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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur SPIM-Untersuchung einer Probe, bei dem eine Probenschicht mit Beleuchtungslicht beleuchtet wird und bei dem von der beleuchteten Probenschicht ausgehendes Detektionslicht detektiert wird.
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Die Erfindung betrifft außerdem eine Vorrichtung zur SPIM-Untersuchung einer Probe.
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Die SPIM-Technik (SPIM: steht hierbei für Single Plane Illumination Microscopy), bei der eine schichtweise Beleuchtung der Probe erfolgt, erlaubt eine schnellere und probenschonendere Erfassung von Bilddaten, als beispielsweise bei einer punktweisen Abtastung einer Probe. Ein bekanntes Einsatzgebiet der SPIM-Technologie ist der Bereich der Fluoreszenz-Mikroskopie, wobei Fluorophore in der Probe mit Laserlicht angeregt werden. Bei der SPIM-Technologie findet hierbei eine Anregung nur in einer von einem Beleuchtungslichtblatt (auch „Lichtstreifen“ genannt) statt. Eine Schädigung der Probe durch Beleuchtungslicht in anderen Ebenen ist hierdurch vermieden.
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Eine nach dem SPIM-Verfahren arbeitende optische Vorrichtung ist in
DE 102 57 423 A1 beschrieben. Bei diesem Mikroskop wird eine Probe mit einem dünnen Lichtblatt beleuchtet, während die Beobachtung aus einer zu der Ebene des beleuchtenden Lichtblattes senkrechten Richtung erfolgt. Hierbei erfolgen die Beleuchtung und die Detektion über zwei separate optische Strahlengänge mit jeweils separater Optik. Das Lichtblatt wird von einer Zylinderlinse erzeugt. Für die Bildaufnahme wird die Probe durch das bezüglich des Detektors feststehende Lichtblatt bewegt, um schichtweise Fluoreszenz- und/oder Streulicht mit einem flächigen Detektor aufzunehmen. Die so gewonnenen Schichtbilddaten lassen sich anschließend zu einem aus einer dreidimensionalen Abbildung der Probe entsprechenden Datensatz zusammensetzen.
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Aus
DE 10 2004 034 957 A1 ist eine Anordnung zur mikroskopischen Beobachtung einer Probe über ein Mikroskopobjektiv bekannt, in dessen Gehäuse außerhalb der Linsenoptik Lichtführungen für das Beleuchtungslicht der Probe vorgesehen sind. Das Beleuchtungslicht verläuft dabei zunächst parallel zur optischen Achse des Objektivs innerhalb der Lichtführung und trifft danach auf einen am Objektivgehäuse angebrachten, ringförmigen Reflektor mit geringer Apertur, die das Beleuchtungslicht mit Hilfe zusätzlicher Abbildungselemente senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs und damit senkrecht zur Beobachtungsrichtung in die Probe fokussieren. Auch hier erfolgt die Beleuchtung der Probe flächenartig nach dem SPIM-Prinzip. Bei dieser Ausführung ist insbesondere problematisch, die Probe innerhalb des ringförmigen Reflektors zu positionieren.
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Aus
DE 10 2009 044 983 A1 ist ein Mikroskop bekannt, das eine Beleuchtungseinrichtung aufweist, mit der ein Lichtblatt zur Beleuchtung eines Probenbereichs erzeugt wird, welches in Richtung einer Beleuchtungsachse eines Beleuchtungsstrahlenganges und in Richtung einer Querachse, welche quer zur Beleuchtungsachse liegt, annähernd flächig ausgedehnt ist. Das Mikroskop weist außerdem eine Detektierungseinrichtung auf, mit der Licht detektiert wird, welches entlang einer Detektierungsachse eines Detektierungsstrahlengangs aus dem Probenbereich abgestrahlt wird, wobei Beleuchtungsachse und Detektierungsachse sowie Querachse und Detektierungsachse in einem von Null verschiedenen Winkel aufeinander stehen, und wobei die Detektierungseinrichtung außerdem im Detektierungsstrahlengang ein Detektierungsobjektiv umfasst. Bei einem solchen Mikroskop umfasst die Detektierungseinrichtung außerdem ein von einer Frontlinse des Detektierungsobjektivs räumlich getrennt angeordnetes und von dieser unabhängig verstellbares optisches Detektierungselement, mittels dessen die Größe eines Detektierungsbildfeldes stufenlos variierbar ist, und/oder mittels dessen eine Detektierungsfokusebene im Probenbereich stufenlos verschiebbar ist.
