CN102288588A - 显微镜 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种显微镜，该显微镜能够在焦平面上按希望形状形成射束点。该显微镜设置有调制光学元件(38)和调节元件(37)，所述调制光学元件(38)具有用于对照明光进行特殊调制的多个区域，所述调节元件(37)用于调节由所述调制光学元件进行了调制的照明光的光学特性。

Description

显微镜
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年6月17日提交的日本申请No.2010-138096、2010年10月7日提交的日本申请No.2010-227698以及2011年3月17日提交的日本申请No.2011-059176的优先权，其全部内容通过引用并入于此。
技术领域
本发明涉及显微镜。
背景技术
光学显微镜领域早已建立并且目前已经开发出了多种类型的显微镜。另外，随着包括激光技术和电子成像技术的外围技术的发展，近年来已经开发出了更加高级的显微镜技术。
在这样的背景下，人们提出了一种高功能性显微镜，其通过用多波长光来照明样本而诱发双谐振吸收过程，而使得不仅能够控制所获得图像的对比度，而且能够对它进行科学分析(例如，参见日本专利特开No.8-184552)。
这种显微镜能够通过选择具有双谐振吸收的特定分子来观察由特定光学跃迁造成的吸收和荧光性。下面将参照图19至图22对其原理进行描述。图19示出了组成样本的分子的价电子轨道的电子结构。首先，用波长为λ1的光来激发图19所示基态(S0态：稳定状态)下分子的价电子轨道上的电子，从而使其跃迁至第一激发态(S1态)。接下来，按相似方式用波长为λ2的光来激发该电子，以便使其跃迁至图21所示的第二激发态(S2状态)。在这种激发态下，该分子发射荧光或磷光并且返回到图22所示的基态。
采用双谐振吸收过程的显微术被用于利用图21的吸收过程和诸如荧光性或磷光现象的光发射来观察吸收图像和发射图像。根据这种显微术，首先，通过谐振波长为λ1的激光等将组成该样本的分子激发至S1态，如图20所示。这时，单位立方体积中S1态的分子数与所发射光的强度成比例地增加。
这里，通过将每分子吸收截面积乘以单位立方体积中的分子数来获得线性吸收系数。因此，在图21所示的激发过程中，随后照射的谐振波长为λ2的光的线性吸收系数取决于最初照射的谐振波长为λ1的光的强度。即，波长λ2的线性吸收系数λ2可以由谐振波长为λ1的光的强度来控制。这表明，通过用波长为λ1的光和波长为λ2的光来照明样本并且用波长λ2来拍摄透射图像，能够完全通过波长为λ1的光来控制透射图像的对比度。
另外，如果可以利用荧光性或磷光现象来执行从图21的激发态向图22的基态的去激发过程，则其发射强度与S1态下的分子数成比例。因此，也可以利用显微镜作为荧光显微镜来控制图像的对比度。
而且，采用双谐振吸收过程的显微术不仅可以如上所述来控制图像的对比度，而且可以进行化学分析。即，因为图19所示最外侧电子的轨道具有特定于每个分子的能级，所以波长λ1在这些分子当中改变，同时，波长λ2也特定于这些分子。
这里，即使用常规的单一波长的光来照射样本，也可以在一定程度上观察到特定分子的吸收图像或者荧光图像。然而，一般来说，因为某些分子的吸收频带的波长范围彼此交叠，所以当用单一波长的光来照射样本时，不能精确地识别出该样本的化学成分。
与此相反，采用双谐振吸收过程的显微术利用两个波长λ1和λ2来限制分子吸收光或发射光，其使得能够比常规方法更精确地识别样本的化学成分。另外，在激发价电子方面，只有那些相对于分子轴具有特定电场矢量的光被强烈吸收，由此通过判定波长λ1的光和波长λ2的光的偏振方向来拍摄吸收图像或荧光图像实现了对相同分子的取向方向的识别。
另外，近来提出了一种能够通过采用双谐振吸收过程来提供超出衍射极限的空间分辨率的荧光显微镜(例如，参见日本专利特开No.2001-100102)。
图23示出了分子的双谐振吸收过程的概念图，其中，处于基态S0的分子被波长为λ1的光激发至第一激发态并进一步被波长为λ2的光激发至第二激发态S2。应注意到，图23示出了来自处于S2状态的特定类型分子的荧光极其弱。
具有如图23所示光学特性的分子呈现了非常有趣的现象。与图23一样，图24也是双谐振吸收过程的概念图，其示出了表示空间距离的扩展的垂直轴X、被波长为λ2的光照射的空间区域A1，以及没有被波长为λ2的光照射的空间区域A0。
在图24中，处于S1态的多个分子是通过在空间区域A0中用波长为λ1的光激发而生成的，这时，可以观察到来自空间区域A0的、由波长为λ3的光发射的荧光。然而，因为将波长为λ2的光照射至空间区域A1，所以处于第一激发态S1的大多数分子都立即被激发至更高状态-第二激发态S2，没有分子保留在第一激发态S1。针对某些分子来识别这种现象。因为这种现象，自从开始起在空间区域A1中就完全消除了波长为λ3的荧光并且没有来自第二激发态S2的荧光，荧光本身在空间区域A1中被完全抑制(荧光抑制效应)并且仅发射来自空间区域A0的荧光。
另外，当波长为λ2的光交叠了荧光发射频带时，分子因诱发发射过程而被迫从第一激发态S1跃迁至基态S0的更高振动级。因而，更加增强了荧光抑制效应。换句话说，随着波长为λ2的光的发射，从第一激发态S1发射的荧光量减小了。因此，如果分子被迫跃迁至量子能级(quantum level)，则呈现了荧光抑制效应。具有这种特性的材料是光致变色分子、包括稀土元素的荧光物质、量子点等。
从显微镜的应用领域来看，这种现象具有非常重要的意义。即，常规扫描显微镜等利用会聚透镜将激光束会聚成微光束(microbeam)，以便在要观察的样本上进行扫描。这时，微光束的尺寸降至衍射极限，后者取决于会聚透镜的数值孔径(numericalaperture)和波长。因此，原理上不能预计进一步的空间分辨率。
然而，在图24所示的情况下，因为通过空间上部分交叠的波长为λ1和波长为λ2的两个不同光来控制荧光区域，所以当注意力集中在波长为λ1的光的发射区域上时，例如可以根据会聚透镜的数值孔径和波长使荧光区域比衍射极限窄，这导致空间分辨率的显著提高。因此，采用这种原理的优点，可以实现超过衍射限制分辨率的、采用双谐振吸收过程的超高分辨率显微镜，即，例如超高分辨率荧光显微镜。
在利用若丹明(rhodamine)6G方面，例如，如果发射了波长为532nm的光(泵浦光；第一照明光)，则若丹明6G分子从基态S0被激发至第一激发态S1，并且发射了峰值在波长560nm的荧光。这时，如果照射了波长为599nm的光(消除光；第二照明光)，则造成双谐振吸收过程，致使若丹明6G分子跃迁至荧光发射非常困难的第二激发态。更具体地说，向若丹明6G同时照射泵浦光和消除光抑制了荧光性。
图25是常规提出的超高分辨率显微镜的主截面构造图。这种超高分辨率显微镜基于激光扫描型通用荧光显微镜并且包括三个独立单元，即，光源单元210、扫描单元230以及显微镜单元250。
光源单元210具有泵浦光源211和消除光源212。从泵浦光源211发射的泵浦光入射到二向色棱镜213并被其反射。从消除光源212发射的消除光在其相位经过调制光学部件215的空间调制之后入射至二向色棱镜213，透射过二向色棱镜213并接着按照与泵浦光同心组合的方式出射(exit)。
