１・λ
１／ＮＡ、ＮＡは輪帯光学系８４の開口数）に存在する
蛍光ラベラー分子のみが観察されることになり、結果的
に超解像性が発現することになる。なお、イレース光を
中空ビーム化する位相板８６は、例えば、図１４に示す
ように、光軸に対して点対称な位置で位相差πを与える
ように構成したものや、液晶面を用いた液晶空間変調器
を用いることができる。

【００２７】

【発明が解決しようとする課題】ところが、従来提案さ
れている超解像蛍光顕微鏡にあっては、以下に説明する
ような問題がある。

【００２８】以下、超解像蛍光顕微鏡を図１５に示すよ
うに構成した場合を例にとって説明する。図１５に示す
超解像蛍光顕微鏡は、上記の特開２００１−１００１０
２号公報に開示されているもので、ローダミン６Ｇで染
色された試料１００を観察するものである。この顕微鏡
では、モードロック型のＮｄ：ＹＡＧレーザー１０１か
ら出射される波長１０６４ｎｍのレーザー光をベータ硼
酸バリウム（ＢＢＯ）結晶からなる波長変換素子１０２
により２倍高調波の波長５３２ｎｍのレーザー光に波長
変換し、このレーザー光をハーフミラー１０３で透過光
と反射光との二光路に分岐して、その透過光をポンプ光
としてダイクロイックミラー１０４および１０５を順次
透過させた後、対物レンズ１０６により二次元移動ステ
ージ１０７上に載置された試料１００に集光させるよう
にしている。

【００２９】また、ハーフミラー１０３での反射光は、
反射ミラー１０８で反射させた後、Ｂａ（ＮＯ₃）₂ 結
晶からなるラマンシフター１０９で波長５９９ｎｍのレ
ーザー光に波長変換し、このレーザー光をイレース光と
して反射ミラー１１０で反射させた後、位相板１１１に
より中空ビームに整形し、さらにダイクロイックミラー
１０４によりポンプ光と同軸上に揃えて、ダイクロイッ
クミラー１０５を経て対物レンズ１０６により試料１０
０に集光させるようにしている。

【００３０】一方、試料１００からの蛍光は、対物レン
ズ１０６を経てダイクロイックミラー１０５で反射させ
た後、蛍光集光レンズ１１２、シャープカットフィルタ
ー１１３およびピンホール１１４を経てフォトマル１１
５で受光するようになっている。なお、試料１００に投
射されるポンプ光およびイレース光は、フォトマル１１
６で受光され、その出力に基づいてＮｄ：ＹＡＧレーザ
ー１０１から出射されるレーザー光の強度が一定となる
ように制御されるようになっている。

【００３１】かかる構成の超解像蛍光顕微鏡の場合、以
下のような問題が生じる。 １）光路分割用のハーフミラー１０３や光路合成用のダ
イクロイックミラー１０４を用いるため、光量のロス等
が発生する。 ２）ポンプ光とイレース光との光路長が異なるため、Ｎ
ｄ：ＹＡＧレーザー１０１をパルス発光させた場合に
は、試料面上における光の照射タイミングがずれるの
で、その補償光学系が必要となる。 ３）ダイクロイックミラー１０４で、ポンプ光とイレー
ス光とを同軸上に揃えるには、実際にはそれぞれの光に
対して独立のあおり機構が必要になると共に、その調整
には熟練した技術を要することになる。 ４）ポンプ光とイレース光とが独立に位置ずれを起こし
た場合には、試料面で所望の空間的な重なりが実現せ
ず、蛍光抑制が理想条件より大きくずれて、空間分解能
の劣化や蛍光強度の揺らぎが大きくなる。

【００３２】したがって、かかる点に鑑みてなされた本
発明の目的は、ポンプ光とイレース光とを光路分岐する
ことなく、一貫して同じ光軸上を進行させて試料面まで
到達させることにより、光の利用効率に優れ、しかも簡
単な光学系の構成で観察分解能に優れた顕微鏡を提供す
ることにある。

