DE102004031048A1

DE102004031048A1 - Mikroskop

Info

Publication number: DE102004031048A1
Application number: DE102004031048A
Authority: DE
Inventors: Werner Dr. Knebel; Volker Dr. Seyfried; Jan Schröder
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2004-06-25
Filing date: 2004-06-25
Publication date: 2006-01-12
Also published as: US20050286122A1; JP2006011440A; JP4932184B2

Abstract

Ein Mikroskop, insbesondere Fluoreszenzmikroskop, mit mindestens einer Lichtquelle, einem das Licht zu einer Probe (1) führenden Beleuchtungsstrahlengang, einem Detektor (5) sowie einem das Detektionslicht (2) von der Probe (1) zum Detektor (5) führenden Detektionsstrahlengang (3) ist dadurch gekennzeichnet, dass im Detektionsstrahlengang (3) ein ansteuerbares Element zur Regulierung und/oder Begrenzung der Lichtleistung im Detektionsstrahlengang (3) vorgesehen ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop, insbesondere ein Fluoreszenzmikroskop, mit mindestens einer Lichtquelle, einem das Licht zu einer Probe führenden Beleuchtungsstrahlengang, einem Detektor sowie einem das Detektionslicht von der Probe zum Detektor führenden Detektionsstrahlengang.
Mikroskope der hier in Rede stehenden Art werden seit langem in den unterschiedlichsten Ausführungsformen für eine Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen eingesetzt. Bei einigen Anwendungen, insbesondere bei einigen Fluoreszenz-Experimenten, tritt das Problem auf, dass in der untersuchten Probe Strahlung hoher Intensität erzeugt wird und somit Detektionslicht hoher Intensität entlang des Detektionsstrahlengangs zum Detektor geführt wird. Dabei kann es vorkommen, dass die auf den Detektor treffende Strahlungsmenge zu groß ist, um von dem Detektor im Rahmen seiner technischen Möglichkeiten verarbeitet werden zu können. Neben erheblichen Einbußen in der Bildqualität aufgrund eines durch die hohe Lichtintensität verursachten nichtlinearen Verhaltens des Detektors kann ein zu hoher Strahlungseintrag auch ursächlich für eine Beschädigung des Detektors sein oder u. U. sogar die vollständige Zerstörung des Detektors zur Folge haben.
Als Beispiel für den beschriebenen Effekt seien Fluoreszenz-Experimente genannt, die im sog. FlyMode durchgeführt werden, bspw. FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) oder FLIP (fluorescence loss in photobleaching). Dabei handelt es sich um ein Untersuchungsverfahren, bei dem eine Probe bidirektional gescannt wird, indem ein Beleuchtungslichtstrahl mit hoher Geschwindigkeit über die zu untersuchende Probe geführt wird. Als Detektoren werden für derartige Experimenten im Allgemeinen Photomultiplier eingesetzt. Dabei können im Konkreten zwei gravierende Probleme auftreten: Zum einen können aufgrund der hohen Scangeschwindigkeit im FlyMode die im Photomultiplier entstehenden Ladungsmengen nicht schnell genug abgebaut und verarbeitet werden. Unbrauchbare Bildaufnahmen sind die Folge. Zum anderen können bedingt durch die hohe Intensität der auf den Detektor auftreffenden Fluoreszenzstrahlung Beschädigungen des Detektors, insbesondere Beschädigungen der empfindlichen Photokathode des Photomultipliers, hervorgerufen werden.
Eine Versuchsklasse, bei der die beschriebenen Probleme häufig auftreten, sind die oben bereits erwähnten FRAP-Experimente. Bei dieser Art von Versuchen wird eine vorgebbare ROI (region of interest) zunächst mit niedriger Lichtintensität bestrahlt und sodann mit hoher Lichtintensität gebleicht. Im Anschluss daran wird der zeitliche Verlauf der Regeneration der Fluoreszenzstrahlung gemessen. Der Recovery-Prozess kann passiv, bspw. durch freie Diffusion, oder durch aktive Transportprozesse erfolgen. Als Fluorochrom, mit dem die molekulare Mobilität, d.h. die Bewegung von Molekülen aus ungebleichten Bereichen der Probe in den gebleichten Probenbereich hinein, nachgewiesen wird, werden häufig FITC (Fluoreszeinisothiocyanat) oder GFP-Derivate verwendet. Insbesondere während des Bleichvorgangs kann es auch bei dieser Art von Experimenten zu einer übermäßig hohen Belastung des Detektors kommen.

Der vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop der eingangs genannten Art anzugeben, mit dem auch beim Vorliegen kritischer Versuchsparameter wie bspw. hoher Scangeschwindigkeit und/oder starker Anregungsstrahlung bei Bleichvorgängen eine störungsfreie Bildaufnahme möglich und eine negative Beeinträchtigung des Detektors vermieden ist.