这里，在观察利用若丹明6G染色的样本时，利用Nd:YAG激光器来设置泵浦光源211，以发射波长为532nm的光，它是该激光器的二次谐波。另外，利用Nd:YAG激光器和拉曼移相器(Raman shifter)来设置消除光源212，以通过拉曼移相器来发射作为Nd:YAG激光器的、被调制成波长为599nm的光的二次谐波的光，作为消除光。
例如，调制光学部件215调制消除光的相位并且具有被围绕光轴径向划分成8个区域的光瞳面，如图26所示。这些区域都是通过形成彼此相差消除光的波长的λ/8相位的光学多层膜，使得消除光的相位差围绕光轴以2π旋转，或者通过蚀刻玻璃基板而形成的。当透射过调制光学部件215的消除光被会聚时，它产生了抵消光轴上的电场的中空消除光。
扫描单元230在通过半棱镜231传递从激光源单元210同轴发射的泵浦光和消除光之后，利用两个检电镜(galvano mirror)232、233在二维方向上进行摆动扫描，以便向下面将描述的显微镜单元250发射光。另外，扫描单元230分支从显微镜单元250入射的荧光，利用半棱镜231反向跟踪(track back)其路径，使得所分支的荧光经由投影透镜234、针孔235以及陷波滤波器236、237被光电倍增器接收。
为简化附图起见，检电镜232、233在图25中可按共平面方式摇摆。陷波滤波器236、237消除了混合在荧光中的泵浦光和消除光。另外，针孔235是组成共焦光学系统的重要光学部件，并且仅允许在所观察样本的特定截面上发射的荧光通过。
显微镜单元250是通用荧光显微镜，其在半棱镜251上反射从扫描单元230入射的泵浦光和消除光，并且利用显微镜物镜252将光会聚在要观察的、包含有三种电子状态(至少包括基态)的分子的样本上。另外，样本253上发射的荧光再次通过物镜252准直并且在半棱镜251上反射，从而返回至扫描单元230，而穿过半棱镜251的一部分荧光被导向目镜254，从而被可视地观察为荧光图像。
根据这种超高分辨率显微镜，除了靠近光轴(在那里，消除光的强度在样本253的聚焦点上变为零)的荧光以外，其它荧光都被控制，结果，能够仅测量在比泵浦光的宽度窄的区域中的荧光标记(labeler)分子。因此，通过在计算机上按二维排列每个测量点处的荧光信号，可以形成分辨率超出衍射极限的空间分辨率的显微镜图像。
应注意到，调制光学部件可以被设置成调制消除光的偏振，以便生成抵消光轴上的电场的中空消除光(例如，参见Y.Iketaki等人的Rev.Sci.Instrum 75(2004)5131)。另外，调制光学部件可以设置在泵浦光和消除光的公共光路上(例如，参见日本专利特开No.2010-150260)。在这种情况下，调制光学部件被形成为具有同心分离的中央区域和外周区域的环状。该中央区域具有形成在透明光学基板(如玻璃基板等)上的光学多层，以反射泵浦光而使消除光相位反转π而透过。该外周区域例如由光学基板形成，并且使泵浦光和消除光无相位调制地透过。另选的是，调制光学部件具有围绕光轴径向划分的多个区域，每个区域都由光学多层形成，以使泵浦光以相同相位透射，而调制消除光的相位，以便形成相位分布按2π旋转的拉盖尔高斯(Laguerre-Gaussian)光束。
发明内容
根据本发明第一方面的显微镜包括：
调制光学元件，该调制光学元件具有用于对照明光进行空间调制的多个区域；以及
调节元件，该调节元件用于调节由所述调制光学元件进行了调制的照明光的光学特性。
本发明的第二方面是根据本发明第一方面的显微镜，其中，
所述调节元件对已经通过了所述调制光学元件的照明光进行调节，使得光轴周围的透射率和相位中的至少一方的非对称分量在所述调制光学元件的所述多个区域之间抵消。
本发明的第三方面是根据本发明第一方面的显微镜，其中，
假设Si表示由所述调制光学元件空间调制的照明光的光瞳面上的与所述多个区域相对应的各个区域i的尺寸，θi表示通过了区域i的光的相位，Ti表示透射率，Ui表示能量密度，则所述调节元件按满足以下关系式的方式进行调节
Σ i = 1 n T i S i sin θ i = Σ i = 1 n U i = 0 .
本发明的第四方面是根据本发明第一方面的显微镜，其中，
所述调节元件一体地形成在所述调节光学元件中。
本发明的第五方面是根据本发明第一方面的显微镜，其中，
作为所述多个区域，所述调制光学元件包括绕光轴径向划分的多个区域。
本发明的第六方面是根据本发明第五方面的显微镜，其中，
假设对于所述调制光学元件的所述多个区域，区域a具有透射率Ta、尺寸Sa和相位θa，而隔着所述光轴与区域a相对的区域b具有透射率Tb、尺寸Sb和相位θb，则满足下面的等式，
TaSasinθa+TbSbsinθb＝0。
本发明的第七方面是根据本发明第六方面的显微镜，其中，
所述区域a和所述区域b具有相同尺寸。
本发明的第八方面是根据本发明第一方面的显微镜，其中，
作为所述多个区域，所述调制光学元件包括同心划分的多个区域。
本发明的第九方面是根据本发明第一方面的显微镜，其中，
所述照明光具有第一照明光和第二照明光，所述第一照明光通过将具有至少两个激发量子态的材料从稳定态激发至第一量子态而使该材料发光，所述第二照明光通过使所述材料进一步跃迁至另一量子态而抑制发光；
所述显微镜还包括照明光学系统，该照明光学系统包括物镜，该物镜通过局部地使得所述第一照明光和所述第二照明光交叠来将这些光会聚在包括所述材料的试样上；并且
所述调制光学元件和所述调节元件设置在所述照明光学系统中。
本发明的第十方面是根据本发明第九方面的显微镜，其中，
所述调制光学元件调制所述第二照明光的相位。
本发明的第十一方面是根据本发明第十方面的显微镜，其中，
所述调制光学元件使所述第一照明光透射，而不改变电场的符号。
本发明的第十二方面是根据本发明第十一方面的显微镜，其中，
所述调制光学部件具有光学多层。
本发明的第十三方面是根据本发明第九面的显微镜，其中，
所述照明光学系统按空间匹配方式交叠所述第一照明光的光轴和所述第二照明光的光轴。
本发明的第十四方面是根据本发明第十三方面的显微镜，其中，
所述照明光学系统具有单模光纤；并且
所述第一照明光和所述第二照明光经由所述单模光纤入射在所述调制光学元件和所述调节元件上。
本发明的十五方面是根据本发明第九方面的显微镜，其中，
所述调节元件包括用于调节所述照明光的光通量的直径的光阑。
本发明的第十六方面是根据本发明第十五方面的显微镜，其中，
所述光阑能够在与进入的照明光的光轴正交的方向上移动。
本发明的第十七方面是根据本发明第九方面的显微镜，该显微镜包括多个照明光源，这些照明光源能够产生至少三种波长的照明光，其中，
从所述多个照明光源同时产生所述第一照明光和所述第二照明光。
本发明的第十八方面是根据本发明第十七方面的显微镜，所述显微镜包括：
光检测器，该光检测器检测所述试样在被来自所述照明光学系统的所述第一照明光和所述第二照明光照射时发出的光；
共焦针孔，该共焦针孔具有尺寸可变的孔径，设置在所述光检测器的入射侧的与所述物镜的焦点位置共轭的位置处；
驱动单元，该驱动单元改变所述共焦针孔的所述孔径的尺寸；以及
控制单元，该控制单元通过控制所述多个照明光源来同时产生所述第一照明光和所述第二照明光，并且还根据所述第一照明光和所述第二照明光，经由所述驱动单元控制所述共焦针孔的所述孔径，以满足下式
