CN104718427B - 检测方法、微阵列的分析方法及荧光读取装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供能够取得能够准确地检测基板的高度差异的图像的检测方法、微阵列的分析方法以及荧光读取装置。所述检测方法是将通过透镜而被聚光后的激光照射于具有凹凸形状的基板，取得来自基板的反射光和/或散射光的接收强度作为图像数据，检测凹凸形状的高度的差异的检测方法，在与透镜的焦点位置相比靠近透镜的位置配置基板的光照射面，接收来自光照射面的反射光和/或散射光作为检测光，基于接收到的光的强度的变化，检测基板的高度的差异。

Description

检测方法、微阵列的分析方法及荧光读取装置

技术领域

本发明涉及检测微阵列的表面的凹凸形状的高度的差异的检测方法、微阵列的分析方法以及荧光读取装置。

背景技术

1990年以来，在生物学、医学、药学方面被称为微阵列的技术的开发进展，逐渐被利用。微阵列在玻璃、塑料等基板上固定有数十～数万探针，将被荧光分子等标记了的样品(靶)应用于该基板，以荧光等检测探针与样品的结合反应。微阵列能够一次进行网罗性测定，今后期待成为定制医疗所需。

以往，已知将DNA作为探针而固定于基板的DNA微阵列(以下，DNA芯片)、将蛋白质作为探针而固定于基板的蛋白质微阵列、将多个微小标本作为探针而固定化于基板的组织微阵列、将多个低分子化合物作为探针固定化于基板的化合物微阵列等。

其中，DNA芯片的实用化最发展，与疾病相关的基因的探索、使用该基因进行检查、诊断的研究活跃地进行，一部分已实用化。

以下对作为微阵列的一方式的DNA芯片，进行详细地说明。

DNA芯片在由玻璃、树脂等构成的基板上网格状地点样(固定化)有DNA。在DNA芯片上，作为能够与被标记的DNA样品特异性反应的探针，点样有单链的DNA(DNA探针)。另外，DNA探针使用序列已知的探针。另一方面，对于应当分析的未知序列的DNA样品(单链DNA)，预先附上能够进行光学检测的发光或荧光标记。这样一来，在将应当分析的未知序列的DNA样品注入至DNA芯片上的情况下，如果该DNA样品的序列与 DNA探针的序列存在互补关系，则DNA探针与DNA样品结合而成为双链的DNA。因此，如果将未与DNA探针结合的DNA样品全部洗掉，使残存于DNA芯片上的想要判定的DNA样品发光，通过读取装置(扫描仪)来读取该发光，则能够作为图像来观察成为了双链的DNA的状况。即，通过分析在DNA芯片上发光的标记的分布，可以分析所寻求的基因的存在、是否表达某基因、或以何种程度表达某基因。这样，通过在DNA芯片上构成具有已知序列的DNA探针组，将各自不同的序列的DNA探针搭载于DNA芯片上，从而可以检测基因的变异、基因的表达量等。

以下，图13中示出DNA芯片分析的一系列处理工序的详细内容。

在图13所示的前处理工序中，将从检体提取的DNA样品中所包含的未知的DNA扩增，对这些DNA附与荧光标记(例如，Cy3、Cy5等)(步骤S201)。

接下来在杂交工序中，在搭载有多种DNA探针的DNA芯片的基板上，滴加附与了荧光标记的DNA样品。这里，如果DNA样品与被点样了的DNA探针存在互补关系，则结合而成为双链(步骤S202)。

接下来，在洗涤工序中，利用规定的洗涤液，将被杂交了的DNA芯片进行洗涤(步骤S203)。由此，未与网格状地配置的DNA探针结合的DNA样品全部被洗掉。

接着，对洗涤后的DNA芯片照射光进行扫描(步骤S204)。在扫描工序中，将适于激发荧光标记的波长的激光照射至DNA芯片，取得来自与各DNA探针分别结合了(杂交了)的DNA样品的荧光作为电信号。由此，可以测定对与被点样了的各DNA探针(基因)结合了的DNA样品附与的荧光标记的发光量，基于此进行分析处理，获得荧光图像数据。