Erfindungsgemäß wird die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1 gelöst. Danach ist das in Rede stehende Mikroskop derart ausgebildet, dass im Detektionsstrahlengang ein ansteuerbares Element zur Regulierung und/oder Begrenzung der Lichtleistung im Detektionsstrahlengang vorgesehen ist.

In erfindungsgemäßer Weise ist zunächst erkannt worden, dass bei bestimmten mikroskopischen Untersuchungsverfahren die Menge der von der Probe ausgehenden und auf den Detektor auftreffenden Detektionsstrahlung eine kritische Größe sowohl im Hinblick auf die Qualität der Bildaufnahme als auch im Hinblick auf Beschädigungen des Detektors darstellt. Zur Vermeidung derartiger Beschädigungen ist erfindungsgemäß ein ansteuerbares Element im Detektionsstrahlengang vorgesehen, mit dessen Hilfe die auf den Detektor auftreffende Detektionsstrahlung reguliert und/oder begrenzt werden kann. Durch die erfindungsgemäße Anordnung entfällt bspw. die Notwendigkeit einer starker Fluoreszenz und sehr schnellem Scannen kann – bspw. auch während eines Bleichvorgangs – eine störungsfreie Bildaufnahme mit reduzierter Lichtintensität durchgeführt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein schnell schaltbares Element vorgesehen, wobei „schnell" in diesem Zusammenhang bedeutet, dass eine zeitliche Synchronisation zwischen dem Scanvorgang einerseits und Schaltvorgängen an dem steuerbaren Element andererseits möglich ist. Bei einer hinreichend hohen Schnelligkeit der Schaltbarkeit kann das Element während eines Scanvorgangs nicht nur frameweise oder linienweise, sondern pixelweise oder sogar subpixelweise geschaltet werden. Die auf den Detektor auftreffende Strahlungsmenge kann bei einer pixelweisen oder subpixelweisen Schaltbarkeit des steuerbaren Elements mit extrem hoher Genauigkeit reguliert werden, so dass Übersteuerungen des Detektors während des gesamten Scanvorgangs effektiv vermieden werden.

Insbesondere bei Versuchen, bei denen auf dem Hinweg des Scanners die Probe gebleicht und auf dem Rückweg beobachtet wird, ist eine linienweise Schaltbarkeit des Elements besonders vorteilhaft. Dabei kann das Element während des Bleichens z.B. derart geschaltet sein, dass die freigesetzte Fluoreszenzstrahlung vollständig ausgeblendet wird. Da jedoch auch während des Bleichenvorgangs spezielle Informationen über die Struktur der Probe gewonnen werden können, ist es vorzuziehen, anstelle eines vollständigen Ausblendens die Fluoreszenzstrahlung lediglich abzuschwächen. Das Element kann dabei auf dem Hinweg des Scanners so geschaltet sein, dass nur soviel Fluoreszenzstrahlung zum Detektor gelangt, dass dieser gerade noch in seinem dynamischen Bereich arbeitet. Auf diese Weise kann zumindest der relative Verlauf der Intensität der Fluoreszenzstrahlung auch während des Bleichprozesses beobachtet werden.

In besonders vorteilhafter Weise könnte vorgesehen sein, dass das Element programmierbar ist. So ist es denkbar, dass die Schaltzustände des steuerbaren Elements bereits vor einer Messung für den gesamten Scanvorgang festlegbar sind. Dies bietet sich insbesondere dann an, wenn die im Detektionsstrahlengang voraussichtlich zu erwartende Strahlungsintensität bereits vor der Messung innerhalb der zu untersuchenden ROI zumindest annähernd bekannt ist. Andernfalls kann das Element in Abhängigkeit von der jeweils detektierten Strahlungsmenge online während der Messung geschaltet werden.

Im Hinblick auf eine hohe Flexibilität kann ein steuerbares Element im Detektionsstrahlengang angeordnet werden, welches wellenlängenspezifisch wirkt. Auf diese Weise können bspw. im Detektionsstrahlengang vorhandene Anteile an Beleuchtungslicht gezielt aus dem Detektionsstrahlengang entfernt werden, so dass das eigentlich interessierende (Fluoreszenz)Detektionslicht nicht durch störendes Anregungslicht, dessen Intensität die Intensität des Detektionslichts oftmals um Größenordnungen übersteigt, überlagert wird. Zusätzlich oder alternativ kann das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht bspw. über das gesamte Spektrum gleichmäßig abgeschwächt oder auch spektralsensitiv abgeschwächt werden.