0.61 λ P NA M > a ≥ 0.49 ϵ e τ σ dip C e 0 λ e NA M
NA：物镜的数值孔径
M：光检测器在物侧会聚像的倍率
λp：第一照明光的波长
λe：第二照明光的波长
σdip：荧光抑制截面积
Ce0：第二照明光的峰值强度
εe：第二照明光的光子通量。
附图说明
图1是例示了调制光学部件和调节部件的示例的图；
图2是例示了调制光学部件的另一示例的图；
图3是例示了用于软X射线的调制光学部件和调节部件的示例的图；
图4是例示了根据第一实施方式的超高分辨率显微镜的主要部分的示意性构造的图；
图5示出了可用于图4的超高分辨率显微镜的调制光学部件的其它三个示例；
图6是例示了在使用图5的调制光学部件时形成在焦点处以及其前后的光束的强度分布的图；
图7是例示了根据第二实施方式的超高分辨率显微镜的主要部分的示意性构造的图；
图8是例示了根据第三实施方式的超高分辨率显微镜的主要部分的示意性构造的图；
图9是例示了可在第三实施方式中使用的示范性带通滤波器的图；
图10是例示了可在第三实施方式中使用的另一示范性带通滤波器的图；
图11是例示了第三实施方式的示范性变型例的局部构造图；
图12是例示了图11所示旋转滤波器的图；
图13是例示了根据第四实施方式的超高分辨率显微镜的主要部分的示意性构造的图；
图14是例示了共焦显微镜的基本构造的模式图；
图15是例示了各种显微镜的点图像分布函数的比较的图；
图16是例示了各种显微镜的衍射尺寸极限的对比度传递函数的图；
图17是例示了根据本发明的调制光学部件的调制状态的示范性变型例的图；
图18是例示了根据本发明的调制光学部件的调制状态的另一示范性变型例的图；
图19是例示了组成样本的分子的价电子轨道的电子构造的概念图；
图20是例示了图19所示分子的第一激发态的概念图；
图21是例示了图19所示分子的第二激发态的概念图；
图22是例示了图19所示分子从第二激发态返回到基态的状态的概念图；
图23是例示了分子的双谐振吸收过程的概念图；
图24是例示了分子的双谐振吸收过程的概念图；
图25是常规超高分辨率显微镜的主要部分的构造图；
图26是例示了图25所示相位板的构造的放大平面图。
具体实施方式
(发明概要)
首先，以发射抑制型超高分辨率显微镜为例对本发明的概要进行描述，该发射抑制型超高分辨率显微镜用于通过采用双色照明光来抑制材料的光发射而实现超高分辨率。
根据本发明的一个实施方式，在超高分辨率显微镜的消除光的照明光学系统中，调节消除光的光学特性，以便保持光瞳面中经过调制光学部件调制的消除光的强度分布的均衡性。
作为第一有效对策，提供了调幅部件来校正消除光的强度分布。图1是例示了调制光学部件和调节部件的示例的图。调制光学部件1具有多个光学多层区域，它们被径向划分(图1中划分成8个部分)，以使相位(相位分布)围绕光轴相对于消除光按2π旋转。调制光学部件1布置在消除光的光路上，或者布置在泵浦光和消除光的公共光路上，由此调制了消除光的相位和偏振。
在利用这个调制光学部件1时，例如，将作为调节部件的透射率补偿片2布置在调制光学部件1的入射面侧或出射面侧(图1中的入射面侧)。在透射率补偿片2上形成了多个透射率补偿区，它们是由围绕光轴径向被划分(图1中划分成6个部分)的、消除光的吸收层形成的。形成透射率补偿区的吸收层可以是单层或多层。
由此，调制光学部件1的每一个光学多层区的透射率都可以通过透射率补偿片2的对应透射率补偿区来控制，以便均衡化从调制光学部件1入射在后一光学部件上的消除光的振幅。另选的是，因为调制光学部件1的每一个光学多层区通常都具有与层数成比例的低透射率，所以调制光学部件的基板上的每一个光学多层区都同时涂敷有用于均衡化透射率的吸收层。在这种情况下，透射率补偿片2一体化在调制光学部件1中。
作为第二有效对策，综合考虑经调制光学部件调制的相位(如调制区的振幅和尺度)，通过在将已穿过光瞳面的消除光聚焦在焦点上时的干扰来抵消电场。即，如果调制光学部件将消除光的光瞳面划分成n个区域，则在假设Si表示每个区域i的尺度，θi表示相位，Ti表示透射率，而Ui表示能量密度的情况下，下面的关系式得以满足。
[公式3]
Σ i = 1 n T i S i sin θ i = Σ i = 1 n U i = 0 . . . ( 1 )
在上面的关系式中可以看出，调制光学部件的每一个区域i都以透射率Ti、尺度Si以及相位θi作为设计参数。因此，与假定调制光学部件的透射率为1的常规超高分辨率显微镜相比，本发明在设计显微镜方面提供了更好的灵活性。因此，例如，如果透射率在调制光学部件的光学多层上劣化，则可以利用这种区域的尺度进行调节。另外，如果透射率劣化，则可以利用这种区域的相位改变量来对其进行补偿。
这种对策对于图2所示的调制光学部件10来说尤其有效。图2所示调制光学部件10被同心地划分成中央区11和外周区12，两者都为环状并且设置在泵浦光和消除光的公共光路上。中央区11由形成在诸如玻璃基板的透明光学基板上的光学多层形成，用于反射波长为λ1的泵浦光，并使波长为λ2的消除光透射而相位反转π。外周区12例如由光学基板形成，用于使泵浦光和消除光透射，而不调制它们的相位。
在利用调制光学部件10时，满足下面的公式。由此，当已穿过调制光学部件10的相干消除光彼此交叠时，可以使消除光的电场强度在焦点上为零。在下面的公式中，Ta、Sa和θa分别表示中央区11的透射率、尺度以及相位，而Tb、Sb和θb分别表示外周区12的透射率、尺度以及相位。
TaSasinθa+TbSbsinθb＝0...(2)
另外，在利用如图1所示围绕光轴径向划分成的多个光学多层区的调制光学部件1时，还用分别表示跨光轴彼此定位的多个光学多层区的透射率、尺度以及相位的Ta和Tb、Sa和Sb以及θa和θb满足上述公式(2)。如果图1所示的调制光学部件1具有跨光轴彼此定位的尺寸相同的多个光学多层区，则满足下面的公式(3)。由此，可以按如上所述类似方式使消除光的电场强度在焦点上为零。
Tasinθa+Tbsinθb＝0...(3)
如上所述，与调制光学部件的设计参数个数成比例地，允许多种更灵活的设计，这增加了实际场合的容许制造误差水平。结果，例如，允许更宽泛的选择光学多层的材料。
在利用采用双色照明光的发射抑制型超高分辨率显微镜时，通常极难调节不同颜色照明光的光轴。在这种情况下，对于照明光学系统的对准来说，必须使不同颜色的两种照明光彼此完全同轴地匹配，并且还聚焦在同一焦点上，而不存在像差。作为其解决方案，例如，其通过利用单模光纤预先同心地排列泵浦光和消除光，而有效地使它们同时进入调制光学部件，并且利用调制光学部件仅调制消除光的相位，以形成跟随光束，而使泵浦光至少在具有要按正常高斯形状会聚的相位分布的光瞳面上以电场的相同符号透射，即，不改变符号。
由此，对已穿过调制光学部件的泵浦光和消除光进行会聚使得能够轻松地满足成像条件，从而与如图25所示的将消除光整形成光束并且在进行光轴调节之后与泵浦光一起会聚的情况相比，表现出超高分辨率功能。即，在图25的情况下，因为消除光在被整形成光束之后与泵浦光同时被调节，所以需要高级技术来调节用于使光轴匹配的镜光学系统，但在调节之后仍不能提供良好的稳定性。与此相反，通过如上所述预先利用单模光纤同心地排列泵浦光和消除光并且经由调制光学部件和光会聚光学系统来会聚它们，能够容易地实现泵浦光和消除光的同轴排列，而且能够对光进行稳定的会聚，而不会造成轴向偏移。
