JPH10104400A - Ｘ線励起型蛍光顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 コントラストを向上させるとともに、観察試
料特定の化学基等の検出や微量な化学基等の検出を行う
ことのできる、高性能な、新しいＸ線励起型蛍光顕微鏡
を提供する。 【解決手段】Ｘ線を放射するＸ線光源と、Ｘ線光源から
のＸ線を観察試料上に集光するＸ線集光部と、Ｘ線集光
部によるＸ線の集光点から発光する燐光および蛍光を集
光する燐光・蛍光集光部と、燐光・蛍光集光部により集
光された燐光および蛍光を検出する光検出器とを備えた
Ｘ線励起型蛍光顕微鏡であって、光子エネルギー２００
０ｅＶ以下で単色化されたＸ線を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、Ｘ線励起型蛍光
顕微鏡に関するものである。さらに詳しくは、この発明
は、コントラストを向上させるとともに、観察試料の特
定の化学基等の検出や微量な化学基等の検出を行うこと
のできる、高性能な、新しいＸ線励起型蛍光顕微鏡に関
するものである。

【０００２】

【従来の技術とその課題】近年、Ｘ線光源やＸ線光学系
の技術進歩に伴い、その応用技術としてのＸ線顕微鏡が
盛んに開発されてきている。このＸ線顕微鏡は、その光
源であるＸ線が生体試料に与えるダメージが少なく、生
体試料を濡れた状態のままで高解像度かつ無染色で観察
できるという特徴を有している。特に、「水の窓」と呼
ばれる波長４２．７Ａ〜２３．６Ａの波長領域におい
て、Ｘ線は、炭素または窒素による吸収が最も多く、さ
らに酸素と水素から成る水分子に対して高い透過率を持
つため、主構成原子が炭素である蛋白質の透過像を、水
中においても良好なコントラストで観察することができ
る。「水の窓」の限界波長４２．７Ａおよび２３．６Ａ
は、それぞれ炭素のＫ吸収端および酸素のＫ吸収端に対
応するものであり、Ｘ線の吸収像の撮影原理は炭素およ
び窒素の１Ｓ電子の内殻電離過程に基づいている。

【０００３】従来より、このような内殻電離過程を用い
たＸ線顕微鏡としては、たとえば、ウォルタータイプに
代表される斜入射光学系、回折効果を用いたフレネルゾ
ーンプレート、２枚の球面鏡にＸ線多層膜鏡を蒸着した
直入射型のシュバルツシルド光学系などのような結像素
子を用いた顕微鏡システムや、結像素子を用いずにＸ線
フィルムやフォトレジストに試料像を直接記録する直接
密着撮影法による顕微鏡システムなどが知られている。

【０００４】一方、この内殻電離過程とは別に、生体分
子の分子軌道への内殻励起過程を用いたＸ線顕微鏡も開
発されてきている。図１（ａ）（ｂ）は、各々、内殻電
離過程と内殻励起過程の概念を例示した図である。この
図１（ａ）に示したように、内殻電離過程は、「水の
窓」の波長領域４２．７Ａ〜２３．６ＡのＸ線により生
体試料の細胞内の炭素または窒素の１Ｓ電子を電離させ
るものである。

【０００５】また、内殻励起過程は、図１（ｂ）に示し
たように、「水の窓」の波長領域のＸ線により生体試料
の細胞内の炭素または窒素の１Ｓ電子を、電子に占有さ
れていない分子軌道に励起させるものである。この内殻
励起過程において重要な役割を果たす分子軌道は、π＊
軌道と呼ばれる反結合性の分子軌道であり、通常は空軌
道である。このπ＊軌道は、生体分子を構成する炭素の
２ｐ軌道が他原子の軌道と二重結合する場合に多く見ら
れる。たとえば、ベンゼン環や窒素塩基ではＸ線の波長
が４３．５Ａ（光エネルギー２８５ｅＶ）前後で強い吸
収線を持つ。これらの吸収線のエネルギー位置は「水の
窓」領域の長波長側の限界である４２．７Ａよりもさら
に１Ａ程度長波長側にある（光子エネルギーにして５ｅ
Ｖ程度低エネルギー側）。このような内殻励起過程は、
一種の共鳴吸収過程であり、Ｘ線の強い吸収が期待でき
る。さらに、分子軌道は分子固有のエネルギー準位を持
つため、Ｘ線の共鳴波長を選択することにより、特定の
分子のみの吸収像を得ることができる。

【０００６】したがって、内殻励起過程を用いたＸ線励
起顕微鏡は、内殻電離過程を用いたＸ線顕微鏡に比べ、
感度が高く、生体試料の観察用Ｘ線顕微鏡として非常に
優れたものである。また、近年では、このような内殻励
起過程を用いたＸ線励起顕微鏡により得られる像のコン
トラストをさらに向上させるために、ラベラーによるラ
ベリングを用いた蛍光顕微鏡が開発されてきている。

