JP2001272345A

JP2001272345A - 二重共鳴吸収顕微鏡

Info

Publication number: JP2001272345A
Application number: JP2000082898A
Authority: JP
Inventors: Yoshinori Iketaki; 慶記池滝; Masaaki Fujii; 正明藤井; Takashige Omatsu; 尾松　　孝茂; Taku Sato; 卓佐藤
Original assignee: Nippon Roper Co Ltd; Japan Science and Technology Corp; Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; Olympus Corp; Nippon Roper Co Ltd
Priority date: 2000-03-23
Filing date: 2000-03-23
Publication date: 2001-10-05
Anticipated expiration: 2020-03-23
Also published as: JP4614495B2

Abstract

(57)【要約】【課題】超解像性に理想的な中空イレース光を発生さ
せることのできる、新しい二重共鳴吸収顕微鏡を提供す
る。【解決手段】ポンプ光光源とイレース光光源と重ね手
段とを備えており、重ね手段を介してポンプ光およびイ
レース光を試料に照射することにより、第一電子励起状
態の試料分子が基底状態へ脱励起する際の発光領域を一
部分抑制する二重共鳴吸収顕微鏡において、集光レンズ
（１０１）およびコリメートレンズ（１０３）とその間
に設けられたピンホール（１０２）とを有し、イレース
光を集光レンズ（１０１）によりピンホール（１０２）
に集光し、且つピンホール（１０２）を通過したイレー
ス光のみをコリメートレンズ（１０３）により平行光に
コリメートする空間フィルター（１００）が、イレース
光の光路に備えられている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、二重共鳴
吸収過程を用いて超解像性を実現する二重共鳴吸収顕微
鏡に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、レーザー技術や電子画像技術をは
じめとする周辺技術の進歩にともない、様々なタイプの
高性能かつ多機能な顕微鏡が開発されてきている。本願
発明の発明者も、その一つとして、複数波長の光を試料
に照明することによって発生する二重共鳴吸収過程を用
いて、得られる画像のコントラスト制御および試料の化
学分析を可能とする顕微鏡（以下、二重共鳴吸収顕微鏡
と呼ぶ）をすでに提案している（特願平６−３２９１６
５参照）。

【０００３】この二重共鳴吸収顕微鏡では、二重共鳴吸
収過程を用いて特定の分子を選択し、特定の光学遷移に
起因する吸収および蛍光を観測することができる。その
原理を説明すると、まず、基底状態（Ｓ₀状態：図１）
の試料分子（つまり、試料を構成する分子）が持つ価電
子軌道の電子を、レーザー光などの共鳴波長λ₁光によ
り第一電子励起状態へ励起させ（Ｓ₁状態：図２）、続
いて共鳴波長λ₂光により第二電子励起状態またはさら
に高位の励起状態へ励起させる（Ｓ₂状態：図３）。分
子は、この励起状態から蛍光あるいは燐光を発光したり
して基底状態に戻る（図４）。そして、図２に示した吸
収や図４に示した蛍光や燐光の発光を用いて吸収像や発
光像を観察する。

【０００４】Ｓ₁状態への励起過程においては、単位体
積内のＳ₁状態の分子数は照射する光の強度が増加する
にしたがって増加する。線吸収係数は、分子一個当たり
の吸収断面積と単位体積当たりの分子数の積で与えられ
るので、Ｓ₂状態への励起過程においては続いて照射す
る共鳴波長λ₂に対する線吸収係数は最初に照射した共
鳴波長λ₁の光の強度に依存する。すなわち、共鳴波長
λ₂（以下、波長λ₂と略称）に対する線吸収係数は共鳴
波長λ₁（以下、波長λ₁と略称）の光の強度で制御でき
る。このことは、波長λ₁および波長λ₂の２波長の光で
試料を照射し、波長λ₂による透過像を撮影すれば、透
過像のコントラストを波長λ₁の光で完全に制御できる
ことを示している。また、Ｓ₂状態からの蛍光または燐
光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強
度はＳ₁状態にある分子数に比例する。したがって、蛍
光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制
御が可能となる。

【０００５】また、この二重共鳴吸収顕微鏡は、コント
ラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。図１
に示される最外穀価電子軌道は個々の分子に固有なエネ
ルギー準位をもつので、波長λ₁は分子によって異な
る。同時に波長λ₂も分子固有のものとなる。単一波長
で照明・観察を行う従来の顕微鏡においても、ある程度
は特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが
可能ではあるが、一般にはいくつかの分子の吸収帯の波
長領域は重複するため、試料の化学組成の正確な同定ま
では不可能である。これに対し、二重共鳴吸収顕微鏡で
は波長λ₁および波長λ₂の２波長により吸収あるいは発
光する分子を限定するので、従来技術よりも正確な試料
の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起す
る場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルを持つ光の
みが強く吸収されるので、波長λ₁および波長λ₂の偏光
方向を決めて、吸収像または蛍光像を撮影すれば、同じ
分子でも配向方向の同定をも行うことができる。

【０００６】本願発明の発明者はさらに、回折限界を越
える高い空間分解能の二重共鳴吸収顕微鏡をも提案して
いる（特願平８−３０２２３２参照）。二重共鳴吸収過
程については、図５に例示したようにＳ₂状態からの蛍
光が極めて弱くなるある種の分子が存在する。このよう
な光学的性質を持つ分子に対しては、以下のような極め
て興味深い現象が起きる。図６は、図５と同じく二重共
鳴吸収過程の概念図であるが、横紬にＸ軸を設けて空間
的距離の広がりを表現しており、波長λ₁光および波長
λ₂光が照射されている空間領域Ａ₁（＝蛍光抑制領域）
と、波長λ₁光のみが照射されて波長λ₂光が照射されて
いない空間領域Ａ₀（＝蛍光領域）について示してい
る。空間領域Ａ₀では波長λ₁光による励起によってＳ₁
状態の分子が多数生成される。このとき空間領域Ａ₀か
らは波長λ₃で発光する蛍光が見られる。しかし空間領
域Ａ₁では、波長λ₂光が照射されるので、Ｓ₁状態の分
子が即座に高位のＳ₂状態へと励起され、Ｓ₁状態の分子
は存在しなくなる。このため空間領域Ａ₁においては、
波長λ₃の蛍光は全く発生せず、しかもＳ₂状態からの蛍
光はもともとないので、完全に蛍光自体が抑制されるこ
ととなる。すなわち蛍光が発生するのは空間領域Ａ₀の
みとなる。このような現象の発生が数種類の分子におい
て確認されている。