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Aus
DE 20 2011 110 077 U1 ist eine Anordnung zum Beleuchten einer Probe bei der SPIM-Mikroskopie bekannt. Die Anordnung weist eine Lichtquelle zum Erzeugen eines Lichtbündels, Mittel zum Erzeugen eines Lichtstreifens aus dem Lichtbündel, insbesondere zum im Wesentlichen flächenartigen Beleuchten einer Probe in einer Beleuchtungsebene aus wenigstens einer Richtung, wenigstens ein Objektiv, das eine Optik aufweist, die dazu ausgebildet und bestimmt ist, von der Probe ausgehendes Detektionslicht direkt oder indirekt einem Detektor zuzuführen, wobei die Optik des Objektivs mit dem Lichtstreifen in Wechselwirkung tritt, und eine der Optik des Objektivs nachgeschaltete Umlenkvorrichtung zum Umlenken des Lichtstreifens, wobei sich der Lichtstreifen nach dem Umlenken zum Beleuchten einer Probe in einem von Null Grad verschiedenen Winkel, insbesondere einem rechten Winkel, zur optischen Achse des Objektivs ausbreitet und/oder in einer optischen Achse des Objektivs nicht parallelen Ebene angeordnet ist.
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Aus der Veröffentlichung MA Q. et al., „Three-dimensional fluorescent microscopy via simultaneous illumination and detection at multiple planes", Scientific Reports, 6, 2016, 1 - 8, 31445; doi: 10.1038/srep31445 ist ein Mikroskopsystem bekannt, mit welchem gleichzeitig mehrere Fokalebenen beleuchtet und detektiert werden können und welches zwei diffraktive Elemente aufweist.
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Schließlich ist aus der
US 2016/0139394 A1 ein Mikroskop zur SPIM-Untersuchung einer Probe bekannt, die mit einem dünnen Lichtblatt beleuchtet wird, während die Beobachtung aus einer zu der Ebene des beleuchtenden Lichtblattes senkrechten Richtung erfolgt, um zu verhindern, dass Aberration das das Lichtblatt verlassende Fluoreszenzlicht beeinflusst.
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Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung anzugeben, das bzw. die besonders flexibel einsetzbar ist und das bzw. die es ermöglicht, besondere Eigenschaften, insbesondere Spektraleigenschaften, der Probe schnell und effektiv zu untersuchen und/oder gleichzeitig verschiedene Schichten der Probe zu untersuchen.
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Die Aufgabe wird jeweils durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Apnspruchs 1 sowie durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Apnspruchs 10 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
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In erfindungsgemäßer Weise wurde erkannt, dass insbesondere die Untersuchung einer Probe, die mit mehreren unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert ist, mit den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren problematisch ist, weil es bei einer zeitgleichen und ortsgleichen Ausleuchtung der gesamten zu untersuchenden Probenschicht (eine Schicht einer Probe) mit einem Lichtblatt, das mehrere Anregungswellenlängen beinhaltet, zu einem Übersprechen aufgrund der oftmals überlappenden Fluoreszenzspektren der unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffe kommt. Wie weiter unten noch im Detail erläutert wird, erlaubt es die vorliegende Erfindung beispielsweise, unterschiedliche Bereiche einer Probenschicht simultan mit Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen zu beaufschlagen. Dies erfolgt beispielsweise dadurch, dass Fächer mit Beleuchtungslichtkomponenten unterschiedlicher Wellenlänge erzeugt wird. Durch Bewegen des Fächers innerhalb der durch den Fächer aufgespannten Ebene bzw. der Beleuchtungsebene kann die zu untersuchende Probenschicht schnell und effizient mit Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen untersucht werden, wobei dennoch eine wellenlängenspezifische räumliche Trennung der Anregung gewährleistet ist.
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Als Beleuchtungsebene im Sinne der vorliegenden Beschreibung soll insbesondere die Ebene verstanden werden, die durch die Längsachse (Ausbreitungsrichtung einer Beleuchtungslichtkomponente des Beleuchtungslichtes) und die lange Querachse eines (Quasi-)Lichtblattes aufgespannt wird, das durch die Beleuchtungslichtkomponente 0. Beugungsordnung (ungebeugtes Licht nach dem Gitter) des Beleuchtungslichtes erzeugt wird. (Zum Begriff des Quasi-Lichtblattes siehe weiter unten.)
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Die Vorrichtung kann so ausgeführt sein, dass das Beleuchtungslicht derart geführt ist, dass mindestens eine, gegebenenfalls in der Beleuchtungsebene angeordnete, Probenschicht mit dem Beleuchtungslicht derart beleuchtet ist, dass mehrere sich in unterschiedliche Richtungen ausbreitende Anteile des räumlich aufgespaltenen Beleuchtungslichtes jeweils eine in der Probenschicht beziehungsweise Beleuchtungsebene angeordnete Ausbreitungsrichtung aufweisen.
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Es ist vorgesehen, dass das Beleuchtungslicht, beispielsweise in Form eines im Transversalquerschnitt kreisrunden Beleuchtungslichtbündels oder eines Lichtblattes, mehrere Wellenlängen aufweist und mittels des Gitters räumlich spektral aufgespalten wird. Dies kann, wie bereits erwähnt, insbesondere in der Weise geschehen, dass das Beleuchtungslicht im Ergebnis einen Fächer mit Beleuchtungslichtkomponenten unterschiedlicher Wellenlänge aufweist. Auf diese Weise ist das Problem des Übersprechens durch die Realisierung einer räumlichen Trennung der Anregung mit unterschiedlichen Wellenlängen gelöst, wobei dennoch ein schnelles und effizientes Abtasten der gesamten Probenschicht dadurch ermöglicht wird, dass der Fächer in der Beleuchtungsebene bewegt wird. Beispielsweise kann ein Bewegen des Fächers mittels einer hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbaren Strahlablenkeinrichtung erfolgen. Insgesamt wird hierdurch eine sehr schnelle Untersuchung einer Probenschicht einer mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen markierten Probe ermöglicht, wobei Fehler durch ein Übersprechen bei der Fluoreszenzanregung wirkungsvoll vermieden sind.