【０００７】この蛍光顕微鏡は、蛍光団を持つ分子であ
る蛍光色素分子、つまりラベラーにより、生体細胞分子
の特定の化学基や元素を染色、つまりラベリングし、こ
のラベリングされた分子の特定の分子軌道に、内殻電子
をＸ線により共鳴吸収させ、生体細胞の構造や組成を解
析するものである。たとえば、N-Succinimidyl-4-nitro
phenylacetate や5-(4-Dimmethylaminophenyl)-2,4-pen
tadienalは、蛋白質のアミノ基（Ｎ端）と結合して、強
い紫外蛍光を発する。また、O-(4-Nitrobenzyl)-N,N'-d
iisopropylisourea は、蛋白質のカルボニル基（Ｃ端）
と結合し、強い紫外蛍光を発する。さらに、N,N,N',N'-
Tetrakis(2-pyridylemethyl)ethylenediamine は、細胞
内での重要な役割を果たす情報伝達物質Ｃａ２＋をラベ
リングする。また、4-Fluroro-7-sulfobenzofurazan,am
monium salt は、たとえばアミノ酸の一種であるシステ
インのＳＨ基と結合し、３８５ｎｍ励起で強い５１５ｎ
ｍの蛍光を発する。

【０００８】このように、特定の化学基や元素をラベリ
ングするラベラーは、何れも強い蛍光を発するという特
徴を持っており、この特徴はラベラーの分子軌道の構造
に起因する。すなわち、ラベラーは二重結合を有する化
学基を持つため、π電子が通常π軌道と呼ばれる分子軌
道に存在する。このπ電子は紫外または可視光によって
高次の占有されていないπ軌道や反結合性のπ＊軌道に
容易に励起され、この励起状態から基底状態に脱励起す
るときに、強い蛍光を発するのである。

【０００９】したがって、このようなラベラーによるラ
ベリングを用いた蛍光顕微鏡は、上述のように発生され
た強い蛍光により吸収像のコントラストを向上させるこ
とができ、生体細胞の構造や組成の解析を、より高い精
度で行うことができる。ところで、π軌道やπ＊軌道の
分子軌道は、分子を構成する原子の２ｐ軌道の線型結合
で形成され、たとえば、

【００１０】

【数１】

【００１１】により表される。ここで、ｘ_i (r) はｉ番
目の分子構成原子の２ｐ軌道の波動関数、Ciは規格化定
数である。一般に、原子の２ｐ軌道は、光励起により１
ｓ軌道の電子と強い相互作用を持つ。すなわち、１ｓ軌
道の電子は、光励起を行う場合において２ｐ軌道へ高い
遷移確率を持つ。図２は、炭素原子において１ｓ電子が
各ｐ軌道へ遷移する場合、および１ｓ電子が電離する場
合における光子エネルギーと吸収断面積との関係を示し
たものである。この図２から明らかなように、炭素原子
は、１ｓ電子が２ｐ軌道へ遷移する場合において約１５
０Ｍｂ（１５０×１０^-18 ｃｍ² ）程度の収断面積を持
ち、「水の窓」の励起波長による１ｓ電子の電離におけ
る吸収断面積と比較すると１００倍以上の強い吸収を持
つことが分かる。

【００１２】また、図３は、ベンゼン分子などの６員環
分子において１ｓ電子がπ＊軌道へ遷移する場合、およ
び１ｓ電子が電離する場合における光子エネルギーと吸
収断面積との関係を示したものである。この図３から明
らかなように、６員環分子は、１ｓ電子がπ＊軌道へ遷
移する場合において、光子エネルギーが２８５ｅＶ前後
で約２４Ｍｂ以上の吸収断面積を持ち、「水の窓」の励
起波長による１ｓ電子の電離における吸収断面積と比
べ、６倍程度大きな吸収断面積を持ち、図２に示した炭
素原子の場合と同様に、非常に強い吸収を持つことが分
かる。

【００１３】また、６員環分子以外の二重結合を持つ分
子も、上述の炭素原子や６員環分子と同様に、「水の
窓」よりも光子エネルギーが小さい領域、つまり「水の
窓」の波長領域よりも長い領域において、内殻励起過程
による非常に強い共鳴吸収を持つ。したがって、ラベリ
ングを行うラベラーは、豊富に二重結合が含まれるため
に内殻励起過程を起こす波長を持つ軟Ｘ線に対する吸収
ラベラーとしても機能する。すなわち、生体分子内のア
ミノ基などのような特定の化学基をラベリングして、内
殻励起過程を生じさせる共鳴する波長のＸ線を用いるこ
とにより生体試料の透過像を撮影すれば特定の化学基の
みの分布像を得ることができる。さらに共鳴による吸収
は非常に強いため、微量な量の化学基をも検出すること
ができる。

【００１４】よって、このようなラベラーによるラベリ
ングを用いたＸ線顕微鏡は、画質向上だけではなく、特
定の化学基のみの分布像を得ることができ、さらにま
た、非常に強い共鳴吸収のために微量な化学基をも検出
することができる。ところで、このラベリングを用いた
Ｘ線顕微鏡を実現するためには、以下に示す２つの必要
条件を満たす必要がある。

【００１５】１）ラベラーとして二重結合を含む分子を
用いる。 ２）ラベラーの持つ内殻励起過程を生じさせる共鳴ライ
ンよりも波長幅、もしくは光子エネルギー幅の狭いバン
ド幅のＸ線を用いる。また、生体試料を観察する場合で
は、その機能を向上させるための付帯条件として、 ３）濡れた状態の生体試料の撮像を可能なものとするた
めに、Ｘ線が水分子に吸収されない、 ことも挙げられ
る。