【０００７】したがって、従来の走査型レーザー顕微鏡
などでは、レーザー光を集光して観察試料上に形成され
るマイクロビームのサイズが集光レンズの開口数と波長
による回折限界で決まるので、それ以上の空間分解能が
原理的に期待できないにの対し、図６で示した現象によ
れば波長λ₁光と波長λ₂光を空間的に一部分重ね合わせ
ることで、波長λ₂光の照射で蛍光領域が抑制されるた
め、たとえば波長λ₁光の照射領域に着目すると、蛍光
領域は集光レンズの開口数と波長とで決まるビームのサ
イズよりも狭くなっており、実質的に空間分解能の向上
が図られている。本願発明者による二重共鳴吸収顕微鏡
（特願平８−３０２２３２参照）は、この原理を用い
て、回折限界を越える超解像顕微鏡を実現しているので
ある。

【０００８】そして本願発明の発明者は、この二重共鳴
吸収顕微鏡の超解像性をさらに高めるべく、その機能を
十分に活かすための試料の調整や波長λ₁光・波長λ₂光
の試料への照射タイミングなどをもすでに提案している
（特願平９−２５５４４４参照）。より具体的には、試
料を染色分子により染色する。この染色分子として、基
底状態を含め少なくとも３つの量子状態（Ｓ₀状態，Ｓ₁
状態，Ｓ₂状態・・・）を有し、且つＳ₁状態を除く高位
の量子状態から基底状態へ脱励起するときの遷移におい
て蛍光による緩和過程よりも熱緩和過程が支配的である
各種分子（以下、蛍光ラベラー分子と呼ぶ）を用いるの
である。このような蛍光ラベラー分子と生化学的な染色
技術を施した生体分子とを化学結合させてなる試料に、
波長λ ₁光を照射して蛍光ラベラー分子をＳ₁状態に励起
させ、続いて即座に波長λ₂光を照射して蛍光ラベラー
分子をより高位の量子準位に励起させることで、Ｓ₁状
態からの蛍光を効果的に抑制できるようになる。この際
に、上述したような空間的な蛍光領域の人為的な抑制を
行うことにより、空間分解能のさらなる向上が実現され
る。

【０００９】上記の蛍光ラベラー分子の光学的性質は、
以下のように量子化学的な見地から説明できる。一般
に、分子はそれを構成する各原子のσまたはπ結合によ
って結ばれている。言い換えると、分子の分子軌道はσ
分子軌道またはπ分子軌道をもっていて、これらの分子
軌道に存在する電子が各原子を結合する重要な役割を担
っている。そのなかでも、σ分子軌道の電子は、各原子
を強く結合し、分子の骨格である分子内の原子間距離を
決める。これに対して、π分子軌道の電子は、各原子の
結合にほとんど寄与しないで、むしろ分子全体に極めて
弱い力で束縛される。

【００１０】多くの場合、σ分子軌道にいる電子を光で
励起させると、分子の原子間隔が大きく変化し、分子の
解離を含む大きな構造変化が起こる。その結果として、
原子の運動エネルギーや構造変化するために光が分子に
与えたエネルギーのほとんどが熱エネルギーに形を変え
る。したがって、励起エネルギーは蛍光という光の形態
で消費されない。また、分子の構造変化は極めて高速に
おこるので（たとえばピコ秒より短い）、その過程で仮
に蛍光が起きても極めて蛍光寿命が短い。しかしそれに
対して、π分子軌道の電子が励起しても、分子の構造自
体はほとんど変化せず、高位の量子的な離散準位に長時
間とどまり、ナノ秒のオーダーで蛍光を放出して脱励起
する性質を持つ。

【００１１】量子化学よれば、分子がπ分子軌道を持つ
ことと、二重結合を持つこととは同等であり、用いる蛍
光ラベラー分子には、二重結合を豊富に持つ分子を選定
することが必要条件となる。そして、二重結合を持つ分
子でもベンゼンやビラジンなどの６員環分子において
は、Ｓ２状態からの蛍光が極めて弱いことが確かめられ
ている（例えば、M..Fujii et.al., Chem. Phys. Lett.
171 (1990) 341）。したがって、ベンゼンやビラジン
などの６員環分子を含む分子を蛍光ラベラー分子として
選定すればＳ１状態からの蛍光寿命が長くなり、しかも
光照射によりＳ₁状態からＳ₂状態に励起させることで分
子からの蛍光を容易に抑制でき、上述の二重共鳴吸収顕
微鏡の超解像性を効果的に利用することができるように
なる。

【００１２】すなわち、これらの蛍光ラベラー分子によ
り試料を染色して観察を行えば、高空間分解能の蛍光像
を取得することができるだけでなく、その蛍光ラベラー
分子の側鎖の化学基を調整することにより生体試料の特
定の化学組織のみを選択的に染色でき、試料の詳細な化
学組成までも分析可能となる。

【００１３】一般に、二重共鳴吸収過程は二つの光の波
長や偏光状態等が特定の条件を満たす場合のみに起こる
ので、これを用いることで非常に詳細な分子の構造を知
ることが可能となる。すなわち、光の偏光方向と分子の
配向方向とは強い相関関係があり、二波長光それぞれの
偏光方向と分子の配向方向とが特定の角度をなすとき二
重共鳴吸収過程が強く起こる。したがって、二波長光を
試料に照射して、各光の偏光方向を回転することによ
り、蛍光の消失の程度が変化するので、その様子から観
察しようとする組織の空間配向の情報も得られる。さら
に、二つの波長の光を調整させることでもこのことが可
能である。

【００１４】他方、波長λ₁光と波長λ₂光の照射タイミ
ングを適当なものに調整することにより（特願平９−２
５５４４４参照）、蛍光像のＳ／Ｎを改善し、且つ蛍光
抑制をさらに効果的に起こすことも可能となっている。