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Im Grunde genommen besteht der oben erwähnte Fächer aus mehreren Einzellichtbündeln unterschiedlicher Wellenlängen, wobei die Probenschicht durch ein schnelles Hin- und Herwedeln des gesamten Fächers mit diesen mehreren Einzellichtbündeln, die jedes für sich gesehen ein Quasi-Lichtblatt bildet, abgescannt werden kann.
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Der Fächer beinhaltet wenigstens zwei Beleuchtungslichtkomponenten unterschiedlicher Wellenlänge. Vorzugsweise erfolgt die Detektion in der Weise, dass orts- und zeitaufgelöst zugeordnet wird, welche Probenbereiche zu welcher Zeit mit Beleuchtungslicht welcher Wellenlänge beaufschlagt wurden und welches Detektionslicht hierbei aus den einzelnen Probenbereichen detektiert wurde.
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Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung wird eine Weißlichtquelle verwendet, um ein primäres Beleuchtungslichtbündel zu erzeugen, das mittels des optischen Gitters räumlich spektral aufgespalten wird. Bei einer solchen Ausführung kann vorteilhafter Weise ein spektral kontinuierlicher Fächer oder wenigstens ein Fächer mit einer Vielzahl von einzelnen spektral aufgespaltenen Wellenlängenkomponenten erzeugt werden. Als Weißlichtquelle kommt insbesondere eine Lichtquelle in Betracht, die eine mikrostrukturierte Faser und/oder eine photonic-band-gap-Faser beinhaltet.
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Losgelöst von den oben beschriebenen Anwendungsmöglichkeiten bei Verwendung von polychromatischem Beleuchtungslicht ist es nach einem eigenständigen Erfindungsgedanken auch möglich, dass das Beleuchtungslicht monochromatisch ist und mehrere Beleuchtungslichtkomponenten unterschiedlicher Beugungsordnungen aufweist. Insbesondere kann hierbei vorteilhaft vorgesehen sein, dass unterschiedliche Bereiche der mindestens einen Probenschicht simultan mit Beleuchtungslicht unterschiedlicher Beugungsordnungen beleuchtet werden.
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Auch bei einer solchen Ausführung kann vorteilhaft während des Detektierens des von der Probenschicht ausgehenden Detektionslichtes ein Bewegen des Fächers der durch Beugung erzeugten Beleuchtungslichtkomponenten erfolgen. Insbesondere ist es auf diese Weise möglich, die Probenschicht simultan mit mehreren Quasi-Lichtblättern abzutasten. Unabhängig von der Verwendung von monochromatischem oder polychromatischem Licht wird unter einem Quasi-Lichtblatt ein Lichtblatt verstanden, dass dadurch entsteht, dass ein Lichtbündel in der Beleuchtungsebene derart schnell hin- und herbewegt wird, dass es sich im Ergebnis nicht oder nur unwesentlich von einem mit einer Zylinderoptik bzw. Zylinderlinse erzeugten Lichtblatt unterscheidet. Typischerweise wird hierzu das Beleuchtungslichtbündel mittels einer Strahlablenkeinrichtung schnell hin- und herbewegt. Die Quasi-Lichtblätter sind hierbei durch die einzelnen, schnell hin- und herbewegten Beugungsmaxima des räumlich aufgespaltenen Beleuchtungslichtes gebildet. Auf diese Weise ist es vorteilhaft möglich, eine Probenschicht besonders schnell abzutasten oder auch das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern bzw. die Bildqualität zu erhöhen: Bestimmend für nichtlineare phototoxische Effekte ist die maximale Leistungsdichte. Daher kann auf Grund der Auffächerung des Beleuchtungslichtes im zeitlichen Mittel eine höhere Intensität für das Beleuchtungslicht verwendet werden ohne die Probe oder Fluorophore (Photobleichung, Photobleaching) in der Probe übermäßig zu schädigen (Phototoxizität) als ohne Auffächerung (also mit einem einzelnen Beleuchtungslichtbündel) möglich ist. Auch Sättigungseffekte hinsichtlich der Fluoreszenz der Fluorophore in der Probe können so verhindert oder zumindest vermindert werden. Durch das Aufaddieren der Messsignale, die durch die einzelnen Beleuchtungslichtkomponenten unterschiedlicher Beugungsordnungen erzeugt werden, kann damit ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis erreicht werden (jeder Punkt der Probe wird hintereinander, also zeitlich getrennt, durch mehrere Beleuchtungslichtkomponenten beleuchtet). Alternativ oder zusätzlich kann ebenfalls bei Verwendung einer entsprechend höheren Intensität des Beleuchtungslichtes eine deutliche Erhöhung der Aufnahmegeschwindigkeit gegenüber der Verwendung eines einzelnen Quasi-Lichtblatts erreicht werden, ohne dass dies eine schlechtere Bildqualität zur Folge hat: Die höhere Gesamtintensität des Beleuchtungslichtes, verteilt auf die verschiedenen Beleuchtungslichtkomponenten, ermöglicht deutlich höhere Geschwindigkeiten für das Hin- und Herbewegen des Beleuchtungslichtes (und damit auch eine schnellere Bildaufnahme) als bei Verwendung des einzelnen Quasi-Lichtblatts ohne Bildqualitätsverlust umsetzbar ist.