在分析工序中，对于所得的荧光图像数据，利用模板来算出各点的荧光强度，执行各种分析(步骤S205)。

这里，图14显示DNA芯片分析所使用的DNA芯片100的一例。图14所示的DNA芯片100形成具有凹凸形状的矩形板状。DNA芯片100具有板面被分割成格子状的多个块101。在该块101的上面形成有多个点102， 所述多个点102形成大致圆柱状或平截头台状地进行设置，固定多个与各个基因对应的DNA探针，在行方向和列方向上以规定数、矩阵状地排列。此外，多个块101形成于棱柱状地凹陷而成的凹部103的底部。另外，点102上所配置的DNA探针分别对应于已经破译了其碱基序列的彼此不同的基因，块101上的其配置位置已预先确定。

此外，图15显示对于DNA芯片的荧光图像数据适用的模板的一例。如图15所示，模板分割成多个(例如，在图15中为32个)块(与块101对应)，在各块内设置有m行n列(在图15中为22×22)的配置成矩阵状的检测区域(与DNA芯片100的各个点102对应)。

在上述分析工序中，对读取到的DNA芯片的荧光图像数据中的各个点102，拟合(对准)分析工具所提供的模板的检测区域，算出在该检测区域中各点102的荧光强度。此时，为了执行准确的分析，需要准确地执行对准处理，对图像上的各个点102正确地设定模板的各个检测区域。

作为该对准的方法，有以块单元进行对准的图案匹配法、投影法等。而且，也可如专利文献1所公开的技术那样，尝试使用点样有被称为阳性对照的荧光物质、任何检体中都包含的持家基因的芯片，准确地进行对准。

进一步，还考察了如专利文献2所公开的技术那样，以来自基板的反射光、散射光将凹凸形状图像化，由该图像进行对准的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2005-172840号公报

专利文献2：日本特开2005-24532号公报

发明内容

发明所要解决的课题

然而，以块单元进行对准的典型的图案匹配法、投影法中，都是杂交了的样品DNA的量多，如果各块101中发出充分强度的荧光的点102不存在1/4至半数左右，则不能正确地对准。因此，在由检体提取的样品中 所包含的DNA量少的情况下，有时不能正常地进行对准。

另一方面，在将荧光物质进行点样来配置的方法中，虽然有即使发出充分强度的荧光的点少也可进行对准这样的优点，但有可在点102上配置的DNA数减少，芯片制造时的成本上升等问题。此外，在将荧光物质进行点样的情况下，在杂交中它们游离，会将阳性对照的周边污染，有可能得不到数据。

本发明是鉴于上述情况而提出的，其目的在于提供能够取得准确地检测基板的高度的差异的图像的检测方法、微阵列的分析方法以及荧光读取装置。

用于解决课题的方法

为了解决上述课题，实现目的，本发明所涉及的检测方法的特征在于，是将通过透镜而被聚光后的激光照射于具有凹凸形状的基板，取得来自该基板的反射光和/或散射光的光强度作为图像数据，检测上述凹凸形状的高度的差异的检测方法，在与上述透镜的焦点位置相比靠近上述透镜的位置配置上述基板的光照射面，接收来自该光照射面的反射光和/或散射光作为检测光，基于该接收到的光的强度的变化，检测上述基板的高度的差异。

此外，本发明所涉及的检测方法的特征在于，在上述发明中，使用在将上述基板的光照射面配置于上述焦点位置的情况下，将来自该光照射面的正反射光从上述检测光中分离的光学系统，进行上述基板的高度的检测。

此外，本发明所涉及的检测方法的特征在于，在上述发明中，将上述透镜的焦点距离设为f，将上述基板从上述焦点位置靠近上述透镜的距离设为α时，在以α/f成为规定范围内的方式设定的α所对应的位置配置上述基板的光照射面。

此外，本发明所涉及的微阵列的分析方法的特征在于，是对形成有凹凸形状、配置有能够与各自经荧光标记的样品结合的多个探针的微阵列，经由物镜照射包含上述荧光标记的激发波长的光，并且接收来自上述微阵列的光，根据基于该接收到的光的图像进行上述微阵列的分析的微阵列的分析方法，其包括下述步骤：荧光图像数据取得步骤，检测来自上述荧光 标记的荧光，取得荧光图像数据；对准用图像数据取得步骤，检测来自上述微阵列的表面的光，取得进行上述荧光图像数据的对准的对准用图像数据；检测步骤，根据上述对准用图像数据的光强度的变化，检测上述凹凸形状的高度的差异；校正步骤，基于通过上述检测步骤检测到的上述凹凸形状的高度的差异，校正上述荧光图像数据；以及位置确定步骤，确定通过上述校正步骤校正后的上述荧光图像数据中的各探针的位置，上述对准用图像数据取得步骤，在将上述微阵列的表面配置于相对于上述物镜的焦点位置靠近该物镜的位置的状态下，取得上述对准用图像数据。