【００１５】また、本願発明の発明者により、波長λ₁
光と波長λ₂光の照射タイミングのさらなる工夫によ
り、Ｓ／Ｎおよび蛍光抑制のさらなる向上を実現するこ
とも提案されている（特願平１０―９７９２４参照）と
ころで、前述した波長λ₁光の照射領域の一部分への波
長λ₂光の照射領域の重ね合わせは、波長λ₂光を中空ビ
ーム化して、つまり中央部（軸近傍領域）がゼロ強度で
あり、且つ軸対象な強度分布を有する中空ビーム光にし
て、波長λ₁光の一部分と空間的に重ね合わせ、試料上
に集光することで実現できる。図７は、この重合せおよ
びそれによる蛍光抑制を例示した概念図である。波長λ
₂光は、図８にも例示したような位相板により中空ビー
ム化されており、この中空ビーム化された波長λ₂光と
波長λ₁光の重ね合わせにより、波長λ₂光の強度がゼロ
となる光軸近傍の領域以外では蛍光は抑制され、波長λ
₁光の広がりよりも狭い領域に存在する蛍光ラベラー分
子（または試料分子）の蛍光のみが観察される。その結
果、超解像性が発現する。

【００１６】図８の位相板は、波長λ₂光にその光軸を
中心対象としてπだけ位相差を与えるものである。この
位相板に波長λ₂光を通すことで、波長λ₂光の光軸近傍
領域（光軸を含む）の位相が反転するため、その光軸近
傍領域の電場強度はゼロとなり、蛍光抑制による超解像
性の発現に理想的な中空ビーム形状をもつ波長λ₂光が
得られるのである。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】さて、以上のように本
願発明の発明者によってこれまで開発されてきた二重共
鳴吸収顕微鏡は、その超解像性と分析能力において際立
った有用性と技術的優位性を示しているものの、未だに
以下に示すような改良すべき点が残されているのが実情
である。なおここからは、試料分子（＝試料を構成する
分子）をＳ₀状態からＳ₁状態へ励起させる波長λ₁光を
ポンプ光、Ｓ₁状態の分子をＳ₂状態へ励起させる波長λ
₂光をイレース光と呼び、中空ビーム形状を有するイレ
ース光を中空イレース光と呼ぶこととする。また、Ｓ₀
状態からＳ₁状態への励起はＳ₀→Ｓ₁励起、Ｓ₁状態から
Ｓ₂状態への励起はＳ₁→Ｓ₂励起と略称する。また、超
解像性の実現をより効果的なものとすべく、蛍光ラベラ
ー分子を用いて試料を染色する場合には、試料分子とは
この蛍光ラベラー分子のこととなる。

【００１８】二重共鳴吸収顕微鏡において、ポンプ光お
よびイレース光の照射領域の一部重合せによる蛍光領域
の抑制によって理論通りの超解像度を実現するために
は、中空イレース光が期待どおりの中空ビーム形状とな
っている必要がある。この中空ビーム形状の乱れ、つま
り強度分布の乱れはそのまま顕微鏡画像の劣化を招いて
しまう。

【００１９】イレース光の光源としてはレーザーがしば
しば用いられるが、光源からのイレース光を期待通りの
中空ビームに成形するためには、その大前提としてレー
ザ光のビームプロファイルが整っている必要がある。す
なわち、ビームの強度分布が光軸軸対称であることが必
要となる。しかしながら、たとえば色素レーザーでは、
そのビーム形状が三角形に近く、強度分布も一様でない
ことから、期待する中空ビームを得ることが難しい場合
がある。このため、試料上で集光したビーム形状が崩れ
たビームパターンとなり、顕微鏡画像の解像度劣化や画
質低下の原因となっている。

【００２０】また、輪帯アパーチャーを介して中空イレ
ース光を取得することが提案されてはいる。しかしなが
ら、輪体アパーチャーを利用すると、光紬合わせや焦点
合わせなどが難しく、良好な画像を得るまでの調整時間
や手間が非常に多くなり、且つそのための熟達技能も必
要となる。実用上好ましいものではない。

【００２１】さらにまた、中空イレース光として理想的
なビームプロファイルを持つ一次のベッセルビームも提
案されてはいる。一次ベッセルビームは、たとえば図９
に例示したように、光紬を中心にして１周すると位相が
２π変化する。理論上は、光軸に関して軸対称な点では
お互いの位相がπずれることから、軸上では電場が完全
に相殺されてゼロとなる。しかしながら、実際にはレー
ザー光は、そのビーム面内で完全に位相面が揃っている
わけではなく、ビーム中央部から外れるに従って位相面
が乱れてくるため、一次ベッセルビームを形成する際、
この位相面の乱れに起因して、電場の相殺が不完全とな
り、ビーム中央部の強度が完全にゼロとならない不完全
な一次ベッセルビームができてしまう。これでは二重共
鳴吸収顕微鏡にとって理想的な中空イレース光とはいえ
ない。

【００２２】この出願の発明は、以上のとおりの事情に
鑑みてなされたものであり、従来の二重共鳴吸収顕微鏡
を改良し、超解像性に理想的な中空イレース光を発生さ
せることのできる、新しい二重共鳴吸収顕微鏡を提供す
ることを課題としている。

【００２３】

【課題を解決する手段】この出願の発明は、上記の課題
を解決するものとして、試料分子を基底状態から第一電
子励起状態へ励起させる波長λ₁のポンプ光の光源と、
第一電子励起状態の試料分子を第二電子励起状態または
より高い励起状態へ励起させる波長λ₂のイレース光の
光源と、ポンプ光およびイレース光の照射領域を一部分
重ね合わせる重ね手段とを備えており、重ね手段を介し
てポンプ光およびイレース光を試料に照射することによ
り、第一電子励起状態の試料分子が基底状態へ脱励起す
る際の発光領域を一部分抑制する二重共鳴吸収顕微鏡に
おいて、集光レンズおよびコリメートレンズとその間に
設けられたピンホールとを有し、イレース光を集光レン
ズによりピンホールに集光し、且つピンホールを通過し
たイレース光のみをコリメートレンズにより平行光にコ
リメートする空間フィルターが、イレース光の光路に備
えられていることを特徴とする二重共鳴吸収顕微鏡（請
求項１）を提供する。

