WO2006097070A1 - Mikroskop - Google Patents

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WO2006097070A1
WO2006097070A1 PCT/DE2006/000405 DE2006000405W WO2006097070A1 WO 2006097070 A1 WO2006097070 A1 WO 2006097070A1 DE 2006000405 W DE2006000405 W DE 2006000405W WO 2006097070 A1 WO2006097070 A1 WO 2006097070A1
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WO
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light
illumination
reflection
microscope according
beam path
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PCT/DE2006/000405
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Inventor
Ralf KRÜGER
Original Assignee
Leica Microsystems Cms Gmbh
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Publication date
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    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B5/00—Optical elements other than lenses
    • G02B5/003—Light absorbing elements
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B5/00—Optical elements other than lenses
    • G02B5/005—Diaphragms

Definitions

  • the present invention relates to a microscope, in particular for the evanescent illumination of a sample, comprising a light source, an xy scanner arranged in the illumination beam path and an objective, both illuminating light and detection light being guided through the objective, the incident illuminating light being in the plane of the objective pupil has a focus, wherein the objective pupil is illuminated in the course of the scanning by juxtaposition of individual illumination points two-dimensional, preferably annular, and wherein on the sample or on a sample cover preferably totally reflected illumination light (reflection light) returns to the illumination beam path.
  • the refraction behavior of light is used in the transition from an optically denser to an optically thinner medium.
  • a stationary evanescent wave forms in the medium with a lower refractive index.
  • the intensity of this well decreases exponentially with the distance to the interface. Because of this, fluorophores farther from the interface are not excited.
  • the background fluorescence is significantly reduced.
  • the image contrast is improved and the resolution is simultaneously increased significantly.
  • a prerequisite for the use of the above-described phenomenon is a sufficiently large difference in the refractive indices of cover glass and medium.
  • a microscope with evanescent illumination of a sample is already known from US 2002/0097489 A1.
  • the microscope includes a white light source whose light is coupled via a slit through the microscope objective into the specimen carrying slide for evanescent illumination.
  • the illumination light propagates in the slide by total internal reflection, whereby the illumination of the sample takes place only in the region of the projecting from the slide evanescent field.
  • Microscopes of this type are known by the term TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescent Microscope).
  • TIRFM Total Internal Reflection Fluorescent Microscope
  • the objective consists of a first lens having a positive refractive power, a second lens having a negative refractive power, wherein the focal length ratio between the two lenses in the range of - 0.4 and - 0.1 and the total refractive power is greater than zero. Furthermore, the lens includes two positive lenses whose focal diameter to focal length is greater than 0.3 and less than 0.6. Further, the objective includes a negative lens and a condenser lens, the negative lens facing the front group, and the focal length ratio of the negative lens and the condenser lens being between -0.5 and -2.
  • a microscope for TIRM Total Internal Reflection Microscopy
  • the microscope has a microscope housing and a lens.
  • the illumination light emanating from a lighting device can be coupled in via an adapter which can be inserted into the microscope housing.
  • the illumination system includes a laser light source whose light is coupled into an optical fiber. Furthermore, a coupling-out optical system is provided, which transmits the light emerging from the fiber into a light source Focused back focal point of the microscope objective.
  • the optical fiber is displaceable in a plane perpendicular to the optical axis of the microscope objective.
  • a device for coupling light in a microscope is known. There, laser light is directed onto the specimen in the field diaphragm plane by means of an optical fiber coupling designed as a slide.
  • the invention is particularly suitable for the TIRF process.
  • a sample is illuminated with a light beam to observe the detection light emitted by the sample, as reflection or fluorescent light.
  • the focus of an illumination light beam is moved by means of a controllable beam deflection device, generally by tilting two mirrors, in a sample plane, wherein the deflection axes are usually perpendicular to one another, so that one mirror deflects in the x direction and the other in the y direction.
  • the tilting of the mirror is accomplished, for example, with the help of galvanometer actuators.
  • the power of the detection light coming from the object is measured as a function of the position of the scanning beam.
  • the control elements are equipped with sensors for determining the current mirror position.
  • an object with the focus of a light beam is scanned in three dimensions.
  • a confocal scanning microscope generally comprises a light source, a focusing optics, with which the light of the source is focused on a pinhole - the so-called excitation diaphragm, a beam splitter, a beam deflector for beam control, a microscope optics, a detection aperture and the detectors for detecting the detection - or fluorescent light.
  • the illumination light is coupled in via a beam splitter.
  • the fluorescence or reflection light coming from the object passes back to the beam splitter via the beam deflector, passes through it, and is subsequently focused onto the detection aperture behind which the detectors are located.