【００１６】以下に、これらの条件について説明する。 １）の条件について 通常、ラベラーは、Ｈ、Ｃ、Ｎ、Ｏを主成分として、若
干のＳ、Ｂｒ、Ｐｂ等を含む有機分子である。したがっ
て、Ｃ、Ｎ、Ｏの１ｓ電子がラベラーのπ軌道またはπ
＊軌道に光励起される場合の吸収ラインを利用すること
が好ましい。この場合の共鳴吸収線の光子エネルギーお
よび波長は、たとえば、以下のようになる。

【００１７】 Ｃ：１ｓ→π＊ ２８０ｅＶ〜３００ｅＶ（４４Ａ〜４１Ａ） Ｎ：１ｓ→π＊ ３９０ｅＶ〜４１０ｅＶ（３２Ａ〜３０Ａ） Ｏ：１ｓ→π＊ ５２０ｅＶ〜５５０ｅＶ（２４Ａ〜２２Ａ） このような領域において、１ｓ→π＊を含む様々な内殻
励起過程による吸収ピーク群が観測されている。

【００１８】この他のＳ、Ｂｒ、Ｐｂ等の重元素の場合
においても、１ｓ→π＊に限らず、２ｐ、２ｓ、３ｓ、
３ｐ、３ｐ．．．．などの様々な内殻軌道よりの吸収ピ
ークが２０００ｅＶ以下で観測されている。したがっ
て、たとえば上述のような波長帯域のＸ線を用いれば、
高性能なＸ線顕微鏡を実現できる。

【００１９】２）の条件について １ｓ→π＊遷移に伴う最も強い吸収ピークは１ｅＶ程度
のライン幅を持っている。したがって、少なくとも光子
エネルギー幅１ｅＶ以下のバンド幅のＸ線を用いること
が必要条件となる。これ以上のバンド幅で透過像を撮像
すると、吸収に関与しない波長が混入するために著しく
コントラストが低下する。よって、上記のバンド幅以上
の分解能をもつ波長分散性のある光学素子や単色化した
光源を用いることが必要である。

【００２０】３）の条件について 濡れた状態の生体試料を撮像するためには、Ｘ線が水分
子に吸収されないことが必要である。すなわち、水分子
中の酸素原子のＫ吸収端、つまり２３．６Ａよりも長い
波長の軟Ｘ線を用いる必要がある。このような条件を満
たすことにより、高性能なＸ線顕微鏡を実現させること
ができる。

【００２１】以下に、ラベラーとしてO-(4-Nitrobenzy
l)hydroxylamineを用いたＸ線顕微鏡によるタバコモザ
イクウィルスの蛋白質の検出の一例を示し、説明する。
タバコモザイクウィルスの形状は、１６×３００ｎｍの
棒状であり、その蛋白質は、１５８個のアミノ酸分子で
構成される２１３０個の小集団の蛋白質から成る。アミ
ノ酸分子１個に対して、ケトン基またはアルデヒド基を
有するペプチド結合は１個存在するため、タバコモザイ
クウィルスは１５８×２１３０のケトン基またはアルデ
ヒド基を持つ。

【００２２】O-(4-Nitrobenzyl)hydroxylamineは、ベン
ゼン環を持ち、光子エネルギー２８５ｅＶ前後で炭素１
ｓ→π＊遷移に伴う強いＸ線の吸収ピークを持つ。この
O-(4-Nitrobenzyl)hydroxylamineによりタバコモザイク
ウィルスのケトン基またはアルデヒド基をラベリングし
た時の１ｓ→π＊遷移に伴う最も強いＸ線の吸収を算出
すると、ベンゼン分子１個あたりの吸収断面積σは、約
２５Ｍｂ（２５×１０^-18 ｃｍ² ）であり、染色された
タバコモザイクウィルスの共鳴波長における、吸収断面
積σと単位体積あたりのケトン基またはアルデヒド基の
密度との積により与えられる線吸収係数μは１３／μｍ
となる。この値は、通常の蛋白質の「水の窓」領域の波
長の線吸収係数μの倍以上の値である。 また、顕微鏡
のコントラストＣは、色々なコントラストの領域を持つ
試料の最大透過率Ｉmax と、対象とする領域の透過率Ｉ
とを用いて次式で与えられる。

【００２３】

【数２】

【００２４】また、ｘ＝１６ｎｍのサイズのタバコモザ
イクウィルスの透過率Ｉは、次式で与えられる。

【００２５】

【数３】

【００２６】これらの式により算出すると、タバコモザ
イクウィルスのコントラストＣは、０．１程度であり、
「水の窓」領域の波長を用いるＸ線顕微鏡と比べ、約２
倍以上の値となる。したがって、ラベラーによるラベリ
ングを用いたＸ線顕微鏡により、非常に高い感度で、た
とえばタバコモザイクウィルスの蛋白質を検出できるこ
とがわかる。

【００２７】しかしながら、このような従来のＸ線顕微
鏡は、透過型顕微鏡、すなわち明視野顕微鏡であり、観
察する試料の構成組織の吸収によって、吸収像のコント
ラストがつくため、式（３）からも明らかなように、観
察する組織のサイズが小さくなると、Ｘ線の吸収の程度
が小さくなり、必然的にコントラストが悪くなるといっ
た問題があった。