【００３３】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成する請求
項１に係る発明は、少なくとも基底状態を含む３つの電
子状態を有する分子を含む試料を観察する顕微鏡であっ
て、レーザー光源と、このレーザー光源から出射したレ
ーザー光の基本波の一部を、同軸上で２倍波に変換する
波長変換素子と、この波長変換素子から出射した上記２
倍波はビーム整形することなく出射させ、上記基本波は
ビーム中央部の強度が周辺部よりも弱くなるように位相
変調して出射する位相変調素子と、この位相変調素子か
ら出射した上記基本波および２倍波を観察試料に集光す
る集光光学系と、上記観察試料からからの発光を検出す
る検出光学系と、を有し、上記２倍波により、上記観察
試料内の上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励
起し、上記基本波により第１電子励起状態から他の電子
状態へ遷移させるよう構成したことを特徴とするもので
ある。

【００３４】請求項２に係る発明は、請求項1に記載の
顕微鏡において、上記レーザー光源は、Ｎｄ：ＹＡＧレ
ーザーであることを特徴とするものである。

【００３５】請求項３に係る発明は、請求項1または２
に記載の顕微鏡において、上記波長変換素子は、非線形
光学素子からなることを特徴とするものである。

【００３６】請求項４に係る発明は、請求項４に記載の
顕微鏡において、上記非線形光学素子は、ベータ棚酸バ
リウムの結晶からなることを特徴とするものである。

【００３７】請求項５に係る発明は、請求項1〜４のい
ずれか一項に記載の顕微鏡において、上記位相変調素子
は、空間的に屈折率分布を有する位相板からなることを
特徴とするものである。

【００３８】請求項６に係る発明は、請求項５に記載の
顕微鏡において、上記位相板は、入射するビームの光軸
対称に９０度毎にλ／４（λは基本波の波長）の位相差
を与えるよう構成されていることを特徴とするものであ
る。

【００３９】請求項７に係る発明は、請求項５に記載の
顕微鏡において、上記位相板は、入射するビームの光軸
を中心とする円形領域で位相変調するよう構成されてい
ることを特徴とする。

【００４０】請求項８に係る発明は、請求項７に記載の
顕微鏡において、上記円形領域は、上記基本波に対する
位相変調度合いがπであることを特徴とするものであ
る。

【００４１】請求項９に係る発明は、請求項８に記載の
顕微鏡において、上記円形領域は基板上に形成された蒸
着膜を有しており、入射するレーザー光のビーム径に対
する上記円形領域の半径比をρ、上記円形領域における
レーザー光の透過率をＢ、上記円形領域以外の上記基板
におけるレーザー光の透過率をＡとするとき、Ａ−２Ｂ
ρ^２＝０、を満たすことを特徴とするものである。

【００４２】請求項１０に係る発明は、請求項1〜４に
記載の顕微鏡において、上記位相変調素子は、液晶空間
光変調器からなることを特徴とするものである。

【００４３】先ず、本発明の原理について図１を参照し
て説明する。図１は蛍光抑制効果の基礎をなす２重共鳴
吸収過程を説明するための振動励起準位を含む分子のエ
ネルギーダイヤグラムを示すもので、分子の基底状態
（Ｓ０）、蛍光発光に強く関与する第１電子励起状態
（Ｓ１）および２重共鳴吸収過程に強く関与する第２電
子励起状態（Ｓ２）が模式的に描かれている。

【００４４】一般に、ベンゼン環を含むような多原子分
子では、無数の振動励起状態（ｖ１，ｖ２，・・・，ｖ
ｎ）が存在し、しかも各電子励起状態と量子的に強く結
合している。一方、基底状態（Ｓ０）と第１電子励起状
態（Ｓ１）とのエネルギー間隔は一般に大きく、振動励
起状態（ｖ１，ｖ２，・・・，ｖｎ）は比較的広いエネ
ルギー間隔をもち、いわゆる「まばら」に存在する。こ
れに対し、第1電子励起状態よりも高い電子励起状態間
のエネルギー間隔は極めて接近している。その結果、振
動励起状態（ｖ′１，ｖ′２，・・・，ｖ′ｎ）は、こ
の接近した電子励起状態間のエネルギー領域に極めて
「密」に存在し、あたかも連続的なプロードな量子状態を
形成する。しかも、量子化学の理論によれば、電子励起
状態自身もその波動関数が互いに混合するため、その傾
向がますます強まる。