  • This detection arrangement is called Descan arrangement.
  • Detection light that does not come directly from the focus region takes a different light path and does not pass through the detection aperture so as to obtain point information obtained by sequentially scanning the object with the light source
  • Focus of the illumination light beam leads to a three-dimensional image.
  • a three-dimensional image is achieved by layerwise image data acquisition.
  • the totally reflected illumination light is problematic because it returns to the illumination beam path and passes without special measures in the detection beam path. To avoid false light, it must therefore be disconnected and absorbed.
  • a TIRF microscope is known per se, in which, according to FIG. 3, a light trap arrangement is provided, to which the excitation light reflected by total reflection at the interface is supplied.
  • reflected illumination light of one-dimensionally illuminated points of the objective exit pupil is masked out via a mirror arrangement. If the reflected illumination light is a two-dimensional illumination pattern, effective masking with the known arrangement is not possible.
  • the present invention has for its object to design a microscope of the generic type such and further, that in two-dimensional illumination pattern stray light in the detection beam path is largely avoided.
  • the microscope of the invention solves the above problem by the features of claim 1.
  • the generic microscope is characterized in that in the illumination beam path of the expression of the reflection light adapted means for spatially separating the reflection light from the illumination light and for deriving the reflection light are provided in a light trap.
  • the means for spatially separating the reflection light from the illumination light serve. Furthermore, a light trap is provided, into which the reflection light spatially separated from the illumination light is introduced for absorption. Thus, it is possible effectively to prevent the reflection light from reaching the detection beam path to the extent of its two-dimensional expression as a stray light and thus to falsify the imaging or measurement.
  • the microscope according to the invention can be a microscope of any type, in which case it is in particular a microscope for the evanescent illumination of a sample.
  • a microscope objective is illuminated evanescently, namely by a punctiform illumination of the objective exit pupil.
  • any points in the objective pupil can be illuminated. Due to the total reflection of the illumination light occurring in TIRF microscopy, the Reflection light are coupled out of the illumination beam path and absorbed so that no stray light can get into the detection beam path.
  • this was extremely expensive or impossible, namely because the evanescent lighting has a mostly annular illumination pattern in the lens exit pupil. This is primarily about fading out and the absorption of two-dimensional illumination patterns, especially in TIRF microscopy.
  • the means for spatially separating the reflection light from the illumination light already include existing components, namely the x-y scanner.
  • this x-y scanner serves to deflect the reflection light reflected at the optical axis into the reflection beam path with an angular offset with respect to the illumination light, so that the reflection light is separated from the incident illumination light.
  • a laser light source wherein the light is coupled by means of optical fiber into the microscope.
  • the beam emerging at the fiber typically has a very small numerical aperture, approximately in the range of 0.08.
  • the divergent light is collimated and impinges as a parallel beam on the scanner, which is usually arranged in a conjugate plane to the object.
  • the lens and illuminates the lens pupil punctiform depending on the position of the scanner.
  • the motion sequence of the scanner produces a two-dimensional illumination pattern in the objective pupil, in accordance with the needs of TIRF microscopy. From there, the illumination light reaches the sample surface or its cover.
  • the beam travels mirrored back into the illumination beam path on the optical axis. Due to the deflection by the xy scanner, the reflection light beam or the reflection beam path formed therefrom receives an angular offset with respect to the incident illumination light, so that the xy scanner can be viewed as part of the means for spatially separating the reflection light from the illumination light. Furthermore, it is advantageous if, in the reflection beam path that is angled away from the illumination beam path, a deflecting device adapted to the two-dimensional expression of the reflection light is provided for the reflection light.
  • the deflector may be a mirror.
  • the deflection device could be designed accordingly as an annular mirror, namely arranged exactly in the reflection beam path and matched to the expression of the reflection light.
  • the deflection device is arranged as far away as possible from the xy scanner so that the reflection light is sufficiently far away from the illumination beam path, namely on the basis of the angle offset of the reflection light with respect to the illuminating light achieved by the xy scanner.
  • the light source most particularly suitable is a laser light source whose light is coupled into the illumination beam path via an optical fiber.
  • the light emerging from the optical fiber is divergent, so that the optical fiber is followed by a collimator for parallelizing the light.
  • the deflection device is arranged near the light coupling following collimator, namely between the collimator and the x-y scanner, as far as possible from the x-y scanner.
  • the deflection device such as the mirror or the annular mirror
  • the deflection device it is possible to arrange the deflection device in the region of the focus of the reflection light, ie next to the fiber, it being pointed out at this point that such an arrangement is difficult to realize due to the proximity to the fiber and the required rotational symmetry.