【００２４】また、この二重共鳴吸収顕微鏡において、
ピンホールの半径ａが、

【００２５】

【数３】

【００２６】の条件または

【００２７】

【数４】

【００２８】の条件を満たしていること（請求項２）
や、空間フィルターを通過したイレース光にその光軸を
中心としてπだけ位相差を与える位相変調素子が備えら
れていること（請求項３）や、ビーム領域限定手段を通
過した後のイレース光に、その光軸を中心としてπだけ
位相差を与える位相変調素子が備えられていること（請
求項４）や、位相変調素子は、イレース光に対して透明
かつオプティカルフラットな平行基板の上に、イレース
光に光軸を中心としてπだけ位相差を与え得る厚み分布
を持つ光学薄膜が被膜されてなること（請求項５）や、
位相変調素子は、イレース光に対して透明かつオプティ
カルフラットな平行基板に、イレース光に光軸を中心と
してπだけ位相差を与え得るエッチングが施されてなる
こと（請求項６）や、試料は、基底状態を含め少なくと
も三つの電子状態を有する蛍光ラベラー分子により染色
されており、前記試料分子はこの蛍光ラベラー分子であ
ること（請求項７）をその態様として提供する。

【００２９】

【発明の実施の形態】この出願の発明は上記のとおりの
特徴を持つものであり、ポンプ光光源、イレース光光
源、および重ね手段を基本構成として備え持つ二重共鳴
吸収顕微鏡において、超解像性をより効果的に発現させ
るべく、空間フィルターを用いてイレース光の中空ビー
ム化について改善している。

【００３０】図１０は、この空間フィルター（１００）
の一例を示した概略図である。この図１０に例示したよ
うに、空間フィルター（１００）は、集光レンズ（１０
１）およびコリメートレンズ（１０３）とその間に設け
られたピンホール（１０２）とを有しており、入射した
イレース光を集光レンズ（１０１）で集光して、ピンホ
ール（１０２）を照明した後、ピンホール（１０２）を
通過したイレース光をコリメートレンズ（１０３）によ
り平行光にコリメートするように構成されている。この
場合、位相が乱れた、すなわち波面が乱れたレーザー光
はピンホール（１０２）を通過できず、結果的に波面の
揃ったレーザー光のみがピンホール（１０２）を通過す
ることになる。

【００３１】この原理を図１１を用いて説明する。図１
１は、半径ｈの入射ビームを、焦点距離ｆのレンズによ
りその焦平面に置かれた半径ａのピンホールに照射した
場合を例示したものである。

【００３２】まず、たとえば、レンズ位置（あるいは瞳
位置）ξ₁で点光源とする波面を考える。点ξ₁からピン
ホールの縁Ｚ_u（点ξ₁に近い側）までの光路長ｌ_1uは、
光路の屈折率をｎとして、次式で与えられる。

【００３３】

【数５】

【００３４】また、点ξ₁からピンホールの縁Ｚ_d（点ξ
₁に遠い側）までの光路長ｌ_1dは、同様に次式で与えら
れる。

【００３５】

【数６】

【００３６】したがって、これらの光路差Δ_lは、次式
で与えられる。

【００３７】

【数７】

【００３８】この数７をテーラー展開して、１までの微
小量をとると、

【００３９】

【数８】

【００４０】となる。このΔ₁が、点ξ₁から出た光がピ
ンホールを通り抜けたときの波面の最大のズレを表す。
このとき、光の波長をλとすると、位相差δ₁は、

【００４１】

【数９】

【００４２】で与えられる。これは、波面収差であり、
これ以上の位相差がでるものはピンホールを通る抜ける
ことができないということを示している。

【００４３】また、光軸上の点ξ₀からピンホールの縁
Ｚ_uまでの光路長ｌ_0uは、次式で与えられる。

【００４４】

【数１０】

【００４５】この場合、最大の位相差は光軸上を通る光
との光路差であるから、同様な計算をすると、位相差δ
₀は、

【００４６】

【数１１】

【００４７】である。すなわち、図１１のようなレーザ
ービームがピンホールを通り抜けるとき、各瞳面におい
て発した光が持つ最大位相差はδ₁〜δ₀の間の値をと
り、結果として全ビームがピンホールを通る時には、δ
₁以下の位相差をもって通過することになる。したがっ
て、仮にレーザービームの波面が乱れていても、図１０
に例示した空間フィルター（１００）を設けることで、
δ₁以下の位相ズレを持つレーザー光だけを通すことが
できる。

【００４８】このことを二重共鳴吸収顕微鏡における中
空イレース光の形成の場合で説明すると、中空イレース
光として、光軸近傍領域で電場強度がゼロとなる一次ベ
ッセルビームを、図８に例示した位相板を用いて形成す
る場合、少なくとも位相板に入射されるイレース光の位
相差が光軸に関して対称な位置でπ／２でないと、光軸
で電場強度が相殺せず、良好な中空ビーム形状とならな
い。しかし、図１０の空間フィルター（１００）をイレ
ース光（波長λ₂）の光路上に設ければ、イレース光の
位相差をδ₁以下にすることができる。具体的には、

【００４９】

【数１２】

【００５０】の条件を満たす位相板を利用すれば、イレ
ース光の位相差が光軸に関して対称な位置で電場強度の
符号が反転し、光軸上で電場強度が弱くなる。すなわ
ち、超解像性を実現できる最低限のビームプロファイル
を持った中空イレース光を発生することができる。数１
２を変形して、空間フィルター（１００）を構成するピ
ンホール（１０２）についての条件とすると、

【００５１】

【数１３】

【００５２】となる。これは、ピンホール（１０２）の
サイズを与える条件である。さらに、この数１３を、イ
レース光のビーム径すなわち瞳面で制限される実効的な
開口数ＮＡで書けば、次式が得られる。

【００５３】

【数１４】

【００５４】したがって、この発明の二重共鳴吸収顕微
鏡における空間フィルター（１００）には、数１３ある
いは数１４で与えられる条件を満たすピンホール（１０
２）を用いることが好ましく、この空間フィルター（１
００）を通すことによって、位相差δ₁以下のビームプ
ロファイルのイレース光のみを取り出すことができ、こ
のイレース光をもって超解像性の発現に好適な中空イレ
ース光を位相板を介して生成できるようになる。

【００５５】なお、数１３および数１４は、ピンホール
（１０２）の条件ではあるが、集光レンズの焦点距離ｆ
や開口数ＮＡなどの数値をも用いているので、ピンホー
ル（１０２）と集光レンズ（１０１）との条件、あるい
は空間フィルター（１００）自体の条件とも言うことが
できる。