另外，如果泵浦光和消除光同轴入射在调制光学部件上，则该调制光学部件例如可以利用如图1或图2所示的光学多层来制造。在这种情况下，如果每一个区域具有不同的透射率，则公式(1)具有较高效率。即，每一个区域的透射率的波动都可以利用尺度的相位差来补偿。因此，根据本发明，在利用调制光学部件的显微镜的实际使用中，可以获得其很高的灵活性，并且容易在焦点平面上按期望形状形成束斑。
尽管上述描述针对的是将本发明应用至采用双色光的反射抑制型超高分辨率显微镜，但是本发明还可有效地应用于采用单色相干光的显微镜。例如，本发明可以应用于利用调制光学部件对单色光进行相位调制来形成多光斑，以便形成期望形状的多光斑的显微镜。而且，本发明还可以应用于用于通过生成中空照明光来检测相位差的差量(differential quantity)的微分干涉显微镜、相位差检测型软X射线显微镜(例如，参见N.Borkor，Opt.Express 17(2009)5533)等，以便形成期望形状的光斑。
尤其是如果本发明应用于后者软X射线显微镜，则可以例如通过组合由图3所示螺旋型菲涅耳波带片20形成的调制光学部件和由图1所示围绕光轴划分成多个区域的透射率补偿片21来补偿菲涅耳波带片20的软X射线的透射率，并且形成期望形状的软X射线光斑。
参照附图，对本发明的实施方式进行描述。
(第一实施方式)
图4是例示了根据本发明第一实施方式的超高分辨率显微镜的主要部分的示意性构造的图。该超高分辨率显微镜是采用双色光的发射抑制型并且具有泵浦光源31和消除光源32。泵浦光源31例如具有Nd:YAG激光器，并且发射波长为532nm的二次谐波作为泵浦光。同时，消除光源32例如具有氪激光器，并且发射波长为647nm的光作为消除光。
若需要，来自泵浦光源31的泵浦光就其强度被AOM(声光调制器)33进行调制，被反射镜34反射并接着透射过二向色镜35。同时，若需要，来自消除光源32的消除光也就其强度被AOM(声光调制器)36进行调制，与泵浦光同轴地被二向色镜35反射，接着与泵浦光组合。
通过二向色镜35彼此组合在一起的泵浦光和消除光经由作为调节部件的光阑37入射在调制光学部件38上。光阑37被设置成能够调节组合在一起的泵浦光和消除光的光通量的直径。另外，光阑37被设置成可在需要时在与光轴正交的平面内移动。由此，组合在一起的泵浦光和消除光的光轴是偏心的(光轴偏移)。
如图2所示，例如，调制光学部件38被设置成，具有都为环状的中央区和外周区。在这种情况下，调制光学部件38的中央区例如被设置成，在光学基板上具有如下表所示的光学多层。在下表中，第一层和第十层分别表示底层和顶层。另外，如果入射了均匀的消除光，则根据公式(1)，中央区的直径为消除光的光瞳直径的1/21/2。由此，可以通过反转波长为647nm的消除光的相位，而在样本42的焦点平面上形成环状的光斑图案。
[表1]
设计的膜厚度
  层   物理膜厚度(nm)   光学膜厚度(4/λ)   材料
  第一层   157.8   1.4   SiO2
  第二层   205.3   3.0   TiO2
  第三层   162.8   1.5   SiO2
  第四层   68.8   1.0   TiO2
  第五层   163.0   1.5   SiO2
  第六层   59.7   0.9   TiO2
  第七层   173.5   1.6   SiO2
  第八层   62.8   0.9   TiO2
  第九层   148.1   1.3   SiO2
  第十层   92.7   1.4   TiO2
折射率
  波长(nm)   SiO2   TiO2
  532   1.48   2.42
  647   1.47   2.36
已穿过调制光学部件38的泵浦光和消除光被分束器39反射并接着被显微镜物镜40聚焦在样本台41上所放置的样本42上。接着，从样本42获得的光在被显微镜物镜40会聚并透射过分束器39之后，被分光镜43分散，使得具有必要波长要素的信号光(荧光)例如被由光电倍增器组成的光检测器接收到。样本42随着样本台31的移动而被空间地扫描，由此，基于从光检测器44获得的信号而生成了样本42的荧光图像。
在这种构造中，调制光学部件38在形成光学多层时可以使该光学多层的特性具有不同设计值，例如不同于π的相位调制，以及明显低于100％的透射率。另外，泵浦光和消除光的激光束通常具有不均匀的面内强度，但形式为相对于光轴对称的高斯光束。因此，假定会聚在样本42上的消除光的光斑的形状没有成为相对于光轴对称，而是发生了变形，从而导致不能够获得预计的超高分辨率功能并且劣化了荧光图像的质量。
根据本实施方式的超高分辨率显微镜在调制光学部件38的入射侧具有光阑37，作为调节部件。因此，通过光阑37来调节泵浦光和消除光的直径并且在需要时调节光轴(偏心率)的简单操作使得能够充分调节调制光学部件38的具有光学多层的中央区的尺度与外周区对于消除光的透射率尺度的比率。由此，可以找出满足公式(2)的条件，其使得能够容易地补偿调制光学部件38的制造误差，调节由调制光学部件38调制的消除光的光学特性。
另外，泵浦光与消除光同轴地组成，并且在不需要电场极性反转的情况下按正常高斯形状会聚在样本32上。因此，如果显微镜物镜40的色差被补偿，则泵浦光以圆环形状会聚在消除光的光斑图案中央，而不需要与轴有偏移，这容易满足用于呈现超高分辨率功能的条件。因此，尽管传统上认为，具有需要高精度加工技术和调节技术的调制光学部件是不可避免的，但根据本实施方式，能够以灵活的光学设计来制造光学部件38，并且还利用简单的光学调节呈现了超高分辨率功能。
调制光学部件38不限于图2所示的环状，而是可以具有如图1所示那样围绕光轴逐渐改变的相位。另外，还可以使用如图5(a)至(c)所示的调制光学部件50。
图5(a)所示的调制光学部件50是组合了图1所示的调制光学部件1和图2所示的调制光学部件10的混合型，并且具有全部为环状的中央区51、中间区52以及外周区53。中央区51和中间区52按与图2所示的调制光学部件10的中央区11和外周区12相似的方式形成。按和图1所示调制光学部件1相似的方式，外周区53被形成为具有径向划分的多个光学多层区(图5(a)中被划分成8个)，使得相位差对于消除光按2π旋转。
另外，优选的是，调制光学部件50被形成为，透射过每一个区域的消除光的偏振彼此不同，以避免透射过中央区51和中间区52的消除光与透射过外周区53的消除光之间的干涉。例如，中央区51和中间区52被形成为，透射过它的消除光为顺时针圆偏振，而外周区53被形成为，透射过它的消除光为逆时针圆偏振。
通过用显微镜物镜40来会聚已透射过调制光学部件50的消除光，可以形成具有以下强度分布的光束形状，该强度分布在焦点上及其周围具有如图6所示的各向异性三维黑孔。在图6中，z和x分别表示光轴的方向和与光轴正交的方向。因此，与共焦光学系统组合使得能够获得在样本42深度方向上的分辨率功能。
图5(b)所示的调制光学部件50和图5(c)所示的调制光学部件都为双环结构。在图5(b)和(c)中，内环区域和外环区域围绕光轴按2π改变消除光的相位分布，同时具有相对于光轴沿彼此相反方向相移的旋转方向。图5(b)示出了通过将内环区和外环区都径向地划分成8个区域来量化相移量的示范性构造。图5(c)示出了逐渐改变围绕光轴的内环区和外环区的相移量的示范性构造。
