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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Beleuchtung
eines Objekts bei der Fluoreszenz-Mikroskopie, vorzugsweise bei
der konfokalen Fluoreszenz-Rastermikroskopie,
mit mindestens einer Anregungslichtquelle und mindestens einer Stimulationslichtquelle,
deren Licht über
einen Strahlvereiniger in einen zumindest teilweise gemeinsamen
Beleuchtungsstrahlengang einspeisbar und über einen Hauptstrahlteiler
zum Objekt leitbar ist, wobei das Objekt zur Emission anregt wird
und emittiertes Licht über
den Hauptstrahlteiler und den Detektionsstrahlengang zu einem Detektor
gelangt.
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Vorrichtungen
der gattungsbildenden Art sind insbesondere bei der konfokalen Fluoreszenz-Rastermikroskopie
aus der WO 95 21 393 (entspricht
DE 44 16 558 C2 ) bekannt. Bei dieser Vorrichtung
wird zur Erhöhung
der lateralen Auflösung
ein Probenpunkt mit einem Anregungslichtstrahl beleuchtet, wodurch
die hierdurch mit Anregungslicht beaufschlagten Fluoreszenzmoleküle in einen
angeregten Zustand versetzt werden. Der Probenpunkt wird darüber hinaus
mit einem Stimulationslichtstrahl geeigneter Wellenlänge beleuchtet,
wodurch Fluoreszenzmoleküle,
die sich im angeregten Zustand befinden, durch den Prozess der stimulierten
Emission wieder in den Grundzustand versetzten lassen. Der Anregungslichtstrahl
und der Stimulationslichtstrahl sind hierbei derart angeordnet,
dass ihre Intensitätsverteilungen
bzw. Beleuchtungsmuster im Objektbereich sich zumindest teilweise überdecken.
Die in dem Überdeckungsbereich
liegenden Fluoreszenzmoleküle
werden nach der Anregung mit dem Anregungslichtstrahl durch stimulierte
Emission sofort in den Grundzustand überführt, so dass ausschließlich von
den Fluoreszenzmolekülen
ausgehendes Fluoreszenzlicht detektiert wird, wobei sich die Fluoreszenzmoleküle im Beleuchtungsmuster des
Anregungsstrahls, jedoch nicht im Beleuchtungsmuster des Stimulationsstrahls
bzw. im Überdeckungsbereich
der beiden Beleuchtungsmuster befinden.
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Das
stimulierte Emissionslicht bzw. das reflektierte Stimulationslicht
wird bislang mit Hilfe optischer Filter aus dem Detektionsstrahlengang
des Rastermikroskops ausgefiltert, so dass lediglich Fluoreszenzlicht
aus dem Bereich des Beleuchtungsmusters des Anregungsstrahls detektiert
wird, der um den Überdeckungsbereich
der beiden Beleuchtungsmuster reduziert ist. Diese Reduktion ermöglicht die
Verkleinerung des zur Fluoreszenzemission beitragenden Objektbereichs
unter die Grenzen der beugungsbegrenzten Abbildung, und stellt somit
eine Auflösungsverbesserung
dar.
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Die
voranstehend geschilderte Art der Mikroskopie wird in Fachkreisen
STED (= Stimulated Emission Depletion) -Mikroskopie genannt. Wie
bereits zuvor erwähnt,
wird dort die Probe zunächst
mit einem Anregungslichtstrahl, beispielsweise mit gepulstem grünen Laserlicht,
optisch angeregt. Anschließend
erfolgt das sogenannte Quenchen, nämlich durch Bestrahlung mittels
Stimulationslicht, so dass eine stimulierte Emission der Probe in
einem Teilbereich des angeregten Fokusbereichs mit einer Wellenlänge erfolgt,
die mit dem Fluoreszenzspektrum des angeregten Farbstoffs überlappt.
Typischerweise liegt die stimulierte Emission im Bereich zwischen
700 und 800 mm. Die abseits der STED-Beleuchtung liegenden Bereiche
emittieren im Rahmen der „normalen" Fluoreszenz.