【００５６】この出願の発明は、以上のとおりの特徴を
持つものであるが、以下に実施例を示し、さらに具体的
に説明する。

【００５７】

【実施例】図１２は、この発明の二重共鳴吸収顕微鏡の
一実施例を示した概略図である。この図１２に例示した
二重共鳴吸収顕微鏡は、レーザー走査型蛍光顕微鏡を構
成しており、ポンプ光およびイレース光を集光してスポ
ット化し、試料（５２３）をそのスポットと相対的に走
査させながら蛍光を検出し、蛍光信号をコンピュータ
（５０１）を用いて画像化するシステムとなっている。

【００５８】このシステム全体は、コンピュータ（５０
１）により制御される。コンピュータ（５０１）は、レ
ーザーコントローラー（５０２）を介して、基本光源で
あるＮｄ：ＹＡＧレーザー（５０５）の発振のタイミン
グを制御する。それと同時に、試料ステージコントロー
ラー（５０３）を介して、試料ステージ（５２４）の移
動をレーザー発振のタイミングと同期させながら制御
し、試料（５２３）を二次元走査する。また、同様にレ
ーザー発振と同期させてカメラコントローラー（５０
４）を介して、ＩＣＣＤカメラ（５４０）から試料（５
２３）の蛍光信号を取得する。

【００５９】本実施例では、試料（５２３）は蛍光ラベ
ラー分子により染色されたものとし、その蛍光ラベラー
分子としてはローダミン系分子を想定する。図１３は、
ローダミン系分子の一つであるローダミン６Ｇの分光デ
ータを例示したものである。この図１３に例示したよう
に、Ｓ₀→Ｓ₁励起に相当する吸収バンドが５３０ｎｍ前
後に存在し、Ｓ₁→Ｓ₂励起および蛍光発光帯域が６００
ｎｍ前後に存在する。したがって、波長λ₁＝５３２ｎ
ｍのポンプ光でＳ₀→Ｓ₁励起させ、波長λ₂＝５９９ｎ
ｍのイレース光でＳ₁→Ｓ₂励起させることで、二重共鳴
吸収過程と誘導放出過程により、５９９ｎｍ以外の波長
の蛍光は消失する。

【００６０】波長５３２ｎｍ光は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザ
ー（５０５）の基本波（波長１０６４ｎｍ）をＢＢＯ結
晶やＫＴＰ結晶などからなる波長変調素子（５０７）に
より２倍波変調することで生成できる。波長５９９ｎｍ
光は、Ｂａ（ＮＯ₃）₂等のラマンシフター（５１２）で
波長５３２ｎｍを５９９ｎｍに変換することで生成でき
る。波長変調素子（５０７）からの波長５３２ｎｍ光
は、ハーフミラー（５０８）により分光され、その透過
光は、テレスコープ（５０９）により適正サイズの平行
光に拡大されて、ポンプ光として利用される。他方、反
射光は、ラマンシフター（５１２）によって波長５９９
ｎｍ光に変調されて、イレース光として利用される。

【００６１】一般にＮｄ：ＹＡＧレーザー（５０５）
は、共振器にガウシアンミラーを用いているため、ビー
ムの光軸近傍の中央部の波面は比較的揃っているが、ビ
ーム周縁部は波面の乱れが多くなり、中央部と比較する
と位相差が生じる。この波面すなわち位相面の歪みのた
めに、レーザービームの全径を利用して中空イレース光
としての一次ベッセルビームを形成しようとすると、超
解像性の実現に良好な中空ビームとならない。

【００６２】そこで、本実施例では、前述した空間フィ
ルター（１００）を、ラマンシフター（５１２）後のイ
レース光の光路上に設けており、この空間フィルター
（１００）を通過させて、波面の乱れを少なくともλ₂
／４以下に抑制したビームプロファイルのイレース光の
みを取り出すことができる。具体的には、まず、ラマン
シフター（５１２）から出力されるイレース光のビーム
径を２ｍｍとして、焦点距離ｆ＝５０ｃｍの集光レンズ
（１０１）でピンホール（１０２）に集光する。この場
合、イレース光の光路の屈折率ｎ、つまり空気の屈折率
ｎを１．０として、前記数１３によりピンホール（１０
２）の半径ａを求めると、半径ａ＝３８μｍとなる。こ
のピンホール（１０２）を通過したイレース光は、集光
レンズ（１０１）と同じ焦点距離ｆを持つコリメータレ
ンズ（１０３）により２ｍｍのビーム径に戻される。

【００６３】このようにして得られた良好なビームプロ
ファイルのイレース光から、完全な一次ベッセルビーム
を生成することができる。具体的には、空間フィルター
（１００）を出たイレース光は、テレスコープ（５１
３）で適正サイズの平行光に拡大された後、位相板（５
１４）によって一次ベッセルビームとなる。

【００６４】本実施例では、イレース光の波長λ₂は５
９９ｎｍであるので、位相板（５１４）として、図１４
に例示したようにガラス基板をエッチングしたものを利
用した。ガラスの屈折率は１．４６（波長５９９ｎｍ）
であるため、イレース光の１／４波長はガラス基板の厚
み３２５．５ｎｍに対応する。したがって、図１４に例
示したように、位相板（５１４）の領域を4分割し、隣
接する各領域で位相差が１／４波長ずつになるように厚
さを設定してエッチングしておけば、イレース光を理想
的に中空ビーム化させることができる。すなわち、イレ
ース光を、その光軸と位相板（５１４）の中心とを一致
させるようにして位相板（５１４）を通過させること
で、位相板（５１４）の中心部分で対向した各領域を通
るイレース光の光軸付近領域の位相が反転するため、そ
の光軸付近領域の電場強度はゼロとなる。これにより、
蛍光抑制による超解像性の発現に理想的な中空ビーム形
状をもつイレース光が得られるのである。このように中
空ビーム化されたイレース光は、一次ベッセルビームと
なっている。

【００６５】なお、位相板（５１４）としては、エッチ
ングの代わりに弗化マグネシウム等の薄膜を位相差を与
えるものとして基板上に蒸著したものを用いてもよい。
また、理想的な中空ビーム・イレース光が得られる限
り、ラマンシフター（５１２）、テレスコープ（５１
３）、位相板（５１４）の順序は変更してもよいことは
言うまでもない。