在利用图5(b)和(c)所示的调制光学部件50时，通过沿径向方向增加已通过它的消除光的振幅强度来补偿电场。因此，利用等效于图2所示黑孔型调制光学部件10的功能的功能，可以通过用显微镜物镜会聚已穿过调制光学部件50的消除光，来生成用于不仅接收焦点处而且接收光平面上的非超细光(no ultra-fine)的干涉区。每个环形区都优选地被设置为，相位如图5(c)所示连续且平滑改变。然而，如果每个环形区都涂敷有光学薄膜，则考虑到实际制造工艺，更容易通过图5(b)所示那样按八个相位量化来制造。另外，利用光学多层作为用于按和图2所示调制光学部件10相似的方式来提供相位调制的装置，可以通过仅相位调制消除光而不需要相位调制泵浦光来整形具有黑孔的光束。
同时，例如图5(d)或5(e)中示出的调制光学部件50也可以应用于超高分辨率显微镜。图5(d)和5(e)的相位反转方向与图5(c)和5(b)的相反。利用图5(d)和5(e)的相位调制模式，可以生成图6所示的具有三维环状孔的会聚消除光束，因为外部区和内部区中的电厂可以抵消并在焦点创建零强度孔。
(第二实施方式)
图7是例示了根据本发明第二实施方式的超高分辨率显微镜的主要部分的示意性构成的图。应注意到，图7中的和图4相同功能的组件被设置了相同标号，并且省略了其描述。在该超高分辨率显微镜中，与图4所示类似的是，通过二向色镜35同轴组合的泵浦光和消除光被会聚透镜60会聚并且进入单模光纤61中。离开单模光纤61的泵浦光和消除光通过准直透镜62而转换成平行光并且经由光阑37入射在调制光学部件38上。
另外，已穿过调制光学部件38的泵浦光和消除光经由检电扫描器(galvanoscanner)单元63入射在分束器39上，并且在被分束器39反射之后，经由光瞳投影透镜64被显微镜物镜40会聚在样本台41上放置的样本42上。由此，利用泵浦光和消除光在两个维度上扫描样本42。从样本42获得的光在被显微镜物镜40会聚之后透射过光瞳投影透镜64和分束器39，接着被分光镜43分散，使得具有必要波长分量的信号光(荧光)被光检测器44接收到，并且基于其输出来生成样本42的荧光图像。
根据本实施方式的超高分辨率显微镜，按和第一实施方式的显微镜相似的方式，可以找到通过简单操作来满足公式(2)的条件，以调节泵浦光和消除光的光通量的直径，并且在需要时通过光阑37来调节光轴(偏心率)。即，针对消除光，可以充分调节调制光学部件38的具有光学多层的中央区的尺度与外周区的透射尺度的比率，由此，可以通过容易地补偿调制光学部件38的制造误差来呈现超高分辨率功能。因此，可以容易地以灵活的光学设计来制造调制光学部件38。
另外，因为泵浦光和消除光被引导到共同使用的单模光纤61中，并且通过准直透镜62提取为平行光，所以可以使具有完整球面波的泵浦光和消除光进入到调制光学部件38中。因此，可以在样本42的焦平面上以环形形成消除光的更精确的光斑图案。
而且，因为泵浦光和消除光被检电扫描器单元63在两个维度上扫描，所以与如图4所示通过移动样本台41在两个维度上扫描样本42的显微镜相比，可以改进测量精度，并且缩短测量时间。而且，因为通过检电扫描器单元63在两个维度上扫描的泵浦光和消除光经由光瞳投影透镜64被显微镜物镜40会聚在样本40上，所以可以在不造成像差的情况下使光会聚在焦平面上。
(第三实施方式)
图8是例示了根据本发明第三实施方式的超高分辨率显微镜的主要部分的示意性构造的图。应注意到，图8中的和图7所示组件相同功能的组件被设置有相同标号并且省略了其描述。根据本实施方式的超高分辨率显微镜被设置成能够处理多种染色分子。即，特别是在生物学科中，各种观察对象沾染有用于解释生命现象的多种染料。
这里，尽管在许多分子中观察到荧光抑制，但激发波长和荧光波长在这些分子当中有很大不同。一般来说，尽管荧光抑制效应可以通过照射波长比荧光波长频带(其中，分子没有被激发至第一激发态(S1状态))更长的消除光来诱发，但其呈现水平取决于消除光的波长。另外，为了将分子激发至光强度很小的S1状态，需要最优化泵浦光的波长。
具体来说，期望有这样一种灵活的显微镜系统，其能够选择可以基于要使用的染料来有效诱发荧光抑制效应消除的泵浦光波长和消除光波长，并且能够在不需要将泵浦光和消除光混合到检测器中的情况下以高灵敏度检测荧光。更具体地说，需要一种能够处理在紫外区与近红外区之间发射光的多种荧光染料的多用途显微镜。
根据本实施方式的超高分辨率显微镜满足上述需要并且具有发射波长不同的三个或更多个激光束。图8例示了具有发射波长不同的五个激光束源71-75的示例。激光束源71发射例如发射波长λ1为405nm的光，并且可以激发诸如荧光蛋白CFP(氰基荧光蛋白)等染料。激光束源72发射例如发射波长λ2为480nm的光，并且可以激发诸如Alexa 488、FIFC(异硫氰酸荧光素)等的典型普通染料。激光束源73发射例如发射波长λ3为532nm的光，并且可以激发诸如Alexa 532、Nile Red等的染料。激光束源74发射例如发射波长λ4为639nm的光，并且可以激发诸如Texas Red等的染料。激光束源75发射例如发射波长λ5为730nm的光，并且可以激发与近红外光相对应的、诸如犬系统(canine system)Cy7等的染料。
除了激光束源71以外的其它激光束源72-75还被用作消除光源。即，可以通过具有如上所述不激发染料发射荧光的更长波长的消除光来诱发荧光抑制效应。因此，如果激光束源71例如被用作泵浦光源，则可以根据要使用的荧光染料将激光束源72-75中的任一个用作消除光源。另外，在将激光束源73用作泵浦光源时，激光束源74或激光束源75可以被用作消除光源。
根据发明人的分析，染料的荧光频带与泵浦光的波长和消除光的波长之间的关系如下所述。即，荧光频带位于泵浦光与消除光的中间波长频带中。因此，可以通过将荧光与泵浦光和消除光的散射光线分离开、通过刚好在光检测器之前设置一个或更多个滤光器、特别是通过安装在泵浦光和消除光的中间波长频带中具有透射率的带通滤波器，或者通过安装用于阻止泵浦光的波长和消除光的波长的两个陷波滤波器来检测荧光。
根据本实施方式的超高分辨率显微镜如上所述具有激光束源71-75，它们能够分别按五个不同波长405nm(λ1)、480nm(λ2)、532nm(λ3)、639nm(λ4)以及730nm(λ5)来振荡。原则上，由此可以利用十个波长对(405nm-480nm、405nm-532nm、405nm-639nm、405nm-730nm、480nm-532nm、480nm-639nm、480nm-730nm、532nm-639nm、532nm-730nm，以及639nm-730nm)来进行超高分辨率测量。
然而，如果该超高分辨率显微镜的泵浦光和消除光在沿光轴方向缺乏彼此对准的同时形成图像，换句话说，如果在该轴上存在色差，则通常不能期望分辨率上的显著改进。因此，优选的是，利用具有几乎难于造成色差的相邻波长的光来测量图像。在这种情况下，作为用于荧光检测的滤波器，优选的是，制备透射率在如图9所示的相邻发射波长λ1-λ2、λ2-λ3、λ3-λ4以及λ4-λ5之间的带通滤波器BPF1至BPF4，并且根据光源的组合来恰当地切换它们。