  • the deflection device can be arranged directly next to the light coupling or the fiber end, wherein the deflection device itself can in turn be coupled to the fiber or forms a structural unit with the fiber. It is essential that the deflection as close to the exit end of the optical fiber comes into effect.
  • the reflection light has an embossing like the illumination light with respect to the spatial distribution of the illumination points.
  • the deflector and the light trap are to be formed, and the above-discussed deflector itself may serve as a light trap for absorbing the light.
  • the deflection device it is possible for the deflection device to be arranged downstream of the actual light trap, whereby the light trap can also have an effective surface adapted to the characteristic of the reflection light.
  • This active surface may be annular according to the design of the deflector, such a provision is not mandatory, provided that a sufficiently good suppression of the reflection light from the illumination beam path has already taken place by means of the deflector.
  • FIG. 1 shows the illumination beam path 1 and the reflection beam path 2 in one exemplary embodiment of a microscope according to the invention.
  • the illumination light 7 is provided via a laser light source 3, wherein the light is coupled via an optical fiber 4 in the illumination beam path 1.
  • the illumination light 7 emerges at the light exit 5 of the optical fiber 4 in an initially divergent form and is collimated or parallelized by means of a collimator 6.
  • the illumination light 7 passes parallel to an x-y scanner 8, which is arranged in a conjugate plane to an object not shown in the figure.
  • the objective pupil (not shown in the figure) is spot-illuminated, with a two-dimensional illumination pattern for TIRF illumination resulting from the scanning movement of the x-y scanner 8.
  • the totally reflected reflection light 9 runs back into the illumination steel path 1 as far as the xy scanner 8, the reflection light 9 being mirrored on the optical axis.
  • the reflection light 9 thus returns to the illumination beam path 1. Due to the deflection by the x-y scanner 8, the reflection light 9 undergoes an indicated by the arrow 10 angle offset relative to the incident illumination light. 7
  • an annular mirror 11 is arranged, which is dimensioned and positioned such that it receives each reflected illumination point of the reflection light 9 and guides it via the reflection beam path 2 to a light trap 12. There, the reflection light 9 is absorbed after it has been deflected by the illumination beam path 1.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop, insbesondere zur evaneszenten Beleuchtung einer Probe, mit einer Lichtquelle (3), einem im Beleuchtungsstrahlengang (1) angeordneten x-y-Scanner (8) und einem Objektiv, wobei sowohl Beleuchtungslicht (7) als auch Detektionslicht durch das Objektiv geführt werden, wobei das einfallende Beleuchtungslicht (7) in der Ebene der Objektivpupille einen Fokus aufweist, wobei die Objektivpupille im Verlauf des Scannens durch Aneinanderreihung einzelner Beleuchtungspunkte zweidimensional, vorzugsweise ringförmig, beleuchtet wird, und wobei an der Probe oder an einer Probenabdeckung vorzugsweise totalreflektiertes Beleuchtungslicht (Reflexionslicht) (9) in den Beleuchtungsstrahlengang (1) zurückkehrt. Das Mikroskop ist dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang (1) der Ausprägung des Reflexionslichts (9) angepasste Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts (9) vom Beleuchtungslicht (7) und zum Ableiten des Reflexionslichts (9) in eine Lichtfalle (12) vorgesehen sind.

Description

MIKROSKOP
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskop, insbesondere zur evaneszenten Beleuchtung einer Probe, mit einer Lichtquelle, einem im Beleuchtungsstrahlengang angeordneten x-y-Scanner und einem Objektiv, wobei sowohl Beleuchtungslicht als auch Detektionslicht durch das Objektiv geführt werden, wobei das einfallende Beleuchtungslicht in der Ebene der Objektivpupille einen Fokus aufweist, wobei die Objektivpupille im Verlauf des Scannens durch Aneinanderreihung einzelner Beleuchtungspunkte zweidimensional, vorzugsweise ringförmig, beleuchtet wird, und wobei an der Probe oder an einer Probenabdeckung vorzugsweise total reflektiertes Beleuchtungslicht (Reflexionslicht) in den Beleuchtungsstrahlengang zurückkehrt.