【００４５】すなわち、第１電子励起状態（Ｓ１）より
も高いエネルギーをもつ振動励起準位は、第２電子励起
状態（Ｓ２）とも確率的にカップリングするので、もし
この振動励起準位でイレース光によりＳ１状態の分子を
励起すれば、その確率で第２電子励起状態（Ｓ２）の分
子が生成されので、原理的には２重共鳴吸収過程が可能
となる。また、この振動励起準位に分子を励起するとＳ
１状態に戻らず、蛍光を発することなく基底状態（Ｓ
０）に直接脱励起することもある。

【００４６】この状況を、２重共鳴吸収過程を利用する
観点から考察すると、イレース光の光子エネルギー、言
い換えると波長の選定条件は、実質上、極めて緩くな
る。特に、超解像顕微鏡法の基礎をなす蛍光抑制効果を
誘起するためには、基底状態（Ｓ０）から第１電子励起
状態（Ｓ１）に遷移しても蛍光を発光することができな
いような小さい光子エネルギーのイレース光を用いれば
よい、と言うことを意味する。そして、そのような条件
の一つとして、イレース光子エネルギーがポンプ光のそ
れの半分となる場合が存在する。波長換算すると、イレ
ース光の波長がポンプ光のそれの倍となる条件である。
例えば、ローダミン系の分子では、ポンプ光が波長５０
０ｎｍ近傍、イレース光が波長１０００ｎｍ前後、とい
う条件で蛍光抑制効果を誘起できる。

【００４７】超解像効果を発揮するためには、イレース
光のビーム形状整形が不可欠であるが、上記のようなポ
ンプ光とイレース光との波長選定は、ビーム形状整形作
業の際に極めて魅力的な条件を提供する。すなわち、超
解像顕微鏡おけるイレース光のビーム整形は、該ビーム
を位相変調するのが一般であり、例えば上記の特開２０
０１−１００１０２号公報には、イレース光の光路に光
軸面において光軸に対して対称に４分割した位相板を挿
入してイレースを空間変調することにより、イレース光
を理想的な中空ビームに整形することが開示されてい
る。また、図１４に示したような光軸に関して位相が２
π周回するような位相差をイレース光に与える位相板の
例もある。これらの位相板の機能を一言で言えば、集光
したときに光軸対称のビーム面を通過する光の位相が反
転するために、言い換えるとπずれているために、ビー
ム中央で電場強度がゼロになると言うことである。

【００４８】ここで、上述したように、もし、イレース
光の波長をポンプ光の倍に設定して、空間位相変調によ
るイレース光のビーム整形を行なうと、非常に興味深い
現象が期待できる。すなわち、図１４で示したような位
相板をイレース光波長に対して設計すると、当然、イレ
ース光は集光すると光軸上で電場がキャンセルされ、中
空状のビームとなる。このような位相板は、具体的に
は、ガラス基板に厚みコントロールした蒸着膜を形成し
たり、ガラス基板を直接エッチングしたりして作製する
ことができる。

【００４９】ところで、イレース光に対して最適化され
た位相板は、ビームプロファイルに対してポンプ光には
如何なる影響も与えない。なぜなら、近赤外・可視光領
域ではガラス基板をはじめとする多くの物質は屈折率が
ほぼ一定であるからである。例えば、ＢＫ７では屈折率
がほぼ１．５であり、数％程度しか変化しない。このた
め、ポンプ光は位相板を通過しても、光軸に対して対称
位置を通る光は位相がイレース光と比較して２倍の２π
の変化を与えることになり、結局、この光を集光しても
電場はキャンセルされず、位相板通過する前の光を集光
した場合と同様のガウシアン関数タイプの光軸中央で強
度極大を持つ、見慣れたパターンが得られることにな
る。