应注意到，如果显微镜的光学系统的色差可以忽略，则可以组合远端发射波长，举例来说，组合振荡波长λ1和λ3或组合发射波长λ2和λ5。在这种情况下，制备透射率在如图10所示的相邻发射波长λ1-λ3与λ2-λ5之间的带通滤波器BPF5、BPF6并且根据光源来恰当地切换。而且，如果不存在因发射消除光或泵浦光而造成的从样本生成的附属光，则可以将能够仅阻止光源的发射波长的多个陷波滤波器插入到检测光学系统的光路中。
如图8所示，从激光束源71发射的激光束被分束器80分散成两个光通量。接着，透射过分束器80的一个光通量在被反射镜81反射之后顺序地透射过合束器82、83、84以及85，接着入射在旋转ND滤波器86上，而被分束器80反射的另一光通量顺序地透射过分束器87、88、89以及90，接着入射在旋转ND滤波器91上。
从激光束源72发射的激光束被分束器87分散成两个光通量。接着，透射过分束器87的一个光通量在被合束器82反射并且与来自反射镜81的激光束的光路同轴组合之后，顺序地透射过合束器83、84以及85，接着入射在旋转ND滤波器86上。被分束器87反射的另一光通量在与来自分束器80的激光束的光路同轴组合之后，顺序地透射过分束器88、89以及90，接着入射在旋转ND滤波器91上。
从激光束源73发射的激光束被分束器88分散成两个光通量。接着，透射过分束器88的一个光通量在被合束器83反射并且与来自合束器82的激光束的光路同轴组合之后，顺序地透射过合束器84、85，接着入射在旋转ND滤波器86上。被分束器88反射的另一光通量在与来自分束器87的激光束的光路同轴组合之后，顺序地透射过分束器89、90，接着入射在旋转ND滤波器91上。
从激光束源74发射的激光束被分束器89分散成两个光通量。接着，透射过分束器89的一个光通量在被合束器84反射并且与来自合束器83的激光束的光路同轴组合之后，透射过合束器85，接着入射在旋转ND滤波器86上。被分束器89反射的另一光通量在与来自分束器88的激光束的光路同轴组合之后，透射过分束器90，接着入射在旋转ND滤波器91上。
从激光束源75发射的激光束被分束器90分散成两个光通量。接着，透射过分束器90的一个光通量在被合束器85反射并与来自合束器84的激光束的光路同轴组合之后，入射在旋转ND滤波器86上。被分束器90反射的另一光通量在与来自分束器89的激光束的光路同轴组合之后，入射在旋转ND滤波器91上。
旋转ND滤波器86、91都被设置成具有设置在同一圆周上、具有不同透射率的多个ND滤波器，并且将具有期望透射率的ND滤波器设置在对应光轴上，以便获得期望强度的透射光。已透射过旋转ND滤波器86的光入射在声光波长可调滤波器92上，而已透射过旋转ND滤波器91的光入射在声光波长可调滤波器93上。
声光波长可调滤波器92、93通过控制所激发的表面声波的频率来选择期望波长的光。由此，从声光波长可调滤波器92获得了期望波长的伪脉冲化泵浦光，而从声光波长可调滤波器93获得了期望波长的伪脉冲化消除光。
从声光波长可调滤波器92获得的泵浦光被反射镜34反射，透射过合束器94，接着经由会聚透镜60进入单模光纤61。同时，从声光波长可调滤波器93获得的消除光被合束器94反射并且与泵浦光的光轴同轴组合，接着经由会聚透镜60进入单模光纤61。
即，根据本实施方式的超高分辨率显微镜选择并驱动激光束源71-75当中的、具有与泵浦光和消除光的期望波长相对应的相邻发射波长的两个激光束源。接下来，从这两个激光束源发射的激光束分别透射过旋转ND滤波器86和声光波长可调滤波器92，以及旋转ND滤波器91和声光波长可调滤波器93。由此，从声光波长可调滤波器92、93获得了被伪脉冲化从而有效呈现荧光抑制效应的泵浦光和消除光。接着，泵浦光和消除光被合束器94同轴组合，接着经由会聚透镜60进入单模光纤61中。
从单模光纤61出射的泵浦光和消除光在被准直器透镜62转换成平行光之后，经由光阑37入射在调制光学部件38上。接着，已透射过调制光学部件38的泵浦光和消除光在已透射过分束器39之后，经由检电扫描器单元63和光瞳投影透镜64被显微镜物镜40会聚在样本台41上放置的样本42上。由此，通过泵浦光和消除光在两个维度上来扫描样本。
另外，从样本42获得的光在被显微镜物镜40会聚之后，在透射过光瞳投影透镜64和检电扫描器单元63之后被分束器39反射。被分束器39反射的来自样本42的光穿过会聚透镜95、共焦针孔96以及滤波器单元97，并且由光检测器44接收具有必要波长分量的信号光(荧光)。基于光检测器44的输出，生成样本42的荧光图像。
这里，如图9所示，滤波器单元97使透射率在五个不同激光束源71-75的相邻发射波长之间的四个独立的带通滤波器BPF1-BPF4保持直线排列并且被设置为可与光检测器44的光路相对滑动。接着，将期望的带通滤波器(即，透射率在两个选定激光束源的发射波长之间的带通滤波器)插入到光检测器44的光路中。还可以将滤波器单元97设置成，使旋转滤波器保持带通滤波器BPF1-BPF4，并且在旋转时将期望的带通滤波器插入到光检测器的光路中。
根据本实施方式的超高分辨率显微镜，可以获得和第二实施方式相同的效果。另外，这种显微镜具有发射波长不同的多个激光束源71-75，和透射率在相邻发射波长之间的多个带通滤波器BPF1-BPF4。因此，允许根据所使用的染料来选择能够有效诱发荧光抑制效应的泵浦光和消除光的波长，并且实现能够通过防止将泵浦光和消除光混入到光检测器44中而以高灵敏度检测来自样本42的荧光的灵活显微系统。而且，利用设置在光检测器44的入射侧上的共焦针孔96，可以通过进一步切断散射光等来改进S/N，并且获得针对样本42的深度方向的空间分辨率。
在图8所示的构造中，如果染料分子具有诸如荧光蛋白的较大斯托克位移(stokeshift)，即，如果染料分子具有相对于泵浦光的吸收波长向较长波长侧显著位移的荧光波长，则可以组合具有远距发射波长的激光束源，如激光束源71和激光束源73。在这种情况下，将其设置成，根据发射波长的组合，通过滤波器单元97保持具有如图10所示透射率特性的BPF，从而将对应BPF插入到光检测器44的入射光路中。
另外，在图8所示的构造中，还可以按与图4和图7所示实施方式相同的方式，在光检测器44的、分束器39与会聚透镜95之间的入射光路上设置分光镜，使得该分光镜分散要经由会聚透镜95、共焦针孔96以及滤波器单元97被光检测器44接收的具有期望波长的信号光(荧光)。由此，可以改进信号光的S/N，并且以高灵敏度来检测信号光。
而且，如图11的局部构造图所示，还可以通过代替图8中的声光波长可调滤波器92、93而设置旋转滤波器101、102以及AOM 33、36，从而获得都被伪脉冲化以有效呈现荧光抑制效应的泵浦光和消除光。这里，如图12(a)所示，旋转滤波器101、102中的每一个都被设置成，保持分别与激光束源71-75中的每一个相对应的激光线路滤波器LF1-LF5，并且在旋转时插入，使得与选定激光束源相对应的期望线路滤波器被插入到光路中。如图12(b)所示，激光线路滤波器LF1-LF5具有窄频带的透射率特性，以允许激光束源71-75的预定发射波长λ1、λ2、λ3、λ4以及λ5的光有效透射。