此外，本发明所涉及的微阵列的分析方法的特征在于，在上述发明中，上述检测步骤，在上述对准用图像数据中，基于上述光强度的变化，检测3个以上基准点，上述校正步骤，根据检测到的基准点，校正上述荧光图像数据的失真。

此外，本发明所涉及的微阵列的分析方法的特征在于，在上述发明中，上述校正步骤，取得基于上述基准点的上述对准用图像数据的倾斜角度θx、θy，根据该倾斜角度θx、θy和下述式(1)、式(2)，校正上述荧光图像数据的剪切变形失真。

[数1]

θxy＝θx-θy ···(2)

此外，本发明所涉及的微阵列的分析方法，在上述发明中，上述对准用图像数据取得步骤，在将上述物镜的焦点距离设为f，将上述微阵列从上述焦点位置靠近上述物镜的距离设为α时，在以α/f成为规定范围内的方式设定的α所对应的位置配置上述微阵列的表面，取得上述对准用图像数据。

此外，本发明所涉及的微阵列的分析方法的特征在于，在上述发明中， 上述微阵列为DNA微阵列。

此外，本发明所涉及的荧光读取装置的特征在于，是从形成有凹凸形状、配置有能够与各自经荧光标记的样品结合的多个探针的基板，接收包含上述荧光标记的荧光的光，取得基于该接收到的光的图像数据的荧光读取装置，所述荧光读取装置具备：光源，其出射至少包含规定波长的激发光的照明光；物镜，其将上述照明光照射于上述基板，并且接收来自照射了该照明光的上述基板的表面的光；图像取得部，其检测上述物镜接收到的光，取得该检测到的荧光的荧光图像数据和来自上述基板的光的基板图像数据；检测部，其根据通过图像取得部取得的上述基板图像数据，检测上述凹凸形状的高度的差异；校正部，其根据通过上述检测部检测到的上述凹凸形状的高度的差异，校正上述荧光图像数据；保持机构，其保持上述基板；以及驱动部，其使上述保持机构沿着上述物镜的光轴移动，上述驱动部，在通过上述图像取得部取得上述基板图像数据时，以在相对于上述物镜的焦点位置靠近上述物镜的位置配置上述基板的方式使上述保持机构移动。

此外，本发明所涉及的荧光读取装置的特征在于，在上述发明中，上述驱动部，在将上述物镜的焦点距离设为f，将上述微阵列从上述焦点位置靠近上述物镜的距离设为α时，以在以α/f成为规定范围内的方式设定的α所对应的位置配置上述基板的方式使上述保持机构移动。

发明的效果

根据本发明，通过取得能够准确地检测基板的高度的差异的图像，从而即使在未配置阳性对照的DNA芯片的分析、样品所包含的DNA量少的芯片的分析的情况下，也可以适当地进行对准处理，能够进行分析。