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Die
aus der Praxis bekannten STED-Mikroskope sind jedoch im Betrieb
problematisch, nämlich in
Bezug auf den Hauptstrahlteiler. Liegt beispielsweise das Fluoreszenzspektrum
des anzuregenden Farbstoffs im Bereich zwischen 650 mm und 800 mm,
so wird die Wellenlänge
des STED-Stimulationslichts so gewählt, dass sie auf jeden Fall
außerhalb
des Maximums des Fluoreszenzspektrums liegt, aber dennoch in einem
Bereich, in dem die Fluoreszenzkurve noch nicht all zu stark abgefallen
ist. So könnte
die Wellenlänge
des STED-Strahls beispielsweise bei 765 mm liegen. In einem solchen
Falle lässt
sich als Hauptstrahlteiler ein optisches Kantenfilter mit sehr steiler
Kante verwenden, mit dem der STED-Strahl auf die Probe reflektiert
wird und mit dem gleichzeitig ein Großteil des Fluoreszenzlichts zum
Detektor transmittiert wird. Aufgrund der spektralen Eigenschaften
des Strahlteilers wird die Fluoreszenzausbeute erheblich reduziert,
die in der STED-Mikroskopie aufgrund des ohnehin schon kleineren
Detektionsvolumens bereits – per
se – eingeschränkt ist.
Folglich ist eine optimale Auswahl der Wellenlänge des STED-Stimulationslichts
in der bisherigen STED-Mikroskopie nicht möglich. So gilt es stets einen
geeigneten Kompromiss zu finden, damit sich die STED-Technik in
der Mikroskopie überhaupt anwenden
lässt.
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Aus
der
DE 202 16 583
U1 ist ein Scanmikroskop bekannt mit zwei Laserlichtquellen
zur Erzeugung von zwei Anregungslichtstrahlen mit unterschiedlichen
Wellenlängen.
Die beiden Anregungslichtstrahlen werden über einen Strahlvereiniger
in einen gemeinsamen Beleuchtungsstrahlengang eingespeist und über einen
Hauptstrahlteiler zum Objekt geleitet. Detektionslicht wird über den
Hauptstrahlteiler zu einem Detektor geleitet. Der als akustooptisches
Bauteil ausgeführte
Hauptstrahlteiler dient zum Selektieren von Anteilen gewünschter
Wellenlängen
im Beleuchtungslichtstrahl.
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Aus
der
DE 101 37 158
A1 ist ein Scanmikroskop mit zwei Laserlichtquellen zur
Erzeugung von Anregungslichtstrahlen unterschiedlicher Wellenlängen bekannt,
wobei der als akustooptisches Bauteil ausgeführte Hauptstrahlteiler zum
Selektieren ausgewählter
Wellenlängen
im Beleuchtungslichtstrahl dient.
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Die
DE 100 01 954 A1 zeigt
ein Laserscanmikroskop mit einer Laserlichtquelle zur Beleuchtung eines
Objekts und einem Detektor zu Detektion des vom Objekt zurückkehrenden
Lichts, wobei der Detektor als Multibanddetektor zur gleichzeitigen
Detektion von Licht mit mehreren Wellenlängen ausgeführt ist. Der Hauptstrahlteiler
ist als Filter ausgeführt
und so ausgelegt, dass er Licht aller Wellenlängen mit Ausnahme eines schmalen
spektralen Bereichs der Beleuchtungs-Laserlichtquelle transmittieren
kann.
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Aus
der
DE 199 06 757
A1 ist ein Laserscanmikroskop mit einer zur Fluoreszenzanregung
geeigneten Lichtquelle bekannt. Das Mikroskop umfasst einen als
AOTF ausgeführten
Hauptstrahlteiler, mit dem am Objekt gestreutes und reflektiertes
Anregungslicht aus dem Detektionsstrahlengang ausblendbar ist.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung
zur Beleuchtung eines Objekts bei der Fluoreszenz-Mikroskopie anzugeben,
mit der eine möglichst
optimale Fluoreszenzausbeute erreicht werden kann.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
zur Beleuchtung eines Objekts bei der Fluoreszenz-Mikroskopie löst die voranstehende
Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist die gattungsbildende
Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass der Hauptstrahlteiler als
schaltbarer Strahlteiler ausgeführt
ist, der in Abhängigkeit
der eingestrahlten Lichtleistung des Stimulationslichts dann auf
Transmission schaltbar ist, wenn das Anregungsniveau im Bereich
des Stimulationslichts vernachlässigbar
geworden ist.
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In
erfindungsgemäßer Weise
ist zunächst
erkannt worden, dass die hier in Rede stehende Vorrichtung ein systemimmanentes
Problem in Bezug auf die Fluoreszenzausbeute mit sich bringt und
dass dieses Problem in erster Linie auf den Hauptstrahlteiler zurückzuführen ist.