Bei der Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie wird das Brechungsverhalten von Licht beim Übergang von einem optisch dichteren in ein optisch dünneres Medium genutzt. So ergibt sich beispielsweise für den Übergang von Deckglas (n1=1 ,518) zu Wasser (n2=1 ,33) ein kritischer Winkel von 61 °, der Winkel der Total-Reflexion. Unter den Bedingungen der Total-Reflexion (Winkel >61 °) bildet sich im Medium mit geringerem Brechungsindex eine stehende evaneszente Welle. Die Intensität dieser Well fällt exponentiell mit dem Abstand zur Grenzfläche ab. Aufgrund dessen werden von der Grenzfläche weiter entfernte Fluorophore nicht angeregt. Die Hintergrundfluoreszenz wird erheblich reduziert. Der Bildkontrast wird dabei verbessert und die Auflösung wird gleichzeitig deutlich gesteigert. Voraussetzung für die Nutzung des voranstehend geschilderten Phänomens ist ein ausreichend großer Unterschied der Brechungsindizes von Deckglas und Medium.
Aus der US 2002/0097489 A1 ist bereits ein Mikroskop mit evaneszenter Beleuchtung einer Probe bekannt. Das Mikroskop beinhaltet eine Weißlichtquelle, deren Licht über eine Schlitzblende durch das Mikroskopobjektiv hindurch in den eine Probe tragenden Objektträger zur evaneszenten Beleuchtung eingekoppelt wird. Das Beleuchtungslicht pflanzt sich in dem Objektträger durch totalinterne Reflektion fort, wobei die Beleuchtung der Probe nur im Bereich des aus dem Objektträger herausragenden evaneszenten Feldes erfolgt. Mikroskope dieser Art sind unter dem Begriff TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescent Microscope) bekannt. Die z-Auflösung von TIRF-Mikroskopen ist aufgrund des nur ca. 100 nm in die Probe ragenden evaneszenten Feldes außerordentlich gut.
Aus der DE 101 08 796 A1 ist ein hochaperturiges Objektiv, insbesondere für TIRF- Anwendungen, bekannt. Das Objektiv besteht aus einer ersten Linse mit einer positiven Brechkraft, einer zweiten Linse mit negativer Brechkraft, wobei das Brennweitenverhältnis zwischen den beiden Linsen im Bereich von - 0,4 und - 0,1 liegt und die Gesamtbrech kraft größer Null ist. Ferner beinhaltet das Objektiv zwei positive Linsen, deren Verhältnisdurchmesser zur Brennweite größer 0,3 und kleiner 0,6 ist. Ferner beinhaltet das Objektiv eine Negativlinse und einer Sammellinse, wobei die Negativlinse der Frontgruppe zugewandt ist und das Brennweitenverhältnis der Negativlinse und der Sammellinse zwischen - 0,5 und - 2 liegt.
Aus der DE 102 17 098 A1 ist eine Auflichtbeleuchtungsanordnung für die TIRF- Mikroskopie bekannt. Die Auflichtbeleuchtungsanordnung beinhaltet eine Beleuchtungsquelle, die im Betrieb ein polarisiertes Beleuchtungsstrahlenbündel abgibt, das unter einem Winkel zur optischen Achse propagiert und eine Umlenkeinrichtung, die das Beleuchtungsstrahlenbündel umlenkt und parallel zur optischen Achse in das Objektiv einkoppelt. Es ist bei dieser Auflichtbeleuchtungsanordnung vorgesehen, dass das von der Beleuchtungsquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlenbündel s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer Phasendifferenz aufweist und die Umlenkeinrichtung das Beleuchtungsstrahlenbündel x-mal reflektiert, wobei x = (n x 180 ° - d)/60 °.
Aus der DE 101 43 481 A1 ist ein Mikroskop zur TIRM (Total Internal Reflection Microscopy) bekannt. Das Mikroskop weist ein Mikroskopgehäuse und ein Objektiv auf. Das von einer Beleuchtungseinrichtung ausgehende Beleuchtungslicht kann über einen in das Mikroskopgehäuse einschiebbaren Adapter eingekoppelt werden.
Aus der US 2004/0001253 A1 ist ein Mikroskop mit einem optischen Beleuchtungssystem, das ein einfaches Umschalten zwischen evaneszenter Beleuchtung und Reflektionsbeleuchtung ermöglicht. Das Beleuchtungssystem beinhaltet eine Laserlichtquelle, deren Licht in eine optische Faser eingekoppelt wird. Ferner ist eine Auskoppeloptik vorgesehen, die das aus der Faser austretende Licht in einen hinteren Brennpunkt des Mikroskopobjektivs fokussiert. Die optische Faser ist in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs verschiebbar.
Aus der DE 102 29 935 A1 ist eine Einrichtung zur Einkopplung von Licht in einem Mikroskop bekannt. Dort wird in der Leuchtfeldblendenebene durch eine als Schieber ausgeführte Lichtleitfaser-Einkopplung Laserlicht auf das Präparat gerichtet. Die Erfindung ist insbesondere für das TIRF-Verfahren geeignet.