附图说明

图1为显示本发明的实施方式所涉及的扫描仪的光学系统的一例的示意图。

图2为示意性显示本实施方式所涉及的由扫描仪读取的DNA芯片的 图像的一例的图。

图3为显示本发明的实施方式所涉及的扫描仪的光学系统的主要部分的构成的示意图。

图4-1为显示本发明的实施方式所涉及的扫描仪的光学系统的主要部分的构成的示意图。

图4-2为显示本发明的实施方式所涉及的扫描仪的光学系统的主要部分的构成的示意图。

图5-1为说明本发明的实施方式所涉及的由扫描仪读取的DNA芯片的图像的图。

图5-2为说明本发明的实施方式所涉及的由扫描仪读取的DNA芯片的图像的图。

图5-3为说明本发明的实施方式所涉及的由扫描仪读取的DNA芯片的图像的图。

图6为显示本发明的实施方式所涉及的图像的对准处理的流程图。

图7为说明本发明的实施方式所涉及的对准用图像数据的四个角的坐标的检测方法的示意图。

图8为显示本发明的实施方式所涉及的由扫描仪读取的DNA芯片的图像的示意图。

图9-1为说明本发明的实施方式所涉及的由扫描仪读取的DNA芯片的图像的图。

图9-2为说明本发明的实施方式所涉及的由扫描仪读取的DNA芯片的图像的图。

图9-3为说明本发明的实施方式所涉及的由扫描仪读取的DNA芯片的图像的图。

图10为显示本发明的实施方式所涉及的扫描仪的光学系统的其它例的示意图。

图11-1A为显示本发明的实施例所涉及的DNA芯片的图像的图。

图11-1B为本发明的实施例所涉及的DNA芯片中的光强度变化的图。

图11-2A为显示本发明的实施例所涉及的DNA芯片的图像的图。

图11-2B为本发明的实施例所涉及的DNA芯片中的光强度变化的图。

图11-3A为显示本发明的实施例所涉及的DNA芯片的图像的图。

图11-3B为本发明的实施例所涉及的DNA芯片中的光强度变化的图。

图11-4A为显示本发明的实施例所涉及的DNA芯片的图像的图。

图11-4B为本发明的实施例所涉及的DNA芯片中的光强度变化的图。

图11-5A为显示本发明的实施例所涉及的DNA芯片的图像的图。

图11-5B为本发明的实施例所涉及的DNA芯片中的光强度变化的图。

图11-6A为显示本发明的实施例所涉及的DNA芯片的图像的图。

图11-6B为显示本发明的实施例所涉及的DNA芯片中的光强度变化的图。

图11-7A为显示本发明的实施例所涉及的DNA芯片的图像的图。

图11-7B为显示本发明的实施例所涉及的DNA芯片中的光强度变化的图。

图11-8A为显示本发明的实施例所涉及的DNA芯片的图像的图。

图11-8B为本发明的实施例所涉及的DNA芯片中的光强度变化的图。

图11-9A为显示本发明的实施例所涉及的DNA芯片的图像的图。

图11-9B为本发明的实施例所涉及的DNA芯片中的光强度变化的图。

图11-10A为显示本发明的实施例所涉及的DNA芯片的图像的图。

图11-10B为本发明的实施例所涉及的DNA芯片中的光强度变化的图。

图11-11A为显示本发明的实施例所涉及的DNA芯片的图像的图。

图11-11B为本发明的实施例所涉及的DNA芯片中的光强度变化的图。

图11-12A为显示本发明的实施例所涉及的DNA芯片的图像的图。

图11-12B为本发明的实施例所涉及的DNA芯片中的光强度变化的图。

图12-1为显示本发明的实施例所涉及的载玻片的图像的图。

图12-2为显示图12-1的图像中的箭头P₁₃-P₁₃’间的光强度变化的图。

图12-3为显示图12-1的图像中的箭头P₁₃-P₁₃’间的载玻片上的高度的差异的图。

图13为显示以往的DNA芯片分析的一系列处理工序的详细内容的流程图。

图14为显示以往的DNA芯片分析所使用的DNA芯片的一例的示意图。

图15为显示对于以往的DNA芯片的荧光图像数据适用的模板的一例的示意图。

具体实施方式

以下，详细地说明用于实施本发明的方式。另外，本发明不限定于以下的实施方式。此外，以下的说明中所参照的各图只不过是以可以理解本发明内容的程度概略性地示出形状、大小和位置关系。因此，本发明不仅仅限定于各图所例示的形状、大小和位置关系。

一般而言，微阵列的荧光读取装置(扫描仪)是对激发波长的光束和/或微阵列进行一维或二维扫描，检测来自基板上的检体的荧光，将其数据图像化，根据其图像，求出来自各探针(对样品标记了的荧光标记)的荧光量。图1示出本发明所使用的扫描仪的优选光学系统。图1为显示本发明的实施方式所涉及的扫描仪的光学系统的一例的示意图。

例如图1所示的扫描仪1由激光光源、物侧光学系统、光滤波器、取得荧光图像数据和对准用图像数据(基板图像数据)的图像取得部等构成，扫描仪1具有：用于在两个方向上扫描上述DNA芯片100(微阵列)的扫描机构(未图示，此外在本说明书中在DNA芯片100的主面，将基板的长度方向设为y轴，将与y轴正交的方向设为x轴)，和载置多个DNA芯片100的自动装载机构(未图示)。