【００２８】そこで、この発明は、以上の通りの事情に
鑑みてなされたものであり、特定の化学基や元素などの
検出を行うことができ、また微小な量の化学基等の検出
をも行うことができるとともに、コントラストをより向
上させることのできる、高性能な、新しいＸ線顕微鏡を
提供することを目的としている。

【００２９】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、Ｘ線を放射するＸ線光源と、Ｘ
線光源からのＸ線を観察試料上に集光するＸ線集光部
と、Ｘ線集光部によるＸ線の集光点から発光する燐光お
よび蛍光を集光する燐光・蛍光集光部と、燐光・蛍光集
光部により集光された燐光および蛍光を検出する光検出
器とを備えたＸ線励起型蛍光顕微鏡であって、光子エネ
ルギー２０００ｅＶ以下で単色化されたＸ線が用いられ
ていることを特徴とするＸ線励起型蛍光顕微鏡（請求項
１）を提供する。

【００３０】また、この発明は、上記の顕微鏡におい
て、波長幅１ｅＶ以下で単色化されたＸ線が用いられて
いること（請求項２）や、Ｘ線の光子エネルギーが２８
０ｅＶ〜５５０ｅＶであり、かつ波長可変であること
（請求項３）や、Ｘ線光源が、シンクロトロン、レーザ
ープラズマ光源、プラズマ放電型Ｘ線光源、もしくは電
子線励起型Ｘ線管のいずれかであること（請求項４）
や、Ｘ線集光部にＸ線集光対物レンズが設けられてお
り、このＸ線集光対物レンズが、フレネルゾーンプレー
ト、ウォルタータイプ、もしくは直入射型シュバルツシ
ルド光学型のいずれかであること（請求項５）や、Ｘ線
集光部に、Ｘ線光源からのＸ線の発光点を制限するピン
ホールが設けられ、また光検出器の前であって燐光・蛍
光集光部に別のピンホールが設けられており、Ｘ線集光
部と燐光・蛍光集光部とが共焦点光学系を形成している
こと（請求項６）等をその好ましい態様としている。

【００３１】さらにまた、この発明は、上記の顕微鏡を
用いる化学検出方法であって、二重結合を含む分子であ
るラベラーにより観察試料をラベリングすることを特徴
とする化学検出方法（請求項７）をも提供する。また、
この発明は、上記の方法において、ラベラーが５員環ま
たは６員環を含むこと（請求項８）や、ラベラーがベン
ゼン環を含むこと（請求項９）や、光子エネルギーが２
８０〜２９０ｅＶであること（請求項１０）や、Ｃ、
Ｎ、Ｏを含む分子の１ｓ→π＊吸収を用いること（請求
項１１）等をもその好ましい態様としている。

【００３２】

【発明の実施の形態】この発明のＸ線励起型蛍光顕微鏡
は、上述の通り、Ｘ線光源と、Ｘ線集光部と、燐光・蛍
光集光部と、光検出器とを備えており、Ｘ線光源から放
射されたＸ線は、Ｘ線集光部により観察試料上に集光さ
れる。そして、この集光されたＸ線により、観察試料の
電子構造に後述の内殻励起過程が起き、この内殻励起過
程後の脱励起過程において発光される燐光および蛍光
が、燐光・蛍光集光部により集光されて、光検出器によ
り検出される。

【００３３】このようなこの発明のＸ線励起型蛍光顕微
鏡は、暗視野顕微鏡の原理を利用している。暗視野顕微
鏡は、観察試料からの散乱光、蛍光、または回折光によ
り像を得るものであり、暗いバックグラウンドの中に、
散乱、蛍光、または回折を引き起こす部分が輝いて見え
る。したがって、試料から発光した光子を純粋に計測す
るため、たとえば微量光子検出技術を用いることにより
高いＳ／Ｎ比で観察試料の微小組織を検出することがで
きる。このように、暗視野顕微鏡は明視野顕微鏡に比べ
て格段に検出感度が優れている。

【００３４】この暗視野顕微鏡の原理を用いたこの発明
のＸ線励起型蛍光顕微鏡は、前述のように、Ｘ線を観察
試料に集光照射することにより、観察試料の電子構造に
内殻励起過程を起こし、この内殻励起過程後の脱励起過
程において発光される燐光および蛍光を検出するもので
ある。すなわち、まず、図４（ａ）（ｂ）（ｃ）は、各
々、内殻励起過程、オージェー過程、脱励起過程におけ
るベンゼン環の炭素分子の電子構造を例示したものであ
る。