【００５０】一方、超解像顕微鏡の光源としては、多く
の場合、レーザー光源が用いられている。また、レーザ
ー光の波長変換には、一般に非線形光学結晶が用いられ
ており、この結晶にレーザー光（基本波）を通すことに
より、その一部の光を非線形光学効果により波長が半分
の光（２倍波）に変換するようにしている。この場合、
結晶からは入射レーザー光と波長変換された光とが同軸
上に出射されるので、通常はダイクロイックミラー等で
波長分離し、単色化して利用される。このような非線形
光学結晶としてはベータ硼酸バリウム（ＢＢＯ）が有名
であり、代表的な固体レーザーであるＮｄ：ＹＡＧレー
ザー等の波長変換素子として多用されている。

【００５１】ここで、上述した位相板を基本波に対して
最適設計して、基本波と２倍波とを同軸で通過させる
と、２倍波は形状が変化せずレーザー光特有のガウシア
ンビームのままであるが、基本波は中空形状のビームと
なる。したがって、非線形光学結晶から同軸上に出射さ
れる基本波および２倍波を、それぞれイレース光および
ポンプ光として利用して位相板に入射させるようにすれ
ば、イレース光とポンプ光とを同軸上に重ね合わせる光
学素子が不要となり、光学系を極めて簡単に構成するこ
とが可能となる。しかも、イレース光およびポンプ光は
同じダイバージェンスで発光しているので、同じ顕微鏡
対物レンズで試料上に集光する際も、ポンプ光用および
イレース光用の独立したダイバージェンス調整レンズが
不要となる。さらに、ポンプ光およびイレース光は独立
して位置ずれすることがないので、観察分解能の低下防
止にも寄与することができる。これにより、上述した従
来の超解像蛍光顕微鏡における問題を完全に解決するこ
とが可能となる。

【００５２】

【発明の実施の形態】以下、本発明による顕微鏡の実施
の形態について、図２〜図６を参照して説明する。

【００５３】図２〜図５は第１実施の形態を示すもの
で、図２は顕微鏡の光学系の構成を示す図であり、図３
〜５は図２の構成の顕微鏡で使用可能な位相板の三つの
変形例を示す図である。本実施の形態の顕微鏡は、イレ
ース光を中空ビーム化して超解像性を発現させて空間分
解能を向上させたレーザー走査型の超解像蛍光顕微鏡
で、ローダミン６Ｇで染色された生体試料を観察するも
のである。

【００５４】ここで、ローダミン６Ｇは、５３０ｎｍの
励起波長帯域で基底状態（Ｓ０）から第１電子励起状態
（Ｓ１）への励起による吸収が最大となる。また、第１
電子励起状態（Ｓ１）から、よりエネルギー的に高い高
位の電子励起状態に励起できる吸収帯が、波長６００〜
６５０ｎｍの領域に存在するが、波長１０００ｎｍ前後
の近赤外領域にも上述したように振動励起準位が存在す
る。

【００５５】そこで、本実施の形態では、ポンプ光およ
びイレース光発生用のレーザー光源としてレーザーダイ
オード（ＬＤ）励起型のモードロックＮｄ：ＹＡＧレー
ザー１を用い、その基本波（波長１０６４ｎｍ）をイレ
ース光として、２倍波（波長５３２ｎｍ）をポンプ光と
して用いる。なお、ＬＤ励起型のモードロックＮｄ：Ｙ
ＡＧレーザー１は、レーザー共振器の設計パラメータの
調整により、ＭＨｚオーダーの繰り返し周波数で、ピコ
秒のレーザーパルスを発振することができる。例えば、
スイス：Time-Bandwidth社製のＧＥ−１００シリーズ
は、標準仕様で、１００ＭＨｚの繰り返し周波数におい
て、パルス幅：６psecのパルス光を平均出力５０ｍＷで
発振することができる。これは、１パルスの持つエネル
ギーが、５００ｐＪに対応する。また、共振器を設計変
更することで、繰り返し周波数を、２５ＭＨｚ〜１ＧＨ
ｚの間で調整することができる。

【００５６】図２において、ＬＤ励起型のモードロック
Ｎｄ：ＹＡＧレーザー１からのレーザー光は、ＢＢＯ結
晶の非線形光学素子からなる波長変換素子２に入射させ
て、同軸上で基本波であるイレース光と２倍波であるポ
ンプ光とを発生させ、これらの光をシャープカットフィ
ルタ３を経て位相変調素子である位相板４に入射させ
る。