Im Konkreten könnte es sieh bei dem steuerbaren Element um einen akusto-optischen Modulator (AOM) oder einen akusto-optischen Deflektor (AOD) handeln. Es hat sich gezeigt, dass sich die genannten Bauteile besonders gut zur Abschwächung bzw. zur vollständigen Entfernung von Fluoreszenzlicht aus dem Detektionsstrahlengang eignen. Zur Ausblendung bzw. zur möglichst vollständigen Unterdrückung von im Detektionsstrahlengang vorhandenem Anregungslicht – in der Praxis handelt es sich dabei im Allgemeinen um im System entstandenes Anregungsstreulicht – bietet sich insbesondere der Einsatz eines akusto-optischen Filters (AOTF) an.

Anstelle eines akusto-optischen Elements können zur Regulierung der Lichtleistung des im Detektionsstrahlengang vorhandenen Fluoreszenzlichts auch ein LCD (liquid crystal display) oder ein LCTF (liquid crystal tunable filter) eingesetzt werden.

Ebenso ist die Verwendung eines grating light valve (GLV) denkbar. Bei diesen elektrisch steuerbaren Beugungsgittern wird der auftreffende Detektionslichtstrahl je nach der an dem Gitter anliegenden Spannung (entsprechend einem bestimmten Gitterabstand) reflektiert oder gebeugt. Da die das Gitter bildenden Keramikbänder zur Änderung der Reflexions- und/oder Beugungscharakteristik des Gitters nur minimal durchbiegen müssen, bietet sich der Einsatz dieser Lichtventile insbesondere dann an, wenn eine schnelle Schaltbarkeit gefordert ist.

Für einfache Anwendungen, bei denen insbesondere keine wellenlängenspezifische Abschwächung erforderlich ist, kann ein Galvanometer als steuerbares Element eingesetzt werden.

Als Alternative zum Einsatz eines einzigen steuerbaren Elements im Detektionsstrahlengang können im Hinblick auf eine besonders hohe Flexibilität der Anordnung mehrere, vorzugsweise zwei steuerbare Elemente vorgesehen sein. So könnte ein erstes steuerbares Element derart gewählt sein, dass es speziell die Ausblendung von Anregungsstreulicht ermöglicht, während das zweite ansteuerbare Element zur wellenlängenspezifischen Unterdrückung von Fluoreszenzlicht ausgelegt sein könnte.

Damit das mittels des steuerbaren Elements oder der steuerbaren Elemente aus dem Detektionsstrahlengang herausgeführte Licht nicht an Komponenten des Systems streut und dadurch evtl. Störungen verursacht, können in vorteilhafter Weise eine oder mehrere Strahlfallen vorgesehen sein, in denen das aus dem Detektionsstrahlengang herausgeführte Licht aufgefangen wird.

Im Hinblick auf die Positionierung des steuerbaren Elements im Detektionsstrahlengang kann vorgesehen sein, dass das ansteuerbare Element vor einem Detektionspinhole angeordnet ist. Wird das Mikroskop mit einem dem Detektionspinhole vorgeschalteten Achromaten betrieben, so bietet sich insbesondere eine Positionierung des steuerbaren Elements vor dem Achromaten an.

Auch eine Positionierung des steuerbaren Elements nach dem Detektionspinhole kann in manchen Fällen sinnvoll sein.

Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Ansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert.
In der Zeichnung zeigt
die einzige Figur in einer schematischen Seitenansicht ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops.
Die Figur zeigt – schematisch – den prinzipiellen Aufbau eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops. Dabei wird das von der Probe 1 ausgehende Detektionslicht 2 entlang eines Detektionsstrahlengangs 3 auf einen als Photomultiplier 4 ausgeführten Detektor 5 geführt. Das nicht dargestellte Beleuchtungslicht wird entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs über einen Strahlteiler 6 und ein Objektiv 7 auf die Probe 1 geführt. Das Detektionslicht 2 durchläuft Objektiv 7 und Strahlteiler 6 in umgekehrter Reihenfolge.
Im Detektionsstrahlengang 3 sind vor dem Photomultiplier 4 zwei steuerbare Elemente zur Regulierung und/oder Begrenzung der Lichtleistung im Detektionsstrahlengang 3 angeordnet. Im Konkreten handelt es sich dabei in dem illustrierten Ausführungsbeispiel um einen AOTF 8 sowie um einen AOM 9.
Der AOTF 8 wird von einer akustischen Welle durchlaufen, die von einem von einer Hochfrequenzquelle angesteuerten Piezo-Schallerzeuger generiert wird. Beide Bauteile – Hochfrequenzquelle und Piezo-Schallerzeuger – sind aus Gründen der Übersichtlichkeit in der Figur nicht dargestellt. Durch Veränderung der Frequenz der den AOTF 8 durchlaufenden Wellen kann der AOTF 8 so geschaltet werden, dass bestimmte Anteile an Wellenlängen aus dem Detektionsstrahlengang 3 entfernt werden und nicht auf den Photomultiplier 4 treffen. Die erwünschten Wellenlängenanteile werden von der akustischen Anregung nicht beeinflusst und nicht aus dem Detektionsstrahlengang 3 ausgeblendet. Bei den unerwünschten Wellenlängenanteilen handelt es sich um störendes Anregungsstreulicht 10, das in der Lichtfalle 11 gefangen wird.
Der AOTF 8 wird vorzugsweise so betrieben, dass das Detektionslicht 2 den Kristall in 0. Ordnung durchläuft, während das zu entfernende Licht in +1. oder in –1. Ordnung abgelenkt wird. Die Kristalleingangs- bzw. -ausgangsflächen sind vorzugs weise so geschnitten, dass für den Strahl 0. Ordnung (Detektionsstrahl) keine Dispersion auftritt. In der Regel sind die Flächen daher parallel.
Hinter dem AOTF 8 befindet sich als weiteres steuerbares Element der AOM 9. Durch Verändern der am AOM 9 anliegenden RF-Leistung kann dessen Beugungseffizienz verändert werden. Im dargestellten Ausführungsbeispiel ist der AOM 9 derart geschaltet, dass unerwünschte Wellenlängenanteile 12 des von der Probe 1 emittierten Fluoreszenzlichts aus dem Detektionsstrahlengang 3 ausgeblendet und in der Strahlfalle 13 absorbiert werden.
Der AOM 9 wird vorzugsweise so betrieben, dass die 0. Ordnung des gebeugten Lichts für die Detektion und die 1. Ordnung zur Lichtunterdrückung benutzt wird.
Das hinter dem AOTF 8 und dem AOM 9 im Detektionsstrahlengang 3 verbleibende Detektionslicht 2 passiert einen Achromaten 14 und ein Detektionspinhole 15 und trifft schließlich auf den Photomultiplier 4. Dieses Detektionslicht 2 ist im Hinblick auf die Lichtleistung – wellenlängenspezifisch – derart begrenzt, dass der Photomultiplier 4 nicht übersteuert und die auftreffende Lichtleistung problemlos, d.h. insbesondere mit einem linearen Ansprechverhalten, verarbeiten kann. Beschädigungen oder gar die Zerstörung des Photomultipliers 4 durch einen zu hohen Lichteintrag sind somit effektiv vermieden.
Es sein angemerkt, dass anstelle des Photomultipliers 4 auch andere Detektoren wie eine CCD mit Bildverstärker, eine Avalanche-Photo-Diode (APD); eine EMCCD (Electron Multiplying CCD), etc. zum Einsatz kommen können.
Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen, dass das voranstehend erörterte Ausführungsbeispiel lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dient, diese jedoch nicht auf das Ausführungsbeispiel einschränkt.

Claims

Mikroskop, insbesondere Fluoreszenzmikroskop, mit mindestens einer Lichtquelle, einem das Licht zu einer Probe (1) führenden Beleuchtungsstrahlengang, einem Detektor (5) sowie einem das Detektionslicht (2) von der Probe (1) zum Detektor (5) führenden Detektionsstrahlengang (3), dadurch gekennzeichnet, dass im Detektionsstrahlengang (3) ein ansteuerbares Element zur Regulierung und/oder Begrenzung der Lichtleistung im Detektionsstrahlengang (3) vorgesehen ist.
Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Element schnell schaltbar ist.
Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Element frameweise, linienweise, pixelweise oder subpixelweise schaltbar ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Element programmierbar ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Element wellenlängenspezifisch wirkt.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Element als akustooptischer Modulator (AOM) (9) oder als akustooptischer Deflektor (AOD) ausgeführt ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Element als akusto-optischer Filter (AOTF) (8), vorzugsweise mit parallelen Endflächen, ausgeführt ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Element als LCD (liquid crystal display) oder als LCTF (liquid crystal tunable filter) ausgeführt ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Element als GLV (grating light valve) ausgeführt ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Element als Galvanometer ausgeführt ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Elemente im Detektionsstrahlengang (3) vorgesehen sind.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 11, gekennzeichnet durch eine Strahlfalle (11, 13) zum Auffangen des aus dem Detektionsstrahlengang (3) herausgeführten Lichts.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Element vor einem Detektionspinhole (15) positioniert ist.
Mikroskop nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Element vor einem dem Detektionspinhole (15) vorgeschalteten Achromaten (14) positioniert ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Element hinter einem Detektionspinhole (15) positioniert ist.