【００３５】図４（ａ）に示したように、ベンゼン環が
波長λｘのＸ線を吸収して、内殻励起過程が起こり、炭
素の軌道１ｓの電子Ａが高位の空の分子軌道ｅ２に励起
される。その後、図４（ｂ）に示したように、励起した
ベンゼン分子は、エネルギー的に不安定であるためオー
ジェー過程を起こし、価電した電子Ｂが軌道１ｓの空孔
をうめる。この時、電子Ａの近くの軌道ｅ１の電子Ｃは
弾き飛ばされて電離してしまう。つまり、このオージェ
ー過程において、１価のベンゼンの励起状態が形成され
る。この際、最初に高位の空の分子軌道ｅ２に励起され
た電子Ａはそのままの状態で留まる。この電子Ａは、通
常スペクテイターと呼ばれる。このスペクテイターは、
図４（ｃ）に例示したように、一定時間、たとえば数ｎ
ｓｅｃ、軌道ｅ２に留まった後、波長λｆ、たとえば２
００ｎｍ〜５００ｎｍの光を放出して、低位の軌道ｅ１
の空孔をうめる。つまり、この脱励起過程において１価
の基底状態に戻る。

【００３６】スペクテイターが存在する分子軌道は、原
子や分子の種類等または化学的環境等の影響を極めて敏
感に受ける。このため、波長λｘおよび波長λｆは、原
子や分子の種類等または化学的環境等に応じて異なった
ものとなる。したがって、この発明のＸ線励起型蛍光顕
微鏡では、観察する分子の１ｓ→π＊遷移に相当する波
長のＸ線を用いて、上述のような内殻励起過程後の脱励
起過程におけるスペクテイターによる蛍光を検出するこ
とにより、微妙に異なる化学的環境を反映した観察試料
の化学基を、優れた感度で検出することができる。

【００３７】そして、さらに、この発明のＸ線励起型蛍
光顕微鏡を用いた化学検出方法では、ラベラーにより、
観察試料の特定の化学基や元素をラベリングすることに
より、Ｃａイオンなどの微小検出を行うことができ、ま
た非常に高いコントラストの像を得ることができる。ま
た、プローブ光として、可視光の波長よりも僅かに短い
波長であるＸ線を用いるため、極めて高い空間分解能が
得られ、現存のＸ線光学素子を用いた場合、２０〜３０
ｎｍの画素密度の映像を得ることができる。

【００３８】さらにまた、Ｘ線光源として、たとえばパ
ルス光源を用いると、時間分解能により、観察試料の過
渡応答をも観察することができる。また、走査型共焦点
型の蛍光顕微鏡と同じような構成とすると、深さ分解能
を有することも可能である。このように、この発明は、
高性能な暗視野顕微鏡であって、蛍光顕微鏡の特徴と、
高い空間分解能を有するＸ線顕微鏡の特徴とを併せるこ
とにより、高性能なＸ線励起型蛍光顕微鏡を実現させる
ことができる。

【００３９】以下、実施例を示し、さらに詳しくこの発
明の実施の形態について説明する。もちろんこの発明は
以下の例によって限定されるものではない。

【００４０】

【実施例】

（実施例１）図５は、この発明の一実施例であるＸ線励
起型蛍光顕微鏡を例示したものである。たとえばこの図
５に例示したように、この発明のＸ線励起型蛍光顕微鏡
では、Ｘ線光源としてシンクロトロン（１）が備えられ
ており、Ｘ線集光部は、回折格子（２）と、斜入射集光
レンズ（３）と、第１ピンホール（４）と、Ｘ線集光対
物レンズとしてのフレネルゾーンプレート（５）とによ
り構成され、また、燐光・蛍光集光部は、光学レンズと
しての可視・紫外光レンズ（７）と第２ピンホール
（８）とにより構成されており、光検出器としてはフォ
トマル（９）が備えられている。

【００４１】シンクロトロン（１）から放射されたＸ線
は、回折格子（２）により分光された後、斜入射集光レ
ンズ（３）により第１ピンホール（４）上に集光され
る。この第１ピンホール（４）上の点像は、フレネルゾ
ーンプレート（５）により観察試料（６）内の１点に縮
小結像される。このようにして、数１０ｎｍ程度のサイ
ズのＸ線マイクロビームが形成される。そして、このＸ
線マイクロビームにより観察試料（６）から発光した蛍
光は、紫外あるいは可視領域の可視・紫外光レンズ
（７）により第２ピンホール（８）上に集光された後、
フォトマル（９）上に集光される。

【００４２】このようなこの発明のＸ線励起型蛍光顕微
鏡により、特定の化学基の検出や微量な化学基の検出を
行うことができるとともに、得られる像のコントラスト
をより向上させることができる。また、図６（ａ）に例
示したように、Ｘ線集光部の第１ピンホール（４）およ
びフレネルゾーンプレート（５）と、燐光・蛍光集光部
の可視・紫外光レンズ（７）および第２ピンホール
（８）とは、共焦点光学系を構成しているため、観察試
料（６）を３次元操作することにより、Ｘ線により励起
された分子からの３次元蛍光像をも得ることができる。

【００４３】もちろん、Ｘ線集光部の第１ピンホール
（４）と燐光・蛍光集光部の第２ピンホール（８）とを
用いずに、Ｘ線集光部のフレネルゾーンプレート（５）
と燐光・蛍光集光部の可視・紫外光レンズ（７）とによ
り、図６（ｂ）に例示したように、共焦点光学系が構成
されていてもよく、また、２次元蛍光像のみを得る場合
には、非共焦点光学系であってもよい。