【００６６】ポンプ光および中空ビーム化されたイレー
ス光は、各々、反射ミラー（５１０）および反射ミラー
（５１５）を介してビームコンバイナー（５１１）に入
射され、同軸光となる。もちろん両光はテレスコープ
（５０９）（５１３）によって同一サイズとされてい
る。同軸光とされたポンプ光およびイレース光は、一種
のテレスコープ光学系であるビームリデューサー（５２
０）によって、集光対物レンズ（５２２）の開口一杯に
両光を取り込むべく、集光対物レンズ（５２２）の口径
と等しいサイズに調整される。そして、集光対物レンズ
（５２２）により試料（５２３）面上に集光される。

【００６７】また、本実施例では、ポンプ光とイレース
光の試料面への到達時刻を調整するため、イレース光の
光路長を調整できるようになっている。具体的には、直
線移動ステージ（５１８）およびそれに搭載されたプリ
ズム（５１９）からなる遅延光学系が、反射ミラー（５
１６）による反射光路側に備えられている。テレスコー
プ（５１３）からのイレース光は、反射ミラー（５１
５）（５１６）を介して遅延光学系のプリズム（５１
９）に入射される。このとき、直線移動ステージ（５１
８）を、イレース光のポンプ光に対する遅延距離だけ移
動させ、プリズム（５１９）を介したイレース光の折り
返し距離を調整する。遅延距離は、到達時間差１ｎｓｅ
ｃに対して３０ｃｍとなる。この遅延距離は、たとえば
マイクロメーター等を用いて測定でき、その測定結果を
直線移動ステージ（５１８）の移動距離に反映させれば
よい。これにより、完全にポンプ光の照射時間がイレー
ス光のそれとオーバーラップする、蛍光抑制の発現に最
適な照射が可能となる。なお、ポンプ光の光源およびイ
レース光の光源として、独立したレーザー、たとえば二
台のＮｄ：ＹＡＧパルスレーザーを用いた場合には、時
間差を持つ二つのトリガーパルスを与えることにより、
独立に各光源のＱスイッチシグナルを電気的制御して
も、ポンプ光およびイレース光の試料（５２３）への到
達時刻を調整することできる。

【００６８】さて、このようにしてポンプ光およびイレ
ース光が試料（５２３）に照射されると、ポンプ光の照
射領域の一部に中空イレース光が重なっていることで、
両光が重なり合っている照射領域は蛍光抑制領域Ａ₁と
なり、中空イレース光の中空部分であるポンプ光のみの
照射領域は蛍光領域Ａ₀となり（図６参照)、この蛍光領
域Ａ₀（＝観察領域）のみからローダミン系分子の蛍光
が発生する。

【００６９】この蛍光は、再び集光対物レンズ（５２
２）を通過し、接眼レンズ（５３８）から分光器（５３
９）へ入射する。分光器（５３９）は、たとえば図１５
に例示したように、コリメータ球面鏡（５３９１）、フ
ォーカシング球面鏡（５３９２）、および機械的に切り
替え可能な回折格子（５３９３）を基本光学系として備
えている。入射スリット（５３９５）を通過した蛍光
は、反射ミラー（５３９４）でコリメータ球面鏡（５３
９１）に入射され、コリメータ球面鏡（５３９１）で回
折格子（５３９３）上へ集光される。そして、回折格子
（５３９３）上で波長分解された蛍光は、フォーカシン
グ球面鏡（５３９２）でＩＣＣＤカメラ（５４０）のＣ
ＣＤ素子上に結像される。

【００７０】このときのＩＣＣＤカメラ（５４０）で得
られる信号は、レーザー１ショット当りの蛍光スペクト
ルである。レーザー１ショットに同期させて試料ステー
ジ（５２４）を二次元移動させて、そのときの蛍光スペ
クトルをコンピュータ（５０１）により積算画像化する
ことで、試料（５２３）の二次元蛍光像を構築すること
ができる。また、蛍光信号にポンプ光およびイレース光
が混在してしまっている場合には、コンピュータ（５０
１）による画像生成において、ポンプ光およびイレース
光の波長成分の信号を取り除き、本来の蛍光波長成分の
みの信号を用いて画像化すれば、十分な超解像性が発現
し、且つ高いＳ／Ｎの蛍光像を得ることができる。

【００７１】また、超解像性をさらに向上すべく、分光
器（５３９）の前に、ポンプ光波長をカットするノッチ
フィルター（５３６）およびイレース光波長をカットす
るノッチフィルター（５３７）を挿入しておいてもよい
（図１５中では、分光器（５３９）への接眼レンズ（５
３８）の前に挿入されている）。これにより、分光器
（５３９）に入射する前にポンプ光およびイレース光を
蛍光信号から分離して、本来の蛍光成分のみをスペクト
ル分析することができ、蛍光信号のいわゆる純度を高
め、より効果的に超解像性を発現させることができる。
もちろん、ノッチフィルター（５３６）（５３７）以外
にも、必要に応じてバンドパスフィルターやシャープカ
ットフィルターを挿入し、蛍光ラベラー分子からの蛍光
以外の不要な波長成分をカットするようにしてもよい。

【００７２】なお、仮に分光器（５３９）の入射スリッ
ト（５３９５）を開いて、回折格子（５３９３）のゼロ
次光をＩＣＣＤカメラ（５４０）のＣＣＤ素子上に結像
すれば、試料（５２３）面からの蛍光像そのものとな
る。特にこの場合では、Ｓ／Ｎ向上のため、上記のノッ
チフィルター（５３６）（５３７）や、バンドパスフィ
ルターあるいはシャープカットフィルターを挿入してお
くことが好ましい。

【００７３】次に、本実施例の試料移動機構について説
明する。前記のようにコンピュータ制御される試料ステ
ージ（５２４）は、ＸＹＺφθ方向への５次元移動ステ
ージとなっている。

【００７４】まず、光軸方向であるＺ方向への移動に
は、たとえば、ピエゾ圧電素子の一種を用いたインチワ
ームステージ機構を用いることができ、ローターリーエ
ンコーダーでその絶対位置をモニターできるように構成
されていることが好ましい。