Erfindungsgemäß wird daher der
Einsatz eines schaltbaren Strahlteilers vorgeschlagen, der in Abhängigkeit
der eingestrahlten Lichtleistung des Stimulationslichts auf Transmission schaltbar
ist, wenn das Anregungsniveau im Bereich des Stimulationslichts
vernachlässigbar
geworden ist. So ist bereits 200 ps nach Beginn der STED-Einstrahlung
das obere Anregungsniveau im STED-Bereich „leergeräumt", während
die normale Fluoreszenz noch einige ns anhält. Es ist erkannt worden, dass
sich mit einem derartigen schaltbaren Strahlteiler in zweifacher
Hinsicht eine Verbesserung der Fluoreszenzausbeute erreichen lässt. Zum
einen lässt sich
eine Transmission im Bereich des gesamten Fluoreszenzspektrums – mit Ausnahme
der schmalbandigen STED-Wellenlänge – erzielen,
zum anderen können
die eingestrahlten Anregungslichtleistungen bzw. Stimulationslichtleistungen
mittels einer Schaltbarkeit des Hauptstrahlteilers ideal aufeinander
abgestimmt werden, um die Fluoreszenzausbeute so weiter zu erhöhen.
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Der
Vorteil eines schaltbaren Strahlteilers geht aus folgender Überlegung
hervor: Das Fluoreszenzspektrum ist in der Regel sehr breitbandig.
Die Bandbreite liegt üblicherweise
im Bereich zwischen 100 und 200 nm. Dagegen ist die Wellenlänge des Stimulationslichts
(STED-Wellenlänge) üblicherweise
schmalbandig mit einer Bandbreite < 1
nm, bei Verwendung einer Pulsbreite von 50 bis 100 ps bis zu wenigen
nm bei nachträglich
verbreiterten fs-Pulsen. Ein schaltbarer Strahlteiler ermöglicht nun
eine extrem schmalbandige Reflexion, nämlich im Bereich der STED-Wellenlänge, bei
gleichzeitiger Transmission im Bereich des kompletten Fluoreszenzspektrums,
jedoch mit Ausnahme der schmalbandigen STED-Wellenlänge. Folglich
lässt sich
alleine durch die Verwendung eines schaltbaren Strahlteilers die Detektionseffizienz
und somit die Fluoreszenzausbeute gegenüber herkömmlichen Filtern als Hauptstrahlteiler
erheblich verbessern.
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Der
als Hauptstrahlteiler dienende schaltbare Strahlteiler ist in vorteilhafter
Weise variabel schaltbar. Somit lässt sich eine Anpassung an
die jeweilige Pulsbreite vornehmen.
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In
ganz besonders vorteilhafter Weise handelt es sich bei dem schaltbaren
Strahlteiler um einen AOBS (Acousto-Optical-Beam-Splitter). Die
Anwendung eines AOBS bei einem Laserscannmikroskop ist für sich gesehen
bekannt. Lediglich beispielhaft wird insoweit auf die
DE 199 06 757 A1 verwiesen. Die
Verwendung dieses akusto-optischen Bausteins als Hauptstrahlteiler
ist unproblematisch, wenn die Wellenlänge des Stimulationslichts
genau im Fluoreszenzspektrum liegt. Von weiterem Vorteil ist dabei,
dass der schaltbare Strahlteiler – AOBS – eine extrem schmalbandige
Reflexion im Bereich der Wellenlänge
des Stimulationslichts (STED-Wellenlänge) bei
gleichzeitiger Transmission im Bereich des kompletten Fluoreszenzspektrums,
jedoch mit Ausnahme der schmalbandigen STED-Wellenlänge, aufweist. Jedenfalls
wird dadurch die Detektionseffizienz gegenüber herkömmlichen Strahlteilern bzw.
Filtern erheblich verbessert.
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Bei
einem AOBS handelt es sich um einen schnell schaltbaren Strahlteiler,
der so ausgelegt und geschaltet sein kann, dass nach etwa 0,5 ns
seit Einschalten des Stimulationslichts der Strahlteiler auf Transmission
geschaltet wird, wodurch am Detektor eine ideale Fluoreszenzausbeute
erreicht werden kann. Im nächsten
Zyklus, typischerweise nach 10 ns, kann dann der Strahlteiler wieder
auf „Beleuchtung" geschaltet werden.
Dieser Vorgang lässt
sich beliebig wiederholen. Dabei lässt sich sogar die STED-Wellenlänge selbst
detektieren, nämlich
dann, wenn nach ca. 0,5 ns insgesamt auf Transmission geschaltet
wird.
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Zu
Beginn ist bereits ausgeführt
worden, dass das Anregungslicht von einer Anregungslichtquelle und
das Stimulationslicht von einer Stimulationslichtquelle kommt. Alternativ
dazu könnte
sowohl das Anregungslicht als auch das Stimulationslicht von einer
einzigen Lichtquelle kommen, so beispielsweise von einer Laserlichtquelle,
die Licht mindestens zweier unterschiedlicher Wellenlängen zur
Verfügung
stellt.
