DE10313138A1

DE10313138A1 - Vorrichtung zur Beleuchtung eines Objekts

Info

Publication number: DE10313138A1
Application number: DE2003113138
Authority: DE
Inventors: Frank Schreiber; Kyra Dr. Möllmann
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2003-03-24
Filing date: 2003-03-24
Publication date: 2004-10-21
Anticipated expiration: 2023-03-25
Also published as: DE10313138B4

Abstract

Eine Vorrichtung zur Beleuchtung eines Objekts (1) bei der Fluoreszenz-Mikroskopie, vorzugsweise bei der konfokalen Fluoreszenz-Rastermikroskopie, mit mindestens einer Anregungslichtquelle (3) und mindestens einer Stimulationslichtquelle (5), deren Licht über einen Strahlvereiniger (6) in einen zumindest teilweise gemeinsamen Beleuchtungsstrahlengang (7) einspeisbar und über einen Hauptstrahlteiler (9) zum Objekt (1) leitbar ist, wobei das Objekt (1) zur Emission angeregt wird und emittiertes Licht (13) über den Hauptstrahlteiler (9) und den Detektionsstrahlengang (16) zu einem Detektor (15) gelangt, ist dadurch gekennzeichnet, dass der Hauptstrahlteiler (9) als schaltbarer Strahlteiler ausgeführt ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Beleuchtung eines Objekts bei der Fluoreszenz-Mikroskopie, vorzugsweise bei der konfokalen Fluoreszenz-Rastermikroskopie, mit mindestens einer Anregungslichtquelle und mindestens einer Stimulationslichtquelle, deren Licht über einen Strahlvereiniger in einen zumindest teilweise gemeinsamen Beleuchtungsstrahlengang einspeisbar und über einen Hauptstrahlteiler zum Objekt leitbar ist, wobei das Objekt zur Emission anregt wird und emittiertes Licht über den Hauptstrahlteiler und den Detektionsstrahlengang zu einem Detektor gelangt.

Vorrichtungen der gattungsbildenden Art sind insbesondere bei der konfokalen Fluoreszenz-Rastermikroskopie aus der WO 95 21 393 (entspricht DE 44 16 558 C2 ) bekannt. Bei dieser Vorrichtung wird zur Erhöhung der lateralen Auflösung ein Probenpunkt mit einem Anregungslichtstrahl beleuchtet, wodurch die hierdurch mit Anregungslicht beaufschlagten Fluoreszenzmoleküle in einen angeregten Zustand versetzt werden. Der Probenpunkt wird darüber hinaus mit einem Stimulationslichtstrahl geeigneter Wellenlänge beleuchtet, wodurch Fluoreszenzmoleküle, die sich im angeregten Zustand befinden, durch den Prozess der stimulierten Emission wieder in den Grundzustand versetzten lassen. Der Anregungslichtstrahl und der Stimulationslichtstrahl sind hierbei derart angeordnet, dass ihre Intensitätsverteilungen bzw. Beleuchtungsmuster im Objektbereich sich zumindest teilweise überdecken. Die in dem Überdeckungsbereich liegenden Fluoreszenzmoleküle werden nach der Anregung mit dem Anregungslichtstrahl durch stimulierte Emission sofort in den Grundzustand überführt, so dass ausschließlich von den Fluoreszenzmolekülen ausgehendes Fluoreszenzlicht detektiert wird, wobei sich die Fluoreszenzmoleküle im Beleuchtungsmuster des Anregungsstrahls, jedoch nicht im Beleuchtungsmuster des Stimulationsstrahls bzw. im Überdeckungsbereich der beiden Beleuchtungsmuster befinden.

Das stimulierte Emissionslicht bzw. das reflektierte Stimulationslicht wird bislang mit Hilfe optischer Filter aus dem Detektionsstrahlengang des Rastermikroskops ausgefiltert, so dass lediglich Fluoreszenzlicht aus dem Bereich des Beleuchtungsmusters des Anregungsstrahls detektiert wird, der um den Überdeckungsbereich der beiden Beleuchtungsmuster reduziert ist. Diese Reduktion ermöglicht die Verkleinerung des zur Fluoreszenzemission beitragenden Objektbereichs unter die Grenzen der beugungsbegrenzten Abbildung, und stellt somit eine Auflösungsverbesserung dar.