【００７５】一般に、開口数の大きい対物レンズで集光
すると、焦点深度は非常に浅くなり、その焦点位置の探
索が非常に困難である。たとえば、開口数ＮＡのレンズ
で集光したときの、焦点からδｚだけ離れた点における
集光ビームの広がりｄは、以下の式で与えられる。

【００７６】

【数１５】

【００７７】ここで仮にδｚが６００ｎｍであるとする
と、ｄは約４００ｎｍ程度となる。これは、ポンプ光を
回折限界まで絞ったサイズと同等であり、基本的には１
μｍ以下の精度で位置制御を行なう必要があることを意
味している。そのため、ピエソ圧電素子の一種を用いた
インチワームステージは、サブμｍでの位置制御が可能
なために、超解像性を発現するこの発明の二重共鳴吸収
顕微鏡に適したステージである。また、絶対位置をモニ
ターすることで、試料（５２３）を交換したとしても、
迅速に観察領域を発見できる。

【００７８】図１６は、試料ステージ（５２４）のＸＹ
方向の二次元移動機構の一例を示したものである。この
図１６に例示したＸＹ二次元移動機構は、板バネ（６０
１）および二つの積層型ピエゾ圧電素子（６０２）（６
０３）から構成されており、積層型ピエゾ圧電素子（６
０２）（６０３）で板バネ（６０１）を駆動し、一方の
積層型ピエゾ圧電素子（６０２）でＸ軸方向へ、他方の
積層型ピエゾ圧電素子（６０３）でＹ軸方向へ、試料ス
テージ（５２４）を光軸と直交する面内において二次元
移動させる。また、図１７に例示したように、直接、積
層型ピエゾ圧電（６０２）（６０３）を試料ステージ
（５２４）に取り付けた移動機構を用いることもできる
が、図１６のように板バネ（６０１）を介した機構の方
が、走査面の歪みによる画質劣化の発生をより効果的に
抑制することができる。

【００７９】また、試料ステージ（５２４）にはθφ方
向の駆動機構をも設けているが、これらは試料（５２
３）表面とポンプ光およびイレース光の光軸とを正確に
直交させるために付加されたものである。

【００８０】以上の五次元移動機構による試料ステージ
（５２４）は、試料（５２３）に対するメカニカルスキ
ャンを前提としている場合のものであるが、たとえば、
揺動するガルバノミラーを光路上に設けて、レーザービ
ーム自体を走査することもできる。

【００８１】さてここで、ポンプ光およびイレース光の
光軸調整の一例について説明する。光軸調整用の標準試
料としては、ポンプ光およびイレース光の両光に対して
透明な薄膜にローダミンＢを分散させてなるものを用い
る。ローダミンＢは、ポンプ光およびイレース光の両光
によって高い確率でＳ₀→Ｓ₁励起が起きるため、十分な
量の蛍光を観測することが可能となる。この標準試料と
しての薄膜は、たとえば、溶液状態のＰＭＭＡにローダ
ミンＢを分散させて、スライドガラスの上に厚さ数μｍ
でスピンコートすることで製作される。

【００８２】光軸調整の手順としては、上記標準試料に
ポンプ光およびイレース光を同時照射し、発生される蛍
光をＩＣＣＤカメラ（５４０）を介してコンピュータ
（５０１）で観察しながら、ポンプ光の集光点とイレー
ス光の集光点が一致するように、ポンプ光の光路上にあ
る反射ミラー（５１０）またはイレース光の光路上にあ
る反射ミラー（５１５）の傾きなどを調節して集光点の
位置を移動させる。このとき、ポンプ光およびイレース
光の集光点が一致するときの蛍光像は、発光面積が最小
となり、且つ、発光輝度が最大となるので、そのような
蛍光像が得られるように光学系を調整すれば、ポンプ光
およびイレース光の光軸一致が実現される。

【００８３】なお、図１２において、（５３３）はハー
フミラー、（５３４）は照明光用レンズ、（５３５）は
照明光源であり、これらは光軸調整のために用いられる
光学系である。

【００８４】また、図１２に例示したように、光軸調整
のための別の顕微鏡光学系を、試料（５２３）の後側に
設けておいてもよい。図１２において、（５２５）は透
過光用レンズ、（５２６）はハーフミラー、（５２７）
は照明光用レンズ、（５２８）は照明光源、（５２９）
（５３０）はポンプ光およびイレース光をカットするノ
ッチフィルター、（５３１）は接眼レンズ、（５３２）
はＩＣＣＤカメラであり、これらによって光軸調整用の
顕微鏡光学系が構成されている。

【００８５】以下に、上述したシステム全体の制御につ
いて説明する。

【００８６】本実施例の顕微鏡システムは、電気的制御
を行うユニットとして、ＩＣＣＤカメラ（５４０）（上
記光軸用顕微鏡光学系を併せ備えた場合にはＩＣＣＤ
（５３２）も）を制御するカメラコントローラー（５０
４）と、試料ステージ（５２４）を制御する試料ステー
ジコントローラー（５０３）と、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー
（５０５）を制御するレーザーコントローラー（５０
２）とを有しており、これらのコントローラーはコンピ
ュータ（５０１）により集中管理される。

【００８７】ＩＣＣＤカメラ（５４０）に対しては蛍光
信号の検出時間を決めるゲートパルスの発生と取得され
た蛍光信号のコンピュータ（５０１）ヘの送信、試料ス
テージ（５２４）に対してはピエゾ圧電素子（６０２）
（６０３）（図１６、図１７参照）のステップ移動、Ｎ
ｄ：ＹＡＧレーザー（５０５）に対してはＱスイッチ信
号の制御がそれぞれ行われる。システムの処理シーケン
スとしては、１．Ｎｄ：ＹＡＧレーザーの発振２．ＩＣＣＤカメラのゲートパルス発生３．データ取り込み４．ピエゾ圧電素子のステップ移動というサイクルを、取得する画像の画素数分だけ繰り返
すことになる。ＩＣＣＤカメラ（５４０）からの各画素
毎の蛍光スペクトルは、コンピュータ（５０１）にて数
値データとして取り込まれ、全画素分のデータを取得
後、数値演算処理によって、バックグラウンド信号とし
て混在しているポンプ光およびイレース光の波長成分を
除去し、その他の波長成分の積分値を１画素の画像信号
とする。このようにして得られた画像データは必要に応
じて、ＣＲＴやプリンター等の外部出力装置に出力され
たり、ＨＤＤやＦＤＤ等の記憶装置に記憶される。