【００５７】位相板４は、イレース光に対して、図１４
に示したように光軸に対して点対称な位置で位相差πを
与えるように最適化して構成し、これによりイレース光
を中空ビーム化する。なお、ポンプ光については位相板
４を通過する際に光軸に対して点対称な位置で位相が２
π変わるので、基本的には位相板４で空間変調されず、
ビームプロファイルも変化しない。

【００５８】位相板４を通過したポンプ光およびイレー
ス光は、キューベット型のハーフミラーからなるビーム
セパレーター５を透過させた後、互いに直交する軸を中
心に揺動可能な２枚のガルバノ揺動ミラー６，７を有す
るガルバノビームスキャナーを経て、対物レンズ８によ
りローダミン６Ｇで染色された例えば生体試料９の表面
に集光させ、その集光点をガルバノビームスキャナーに
よりビデオレートに同期して移動させて試料面上を２次
元走査する。なお、図２では、図面を簡略化するため
に、ガルバノ揺動ミラー６，７を互いに平行な軸を中心
に揺動するように示している。

【００５９】一方、ポンプ光およびイレース光の照射に
より試料９から発する蛍光は、対物レンズ８によりコリ
メートしたのち、入射光路とは逆の経路を辿って、ガル
バノビームスキャナーを経てビームセパレーター５に入
射させ、該ビームセパレーター５で反射される蛍光を投
影レンズ１０によりピンホール１１に集光させる。ピン
ホール１１は、試料９の蛍光発光点に対して共焦点位置
に配置し、このピンホール１１を透過した蛍光を、ポン
プ光カットノッチフィルター１２およびイレース光カッ
トノッチフィルター１３を透過させて、それぞれポンプ
光およびイレース光を除去した後、光電子増倍管１４で
受光して蛍光出力信号を得る。ここで、投影レンズ１
０、ピンホール１１、ポンプ光カットノッチフィルター
１２、イレース光カットノッチフィルター１３および光
電子増倍管１４は、検出光学系を構成する。

【００６０】光電子増倍管１４から得られる蛍光出力信
号は、パルスカウンティング法により計数し、その計数
値を図示しないパーソナルコンピュータのフレームメモ
リに格納して、試料９の蛍光２次元画像をＣＲＴ等のモ
ニタにリアルタイムで表示する。

【００６１】このように、本実施の形態によれば、Ｎ
ｄ：ＹＡＧレーザー１からのレーザー光を波長変換素子
２に入射させて、同軸上で基本波と２倍波とを得、基本
波をイレース光として用い、２倍波をポンプ光として用
いるようにしたので、上述した従来の超解像蛍光顕微鏡
における問題を完全に解決でき、光の利用効率に優れ、
しかも簡単な光学系の構成で観察分解能に優れた超解像
蛍光顕微鏡を実現することができる。

【００６２】図３は、図２に示した構成の顕微鏡で使用
可能な位相板の第１変形例を示すもので、図３（ａ）は
正面図、図３（ｂ）は平面図である。この位相板２１は
蒸着技術で作製したもので、レーザービーム面すなわち
瞳面の光軸を中心に９０度毎にλ／４（λは基本波）の
位相差を与えるようにしたものである。すなわち、瞳面
を光軸を中心に９０度毎に４つの領域２２−１〜２２−
４に分割し、イレース光波長に対して光軸対称領域で位
相差πを与えるように、領域２２−２にはλ／４の蒸着
膜を形成し、領域２２−３には２λ／４の蒸着膜を形成
し、領域２２−４には３λ／４の蒸着膜を形成したもの
である。

【００６３】かかる位相板２１を通してイレース光を顕
微鏡対物レンズにより試料面に集光すると、光軸中央で
電場強度が相殺され、中央で電場強度がゼロとなるドー
ナツツ状の疑似ベッセルビームを得ることができる。こ
れは、イレース光の形状として優れた資質を有する。