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Des
Weiteren ist es denkbar, dass mehrere Stimulationslichtquellen vorgesehen
sind, deren Licht simultan oder sequentiell eingespeist wird. Im Falle
einer sequentiellen Einspeisung des Stimulationslichts sollte dies
vorzugsweise im schnellen Wechsel erfolgen. Mit einer solchen Anordnung
ist die Verwendung von mehreren STED-Strahlen für einen Farbstoff oder für mehrere
Farbstoffe möglich.
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Für das Stimulationslicht
sind nur geringe Leistungen von einigen 10 mW und relativ langen Pulsbreiten
im Bereich von 40 bis 100 ps erforderlich. Berücksichtigt man dies, so ist
es denkbar, als Stimulationslichtquellen vorzugsweise gepulste Laserdioden
zu verwenden. Unter Verwendung von Laserdioden ist es dann weiter
denkbar, diese in einer Art Batterie von Laserdioden mit verschiedenen
Wellenlängen
anzuordnen, deren Licht je nach Anwendung in geeigneter Weise auf
die zu stimulierende Probe eingestrahlt wird. Durch diese Maßnahme ist
ein höchstes
Maß an
Flexibilität
gegeben.
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Es
gibt nun verschiedene Möglichkeiten,
die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten
und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch
1 nachgeordneten Patentansprüche
und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels
der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit
der Erläuterung
des bevorzugten Ausführungsbeispiels
der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte
Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In
der Zeichnung zeigt die einzige
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Fig.
in einem schematische Blockschaltbild den prinzipiellen Aufbau einer
erfindungsgemäßen Vorrichtung
in einem Fluoreszenz-Mikroskop.
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Die
einzige Fig. zeigt eine Vorrichtung zur Beleuchtung eines Objekts 1 bei
der Fluoreszenz-Rastermikroskopie. Das Fluoreszenz-Rastermikroskop
weist einen Beleuchtungsstrahlengang 2 einer Anregungslichtquelle 3 auf,
der zur punktförmigen
Fluoreszenzanregung des Objekts 1 dient. Zur stimulierten
Emission von Fluoreszenzmolekülen
in einem definierten Objektbereich des Objekts 1 dient ein
weiterer Beleuchtungsstrahlengang 4 einer weiteren Lichtquelle,
die fortan als Stimulationslichtquelle 5 bezeichnet wird.
Die Beleuchtungsstrahlengänge 2, 4 werden über einen
Strahlvereiniger 6 zusammengeführt.
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Der
weiterführende
Beleuchtungsstrahlengang 7 führt über ein Anregungspinhole 8 zu
einem Hauptstrahlteiler 9, durch den das Anregungs-/Stimulationslicht über eine Scanneinrichtung 10,
eine Linsenanordnung 11 und schließlich über das Objektiv 12 zu
dem Objekt 1 leitbar ist.
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Das
Objekt 1 bzw. dort entsprechend markierte Bereiche werden
zur Emission angeregt, und zwar einerseits durch das Anregungslicht
und andererseits durch das Stimulationslicht gemäß den Ausführungen in der Beschreibungseinleitung
im Sinne der zuvor erörterten
STED-Anwendung. Das emittierte Licht 13 gelangt über den
Hauptstrahlteiler 9 und ein Detektionspinhole 14 über einen
Detektionsstrahlengang 16 zu einem Detektor 15.
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Erfindungsgemäß ist der
Hauptstrahlteiler 9 als schaltbarer Strahlteiler ausgeführt, der
in Abhängigkeit
der eingestrahlten Lichtleistung des Stimulationslichts dann auf
Transmission schaltbar ist, wenn das Anregungsniveau im Bereich
des Stimulationslichts vernachlässigbar
geworden ist, wobei hier im Konkreten ein variabel schaltbarer AOBS
Verwendung findet. Der AOBS ist derart ausgelegt und schaltbar,
dass er im Bereich der Wellenlänge
des Stimulationslichts schmalbandig reflektiert und im Bereich des
Fluoreszenzspektrums – mit
Ausnahme der Wellenlänge
des Stimulationslicht – gleichzeitig transmittiert,
so dass eine gegenüber
herkömmlichen Filtern
erhebliche Steigerung der Detektionseffizienz erreicht wird.
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Zur
Vermeidung von Wiederholungen wird ansonsten auf den allgemeinen
Teil der Beschreibung verwiesen.
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Schließlich sei
angemerkt, dass das voranstehend erörterte Ausführungsbeispiel der beispielhaften
Erörterung
der beanspruchten Lehre dient, diese jedoch nicht auf das Ausführungsbeispiel
einschränkt.