In der Rastermikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Detektionslicht, als Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahlenbündels wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Probenebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Detektionslichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet. Speziell in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahls in drei Dimensionen abgetastet.
Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Diese Detektionsanordnung wird Descan- Anordnung genannt. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts mit dem Fokus des Beleuchtungslichtstrahlenbündels zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt.
Wie bereits zuvor erwähnt, geht es hier um Mikroskope, die sich für TIRF-Unter- suchungen eignen. Dabei wir eine Probe unter sehr flachem Winkel beleuchtet, nämlich zur Erzeugung von Total-Reflexion an der Probenoberfläche, an einem Deckglas oder dergleichen. Im Stand der Technik verwendet man dazu Objektive mit sehr großer Apertur, um große Beleuchtungsaperturen zu ermöglichen. Die Fluoreszenz-Anregung erfolgt über eine Laserlichtquelle, wobei der Laser regelmäßig auf einen Punkt am Pupillenrand des Objektivs abgebildet wird. Aus dem Stand der Technik ist es auch bereits bekannt, zur Fluoreszenz-Anregung Gasentladungs-Lampen zu verwenden. In der Aperturebene des Beleuchtungsstrahlengangs wird dabei eine Ringblende eingebracht, so dass nur der Pupillenrand des Objektivs beleuchtet wird.
Bei der Totalinternen-Reflexions-Mikroskopie ist das total reflektierte Beleuchtungslicht problematisch, da es in den Beleuchtungsstrahlengang zurückkehrt und ohne besondere Maßnahmen in den Detektionsstrahlengang gelangt. Zur Vermeidung von Falschlicht muss es daher ausgekoppelt und absorbiert werden.
Aus der DE 102 58 945 A1 ist für sich gesehen ein TIRF-Mikroskop bekannt, bei dem gemäß dortiger Figur 3 eine Lichtfallenanordnung vorgesehen ist, der das durch Totalreflexion an der Grenzfläche reflektierte Anregungslicht zugeführt wird. Dabei wird reflektiertes Beleuchtungslicht eindimensional beleuchteter Punkte der Objektivaustrittspupille über eine Spiegelanordnung ausgeblendet. Handelt es sich bei dem reflektierten Beleuchtungslicht um ein zweidimensionales Beleuchtungsmuster, ist eine wirksame Ausblendung mit der bekannten Anordnung nicht möglich.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop der gattungsbildenden Art derart auszugestalten und weiterzubilden, dass bei zweidimensionalem Beleuchtungsmuster Falschlicht im Detektionsstrahlengang weitestgehend vermieden wird. Das erfindungsgemäße Mikroskop löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist das gattungsbildende Mikroskop dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang der Ausprägung des Reflexionslichts angepasste Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht und zum Ableiten des Reflexionslichts in eine Lichtfalle vorgesehen sind.
In erfindungsgemäßer Weise ist erkannt worden, dass man auch bei zweidimensionalen Beleuchtungsmustern eine Ausblendung des total reflektierten Beleuchtungslichts zur Vermeidung von Fehllicht im Detektionsstrahlengang mit einfachen Mitteln realisieren kann, nämlich dadurch, dass im Beleuchtungsstrahlengang besondere Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht vorgesehen sind. Diese besonderen Mittel sind der Ausprägung des Reflexionslichts angepasst. Mit anderen Worten handelt es sich hier um Mittel, die entsprechend der zweidimensionalen Ausprägung des Reflexionslichts konstruiert sind, so dass die Ausblendung ausschließlich in Bezug auf das konkret ausgebildete Reflexionslicht stattfinden kann. So ist in Bezug auf die die Ausblendung bewerkstelligenden Mittel nicht nur deren exakte Positionierung sondern auch die Form der in Bezug auf die Ausblendung wirksamen Fläche von besonderer Bedeutung.
Wie bereits zuvor ausgeführt, dienen die Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht. Des Weiteren ist eine Lichtfalle vorgesehen, in die das vom Beleuchtungslicht räumlich getrennte Reflexionslicht zur Absorption hineingeleitet wird. So lässt sich wirksam verhindern, dass das Reflexionslicht im Umfange seiner zweidimensionalen Ausprägung als Falschlicht in den Detektionsstrahlengang gelangt und somit die Abbildung bzw. Messung verfälscht.