【００４４】Ｘ線光源としては、シンクロトロンだけで
なく、レーザープラズマ光源や、プラズマ放電型Ｘ線光
源、電子線励起型Ｘ線管等が設置されていてもよく、ま
た、Ｘ線集光対物レンズとして、フレネルゾーンプレー
ト（５）の代わりに、ウォルタータイプに代表される斜
入射光学系や、２枚の球面鏡にＸ線多層膜鏡が蒸着され
た構造を有する直入射型シュバルツシルド光学型等が設
置されていてもよい。

【００４５】また、光検出部の光学レンズとしては、可
視・紫外光レンズ（７）だけではなく、十分な蛍光強度
を有する、フレネルゾーンプレート、ウォルタータイ
プ、直入射型シュバルツシルド光学型などのＸ線結像光
学系が備えられていてもよい。 （実施例２）図６は、この発明の一実施例であるＸ線励
起型蛍光顕微鏡を例示したものである。

【００４６】この図６に例示したこの発明のＸ線励起型
蛍光顕微鏡では、レーザー光を放射するレーザーシステ
ム（１０）が備えられており、このレーザーシステム
（１０）からのレーザー光を観察試料（６）上に集光さ
せるためのミラー（１１）とレーザー光集光レンズ（１
２）とが設けられている。その他の構成は、図５のＸ線
励起型蛍光顕微鏡と同じである。

【００４７】レーザーシステム（１０）から放射される
レーザー光を、ミラー（１１）により方向調整し、レー
ザー光集光レンズ（１２）により観察試料（６）上に集
光させることにより、観察試料（６）における観察の対
象とする分子の価電子を励起させた後、Ｘ線光源（１）
からのＸ線により、同じ分子の内殻電子を共鳴波長で外
殻価電子軌道に励起させる。そして、オージェー過程後
の分子からの蛍光を検出する。

【００４８】このようにして、たとえば紫外光＋Ｘ線の
二重共鳴吸収を起こさせることにより、特定の微量な分
子を高感度で検出することができる。レーザーシステム
（１０）は、波長可変のものが好ましく、たとえば、Ｎ
ｄ：ＹＡＧレーザー＋色素レーザーを用い、これと非線
型結晶とを併用することにより、赤外〜紫外領域の光を
放射することができる。また、オプティカルパラメトリ
クオシレーター（ＯＰＯ）やチタンサファイヤレーザー
等を用いてもよい。

【００４９】もちろん、図６に示したようなレーザーシ
ステムでなくとも、二重共鳴を起こすことのできる光源
システムであればよい。また、任意に、フォトダイオー
ド、光電子増倍管、マイクロチャンネルプレート等の検
出器の受光面の入り口に、フィルター等の分光光学素子
を挿入することにより、検出感度をさらに向上させるこ
とができる。

【００５０】（実施例３）この発明のＸ線励起型蛍光顕
微鏡を用いた化学検出方法により、生体試料をラベラー
によりラベリングし、生体試料の蛋白質分子中のケトン
基またはアルデヒド基の分布を撮像する。ラベラーとし
て、O-(4-Nitrobenzyl)hydroxylamineを用いる。このO-
(4-Nitrobenzyl)hydroxylamineは、高い蛍光収率のベン
ゼン環を有し、さらに光子エネルギー２８５ｅＶ前後で
炭素１ｓ→π＊遷移に伴う強いＸ線の吸収ピークを持
つ。

【００５１】このような特徴を有するO-(4-Nitrobenzy
l)hydroxylamineにより、生体試料の蛋白質分子中のケ
トン基またはアルデヒド基をラベリングする。そして、
光子エネルギー２８５ｅＶ前後のＸ線により、ベンゼン
環の炭素１ｓ電子を内殻励起させた後、脱励起過程にお
いて発光する蛍光を検出することにより、ケトン基また
はアルデヒド基の分布を高感度、且つ高コントラストで
撮像することができる。

【００５２】（実施例４）ここでは、以下に、この発明
において用いることのできる、様々な特定の化学基また
は分子に対するラベラーを例示する。 １）チオール基のラベラー（Ｒ−ＳＨ） ジスルフィードの交換反応を起こす分子やリアールハラ
イドなどがあり、ＳＨ基の特異的反応を利用するマレイ
ミド基を持つ分子。

【００５３】たとえば、 ・4-Fluoro-7-sulfamoylbenzofurazan ・2,2'-Dihydroxy-6,6'dinaphthyl disulfide ・N-(9-Acridinyl)maleimide ２）カルボキシル基のラベラー（Ｒ−ＣＯＯＨ） ブロメチル基を反応活性基とする分子。

【００５４】たとえば、 ・4-Bromomethyl-7-methoxycoumarin ・3-Bromomethyl-6,7-dimethoxy-1-methyl-1,2-ditydro
quinoxaline-2-one ３）アミノ基のラベラー（Ｒ−ＮＨ、Ｒ−ＮＨ２） イソチオシアネート基、フェロセニルイソチオシアネー
ト基、ニトロアリールハライド、酸クロリド基を活性基
とする分子。