Die voranstehend geschilderte Art der Mikroskopie wird in Fachkreisen STED (= Stimulated Emission Depletion) -Mikroskopie genannt. Wie bereits zuvor erwähnt, wird dort die Probe zunächst mit einem Anregungslichtstrahl, beispielsweise mit gepulstem grünen Laserlicht, optisch angeregt. Anschließend erfolgt das sogenannte Quenchen, nämlich durch Bestrahlung mittels Stimulationslicht, so dass eine stimulierte Emission der Probe in einem Teilbereich des angeregten Fokusbereichs mit einer Wellenlänge erfolgt, die mit dem Fluoreszenzspektrum des angeregten Farbstoffs überlappt. Typischerweise liegt die stimulierte Emission im Bereich zwischen 700 und 800 mm. Die abseits der STED-Beleuchtung liegenden Bereiche emittieren im Rahmen der „normalen" Fluoreszenz.

Die aus der Praxis bekannten STED-Mikroskope sind jedoch im Betrieb problematisch, nämlich in Bezug auf den Hauptstrahlteiler. Liegt beispielsweise das Fluoreszenzspektrum des anzuregenden Farbstoffs im Bereich zwischen 650 mm und 800 mm, so wird die Wellenlänge des STED-Stimulationslichts so gewählt, dass sie auf jeden Fall außerhalb des Maximums des Fluoreszenzspektrums liegt, aber dennoch in einem Bereich, in dem die Fluoreszenzkurve noch nicht all zu stark abgefallen ist. So könnte die Wellenlänge des STED-Strahls beispielsweise bei 765 mm liegen. In einem solchen Falle lässt sich als Hauptstrahlteiler ein optisches Kantenfilter mit sehr steiler Kante verwenden, mit dem der STED-Strahl auf die Probe reflektiert wird und mit dem gleichzeitig ein Großteil des Fluoreszenzlichts zum Detektor transmittiert wird. Aufgrund der spektralen Eigenschaften des Strahlteilers wird die Fluoreszenzausbeute erheblich reduziert, die in der STED-Mikroskopie aufgrund des ohnehin schon kleineren Detektionsvolumens bereits – per se – eingeschränkt ist. Folglich ist eine optimale Auswahl der Wellenlänge des STED-Stimulationslichts in der bisherigen STED-Mikroskopie nicht möglich. So gilt es stets einen geeigneten Kompromiss zu finden, damit sich die STED-Technik in der Mikroskopie überhaupt anwenden lässt.

Der vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Beleuchtung eines Objekts bei der Fluoreszenz-Mikroskopie anzugeben, durch de ren Anwendung die STED-Mikroskopie bei hinreichender Fluoreszenzausbeute anwendbar ist.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Beleuchtung eines Objekts bei der Fluoreszenz-Mikroskopie löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist die gattungsbildende Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass der Hauptstrahlteiler als schaltbarer Strahlteiler ausgeführt ist.

Erfindungsgemäß ist zunächst einmal erkannt worden, dass die hier in Rede stehende Vorrichtung bzw. optische Anordnung ein systemimmanentes Problem in Bezug auf die Fluoreszenzausbeute mit sich bringt, welches in erster Linie auf den Hauptstrahlteiler zurückzuführen ist. So ist weiter erkannt worden, dass ein „starrer" Hauptstrahlteiler stets einen Kompromiss fordert, der aufgrund der sich überlappenden Wellenlängen des Anregungslichts und des Stimulationslichts zu Ungunsten der Fluoreszenzausbeute ausfällt. Eine Lösung des Problems lässt sich dadurch herbeiführen, dass ein schaltbarer Strahlteiler als Hauptstrahlteiler verwendet wird. Der Vorteil eines schaltbaren Strahlteilers geht aus folgender Überlegung hervor:
Das Fluoreszenzspektrum ist in der Regel sehr breitbandig. Die Bandbreite liegt üblicherweise im Bereich zwischen 100 und 200 nm. Dagegen ist die Wellenlänge des Stimulationslichts (STED-Wellenlänge) üblicherweise schmalbandig mit einer Bandbreite < 1 nm, bei Verwendung einer Pulsbreite von 50 bis 100 ps bis zu wenigen nm bei nachträglich verbreiterten fs-Pulsen. Ein schaltbarer Strahlteiler ermöglicht nun eine extrem schmalbandige Reflexion, nämlich im Bereich der STED-Wellenlänge, bei gleichzeitiger Transmission im Bereich des kompletten Fluoreszenzspektrums, jedoch mit Ausnahme der schmalbandigen STED-Wellenlänge. Folglich lässt sich alleine durch die Verwendung eines schaltbaren Strahlteilers die Detektionseffizienz und somit die Fluoreszenzausbeute gegenüber herkömmlichen Filtern als Hauptstrahlteiler erheblich verbessern.

Der als Hauptstrahlteiler dienende schaltbare Strahlteiler ist in vorteilhafter Weise nicht nur schaltbar, sondern obendrein variabel schaltbar. Somit lässt sich eine Anpassung an die jeweilige Pulsbreite vornehmen.