【００６４】具体的には、Ｎｄ：ＹＡＧレーザーの基本
波である波長１０６４ｎｍのレーザー光をイレース光と
する場合には、ＢＫ７のガラス基板２３上にフッ化マグ
ネシウムを、領域２２−２では厚さ３５０ｎｍに、領域
２２−３では厚さ７００ｎｍに、領域２２−４では厚さ
１０５０ｎｍにそれぞれ蒸着する。このようにすれば、
各領域で３５０ｎｍの厚み差が付けられているので、イ
レース光に対してλ／４ずつの位相差を与えることがで
きる。また、この位相板２１に半分の波長５３２ｎｍで
ある２倍波を通過させると、この波長領域では屈折率が
全く変化しないので、光軸対称位置を通る光は、丁度、
1波長分変化し、ビーム波面の位相分布は全く変化しな
い。

【００６５】この位相板２１は、ガラス基板２３を４つ
の領域２２−１〜２２−４に分割し、その３つの領域に
フッ化マグネシウムをそれぞれ所望の厚さ蒸着して作製
するので、その作製に用いるマスクの製造およびマスク
の位置合わせが簡単にでき、位相板２１を容易かつ安価
に作製することができる。

【００６６】図４は、図２に示した構成の顕微鏡で使用
可能な位相板の第２変形例を示すもので、図４（ａ）は
正面図、図４（ｂ）は平面図である。この位相板３１
は、図３に示した位相板２１と同様に蒸着技術で作製し
たもので、レーザー光の断面中央の円形領域３２に、光
軸対称位置で位相差πを与えるように蒸着膜を形成した
ものである。

【００６７】具体的には、Ｎｄ：ＹＡＧレーザーの基本
波である波長１０６４ｎｍのレーザー光をイレース光と
する場合には、ＢＫ７のガラス基板３３上の領域３２上
にフッ化マグネシウムを厚さ２λ／４（７００ｎｍ）蒸
着する。この位相板３１を用いて、領域３２よりも大き
い径の円形のレーザー光を入射させれば、領域３２を透
過するレーザー光は空間変調されるので、この位相板３
１を透過したレーザー光を対物レンズにより試料面に集
光させれば、やはり光軸中央で電場強度が相殺されてゼ
ロとなるドーナツ状のイレース光を得ることができる。
この位相板３１は、形状が単純で、簡単かつ安価に製作
でき、極めて実用的である。

【００６８】だだし、この場合、ビーム中央で完全に電
場強度をゼロにするためには、波動光学の理論から、下
記の定量的な条件が要請される。すなわち、フーリエ光
学理論（例えば、矢田貝豊彦著：現代人の物理「光とフ
ーリエ変換」朝倉書店）によると、上記の位相板３１を
用いた場合の焦点面（ｘ，ｙ）上での集光パターンＩ
（ｘ，ｙ）は、下記の（１）式で与えられる。

【００６９】

【数１】

【００７０】ここで、ＮＡは対物レンズの開口数、λは
レーザー光の波長、ρはレーザー光のビーム径に対する
領域３２の半径比、Ｂは領域３２のレーザー光の透過
率、Ａは領域３２以外の基板３３のレーザー光の透過
率、Ｊ１（ｘ，ｙ）はベッセルの１次関数である。

【００７１】上記（１）式によると、光軸中心（０，
０）で電場強度がゼロとなる条件は、Ａ−２Ｂρ^２＝
０、となる。したがって、例えば位相板の透過率が全領
域で１００％（Ａ＝Ｂ＝１）の場合には、ρ＝０．７０
７となる。この場合には、対物レンズの瞳径と位相板３
１の領域３２の径との比が、０．７０７となるように光
学系を構成すればよい。