【００５５】たとえば、 ・Fluoresceinisothiothiocyanate,isomer-1 ・4-[4-(Dimethylamino)phenylazo]phenylisothiocyana
te ・4-Chloro-7-nitrobenzofurazan ・4-Fluroro-7-nitrobenzofurazan ・3-Chlorocarbonyle-6,7-dimethoxy-1-methyl-2(1H)-q
uinoxalinone ・N-Succinimidyl-4-nitrophenylacetate ・Sulforrhodamine 101 acid chloride ４）アルデヒド基のラベラー たとえば、 ・1,2-Diamino-4,5-dimethoxybenzen,dihydrochloride ・2,2'-Dithiobis(1-aminonaphthalene) ５）水酸基のラベラー 酸クロリドなど。

【００５６】たとえば、 ・3-Chlorocarboonyle-6,7-dimethoxy-1-methyl-2(1H)-
quinoxalinone ６）蛋白質の疎水ポケットのラベラー たとえば、 ・3,6-Bis(dimethylamino)-10-dodecylacridinium brom
ide ・4-Benzylamino-7-nitrobenzofurazan ・4-(4-Methoxybenzylamino)-7-nitrobenzofurazan ７）細胞内カルシウムイオンのラベラー たとえば、 ・O,O'-Bis(2-aminophenyl)ethyleneglycol-N,N,N',N',
-tetraacetic acide,tetrapotassiumu salt,hydrate ・N,N,N',N'-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediami ・1-[2-Amido-5-(2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxy-9-xan
thenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-
N,N,N',N',-tetraacetic acid ８）細胞内のｐＨのラベラー たとえば、 ・2',7'-Bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescei
n ・3'-O-Acetyl-2',7'-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carbo
xyfluorescein,diacetoxymethyl ester ９）細胞膜のラベラー（リン脂質、生体膜） たとえば、 ・1,3-Bis(1-pyrenyl)propane ・1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-phenyl-1,3,5-hex
atriene iodide １０）ＤＮＡなどの核酸のラベラー たとえば、 ・4',6-diamino-2-phenylindole(DAPI) また、官能基と少なくとも１つの二重結合とを持つ分子
であれば、この発明においてラベラーとして用いること
ができる。

【００５７】このように、様々なラベラーを使い分ける
ことにより、生体細胞の特定の化学基、分子、構造等を
ラベリングして、それらの分布像を高感度で検出するこ
とができる。もちろん、上記以外にも、蛍光性を有する
分子であれば、ラベラーとして用いることができ、たと
えば、表１に例示した様々な分子もラベラーとして用い
ることができる。

【００５８】（実施例５）この発明により、O-(4-Nitro
benzyl)hydroxylamineを用いて生体試料の蛋白質分子中
のケトン基またはアルデヒド基をラベリングし、蛍光像
を撮像する場合において、蛍光像のコントラストを制御
する。図３に示したように、ベンゼン環の１ｓ→π＊遷
移に伴う吸収断面積の吸収ピークは約１ｅＶのバンド幅
を持つ。この共鳴ラインのバンド幅より一桁程度狭いバ
ンド幅で単色化され、且つ波長可変のＸ線を用いること
により、観察像のコントラストを容易に調整することが
できる。

【００５９】たとえば文部省高エネルギー物理学研究所
フォトンファクトリーのビームラインＰＦ−ＢＬ２は、
光子エネルギー２８５ｅＶ前後でバンド幅５０ｍｅＶ程
度の分光されたＸ線を取り出すことができ、このような
Ｘ線を用いて、O-(4-Nitrobenzyl)hydroxylamineにより
ラベリングされた試料を、ベンゼン環の１ｓ→π＊遷移
の共鳴ラインピークの先頭値の光子エネルギーで照射す
ると、蛍光発光が最大になる。また、共鳴ラインピーク
の先頭値よりも２５０ｍｅＶ程度低い光子エネルギーで
撮影すると、ベンゼンのＸ線に対する吸収断面積が半減
するために蛍光発光量も半減する。

【００６０】この発明では、このようにＸ線の光子エネ
ルギーもしくは波長を選択することにより、蛍光発光量
を調整するとができ、よって得られる像のコントラスト
の制御を行うことができる。たとえば、サイズが大き
く、且つ蛋白質を多量に含む細胞は、必要以上に発光が
強すぎるために、そのままでは微細構造の観察ができな
い。

【００６１】このような場合、従来のＸ線顕微鏡では、
コントラストの調整は、試料の厚みを調整することによ
り行っていたために非常に困難であった。しかしなが
ら、この発明のＸ線励起型蛍光顕微鏡では、上述のよう
にＸ線の光子エネルギーもしくは波長を任意に選択する
だけで、蛍光発光量、すなわちコントラストを非常に容
易に調整することができ、高精度の観察を行うことがで
きる。

【００６２】（実施例６）観察対象の化学基の密度を
Ｎ、ラベラーのＸ線吸収断面積をσｘとすると、線吸収
係数μは、

【００６３】

【数４】

【００６４】により与えられる。この式４によると、観
察対象の化学基の密度Ｎが小さくなると、従来のＸ線顕
微鏡では、Ｘ線の吸収が少なく、蛍光量が減少すること
がわかる。しかし、この発明の方法では、ラベラーの分
子設計により、微量な化学基の蛍光像を得るための蛍光
効果を増幅させることができる。