具体而言，扫描仪1具备：激光光源11、12，其分别将至少包含特定波长的激发光的照明光出射至基板表面；物镜13，其使来自接收到该激发 光的探针的荧光为平行光；开孔镜体14，其设置于激光光源11、12和物镜13之间，形成有使从激光光源11、12分别出射且在光路N1上行进的照明光通过到物镜13侧的孔140，并且将由DNA芯片100发出的光的至少一部分向光路N2侧弯折；截止滤光片15，其具有将与由激光光源11发出的激发光对应的波长的光截止同时仅使与来自与DNA探针杂交了的样品的荧光对应的波长的光透射的激发光截止滤光片15a、和将与由激光光源12发出的激发光对应的波长的光截止同时仅使与来自与DNA探针杂交了的样品的荧光对应的波长的光透射的激发光截止滤光片15b；成像透镜16，其将来自与DNA探针杂交了的样品的荧光进行成像；以及图像取得部17，其通过接收来自与DNA探针杂交了的样品的荧光而取得荧光图像数据，并且接收来自基板表面的反射光，根据其接收强度，作为能够检测DNA芯片100的块101表面的凹凸形状的对准用图像数据而取得。另外，激发光截止滤光片15a、15b(截止滤光片15)对连接开孔镜体14与图像取得部17的光路N2插脱自如地设置。

开孔镜体14中，用于使激发光入射至DNA芯片100(物镜13)的孔140通常设置在中央。此外，开孔镜体14的孔140，如图1所示，具有下述功能：在光读取时，为了使成为噪声的来自基板的正反射光不导入至图像取得部17侧，将荧光或激发光的反射光(检测光)、与来自基板的正反射光进行几何学分离。

另外，在图1所示的方式中，为了减小装置，通过镜体18、19使来自激光光源11、12的激发光折射而到达DNA芯片100。

此外，为了获得没有失真的图像，优选扫描机构的基准轴正交。作为扫描机构，一般而言优选两轴都使用滑动器。

进一步本实施方式中，具备：控制部20，其进行扫描仪1整体的控制；以及驱动部21，其进行使保持DNA芯片100的保持部104(保持机构)以DNA芯片100(块101)的主面沿着与物镜13的光轴平行的光路N1的方式移动的控制。通过驱动部21的控制，DNA芯片100对物镜13接近或离开。

此外，控制部20具有：检测DNA芯片100的表面的凹凸形状的高度 的差异(以下，称为高度的差异)的检测部20a；根据检测部20a检测到的高度的差异，校正图像取得部17所取得的图像的校正部20b；以及基于校正部20b校正后的图像，参照预先记录的分析定义文件，确定DNA芯片100的点102的位置的确定部20c。

本实施方式中，为了制成对样品附上两种荧光标记并进行它们的读取的装置，具备：出射与该两种荧光标记对应的波长的光的激光光源11、12；以及与出射的激发光的波长分别对应的激发光截止滤光片15a、15b。然而，也可以制成对样品附上仅一种荧光标记并进行其读取的装置，也可以制成附上3种以上荧光标记并进行它们的读取的装置。在任一情况下，只要设置与所使用的荧光标记(荧光色素)对应的激光光源和激发光截止滤光片即可。

接下来，对利用扫描仪1的荧光图像数据的取得方法进行描述。首先，使用图1对荧光图像数据的取得方法进行说明。另外，以下，说明使用了Cy5、Cy3作为荧光色素的方式，但用于标记样品的荧光色素可以是任一方，此外不限定于它们。作为荧光色素，可以使用例如，Fluorescein(荧光素)、FITC、Alexa Fluor 555、Rhodamine(罗丹明)、Cy3.5、Texas Red(德克萨斯红)、TAMRA、Oyster 650、Cy5.5等。

例如，最初为了读取荧光色素Cy5，由Cy5用的激光光源11(例如发出波长635nm的光的激光光源)照射激光(即荧光色素Cy5的激发光)。激光经由开孔镜体14和物镜13照射至DNA芯片100。来自通过被照射了的激光而激发发光了的荧光分子的荧光以及在芯片表面反射和/或散射了的激光，通过物镜13彼此形成大致平行光，在光路N1中沿图中箭头方向行进。