An dieser Stelle sei angemerkt, dass es sich bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop um ein Mikroskop jedweder Bauart handeln kann, wobei es sich dabei insbesondere um ein Mikroskop zur evaneszenten Beleuchtung einer Probe handelt. Dabei wird ein Mikroskopobjektiv evaneszent beleuchtet, nämlich durch eine punktförmige Beleuchtung der Objektivaustrittspupille. Durch einen zweidimensionalen Scanner lassen sich beliebige Punkte in der Objektivpupille ausleuchten. Aufgrund der bei der TIRF-Mikroskopie auftretenden Totalreflexion des Beleuchtungslichts muss das Reflexionslicht aus dem Beleuchtungsstrahlengang ausgekoppelt und absorbiert werden, damit kein Falschlicht in den Detektionsstrahlengang gelangen kann. Mit bisher bekannten Mitteln war dies äußerst aufwendig oder unmöglich, da nämlich die evaneszente Beleuchtung ein meist ringförmiges Beleuchtungsmuster in der Objektivaustrittspupille aufweist. So geht es hier in erster Linie um das Ausblenden und um die Absorption zweidimensionaler Beleuchtungsmuster, insbesondere bei der TIRF-Mikroskopie.
In konstruktiver Hinsicht ist es von Vorteil, wenn die Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht bereits vorhandene Bauteile umfassen, nämlich den x-y-Scanner. Dieser x-y-Scanner dient nämlich über seine eigentliche Scanfunktion hinaus dazu, das an der optischen Achse gespiegelte Reflexionslicht mit einem Winkelversatz gegenüber dem Beleuchtungslicht in einen Reflexionsstrahlengang abzulenken, so dass das Reflexionslicht vom einfallenden Beleuchtungslicht getrennt ist.
Zur Funktionsweise des Mikroskops sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass als Lichtquelle meist eine Laserlichtquelle dient, wobei das Licht mittels Lichtleitfaser in das Mikroskop eingekoppelt wird. Der an der Faser austretende Strahl hat typischerweise eine sehr kleine numerische Apertur, so in etwa im Bereich von 0,08. Üblicherweise wird das divergente Licht kollimiert und trifft als Parallelstrahl auf den Scanner, der üblicherweise in einer konjugierten Ebene zum Objekt angeordnet ist. Im weiteren Verlauf gelangt das Licht in das Objektiv und beleuchtet die Objektivpupille punktförmig, und zwar je nach Stellung des Scanners. Im Bewegungsablauf des Scanners entsteht ein zweidimensionales Beleuchtungsmuster in der Objektivpupille, und zwar entsprechend den Bedürfnissen der TIRF-Mikroskopie. Von dort aus gelangt das Beleuchtungslicht zur Probenoberfläche bzw. zu deren Abdeckung. Nach Totalreflexion an der Probe bzw. an der Objektabdeckung läuft der Strahl an der optischen Achse gespiegelt in den Beleuchtungsstrahlengang zurück. Aufgrund der Ablenkung durch den x-y-Scanner erhält der Reflexionslichtstrahl bzw. der daraus gebildete Reflexionsstrahlengang einen Winkelversatz gegenüber dem einfallenden Beleuchtungslicht, so dass der x-y-Scanner als Bestandteil der zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts vom Beleuchtungslicht dienenden Mittel betrachtet werden kann. Des Weiteren ist es von Vorteil, wenn in dem vom Beleuchtungsstrahlengang abgewinkelten Reflexionsstrahlengang eine der zweidimensionalen Ausprägung des Reflexionslichts angepassten Ablenkeinrichtung für das Reflexionslicht vorgesehen ist. Bei der Ablenkeinrichtung kann es sich um einen Spiegel handeln. Sofern das Reflexionslicht - entsprechend der Prägung des Beleuchtungslichts - eine ringförmige Anordnung der einzelnen Beleuchtungspunkte aufweist, könnte die Ablenkeinrichtung entsprechend als Ringspiegel ausgeführt sein, nämlich exakt im Reflexionsstrahlengang angeordnet und auf die Ausprägung des Reflexionslichts abgestimmt.
Zur Realisierung einer hinreichend großen Ablenkeinrichtung, die zur weiterreichenden Ablenkung des Reflexionslichts geeignet ist, ist es von weiterem Vorteil, wenn die Ablenkeinrichtung möglichst weit von dem x-y-Scanner entfernt angeordnet ist, damit nämlich das Reflexionslicht hinreichend weit vom Beleuchtungsstrahlengang entfernt ist, nämlich unter Zugrundelegung des durch den x-y-Scanner erzielten Winkelversatzes des Reflexionslichts in Bezug auf das Beleuchtungslicht.