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Insbesondere wenn die einzelnen Beugungsordnungen eine unterschiedliche Leistungsdichte beinhalten, ist es in besonders vorteilhafter Weise möglich, eine interessierende Probenschicht simultan mit mehreren Quasi-Lichtblättern unterschiedlicher Intensität abzutasten, was bei den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren nur dadurch möglich wäre, dass das Abtasten der interessierenden Probenschicht zeitlich nacheinander mit Lichtblättern oder Quasi-Lichtblättern unterschiedlicher Intensität erfolgt, was ein Vielfaches der Zeit beanspruchen würde.
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Bei Einsatz von polychromatischem Beleuchtungslicht ist auch eine gleichzeitige Ausnutzung der räumlich spektralen Aufspaltung und der Aufspaltung entsprechend der Beugungsordnungen denkbar um eine Probenschicht zu beleuchten.
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Unabhängig von der Verwendung von monochromatischem oder polychromatischem Beleuchtungslicht ist es auch möglich, durch entsprechende Anordnung des Gitters das Beleuchtungslicht so aufzufächern, dass die einzelnen Beleuchtungslichtkomponenten beim Scanvorgang unterschiedliche Probenschichten beleuchten, also zwei oder mehr Probenschichten durch die Beleuchtungslichtkomponenten beleuchtet werden. (Hierzu muss das Gitter bezogen auf die Position des Gitters, in der die Beleuchtungslichtkomponenten nur eine Probenschicht während des Scanvorgangs beleuchten, um mehr als 0°, aber weniger als 180° um die Senkrechte zur Gitterebene gedreht sein, beispielsweise um etwa 90°.) Der Fächer aus den Beleuchtungslichtkomponenten liegt also nicht vollständig in der durch die 0. Beugungsordnung des Beleuchtungslichtes definierten Beleuchtungsebene. Mittels einer entsprechenden Strahlablenkeinrichtung oder einer Zylinderoptik bzw. Zylinderlinse können somit Stapel von (Quasi-)Lichtblättern erzeugt werden, die unterschiedliche Probenschichten der Probe zeitgleich beleuchten. In Kombination mit einer geeigneten Detektionsoptik bzw. einem oder mehreren geeigneten Detektionsobjektiven ist es somit möglich, zeitgleich Aufnahmen dieser unterschiedlichen Probenschichten der Probe aufzunehmen. Mittels einer Strahlablenkeinrichtung kann zusätzlich erreicht werden, dass der Stapel aus (Quasi-)Lichtblättern innerhalb der Probe verschoben werden kann. Neben dem Vorteil der möglichen zeitgleichen Aufnahme von mehreren Probenschichten ergeben sich die gleichen weiter oben beschriebenen Vorteile wie für den Fall des Abtastens einer Probenschicht mittels eines Fächers des Beleuchtungslichts: Geringere Phototoxizität (Phototoxie) sowie geringere Sättigungseffekte hinsichtlich der Fluoreszenz der Fluorophore in der Probe und daraus folgend möglicher Einsatz einer höhere Intensität für das Beleuchtungslicht, was wiederum eine höhere Bildqualität und/oder höhere Aufnahmegeschwindigkeit ermöglicht. Folglich kann beispielsweise die zeitgleiche Aufnahme von mehreren Probenschichten mit derselben Bildqualität wie mit einem einzelnen Beleuchtungslichtbündel ohne Auffächerung durchgeführt werden.
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Unabhängig davon, ob das Beleuchtungslicht nun polychromatisch oder monochromatisch ist, kann ganz allgemein vorteilhaft vorgesehen sein, dass die Position und/oder die Ausrichtung des Beleuchtungslichts relativ zur Probe, insbesondere durch ein Bewegen in der mindestens einen beleuchteten Probenschicht, verändert wird. Hierbei erfolgt bei einer vorteilhaften Ausführung für unterschiedliche Positionen und/oder Ausrichtungen des Beleuchtungslichts jeweils eine, insbesondere ortsaufgelöste und/oder spektral aufgelöste, Detektion des von der Probe ausgehenden Detektionslichts. Auf diese Weise ist es vorteilhaft ermöglicht, simultan unterschiedliche Eigenschaften der Probe zu untersuchen.