【００７２】図５は、図２に示した構成の顕微鏡で使用
可能な位相板の第３変形例を示す斜視図である。この位
相板４１は、ガラス基板を化学エッチングにより、入射
するビームの光軸を中心に９０度毎に４つの領域４２−
１〜４２−４に分割して、イレース光波長に対して光軸
対称領域で位相差πを与えるように、領域４２−１と領
域４２−２との間、領域４２−２と領域４２−３との
間、および領域４２−３と領域４２−４との間で、それ
ぞれλ／４の段差を形成したもので、その作用は図３に
示した位相板２１と同様である。具体的には、Ｎｄ：Ｙ
ＡＧレーザーの基本波である波長１０６４ｎｍのレーザ
ー光をイレース光とする場合には、ＢＫ７のガラス基板
４３に上記領域間のλ／４の段差として３２５．５ｎｍ
の段差を形成する。この位相板４１は、ガラス基板等を
直接、化学エッチングして作製できるので、簡単かつ安
価にできる。

【００７３】図６は、本発明による顕微鏡の第２実施の
形態における光学系の構成を示す図である。この顕微鏡
は、図２に示した顕微鏡において、位相変調素子として
位相板４に代えて液晶空間光変調器５１を用いてイレー
ス光をビーム整形するようにしたものである。このた
め、本実施の形態では、シャープカットフィルタ３を経
て同軸上で出射されるイレース光とポンプ光とをハーフ
ミラー５２で反射させて液晶空間光変調器５１に入射さ
せ、ここで回折させてイレース光をビーム整形した後、
ハーフミラー５２および反射ミラー５３を経てビームセ
パレーター５に入射させる。その他の構成は、図２と同
様であるので、図２と同一素子には同一参照番号を付し
て説明を省略する。

【００７４】液晶空間光変調器５１は、イレース光の波
長に対して空間変調するように、その液晶面の屈折率分
布をプログラミングする。このようにすれば、イレース
光のみを中空ビームに整形し、その２倍波のポンプ光に
対しては回折面において２倍の位相変調すなわち２πの
位相差を与えてビーム形状を変化させないようにするこ
とができる。したがって、本実施の形態においても第１
実施の形態と同様の効果を得ることができる。

【００７５】なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限
定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能で
ある。例えば、イレース光をビーム整形する位相変調素
子は、上述した位相板や液晶空間光変調器に限らず、他
の公知の素子を使用することができる。

【００７６】

【発明の効果】以上のように、本発明によれば、レーザ
ー光源からのレーザー光を波長変換素子に入射させて同
軸上で基本波と２倍波とを得、これらの光を位相変調素
子に入射させて、２倍波はビーム整形することなく出射
させ、基本波はビーム中央部の強度が周辺部よりも弱く
なるように位相変調して出射させ、この位相変調素子か
ら出射される基本波をイレース光とし、２倍波をポンプ
光として集光光学系により観察試料に集光させて、ポン
プ光により観察試料内の分子を基底状態から第１電子励
起状態に励起し、イレース光により第１電子励起状態か
ら他の電子状態へ遷移させて、観察試料からからの発光
を検出光学系で検出するようにしたので、上述した従来
の超解像顕微鏡における種々の問題を解決でき、光の利
用効率に優れ、しかも簡単な光学系の構成で観察分解能
に優れた超解像顕微鏡を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の原理を説明するための図である。

【図２】 本発明の第１実施の形態における顕微鏡の光
学系の構成を示す図である。

【図３】 図２に示す顕微鏡に使用可能な位相板の第１
変形例を示す正面図および平面図である。

【図４】 同じく、位相板の第２変形例を示す正面図お
よび平面図である。

【図５】 同じく、位相板の第３変形例を示す斜視図で
ある。

【図６】 本発明の第２実施の形態における顕微鏡の光
学系の構成を示す図である。

【図７】 試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造
を示す概念図である。

【図８】 図７の分子の第１電子励起状態を示す概念図
である。

【図９】 同じく、第２電子励起状態を示す概念図であ
る。

【図１０】 同じく、第２電子励起状態から基底状態に
戻る状態を示す概念図である。

【図１１】 分子における二重共鳴吸収過程を説明する
ための概念図である。

【図１２】 同じく、二重共鳴吸収過程を説明するため
の概念図である。

【図１３】 従来の超解像顕微鏡の一例の構成を示す図
である。

【図１４】 図１３に示す位相板の構成を示す平面図で
ある。

【図１５】 従来の超解像顕微鏡の他の例の構成を示す
図である。

【符号の説明】

１ Ｎｄ：ＹＡＧレーザー ２ 波長変換素子 ３ シャープカットフィルタ ４ 位相板 ５ ビームセパレーター ６，６ ガルバノ揺動ミラー ８ 対物レンズ ９ 試料 １０ 投影レンズ １１ ピンホール １２ ポンプ光カットノッチフィルター １３ イレース光カットノッチフィルター １４ 光電子増倍管 ２１，３１，４１ 位相板 ５１ 液晶空間光変調器 ５２ ハーフミラー ５３ 反射ミラー