In ganz besonders vorteilhafter Weise handelt es sich bei dem schaltbaren Strahlteiler um einen AOBS (Acousto-Optical-Beam-Splitter). Die Anwendung eines AOBS bei einem Laserscannmikroskop ist für sich gesehen bekannt. Lediglich beispielhaft wird insoweit auf die DE 199 06 757 A1 verwiesen. Die Verwendung dieses akusto-optischen Bausteins als Hauptstrahlteiler ist unproblematisch, wenn die Wellenlänge des Stimulationslichts genau im Fluoreszenzspektrum liegt. Von weiterem Vorteil ist dabei, dass der schaltbare Strahlteiler – AOBS – eine extrem schmalbandige Reflexion im Bereich der Wellenlänge des Stimulationslichts (STED-Wellenlänge) bei gleichzeitiger Transmission im Bereich des kompletten Fluoreszenzspektrums, jedoch mit Ausnahme der schmalbandigen STED-Wellenlänge, aufweist. Jedenfalls wird dadurch die Detektionseffizienz gegenüber herkömmlichen Strahlteilern bzw. Filtern erheblich verbessert.

In weiter vorteilhafter Weise erfolgt die stimulierte Emission quasi instantan, wobei der Strahlteiler bzw. AOBS in Abhängigkeit von der eingestrahlten Lichtleistung des Stimulationslichts dann auf Transmission schaltbar ist, wenn das Anregungsniveau im Bereich des Stimulationslichts vernachlässigbar geworden ist. So ist bereits 200 ps nach Beginn der STED-Einstrahlung das obere Anregungsniveau im STED-Bereich „leergeräumt", während die normale Fluoreszenz noch einige ns anhält.

Bei einem AOBS handelt es sich um einen schnell schaltbaren Strahlteiler, der so ausgelegt und geschaltet sein kann, dass nach etwa 0,5 ns seit Einschalten des Stimulationslichts der Strahlteiler auf Transmission geschaltet wird, wodurch am Detektor eine ideale Fluoreszenzausbeute erreicht werden kann. Im nächsten Zyklus, typischerweise nach 10 ns, kann dann der Strahlteiler wieder auf „Beleuchtung" geschaltet werden. Dieser Vorgang lässt sich beliebig wiederholen. Dabei lässt sich sogar die STED-Wellenlänge selbst detektieren, nämlich dann, wenn nach ca. 0,5 ns insgesamt auf Transmission geschaltet wird.

Zu Beginn ist bereits ausgeführt worden, dass das Anregungslicht von einer Anregungslichtquelle und das Stimulationslicht von einer Stimulationslichtquelle kommt. Alternativ dazu könnte sowohl das Anregungslicht als auch das Stimulationslicht von einer einzigen Lichtquelle kommen, so beispielsweise von einer Laserlichtquelle, die Licht mindestens zweier unterschiedlicher Wellenlängen zur Verfügung stellt.

Des Weiteren ist es denkbar, dass mehrere Stimulationslichtquellen vorgesehen sind, deren Licht simultan oder sequentiell eingespeist wird. Im Falle einer sequentiellen Einspeisung des Stimulationslichts sollte dies vorzugsweise im schnellen Wechsel erfolgen. Mit einer solchen Anordnung ist die Verwendung von mehreren STED-Strahlen für einen Farbstoff oder für mehrere Farbstoffe möglich.

Für das Stimulationslicht sind nur geringe Leistungen von einigen 10 mW und relativ langen Pulsbreiten im Bereich von 40 bis 100 ps erforderlich. Berücksichtigt man dies, so ist es denkbar, als Stimulationslichtquellen vorzugsweise gepulste Laserdioden zu verwenden. Unter Verwendung von Laserdioden ist es dann weiter denkbar, diese in einer Art Batterie von Laserdioden mit verschiedenen Wellenlängen anzuordnen, deren Licht je nach Anwendung in geeigneter Weise auf die zu stimulierende Probe eingestrahlt wird. Durch diese Maßnahme ist ein höchstes Maß an Flexibilität gegeben.

Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigt die einzige
Fig. in einem schematische Blockschaltbild den prinzipiellen Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung in einem Fluoreszenz-Mikroskop.
Die einzige Fig. zeigt eine Vorrichtung zur Beleuchtung eines Objekts 1 bei der Fluoreszenz-Rastermikroskopie. Das Fluoreszenz-Rastermikroskop weist einen Beleuchtungsstrahlengang 2 einer Anregungslichtquelle 3 auf, der zur punktförmigen Fluoreszenzanregung des Objekts 1 dient. Zur stimulierten Emission von Fluoreszenzmolekülen in einem definierten Objektbereich des Objekts 1 dient ein weiterer Beleuchtungsstrahlengang 4 einer weiteren Lichtquelle, die fortan als Stimulations lichtquelle 5 bezeichnet wird. Die Beleuchtungsstrahlengänge 2, 4 werden über einen Strahlvereiniger 6 zusammengeführt.
Der weiterführende Beleuchtungsstrahlengang 7 führt über ein Anregungspinhole 8 zu einem Hauptstrahlteiler 9, durch den das Anregungs-/Stimulationslicht über eine Scanneinrichtung 10, eine Linsenanordnung 11 und schließlich über das Objektiv 12 zu dem Objekt 1 leitbar ist.
Das Objekt 1 bzw. dort entsprechend markierte Bereiche werden zur Emission angeregt, und zwar einerseits durch das Anregungslicht und andererseits durch das Stimulationslicht gemäß den Ausführungen in der Beschreibungseinleitung im Sinne der zuvor erörterten STED-Anwendung. Das emittierte Licht 13 gelangt über den Hauptstrahlteiler 9 und ein Detektionspinhole 14 über einen Detektionsstrahlengang 16 zu einem Detektor 15.
Erfindungsgemäß ist der Hauptstrahlteiler 9 als schaltbarer Strahlteiler ausgeführt, wobei hier im Konkreten ein variabel schaltbarer AOBS Verwendung findet. Der AOBS ist derart ausgelegt und schaltbar, dass er im Bereich der Wellenlänge des Stimulationslichts schmalbandig reflektiert und im Bereich des Fluoreszenzspektrums – mit Ausnahme der Wellenlänge des Stimulationslicht – gleichzeitig transmittiert, so dass eine gegenüber herkömmlichen Filtern erhebliche Steigerung der Detektionseffizienz erreicht wird.
Zur Vermeidung von Wiederholungen wird ansonsten auf den allgemeinen Teil der Beschreibung verwiesen.
Schließlich sei angemerkt, dass das voranstehend erörterte Ausführungsbeispiel der beispielhaften Erörterung der beanspruchten Lehre dient, diese jedoch nicht auf das Ausführungsbeispiel einschränkt.

Claims

Vorrichtung zur Beleuchtung eines Objekts (1) bei der Fluoreszenz-Mikroskopie, vorzugsweise bei der konfokalen Fluoreszenz-Rastermikroskopie, mit mindestens einer Anregungslichtquelle (3) und mindestens einer Stimulationslichtquelle (5), deren Licht über einen Strahlvereiniger (6) in einen zumindest teilweise gemeinsamen Beleuchtungsstrahlengang (7) einspeisbar und über einen Hauptstrahlteiler (9) zum Objekt (1) leitbar ist, wobei das Objekt (1) zur Emission anregt wird und emittiertes Licht (13) über den Hauptstrahlteiler (9) und den Detektionsstrahlengang (16) zu einem Detektor (15) gelangt, dadurch gekennzeichnet, dass der Hauptstrahlteiler (9) als schaltbarer Strahlteiler ausgeführt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteiler variabel schaltbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem schaltbaren Strahlteiler um einen AOBS handelt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenlänge des Stimulationslichts innerhalb des Fluoreszenzspektrums liegt.
Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der schaltbare Strahlteiler eine schmalbandige Reflexion im Bereich der Wellenlänge des Stimulationslichts bei gleichzeitiger Transmission im Bereich des Fluoreszenzspektrums – mit Ausnahme der Wellenlänge des Stimulationslichts – aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteiler in Abhängigkeit der eingestrahlten Lichtleistung des Stimulationslichts dann auf Transmission schaltbar ist, wenn das Anregungsniveau im Bereich des Stimulationslichts vernachlässigbar geworden ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteiler nach etwa 0,5 ns seit Einschalten des Stimulationslichts auf Transmission schaltbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteiler im nächsten Zyklus, etwa nach weiteren 10 ns, auf Beleuchtung schaltbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht und das Stimulationslicht von einer Lichtquelle, vorzugsweise von einer Laserlichtquelle, bereitgestellt wird.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Stimulationslichtquellen (5) vorgesehen sind, deren Licht simultan einspeisbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Stimulationslichtquellen (5) vorgesehen sind, deren Licht sequentiell, vorzugsweise im schnellen Wechsel, einspeisbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Stimulationslichtquellen (5) vorzugsweise gepulste Laserdioden vorgesehen sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Stimulationslichtquellen (5) eine Anordnung von Laserdioden mit verschiedenen Wellenlängen vorgesehen ist.