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Auch hier ist bei Einsatz von polychromatischem Beleuchtungslicht eine gleichzeitige Ausnutzung der räumlich spektralen Aufspaltung und der Aufspaltung entsprechend der Beugungsordnungen denkbar um mehrere Probenschichten zu beleuchten.
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Um die Ausrichtung und/oder die Position des Beleuchtungslichts relativ zur Probe verändern zu können, kann im Strahlengang des Beleuchtungslichts vorteilhaft wenigstens eine hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbare Strahlablenkeinrichtung vorhanden sein. Eine solche Strahlablenkeinrichtung kann beispielsweise einen drehbar gelagerten Scanspiegel oder mehrere drehbar gelagerte Scanspiegel beinhalten. Es ist auch möglich, dass die Strahlablenkeinrichtung das Beleuchtungslicht akustooptisch oder elektrooptisch ablenkt.
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Das Beleuchten der Probenschicht und das Detektieren des von der Probenschicht ausgehenden Detektionslichts kann insbesondere mittels einer Vorrichtung erfolgen, die ein Beleuchtungsobjektiv und ein Detektionsobjektiv aufweist, wobei die optische Achse des Detektionsobjektivs senkrecht zur Beleuchtungsebene und senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs ausgerichtet ist.
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Eine ganz besonders vorteilhafte, andere Vorrichtung ist in der Weise aufgebaut, dass die optischen Achsen von Beleuchtungsobjektiv und Detektionsobjektiv koaxial oder parallel zueinander ausgerichtet sind. Eine solche Vorrichtung hat den ganz besonderen Vorteil, dass ein handelsübliches Mikroskopstativ, insbesondere ein handelsübliches inverses Mikroskopstativ zur Realisierung der Vorrichtung verwendet werden kann. Bei einer solchen Vorrichtung ist ein Umlenkbauteil vorhanden, das das von dem Beleuchtungsobjektiv kommende Beleuchtungslicht in die Beleuchtungsebene umlenkt. Insbesondere kann hierbei vorgesehen sein, dass das Umlenkbauteil das von dem Beleuchtungsobjektiv kommende Beleuchtungslicht um 90° (rechter Winkel) derart umlenkt, dass es sich anschließend entlang der senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs und senkrecht zur optischen Achse des Detektionsobjektivs ausgerichteten Beleuchtungsebene ausbreitet.
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Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung beinhaltet das Umlenkbauteil das optische Gitter oder ist durch das optische Gitter gebildet. Eine solche Ausführung hat den besonderen Vorteil, dass das optische Gitter eine Doppelfunktion wahrnimmt, so dass insgesamt weniger Komponenten erforderlich sind. Vorzugsweise wird das Beleuchtungslicht mittels des Beleuchtungsobjektivs derart fokussiert, dass das Beleuchtungslicht, in der Probenschicht einen Fokus aufweist und/oder die einzelnen durch räumliche Aufspaltung erzeugten Beleuchtungslichtkomponenten des Beleuchtungslichts in der Probenschicht einen Fokus aufweisen.
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Das optische Gitter kann insbesondere als Reflexionsgitter ausgebildet sein. Eine solche Ausführung des optischen Gitters kann vorteilhaft auch als Umlenkbauteil fungieren, das das Beleuchtungslicht in die Beleuchtungsebene umlenkt. Es ist alternativ jedoch auch möglich, dass das optische Gitter als Transmissionsgitter ausgebildet ist.
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Das optische Gitter kann vorteilhaft eine Gitterkonstante im Bereich zwischen 10 Strichen/mm und 1000 Strichen/mm oder auch darüber aufweisen. Bei einer besonderen Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind mehrere optische Gitter unterschiedlicher Gitterkonstante vorhanden, die in Abhängigkeit von den jeweiligen Untersuchungsanforderungen gegeneinander ausgetauscht und bei der Untersuchung eingesetzt werden können. Das optische Gitter kann insbesondere ein Metallsubstrat aufweisen, in das eine Gitteroberfläche, beispielsweise durch Fräsen, eingearbeitet ist.
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Das Gitter kann alternativ auch durch ein akustooptisches Bauteil, wie beispielsweise ein AOM (Akustooptischer Modulator) oder ein AOD (Akustooptischer Deflektor), realisiert sein, an dessen Piezoelement mindestens eine Radiofrequenz angelegt wird. Dies ermöglicht auf Grund der veränderbaren Radiofrequenz eine an die Wellenlängen und die Probe angepasste Auffächerung des Beleuchtungslichtes. Es können auch zeitgleich mehr als eine Radiofrequenz angelegt werden, beispielsweise um mehrere Beleuchtungslichtkomponenten einer Beugungsordnung (beispielsweise der 1. Beugungsordnung) zu ermöglichen. Solche mehreren Beleuchtungslichtkomponenten dieser Beugungsordnung können analog zu der Verwendung mehrerer Beleuchtungslichtkomponenten unterschiedlicher Beugungsordnung dazu benutzt werden, um eine einzelne Probenschicht mit einem Fächer aus mehreren Beleuchtungslichtkomponenten abzutasten oder alternativ mehr als eine Probenschicht gleichzeitig beim Scanvorgang zu beleuchten, bei Einsatz einer entsprechenden Strahlablenkeinrichtung oder einer Zylinderoptik bzw. Zylinderlinse in der Form von (Quasi-)Lichtblättern.