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 池滝 慶記 東京都渋谷区幡ヶ谷２丁目43番２号 オリ ンパス光学工業株式会社内 (72)発明者 渡邊 武史 愛知県岡崎市小呂町２丁目72 大野マンシ ョンＩＩ 202号 (72)発明者 藤井 正明 愛知県岡崎市竜美南２−３−１ ６号棟 303号 (72)発明者 尾松 孝茂 神奈川県横浜市戸塚区平戸５−10−９ (72)発明者 山元 公寿 東京都大田区田園調布９−２−304 (72)発明者 鈴木 智雄 千葉県千葉市美浜区中瀬１−３ 幕張テク ノガーデンＤ−10Ｅ 株式会社日本ローパ ー内 Ｆターム(参考） 2H052 AA03 AA07 AA09 AC04 AC10 AC12 AC15 AC27 AC34 2H088 EA47 HA13 HA17 HA22 MA06 MA20 2K002 AA04 AB12 BA03 CA02 EA30 HA20

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも基底状態を含む３つの電子状
   態を有する分子を含む試料を観察する顕微鏡であって、 レーザー光源と、 このレーザー光源から出射したレーザー光の基本波の一
   部を、同軸上で２倍波に変換する波長変換素子と、 この波長変換素子から出射した上記２倍波はビーム整形
   することなく出射させ、上記基本波はビーム中央部の強
   度が周辺部よりも弱くなるように位相変調して出射する
   位相変調素子と、 この位相変調素子から出射した上記基本波および２倍波
   を観察試料に集光する集光光学系と、 上記観察試料からからの発光を検出する検出光学系と、 を有し、上記２倍波により、上記観察試料内の上記分子
   を基底状態から第１電子励起状態に励起し、上記基本波
   により第１電子励起状態から他の電子状態へ遷移させる
   よう構成したことを特徴とする顕微鏡。
2. 【請求項２】 上記レーザー光源は、Ｎｄ：ＹＡＧレー
   ザーであることを特徴とする請求項1に記載の顕微鏡。
3. 【請求項３】 上記波長変換素子は、非線形光学素子か
   らなることを特徴とする請求項1または２に記載の顕微
   鏡。
4. 【請求項４】 上記非線形光学素子は、ベータ硼酸バリ
   ウムの結晶からなることを特徴とする請求項４に記載の
   顕微鏡。
5. 【請求項５】 上記位相変調素子は、空間的に屈折率分
   布を有する位相板からなることを特徴とする請求項1〜
   ４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
6. 【請求項６】 上記位相板は、入射するビームの光軸を
   中心に９０度毎にλ／４（λは基本波の波長）の位相差
   を与えるよう構成されていることを特徴とする請求項５
   に記載の顕微鏡。
7. 【請求項７】 上記位相板は、入射するビームの光軸を
   中心とする円形領域で位相変調するよう構成されている
   ことを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡。
8. 【請求項８】 上記円形領域は、上記基本波に対する位
   相変調度合いがπであることを特徴とする請求項７に記
   載の顕微鏡。
9. 【請求項９】 上記円形領域は基板上に形成された蒸着
   膜を有しており、入射するレーザー光のビーム径に対す
   る上記円形領域の半径比をρ、上記円形領域におけるレ
   ーザー光の透過率をＢ、上記円形領域以外の上記基板に
   おけるレーザー光の透過率をＡとするとき、Ａ−２Ｂρ
   ^２＝０、を満たすことを特徴とする請求項８に記載の顕
   微鏡。
10. 【請求項１０】 上記位相変調素子は、液晶空間光変調
    器からなることを特徴とする請求項1〜４に記載の顕微
    鏡。