接着，通过旋转滤波器101从已透射过旋转ND滤波器86的双色激光束获得期望波长的激光束，并且通过AOM 33来调制该激光束的强度，以便获得伪脉冲化的期望泵浦光。类似的是，通过旋转滤波器102从已透射过旋转ND滤波器91的双色激光束获得期望波长的激光束，并且通过AOM 36来调制该激光束的强度，以便获得伪脉冲化的期望泵浦光。其它构造和图8所示构造相同。
(第四实施方式)
图13是例示了根据本发明第四实施方式的超高分辨率显微镜的主要部分的示意性构造的图。根据本实施方式的显微镜具有图11所示的构造，其中，图8所示的用于光检测器44的共焦针孔96被形成为在X方向和Y方向上具有可变缝隙宽度的矩形光栅，如图13所示，每一个宽度都可以通过由P2T等构成的对应驱动单元111x、111y来调节。另外，根据本实施方式的显微镜具有用于激光束源71-75和驱动单元111x、111y的控制单元112。由此，基于要生成的泵浦光和消除光，控制激光束源71-75的驱动和组合，即，要使用的泵浦光和消除光的生成，并且经由驱动单元111x、111y来控制共焦针孔96的光栅(在这种情况下，内切圆的直径)，以满足下面的公式(4)。
[公式4]
0.61 λ p NA M > a ≥ 0.49 ϵ e τ σ dip C e 0 λ e NA M | - - - ( 4 )
NA：物镜的数值孔径
M：光检测器的用于在物侧聚焦图像的放大率
λp：泵浦光波长
λe：消除光波长
σdip：荧光抑制截面积尺度
Ce0：消除光的峰值强度
εe：消除光的光子通量。
即，根据本实施方式，基于Rayleigh标准将共焦针孔96的光栅控制在衍射极限之下，并且等于或超过光检测器44(参见图8)的点扩散函数的半宽。其它构造与图8和图11所示的构造相同。因此，与图8和图11所示组件相同的组件被提供了相同标号并且省略了其描述。
下面，对共焦显微镜的点扩散函数(PSF：点扩散函数)进行描述。图14是例示了共焦显微镜的基本构造的模式图。在图14中，从点光源120发射的光被透镜121准直并且被分束器122反射，以通过物镜123会聚在物体124上。另外，来自物体124的光(例如，荧光)在通过分束器122、会聚透镜125以及共焦针孔126之后被光检测器127检测。
在图14所示共焦显微镜中，满足下面的公式(5)，假设I0(x，y)表示物镜123的物质的PSF，Id(x，y)表示光检测器127的PSF，d表示共焦针孔126的光栅的坐标，t表示物体124的发射强度分布，物镜123的放大率M为1，而h(x，y)表示共焦显微镜的PSF，
[公式5]
h ( x , y ) = { I 0 ( I d ⊗ d ) } ⊗ t | . . . ( 5 )
应注意，
Figure BDA0000068796970000222
表示卷积。
尽管为简化起见，在上述公式中定义了M＝1，但如果M≠1，则针对物质124和光检测器127的坐标进行缩放。例如，假设g(x，y)表示光检测器127检测的图像，而f(x，y)表示物质124的原始图像，则满足下面的公式(6)。
[公式6]
g ( x ) ⊗ f ( x ) = ∫ g ( x - t ) f ( t ) dt | . . . ( 6 )
这里，如果t是delta函数t＝δ(x，y)，则上述公式(5)变为下面的公式(7)。
[公式7]
h ( x , y ) = I 0 ( I d ⊗ d ) | . . . ( 7 )
而且，如果d＝δ(x，y)，则上述公式(7)变为下面的公式(8)。
[公式8]
h(x，y)＝IoId...(8)
可以在上述公式(8)中看出，共焦显微镜的分辨率功能相比没有共焦针孔的显微镜的分辨率功能要好。这里，对于正常共焦显微镜，即，不具有呈现超高分辨率的功能的共焦显微镜来说，I0和Id都是高斯函数。与此相反，对于具有呈现超高分辨率的功能的超高分辨率显微镜来说，具有使I0作为Lorenz函数而Id作为高斯函数的特性。因此，PSF根据是否存在共焦针孔和超高分辨率功能而不同。
图15是例示了比较每一个显微镜的PSF的图。在图15中，实线表示具有爱里斑尺寸的共焦针孔的正常共焦显微镜的PSF。虚线(broken line)表示没有共焦针孔(即，具有无限尺寸光检测器)的超高分辨率显微镜。点划线(dashed line)表示具有共焦针孔且直径为PSF半宽的超高分辨率共焦显微镜的PSF。
图16(a)至(d)是例示了每一个显微镜的衍射极限尺寸的对比度传递函数(CTF：Contrast Transfer Function)的图。图16(a)示出了单色图案的具有衍射极限尺寸的原始图像。图16(b)示出了正常共焦显微镜对于图16(a)的原始图像的CTF，图16(c)示出了没有共焦针孔的超高分辨率显微镜对于图16(a)的原始图像的CTF，而图16(d)示出了超高分辨率共焦显微镜对于图16(a)的原始图像的CTF。
可以在图15中看出，通过比较没有共焦针孔的超高分辨率显微镜的PSF和正常共焦显微镜的PSF，没有共焦针孔的超高分辨率显微镜的PSF可以缩减(缩窄)半宽。结果，从图16(b)与(c)之间的比较显见，即使没有共焦针孔，超高分辨率显微镜也可以获得比正常共焦显微镜的CTF更高的CTF和良好的对比度图像。
然而，如图15所示，没有共焦针孔的超高分辨率显微镜的PSF在低强度的底部比正常共焦显微镜的PSF扩展得更宽。因此，可以利用诸如荧光珠的分散样本获得良好的对比度图像，并由此可以改进分辨能力，而随着因卷积物体的PSF和光检测器的PSF而造成底部的分量交叠，对于拥挤样本(congested sample)可能会劣化对比度。
与此相反，如本实施方式所述，根据要使用的泵浦光和消除光，通过控制单元将共焦针孔96的光栅设置成例如光检测器44(参见图8)的PSF的半宽。由此，如图15中的点划线所示，与正常共焦显微镜的PSF相比，可以缩减低PSF强度的底部的扩展。结果，如图16(d)所示，改进了CTF，提供了尖锐的显微图像。尤其是在将拥挤样本用作观察对象时，使得能够在高对比度下获得超高分辨率显微图像。
即，正常共焦显微镜的共焦针孔的尺寸大于等于光检测器的爱里斑的尺寸。这不仅是因为空间分辨率没有因将尺寸缩减得小于爱里斑的尺寸而得到改进，而且因为检测信号被减弱并由此A/N劣化所致。然而，根据本实施方式的超高分辨率显微镜，利用光检测器44的PSF的较小(窄)半宽，可以进一步减小共焦针孔96的尺寸。
根据发明人模拟的结果，确认通过将共焦针孔96的直径减小至PSF的半宽，可以按大约只有30％通过光检测器44来改进显著保持受光量(photolepsy)缩减的CTF。还确认了也可以改进调制传递函数(MTF：Modulation Transfer Function)。如果共焦针孔96的尺寸小于光检测器44的PSF的半宽，则光学信号分量的受光量缩减，由此SN不期望地降低。而且，如果点图像分布函数(point image distribution function)足够小，则共焦针孔本身不再是必需的。因此优选的是，共焦针孔96的尺寸满足上述公式(4)。
应当明白，本发明不限于上述实施方式，而是可以按多种方式修改或改变。在上述实施方式中，例如，可以将调制光学部件38设置在照明光路上，并且同时设置在来自样本42的响应光的光路上。在这种情况下，调制光学部件38被设置成，使来自样本42的响应光(例如，荧光)透射。这种构造也适用于使用单色照明光的情况。另外，在图7和图8所示构造中，调制光学部件38可以设置在检电扫描器单元63的光瞳共轭面上。由此，并不生成因扫描而造成的光通量渐晕(vignetting)，使得总是能够稳定地形成期望的光斑图案。