Zuvor ist bereit erwähnt worden, dass sich als Lichtquelle ganz besonders eine Laserlichtquelle eignet, deren Licht über eine Lichtleitfaser in den Beleuchtungsstrahlengang eingekoppelt wird. Das aus der Lichtleitfaser austretende Licht ist divergent, so dass der Lichtleitfaser ein Kollimator zur Parallelisierung des Lichts nachgeschaltet ist. Insoweit ist es von Vorteil, wenn die Ablenkeinrichtung nahe des der Lichteinkopplung folgenden Kollimators, nämlich zwischen dem Kollimator und dem x-y-Scanner, angeordnet ist, und zwar möglichst weit vom x-y-Scanner entfernt.
In Bezug auf die Anordnung der Ablenkeinrichtung, so beispielsweise des Spiegels bzw. des Ringspiegels, ist es denkbar, diesen im Rahmen einer alternativen Ausgestaltung nahe der Lichteinkopplung vorzusehen, so beispielsweise nahe dem Faserende einer Lichtleitfaser, die zum Einkoppeln in das Beleuchtungslicht dient. Insoweit ist es möglich, die Ablenkeinrichtung im Bereich des Fokus des Reflexionslichts, d.h. neben der Faser, anzuordnen, wobei an dieser Stelle darauf hingewiesen sei, dass eine solche Anordnung aufgrund der Nähe zur Faser und der erforderlichen Rotationssymmetrie schwierig in der Realisierung ist. Dennoch ist es möglich, die Ablenkeinrichtung nahe der Lichteinkopplung vorzusehen, und zwar insbesondere in einer konjugierten Ebene zur Lichteinkopplung. Im Konkreten kann die Ablenkeinrichtung unmittelbar neben der Lichteinkopplung bzw. dem Faserende angeordnet sein, wobei die Ablenkeinrichtung selbst wiederum an die Faser gekoppelt sein kann oder mit der Faser eine bauliche Einheit bildet. Wesentlich ist dabei, dass die Ablenkeinrichtung möglichst nahe am Austrittsende der Lichtleitfaser zur Wirkung kommt.
In Bezug auf die erfindungsgemäße Lehre ist von Bedeutung, dass das Reflexionslicht eine Prägung wie das Beleuchtungslicht in Bezug auf die räumliche Verteilung der Beleuchtungspunkte aufweist. Entsprechend sind die Ablenkeinrichtung und die Lichtfalle auszubilden, wobei die zuvor erörterte Ablenkeinrichtung selbst als Lichtfalle zur Absorption des Lichts dienen kann. Ebenso ist es möglich, dass der Ablenkeinrichtung die eigentliche Lichtfalle nachgeordnet ist, wobei auch die Lichtfalle eine der Ausprägung des Reflexionslichts angepasste Wirkfläche haben kann. Diese Wirkfläche kann entsprechend der Ausgestaltung der Ablenkeinrichtung ringförmig ausgebildet sein, wobei eine solche Vorkehrung nicht zwingend erforderlich ist, sofern eine hinreichend gute Ausblendung des Reflexionslichts aus dem Beleuchtungsstrahlengang mittels der Ablenkeinrichtung bereits stattgefunden hat.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigt
die einzige Fig. in einer schematischen Ansicht den prinzipiellen Verlauf des Beleuchtungslichts und des Reflexionslichts bis hin zu einer Lichtfalle. Die einzige Figur zeigt den Beleuchtungsstrahlengang 1 und den Reflexionsstrahlengang 2 in einem Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops.
Im Konkreten wird das Beleuchtungslicht 7 über eine Laserlichtquelle 3 zur Verfügung gestellt, wobei das Licht über eine Lichtleitfaser 4 in den Beleuchtungsstrahlengang 1 eingekoppelt wird. Das Beleuchtungslicht 7 tritt am Lichtaustritt 5 der Lichtleitfaser 4 in zunächst divergenter Form aus und wird mittels Kollimator 6 kollimiert bzw. parallelisiert. Das Beleuchtungslicht 7 gelangt parallel zu einem x-y-Scanner 8, der in einer konjugierten Ebene zu einem in der Figur nicht gezeigten Objekt angeordnet ist.
Im weiteren Verlauf wird die in der Figur nicht gezeigte Objektivpupille punktförmig beleuchtet, wobei sich aufgrund der Scannbewegung des x-y-Scanners 8 ein zweidimensionales Beleuchtungsmuster zur TIRF-Beleuchtung ergibt.