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Bei einer besonderen Ausführung der Vorrichtung ist die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs, das das Beleuchtungslicht fokussiert, senkrecht zur Probenschicht ausgerichtet. Alternativ oder zusätzlich kann auch vorgesehen sein, dass von der Probe ausgehendes Detektionslicht durch ein Detektionsobjektiv verläuft, dessen optisch Achse senkrecht zur Probenschicht ausgerichtet ist. Wie bereits erwähnt kann außerdem vorteilhaft vorgesehen sein, dass die optische Achse eines Beleuchtungsobjektivs, das das Beleuchtungslicht fokussiert, und die optische Achse eines Detektionsobjektivs koaxial zueinander oder parallel zueinander ausgerichtet sind.
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Es kann außerdem vorteilhaft vorgesehen sein, dass das Beleuchtungslicht in der Beleuchtungsebene als Lichtblatt oder als Quasi-Lichtblatt ausgebildet ist. Ein Lichtblatt kann insbesondere durch eine Zylinderoptik bzw. Zylinderlinse geformt werden. Ein Quasi-Lichtblatt kann dadurch gebildet werden, dass ein Lichtbündel, das beispielsweise eine mittels des Gitters durch Beugung erzeugte Beleuchtungslichtkomponente sein kann, in der Beleuchtungsebene derart schnell hin- und herbewegt wird, dass sich das schnell hin und her gewedelte Lichtbündel im Ergebnis nicht oder nur unwesentlich von einem mit einer Zylinderoptik/Zylinderlinse erzeugten Lichtblatt unterscheidet.
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Insbesondere kann auch vorteilhaft vorgesehen sein, dass das optische Gitter das Lichtblatt aus einem, insbesondere im Transversalquerschnitt kreisrunden, Primärlichtbündel formt. Dies könnte durch eine geeignete Gitterstruktur erzielt werden, die zum Beispiel mehrere unterschiedliche Gitterkonstanten aufweist, und/oder insbesondere auch in der Weise erfolgen, dass keine zusätzliche Zylinderoptik/Zylinderlinse erforderlich ist.
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Insbesondere bei Verwendung von polychromatischen Beleuchtungslicht bietet es sich vorteilhaft an, im Strahlengang des Detektionslichts einen Farbfilter, insbesondere einen Interferenzfilter einzusetzen, der Licht der Wellenlänge des Beleuchtungslichts herausfiltert und lediglich das Fluoreszenzlicht zu dem Detektor passieren lässt. Alternativ kann auch eine kamerabasierte zeitliche Separierung von Anregungs- und Fluoreszenzlicht durch ein Gating erfolgen. Es ist auch denkbar, zeitlich derart hochaufgelöst zu detektieren, dass ein Farbfilter im Detektionsstrahlengang überflüssig wird. In diesem Fall kann, insbesondere bei Verwendung eines Weißlichtlasers, insbesondere auf der Basis einer mikrostrukturierten Faser und/oder auf der Basis von photonic-band-gap-Material, ortsabhängig und kontinuierlich die Fluoreszenz in Abhängigkeit von der jeweiligen Anregungswellenlänge detektiert werden.
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Insbesondere kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass das Beleuchtungslichtbündel, beispielsweise in einem Inversen Mikroskopstativ, zunächst in vertikaler Richtung durch das Beleuchtungsobjektiv verläuft und anschließend in horizontale Richtung mit der Umlenkeinrichtung, die durch das Gitter gebildet sein kann, in die Beleuchtungsebene umgelenkt wird, um die Probe in der Beleuchtungsebene angeordnete Probenschicht zu beleuchten.
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Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung sind das Beleuchtungsobjektiv und die Umlenkeinrichtung relativ zueinander beweglich angeordnet, um hierdurch das Beleuchtungslicht relativ zur Probe bewegen zu können. Alternativ oder zusätzlich kann auch vorgesehen sein, dass die Umlenkeinrichtung, insbesondere beweglich, an dem Detektionsobjektiv befestigt ist.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann vorteilhaft ein Rastermikroskop oder ein konfokales Rastermikroskop aufweisen und/oder durch Umrüsten eines ein Rastermikroskops oder eines konfokalen Rastermikroskops hergestellt sein. Hierbei bietet sich insbesondere die Verwendung eines inversen Mikroskopstatives an. Von besonderem Vorteil ist insoweit die Verwendung und/oder Umrüstung eines (möglicherweise in einem Labor ohnehin vorhandenen) Rastermikroskops zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand beispielhaft und schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleiche oder gleich wirkende Elemente zumeist mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:
- 1 schematisch ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und
- 2 eine schematische Darstellung der Beleuchtung einer Probenschicht.
- 3 eine schematische Darstellung der Beleuchtung mehrerer Probenschichten.