然后，荧光以及激光在开孔镜体14被反射而在光路N2上行进，入射至光路N2上所配置的Cy5用的激发光截止滤光片15a。另外，在DNA芯片100的表面正反射了的激光通过开孔镜体14的孔140。来自激发发光了的荧光分子的荧光透射过该激发光截止滤光片15a，通过成像透镜16被聚光。

另一方面，到达激发光截止滤光片15a的激发光(在芯片表面反射和/或散射了的光)被截止。通过成像透镜16被聚光了的荧光入射至图像取得部17。图像取得部17对接收到的光数据实施光电转换处理，输出与光的强弱对应的电信号(模拟信号)。对于这样的工序，使DNA芯片100在两个方向上扫描而重复进行，同时将由图像取得部17输出的电信号进行A/D转换而作成荧光图像数据。

接着，进行荧光色素Cy3的读入。荧光色素Cy3的读入，除了将Cy5用的激光光源11置换成Cy3用的激光光源12(例如发出激光波长532nm的光的激光光源)，并且将Cy5用的激发光截止滤光片15a置换成Cy3用的激发光截止滤光片15b以外，与荧光色素Cy5的读入同样地进行即可。即，通过由Cy3用的激光光源12照射激光(即荧光色素Cy3的激发光)，并且利用Cy3用的激发光截止滤光片15b将到达该激发光截止滤光片15b的激发光(即在芯片表面反射和/或散射了的光)除去，从而与荧光色素Cy5同样地作成荧光图像数据。

图2为示意性显示本实施方式所涉及的由扫描仪1读取的DNA芯片100的图像的一例的图。这里，在扫描仪的扫描机构具备2个滑动器的情况下，这些滑动器不一定限定于正交。装置组装时或随着时间的经过，有时会偏离。因此，由扫描仪1读取的DNA芯片100的图像也有可能例如如图2(a)所示那样相对于x轴倾斜。这样，在所取得的图像中的扫描机构的扫描方向与x轴和/或y轴不一致的情况下，所得的荧光图像数据会失真，无法使模板的检测区域与所获得的图像正确地进行位置匹配。此外，即使滑动器的x轴、y轴机械地正交的情况下，由于荧光图像的x轴、y轴与滑动器的轴不正交，因此在设置DNA芯片100时会旋转，结果有时荧光图像旋转了。在这些情况下，无法将模板的检测区域与所获得的图像正确地正确地进行位置匹配。

因此，优选根据图像检测正交度的偏离，进行校正使得该图像与由滑动器正交的扫描机构获得的图像变为同等。更具体而言，将荧光图像数据相对于x轴投影于y轴方向，算出每坐标X的累计强度(各像素值的累计 值)。使荧光图像数据绕坐标原点每次旋转预先设定的角度而重复进行该处理。例如，投影方向与点的y轴方向的排列方向偏离了的情况下的累计强度图成为图2(b)所示那样振幅小的图。

另一方面，投影方向与点的y轴方向的排列方向一致的情况下的累计强度图如图2(c)所示那样，振幅以一定间隔发生变化，信号的振幅变为最大。利用投影数据的这样的特征，求出累计强度的标准偏差取最大值的角度，从而可以检测点102相对于y轴的排列角度。同样地求出相对于x轴的排列角度，实施剪切变形等图像处理，从而能够使点的排列方向正交。

在以上那样地操作而取得荧光图像数据的情况下，如果检体非常少，则荧光色素Cy5、Cy3都由于发出荧光的DNA探针(与DNA样品杂交了的DNA探针)数变少，因此不知道块的边界，此外也不能进行图像的正交度校正，因此不能进行对准处理。

因此，在本发明中，除了上述那样的荧光图像数据以外，不再次设置DNA芯片100，也可取得对准用图像数据。优选在取得对准用图像数据时，与通过物镜13激光被聚光了的焦点位置相比，将DNA芯片100向物镜13侧靠近地设置，取得对准用图像数据。图3为显示本实施方式所涉及的扫描仪1的光学系统的主要部分的构成的示意图。图4-1、4-2为显示本实施方式所涉及的扫描仪1的光学系统的主要部分的构成的示意图，图4-1为显示在DNA芯片100的凹部103中具有倾斜的情况的图，图4-2为显示在DNA芯片100的凹部103中不具有倾斜的情况的图。