【００８８】この発明は以上の例に限定されるものでは
なく、細部については様々な態様が可能であることは言
うまでもない。

【００８９】

【発明の効果】以上詳しく説明したように、この出願の
発明によって、超解像性に理想的な中空イレース光を発
生させることができ、超解像性をより確実に実現でき
る、新しい二重共鳴吸収顕微鏡が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】基底状態の試料分子の電子配置を例示した図で
ある。

【図２】Ｓ₁状態に励起された試料分子の電子配置を例
示した図である。

【図３】Ｓ₂状態に励起された試料分子の電子配置を例
示した図である。

【図４】脱励起した試料分子の電子配置を例示した図で
ある。

【図５】二重共鳴吸収過程を例示した概念図である。

【図６】二重共鳴吸収過程を空間的に例示した概念図で
ある。

【図７】ポンプ光およびイレース光の一部重合せおよび
それによる蛍光抑制を例示した概念図である。

【図８】イレース光の中空ビーム化のための位相板の一
例を示した図である。

【図９】光紬を原点とした一次ベッセルビームの断面の
位相分布を例示した概念図である。

【図１０】この発明の二重共鳴吸収顕微鏡にて用いられ
る空間フィルターの一例を示した概略図である。

【図１１】空間フィルターによる良好なビームプロファ
イルのイレース光形成の原理を説明する図である。

【図１２】この発明の一実施例である二重共鳴吸収顕微
鏡を用いたレーザー走査型蛍光顕微鏡システムを例示し
た概略図である。

【図１３】ローダミン６Ｇの吸収特性（実線）および蛍
光特性（点線）を例示した図である。

【図１４】ガラス基板のエッチングによる位相板の一例
を示した概略図である。

【図１５】図１２の顕微鏡システムにおける分光器の内
部構造を例示した概略図である。

【図１６】図１２の顕微鏡システムにおける試料ステー
ジのＸＹ二次元移動機構の一例を示した概略図である。

【図１７】試料ステージのＸＹ二次元移動機構の別の一
例を示した概略図である。

【符号の説明】

１００空間フィルター１０１集光レンズ１０２ピンホール１０３コリメートレンズ５０１コンピュータ５０２レーザーコントローラー５０３試料ステージコントローラー５０４カメラコントローラー５０５Ｎｄ：ＹＡＧレーザー５０７波長変調素子５０８ハーフミラー５０９テレスコープ５１０反射ミラー５１１ビームコンバイナー５１２ラマンシフター５１３テレスコープ５１４位相板５１５，５１６，５１７反射ミラー５１８直線移動ステージ５１９プリズム５２０ビームリデューサー５２１ハーフミラー５２２集光対物レンズ５２３試料５２４試料ステージ５２５透過光用レンズ５２６ハーフミラー５２７照明光用レンズ５２８照明光源５２９，５３０ノッチフィルター５３１接眼レンズ５３２ＩＣＣＤカメラ５３３ハーフミラー５３４照明光用レンズ５３５照明光源５３６，５３７ノッチフィルター５３８接眼レンズ５３９分光器５３９１コリメータ球面鏡５３９２フォーカシング球面鏡５３９３回折格子５３９４反射ミラー５３９５スリット５４０ＩＣＣＤカメラ６０１板バネ６０２，６０３積層型エピゾ圧電素子

フロントページの続き (72)発明者藤井正明愛知県岡崎市竜美南２−３−１６号棟 303号 (72)発明者尾松孝茂神奈川県横浜市戸塚区平戸５−10−９ (72)発明者佐藤卓神奈川県川崎市幸区塚越４−320−４− 1209 Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA14 CA07 DA02 DA05 EA01 EA02 EA13 FA02 FA06 FA07 GA03 GA07 GB01 GB02 HA01 HA02 HA03 HA09 HA15 JA04 KA02 KA05 KA07 KA09 LA03 2H052 AA07 AA09 AC04 AC12 AC15 AC27 AC29 AC34 AF14 AF21 AF25

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料分子を基底状態から第一電子励起状
態へ励起させる波長λ₁のポンプ光の光源と、第一電子
励起状態の試料分子を第二電子励起状態またはより高い
励起状態へ励起させる波長λ₂のイレース光の光源と、
ポンプ光およびイレース光の照射領域を一部分重ね合わ
せる重ね手段とを備えており、重ね手段を介してポンプ
光およびイレース光を試料に照射することにより、第一
電子励起状態の試料分子が基底状態へ脱励起する際の発
光領域を一部分抑制する二重共鳴吸収顕微鏡において、集光レンズおよびコリメートレンズとその間に設けられ
たピンホールとを有し、イレース光を集光レンズにより
ピンホールに集光し、且つピンホールを通過したイレー
ス光のみをコリメートレンズにより平行光にコリメート
する空間フィルターが、イレース光の光路に備えられて
いることを特徴とする二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項２】ピンホールの半径ａが、【数１】の条件または【数２】の条件を満たしている請求項１の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項３】空間フィルターを通過したイレース光に
その光軸を中心としてπだけ位相差を与える位相変調素
子が備えられている請求項１または２の二重共鳴吸収顕
微鏡。
【請求項４】ビーム領域限定手段を通過した後のイレ
ース光に、その光軸を中心としてπだけ位相差を与える
位相変調素子が備えられている請求項３の二重共鳴吸収
顕微鏡。
【請求項５】位相変調素子は、イレース光に対して透
明かつオプティカルフラットな平行基板の上に、イレー
ス光に光軸を中心としてπだけ位相差を与え得る厚み分
布を持つ光学薄膜が被膜されてなる請求項４の二重共鳴
吸収顕微鏡。
【請求項６】位相変調素子は、イレース光に対して透
明かつオプティカルフラットな平行基板に、イレース光
に光軸を中心としてπだけ位相差を与え得るエッチング
が施されてなる請求項４の二重共鳴吸収顕微鏡。
【請求項７】試料は、基底状態を含め少なくとも三つ
の電子状態を有する蛍光ラベラー分子により染色されて
おり、前記試料分子はこの蛍光ラベラー分子である請求
項１ないし６のいずれかの二重共鳴吸収顕微鏡。