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1 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur SPIM-Untersuchung einer Probe 1. Die Vorrichtung weist eine Lichtquelle 2 auf, die Beleuchtungslicht 3 erzeugt. Das Beleuchtungslicht 3 gelangt über eine hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbare Strahlablenkeinrichtung 4 und weitere der besseren Übersichtlichkeit halber nicht eingezeichnete optische Elemente zum Führen und Formen des Beleuchtungslichts 3 zu einem Beleuchtungsobjektiv 5, das das Beleuchtungslicht 3 fokussiert.
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Dem Beleuchtungsobjektiv 5 ist ein optisches Gitter 6 nachgeschaltet, das das Beleuchtungslicht 3 räumlich aufspaltet und in eine Beleuchtungsebene umlenkt, in der sich die Probe 1 befindet. Bezogen auf die Figur ist die Beleuchtungsebene horizontal und senkrecht zur Zeichenebene ausgerichtet. Nach dem Umlenken und dem räumlichen Aufspalten des Beleuchtungslichts 3 mittels des optischen Gitters 6 breiten sich die einzelnen, aufgespaltenen Beleuchtungslichtkomponenten jeweils mit einer in der Beleuchtungsebene liegenden Ausbreitungsrichtung aus.
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Die in der Beleuchtungsebene angeordnete Probenschicht 7 der Probe 1 wird auf diese Weise simultan mit mehreren Beleuchtungslichtkomponenten beleuchtet.
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Das von der Probenschicht 7 ausgehende Detektionslicht 8 gelangt durch ein Detektionsobjektiv 9, dessen optische Achse senkrecht zur Beleuchtungsebene ausgerichtet ist, und durch weitere, der besseren Übersichtlichkeit halber nicht dargestellte optische Komponenten zum Führen und Formen des Detektionslichts 8 zu einem Flächendetektor 10, der das von der Probenschicht 7 ausgehende Detektionslicht 8 ortsaufgelöst und/oder spektral aufgelöst detektiert. Der Flächendetektor kann beispielsweise ein CMOS-Detektor oder ein sCMOS-Detektor sein.
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Die Strahlablenkeinrichtung 4 dient dazu, die Beleuchtungslichtkomponenten des aufgespaltenen Beleuchtungslichts 3 relativ zur Probe 1 zu bewegen. Dies kann insbesondere in der Weise erfolgen, dass die sich in der Beleuchtungsebene ausbreitenden Beleuchtungslichtkomponenten innerhalb der Beleuchtungsebene bewegt werden. Die Strahlablenkeinrichtung 4 kann hierzu beispielsweise wenigstens einen drehbar gelagerten Scanspiegel beinhalten. Bei einer besonderen Ausführung beinhaltet die Scaneinrichtung 4 zwei drehbar gelagerte Scanspiegel, deren Drehachsen in der Projektion senkrecht zueinander angeordnet sind. Mittels einer solchen Strahlablenkeinrichtung lässt sich vorteilhafterweise auch ein Parallelversatz des Beleuchtungslichts 3 bewirken.
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2 illustriert schematisch eine erste Art der Beleuchtung der Probe 1, nämlich einer einzelnen Probenschicht 7 dieser Probe. Das von dem Beleuchtungsobjektiv 5 kommende Beleuchtungslicht 3 wird mittels des optischen Gitters 6 umgelenkt und räumlich spektral und/oder entsprechend der Beugungsordnungen aufgespalten. Die Aufspaltung erfolgt derart, dass die einzelnen Beleuchtungslichtkomponenten 12, 13, 14 des Beleuchtungslichts 3 nach der Aufspaltung in der Beleuchtungsebene verlaufen. Der ungebeugte Anteil 11 (0. Beugungsordnung) des Beleuchtungslichts 3 wird bei diesem Ausführungsbeispiel an der Probe 1 vorbeigeführt. Generell ist aber auch eine Verwendung des ungebeugten Anteils, insbesondere bei monochromatischem Beleuchtungslicht 3, möglich.
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Das räumlich aufgespaltene Beleuchtungslicht 3 weist bei diesem Ausführungsbeispiel eine erste Beleuchtungslichtkomponente 12, eine zweite Beleuchtungslichtkomponente 13 und eine dritte Beleuchtungslichtkomponente 14 auf, die simultan die Probenschicht 7 an unterschiedlichen Probenorten der Probenschicht 7 beleuchten. Mittels einer Strahlablenkeinrichtung 4 kann der so gebildete Fächer von Beleuchtungslichtkomponenten gleicher oder unterschiedlicher Wellenlänge relativ zur Probenschicht 7, insbesondere in der Beleuchtungsebene, bewegt werden, so dass jeder Ort der Probenschicht 7 nacheinander mit dem Licht der Beleuchtungslichtkomponenten 12, 13, 14 beaufschlagt werden kann. Vorzugsweise erfolgt hierbei eine ortsaufgelöste und/oder spektralaufgelöste und/oder zeitaufgelöste Detektion des von der Probenschicht 7 ausgehenden Detektionslichts 8 (in dieser Figur nicht eingezeichnet). Die einzelnen Striche des optischen Gitters 6 sind bei diesem Ausführungsbeispiel parallel zu der Ebene angeordnet, in der sich das Beleuchtungsobjektiv 5, das Detektionsobjektiv 9 und das optische Gitter 6 selbst befinden, um eine räumlich Aufspaltung in der Beleuchtungsebene zu erreichen. Der Pfeil deutet perspektivisch die Auffächerung des Beleuchtungslichts 3 aus der Papierebene heraus an. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind zusätzlich zu den beispielhaft eingezeichneten Beleuchtungslichtkomponenten 12, 13, 14 keine weiteren Beleuchtungslichtkomponenten bzw. Beugungsordnungen eingezeichnet, die aber vorhanden sein können.