Nach Totalreflexion am Objekt bzw. an der Objektabdeckung läuft das totalreflektierte Reflexionslicht 9 zurück in den Beleuchtungsstahlengang 1 bis hin zum x- y-Scanner 8, wobei das Reflexionslicht 9 an der optischen Achse gespiegelt ist.
Das Reflexionslicht 9 kehrt somit in den Beleuchtungsstrahlengang 1 zurück. Aufgrund der Ablenkung durch den x-y-Scanner 8 erfährt das Reflexionslicht 9 einen durch den Pfeil 10 angedeuteten Winkelversatz gegenüber dem einfallenden Beleuchtungslicht 7.
Nahe dem Kollimator 6 ist ein Ringspiegel 11 angeordnet, der derart dimensioniert und positioniert ist, dass er jeden reflektierten Beleuchtungspunkt des Reflexionslichts 9 aufnimmt und ihn über den Reflexionsstrahlengang 2 zu einer Lichtfalle 12 leitet. Dort wird das Reflexionslicht 9 absorbiert, nachdem es von dem Beleuchtungsstrahlengang 1 abgelenkt worden ist.
In Bezug auf weitere vorteilhafte Ausgestaltungen, die sich der einzigen Figur nicht entnehmen lassen, sei zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung verwiesen. Schließlich sei angemerkt, dass das voranstehend beschriebene Ausführungsbeispiel der Erörterung der erfindungsgemäßen Lehre dient, diese jedoch nicht auf das Ausführungsbeispiel einschränkt.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Mikroskop, insbesondere zur evaneszenten Beleuchtung einer Probe, mit einer Lichtquelle (3), einem im Beleuchtungsstrahlengang (1) angeordneten x-y- Scanner (8) und einem Objektiv, wobei sowohl Beleuchtungslicht (7) als auch Detektionslicht durch das Objektiv geführt werden, wobei das einfallende Beleuchtungslicht (7) in der Ebene der Objektivpupille einen Fokus aufweist, wobei die Objektivpupille im Verlauf des Scannens durch Aneinanderreihung einzelner Beleuchtungspunkte zweidimensional, vorzugsweise ringförmig, beleuchtet wird, und wobei an der Probe oder an einer Probenabdeckung vorzugsweise totalreflektiertes Beleuchtungslicht (Reflexionslicht) (9) in den Beleuchtungsstrahlengang (1) zurückkehrt, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass im Beleuchtungsstrahlengang (1 ) der Ausprägung des Reflexionslichts (9) angepasste Mittel zum räumlichen Trennen des Reflexionslichts (9) vom Beleuchtungslicht (7) und zum Ableiten des Reflexionslichts (9) in eine Lichtfalle (12) vorgesehen sind.
2. Mikroskop nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel den x-y- Scanner (8) umfassen, der das an der optischen Achse gespiegelte Reflexionslicht (9) mit einem Winkelversatz (10) gegenüber dem Beleuchtungslicht (7) in einen Reflexionsstrahlengang (2) ablenkt.
3. Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Reflexionsstrahlengang (2) eine der zweidimensionalen Ausprägung des Reflexionslicht (9) angepasste Ablenkeinrichtung für das Reflexionslicht (9) vorgesehen ist.
4. Mikroskop nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkeinrichtung als Spiegel ausgeführt ist.
5. Mikroskop nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkeinrichtung als Ringspiegel (11 ) ausgeführt ist.
6. Mikroskop nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkeinrichtung möglichst weit von dem x-y-Scanner (8) entfernt angeordnet ist.
7. Mikroskop nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkeinrichtung nahe eines einer Lichteinkopplung folgenden Kollimators (6), zwischen dem Kollimator (6) und dem x-y-Scanner (8), angeordnet ist.
8. Mikroskop nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkeinrichtung nahe der Lichteinkopplung, vorzugsweise nahe dem Faserende einer Lichtleitfaser (4), angeordnet ist.
9. Mikroskop nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkeinrichtung in einer konjugierten Ebene zur Lichteinkopplung angeordnet ist.
10. Mikroskop nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkeinrichtung unmittelbar neben der Lichteinkopplung angeordnet ist.
11. Mikroskop nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkeinrichtung an die Faser gekoppelt ist oder mit der Faser eine bauliche Einheit bildet.
12. Mikroskop nach einem der Ansprüche 3 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Ablenkeinrichtung als Lichtfalle (12) ausgeführt ist oder dass der Ablenkeinrichtung die Lichtfalle (12) nachgeordnet ist.
13. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtfalle (12) eine der Ausprägung des Reflexionslichts (9) angepasste Wirkfläche hat.
14. Mikroskop nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirkfläche der Lichtfalle (12) ringförmig ausgebildet ist.
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