【００６５】通常、内殻電子がπ＊軌道へ遷移する場合
の吸収断面積は、ラベラーが持っている二重結合の数に
比例する。したがって、ラベラーに、二重結合を持つ側
鎖を必要な数だけ付加することにより、ラベラーのＸ線
の吸収断面積を、側鎖の付加数に比例して高めることが
できる。付加する側鎖の数をｍ、側鎖を付加する前のラ
ベラーのＸ線吸収断面積をσｓとすると、側鎖付加後の
ラベラーのＸ線吸収断面積は、

【００６６】

【数５】

【００６７】となり、したがって、線吸収係数μは、

【００６８】

【数６】

【００６９】のようになる。たとえば、O-(4-Nitrobenz
yl)hydroxylamineは、二重結合を有するベンゼン環を一
つしか含んでいないが、これにｍ個のベンゼン環側鎖を
付加すると、発光する蛍光量がｍ倍となり、高感度で試
料の化学基の分布像を得ることができる。

【００７０】

【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って、コントラストを向上させるとともに、観察試料の
特定の化学基等の検出や微量な化学基等の検出を行うこ
とのできる、高性能な、新しいＸ線励起型蛍光顕微鏡が
提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】（ａ）（ｂ）は、各々、内殻電離過程と内殻励
起過程を例示した概念図である。

【図２】炭素原子において１ｓ電子が各ｐ軌道へ遷移す
る場合、および１ｓ電子が電離する場合における光子エ
ネルギーと吸収断面積との関係を例示した図である。

【図３】６員環分子において１ｓ電子がπ＊軌道へ遷移
する場合、および１ｓ電子が電離する場合における光子
エネルギーと吸収断面積との関係を例示した図である。

【図４】（ａ）（ｂ）（ｃ）は、各々、内各励起過程、
オージェ過程、脱励起過程におけるベンゼン環の炭素分
子の電子構造を例示した概念図である。

【図５】この発明の一実施例であるＸ線励起型蛍光顕微
鏡の構成を例示した概略図である。

【図６】（ａ）（ｂ）は、各々、図５のこの発明のＸ線
励起型蛍光顕微鏡における共焦点光学系の構成を例示し
た概略図である。

【図７】この発明の一実施例であるＸ線励起型蛍光顕微
鏡の構成を例示した概略図である。

【符号の説明】

１ シンクロトロン ２ 回折格子 ３ 斜入射集光レンズ ４ 第１ピンホール ５ フレネルゾーンプレート ６ 観察試料 ７ 可視・紫外光レンズ ８ 第２ピンホール ９ フォトマル １０ レーザーシステム １１ ミラー １２ レーザー光集光レンズ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｘ線を放射するＸ線光源と、Ｘ線光源か
   らのＸ線を観察試料上に集光するＸ線集光部と、Ｘ線集
   光部によるＸ線の集光点から発光する燐光および蛍光を
   集光する燐光・蛍光集光部と、燐光・蛍光集光部により
   集光された燐光および蛍光を検出する光検出器とを備え
   たＸ線励起型蛍光顕微鏡であって、光子エネルギー２０
   ００ｅＶ以下で単色化されたＸ線が用いられることを特
   徴とするＸ線励起型蛍光顕微鏡。
2. 【請求項２】 波長幅１ｅＶ以下で単色化されたＸ線が
   用いられることを特徴とする請求項１のＸ線励起型蛍光
   顕微鏡。
3. 【請求項３】 Ｘ線の光子エネルギーが２８０ｅＶ〜５
   ５０ｅＶであり、かつ波長可変であることを特徴とする
   請求項１のＸ線励起型蛍光顕微鏡。
4. 【請求項４】 Ｘ線光源が、シンクロトロン、レーザー
   プラズマ光源、プラズマ放電型Ｘ線光源、もしくは電子
   線励起型Ｘ線管のいずれかである請求項１ないし３のＸ
   線励起型蛍光顕微鏡
5. 【請求項５】 Ｘ線集光部にＸ線集光対物レンズが設け
   られており、このＸ線集光対物レンズが、フレネルゾー
   ンプレート、ウォルタータイプ、もしくは直入射型シュ
   バルツシルド光学型のいずれかである請求項１ないし４
   のＸ線励起型蛍光顕微鏡。
6. 【請求項６】 Ｘ線集光部に、Ｘ線光源からのＸ線の発
   光点を制限するピンホールが設けられ、また光検出器の
   前であって燐光・蛍光集光部に別のピンホールが設けら
   れており、Ｘ線集光部と燐光・蛍光集光部とが共焦点光
   学系を形成していることを特徴とする請求項４または５
   のＸ線励起型蛍光顕微鏡。
7. 【請求項７】 請求項１ないし６のＸ線励起型蛍光顕微
   鏡を用いる化学検出方法であって、二重結合を含む分子
   であるラベラーにより観察試料をラベリングすることを
   特徴とする化学検出方法。
8. 【請求項８】 ラベラーが５員環または６員環を含む請
   求項７の化学検出方法。
9. 【請求項９】 ラベラーがベンゼン環を含む請求項７の
   化学検出方法。
10. 【請求項１０】 光子エネルギーが２８０〜２９０ｅＶ
    であることを特徴とする請求項９の化学検出方法。
11. 【請求項１１】 Ｃ、Ｎ、Ｏを含む分子の１ｓ→π＊吸
    収を用いることを特徴とする請求項７の化学検出方法。