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3 illustriert schematisch eine zweite Art der Beleuchtung der Probe 1. Das von dem Beleuchtungsobjektiv 5 kommende Beleuchtungslicht 3 wird mittels des optischen Gitters 6 umgelenkt und räumlich spektral und/oder entsprechend der Beugungsordnungen aufgespalten. Die Aufspaltung in einzelne Beleuchtungslichtkomponenten 12, 13, 14 des Beleuchtungslichts 3 erfolgt derart, dass zur Bildaufnahme unterschiedliche Probenschichten bzw. Ebenen innerhalb der Probe beleuchtet werden. Es existieren also mehrere Beleuchtungsebenen. Der ungebeugte Anteil 11 (0. Beugungsordnung) des Beleuchtungslichts 3 wird bei diesem Ausführungsbeispiel an der Probe 1 vorbeigeführt. Generell ist aber auch eine Verwendung des ungebeugten Anteils, insbesondere bei monochromatischem Beleuchtungslicht 3, möglich.
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Das räumlich aufgespaltene Beleuchtungslicht 3, das die Form eines im Transversalquerschnitt kreisrunden Beleuchtungslichtbündels oder auch eines Lichtblattes haben kann (erzeugt beispielsweise durch eine Zylinderoptik), weist bei diesem Ausführungsbeispiel eine erste Beleuchtungslichtkomponente 12, eine zweite Beleuchtungslichtkomponente 13 und eine dritte Beleuchtungslichtkomponente 14 auf, die simultan die Probe 1 in unterschiedlichen Ebenen (Probenschichten 15, 16, 17) beleuchten, die ungefähr parallel liegen können aber nicht müssen. Mittels einer Strahlablenkeinrichtung 4 kann im Falle eines strahlförmigen Beleuchtungslichtes der so gebildete Fächer von Beleuchtungslichtkomponenten gleicher oder unterschiedlicher Wellenlänge so durch die Probe bewegt werden, dass jeder Ort der Probenschichten 15, 16, 17 nacheinander mit dem Licht der Beleuchtungslichtkomponenten 12, 13, 14 beaufschlagt werden kann (Erzeugung mehrerer Quasi-Lichtblätter). Im Falle, dass das Beleuchtungslicht 3 ein durch eine Zylinderoptik geformtes Lichtblatt ist, ist ein Abtasten mittels einer Strahlablenkeinrichtung nicht mehr notwendig. In beiden Fällen kann der Fächer mittels der Strahlablenkeinrichtung 4 (oder alternativ einen zweiten Strahlablenkeinrichtung) so durch die Probe geführt werden, dass die Lichtblätter unterschiedliche Probenschichten beleuchten und die Probe oder Teile der Probe in kurzer Zeit abgescannt werden.
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Vorzugsweise erfolgt eine ortsaufgelöste und/oder spektral aufgelöste und/oder zeitaufgelöste Detektion des von der Probenschicht 7 ausgehenden Detektionslichts 8 (in dieser Figur nicht eingezeichnet). Die einzelnen Striche des optischen Gitters 6 sind bei diesem Ausführungsbeispiel verdreht (beispielsweise senkrecht, wie in der Figur gezeigt), also nicht parallel, zu der Ebene angeordnet, in der sich das Beleuchtungsobjektiv 5, das Detektionsobjektiv 9 und das optische Gitter 6 selbst befinden, um eine zeitgleiche Beleuchtung unterschiedlicher Probenschichten 15, 16, 17 zu ermöglichen. Der Pfeil deutet perspektivisch die Auffächerung des Beleuchtungslichts 3 in der Papierebene an. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind zusätzlich zu den beispielhaft eingezeichneten Beleuchtungslichtkomponenten 12, 13, 14 keine weiteren Beleuchtungslichtkomponenten bzw. Beugungsordnungen eingezeichnet, die aber vorhanden sein können.
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Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen, dass die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken. Insbesondere sind sämtliche, in dieser Beschreibung enthaltenen Merkmale und/oder deren Funktionen, Wirkungen und Eigenschaften für sich gesehen und/oder in Kombination miteinander als hierin offenbart anzusehen, die ein auf dem vorliegenden Gebiet tätiger Fachmann ggf. unter Hinzuziehung seines Fachwissens einzeln oder in Kombination zur Lösung der objektiven Aufgabe oder damit zusammenhängenden Problemstellungen vorsehen würde.