另外，在上述实施方式中，调制光学部件38还可以被设置成，具有如图1所示围绕光轴按2π旋转的、径向划分的多个光学多层区。在这种情况下，可以通过单独或集成调节部件来调节调制光学部件38的制造误差。
例如，假定如图17(a)所示，将调制光学部件38围绕光轴划分成了6个光学多层区38a-38f，并且光学多层区38c和38d的尺度与其它光学多层区的尺度不同。在这种情况下，光学多层区38a、38c的透射率通过调节部件来调节，以满足公式(1)，如图17(b)所示。
另外，可能存在这样的情况，利用符合图18(a)所示设计值制造的调制光学部件38，公式(1)因在显微光学系统的另一部分中生成的消除光等的吸收效应而不能满足。在这种情况下，如图18(b)所示，例如，通过调节部件来调节光学多层区38b、38c、38d的透射率，而通过调节部件来调节光学多层区38e、38f的相位和透射率，以便满足公式(1)。在利用图17(b)和图18(b)所示的调制光学部件38方面，光阑37可以省略或者被用于在已透射过调制光学部件38之后精细地调节消除光的特性。
另外，根据第三实施方式的构造不仅可应用于荧光抑制型超高分辨率显微镜，而且可应用于用于同轴地照射红外光和中空可见光的红外超高分辨率显微术(例如，Bokor等人的OPTICS COMMUNICATIONS，283(2010)509)。而且，根据第三实施方式，还可以利用诸如光参量发射的激光束源、Ti蓝宝石激光、超激光(supercontinuum laser)等的至少两个可调激光器代替多个单色激光束源地来设置，以便处理多种波长组合。
而且，尽管在上述实施方式中以采用双色光源的超高分辨率显微镜为证进行了说明，但本发明还可应用于采用三色或更多色光源的显微系统(例如，SHell等人的J.Microscopy 236(2009)35)，并由此更加通用。
标号列表
1     调制光学部件
2     透射率补偿片
10    调制光学部件
11    中央区
20    菲涅耳波带片
21    透射率补偿片
31    泵浦光源
32    消除光源
34    反射镜
35    二向色镜
37    光阑
38    调制光学部件
39    分束器
40    显微镜物镜
41    样本台
42    样本
43    分光镜
44    光检测器
50    调制光学部件
60    会聚透镜
61    单模光纤
62    准直器透镜
63    检电扫描单元
64    光瞳投影透镜
  71、72、73、74、75    激光束源
  86、91    旋转ND滤波器
  92、93    声光波长可调滤波器
  96        共焦针孔
  97        滤波器单元
  101、102  旋转滤波器
  11x、112y 驱动单元
  112       控制单元

Claims (18)

1.一种显微镜，该显微镜包括：
调制光学元件，该调制光学元件具有用于对照明光进行空间调制的多个区域；以及
调节元件，该调节元件用于调节由所述调制光学元件进行了调制的照明光的光学特性。
2.根据权利要求1所述的显微镜，其中，所述调节元件对已经通过了所述调制光学元件的照明光进行调节，使得光轴周围的透射率和相位中的至少一方的非对称分量在所述调制光学元件的所述多个区域之间抵消。
3.根据权利要求1所述的显微镜，其中，假设Si表示由所述调制光学元件空间调制的照明光的光瞳面上的与所述多个区域相对应的各个区域i的尺寸，θi表示通过了区域i的光的相位，Ti表示透射率，Ui表示能量密度，则所述调节元件按满足以下关系式的方式进行调节
Σ i = 1 n T i S i sin θ i = Σ i = 1 n U i = 0 .
4.根据权利要求1所述的显微镜，其中，所述调节元件一体地形成在所述调节光学元件中。
5.根据权利要求1所述的显微镜，其中，作为所述多个区域，所述调制光学元件包括绕光轴径向划分的多个区域。
6.根据权利要求5所述的显微镜，其中，假设对于所述调制光学元件的所述多个区域，区域a具有透射率Ta、尺寸Sa和相位θa，而隔着所述光轴与区域a相对的区域b具有透射率Tb、尺寸Sb和相位θb，则满足下面的等式，
TaSasinθa+TbSbsinθb＝0。
7.根据权利要求6所述的显微镜，其中，所述区域a和所述区域b具有相同尺寸。
8.根据权利要求1所述的显微镜，其中，作为所述多个区域，所述调制光学元件包括同心划分的多个区域。
9.根据权利要求1所述的显微镜，其中，
所述照明光具有第一照明光和第二照明光，所述第一照明光通过将具有至少两个激发量子态的材料从稳定态激发至第一量子态而使该材料发光，所述第二照明光通过使所述材料进一步跃迁至另一量子态而抑制发光；
所述显微镜还包括照明光学系统，该照明光学系统包括物镜，该物镜通过局部地使得所述第一照明光和所述第二照明光交叠来将这些光会聚在包括所述材料的试样上；并且
所述调制光学元件和所述调节元件设置在所述照明光学系统中。
10.根据权利要求9所述的显微镜，其中，所述调制光学元件调制所述第二照明光的相位。
11.根据权利要求10所述的显微镜，其中，所述调制光学元件使所述第一照明光透射，而不改变电场的符号。
12.根据权利要求11所述的显微镜，其中，所述调制光学元件具有光学多层。
13.根据权利要求9所述的显微镜，其中，所述照明光学系统按空间匹配方式交叠所述第一照明光的光轴和所述第二照明光的光轴。
14.根据权利要求13所述的显微镜，其中，
所述照明光学系统具有单模光纤；并且
所述第一照明光和所述第二照明光经由所述单模光纤入射在所述调制光学元件和所述调节元件上。
15.根据权利要求9所述的显微镜，其中，所述调节元件包括用于调节所述照明光的光通量的直径的光阑。
16.根据权利要求15所述的显微镜，其中，所述光阑能够在与进入的照明光的光轴正交的方向上移动。
17.根据权利要求9所述的显微镜，该显微镜包括多个照明光源，这些照明光源能够产生至少三种波长的照明光，其中，
从所述多个照明光源同时产生所述第一照明光和所述第二照明光。
18.根据权利要求17所述的显微镜，该显微镜包括：
光检测器，该光检测器检测所述试样在被来自所述照明光学系统的所述第一照明光和所述第二照明光照射时发出的光；
共焦针孔，该共焦针孔具有尺寸可变的孔径，设置在所述光检测器的入射侧的与所述物镜的焦点位置共轭的位置处；
驱动单元，该驱动单元改变所述共焦针孔的所述孔径的尺寸；以及
控制单元，该控制单元通过控制所述多个照明光源来同时产生所述第一照明光和所述第二照明光，并且还根据所述第一照明光和所述第二照明光，经由所述驱动单元控制所述共焦针孔的所述孔径，以满足下式
0.61 λ p NA M > a ≥ 0.49 ϵ e τ σ dip C e 0 λ e NA M
NA：物镜的数值孔径
M：光检测器在物侧会聚像的倍率
λp：第一照明光的波长
λe：第二照明光的波长
σdip：荧光抑制截面积
Ce0：第二照明光的峰值强度
εe：第二照明光的光子通量。
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