图3为显示入射光通过开孔镜体14入射至DNA芯片100的块101的表面(光照射面)的情况。入射光是以激光为代表的平行光。在假定在入射光通过物镜13被聚光了的焦点位置(正焦点(just focus)位置，表面位置P0)具有块101的表面的情况下，其正反射光通过物镜13被聚光，理想上与入射光成为相同直径，大部分的正反射光通过开孔镜体14的孔140，几乎未导入至图像取得部17侧(图3实线箭头Y1)。但是，由于物镜13的象差(球面象差、彗形像差、象散等)，一部分反射光在开孔镜体14反射，导入至图像取得部17，但其强度小。

另一方面，在与焦点位置相比远的位置(表面位置P1)具有DNA芯片100的块101的表面的情况下，如果从物镜13观察，则来自其表面的正反射光被看作是从与焦点位置(表面位置P0)相比远的部分发出的点光源。因此，该反射光在物镜的入射光侧聚焦(图3中单点划线箭头Y2)。因此，在开孔镜体14的位置，光的直径与来自表面位置P0处的表面的光的直径相比变小。因此，大部分正反射光通过开孔镜体14的孔140，因此未导入至图像取得部17侧而进一步变暗。

基于这样的理由，如果将DNA芯片100的反射光图像化，则例如可以获得块101的上面(靠近物镜的部分)明亮，凹部103的底部(距离物镜远的部分)暗的图像。

然而，在DNA芯片100的表面具有微细的损伤、附着物的情况下，在这里发生漫反射。将该漫反射的光路以图3的虚线箭头Y3表示。该漫反射了的光在开孔镜体14反射，进入到图像取得部17侧。因此，在DNA芯片100的表面具有微细的损伤、附着物的情况下，发生由漫反射引起的图像混乱，产生不能将基板的凹凸图像化的情况。特别是在基板为树脂制的情况下，通过利用模具的成型来制作的情况多，但由加工工具产生的模具的切削痕迹直接转印至基板，发生由漫反射引起的图像混乱的情况多。

为了消除以上的不良状况，将DNA芯片100的摄像对象表面在与焦点位置(表面位置P0)相比靠近物镜13的位置(表面位置P2)取得对准用图像数据。这样一来，如图3的虚线箭头Y4所示那样，从物镜13观察，正反射光被看作是从与焦点距离相比近的部分发出的点光源，因此通过物镜13也会发散，在开孔镜体14反射至图像取得部17侧。因此，漫反射光(例如，虚线箭头Y3)的影响变少，仅基板的高低差(边缘)部分变暗。

摄像对象表面的表面位置P2优选使用物镜13的焦点距离f与将DNA芯片100从焦点位置(表面P0)靠近物镜13的距离α的关系α/f来设定。该α/f的优选的范围为0.017～0.17，进一步优选为0.033～0.17。驱动部21在控制部20的控制下以在所设定的α的位置配置DNA芯片100的摄像对象面的方式，进行移动保持部104的控制。

这里，如图4-1所示那样，在DNA芯片100的凹部103的侧面以角度θ倾斜了的情况下，其反射光朝向其它方向。此外，在凹部103的侧面垂直(角度θ＝90度)地峭立的情况下(图4-2)，返回到透镜的反射光成为2次反射。如果为2次反射，则光变得非常地弱(通常，透明体的反射率为4％左右，因此2次反射的光量相对于1次反射成为1/25的强度)。因此基板的高低差部分变暗。

凹部103的角度θ的优选的范围为20度～90度。如果大于90度，则基板的制作困难，如果小于20度，则有时不能通过图像数据识别高低差部分。图14那样的DNA芯片100，从生产性的观点出发，优选通过将树脂进行注射成型来制作。在该情况下，从成型的容易性(从模具拔出的容易性)这样的观点出发，角度θ进一步优选为20度～80度。

将这样获得的对准用图像的例子示于图5-1～5-3中。图5-1～5-3为说明本实施方式所涉及的由扫描仪读取的微阵列的图像的图。图5-1为显示对准用图像的图。图5-2为显示图5-1的对准用图像中的箭头P-P’间的光强度变化的图。图5-3为显示图5-1的对准用图像中的箭头P-P’间的DNA芯片100的高度的差异的图。由图5-2可以确认，在与DNA芯片100的凹部103的侧面对应的位置，反射光量减少，可以将基板上的凹凸形状图像化。能够以此为基础判断对准用图像中的DNA芯片100的凹部103的位置，将荧光图像进行对准。

关于对准用图像数据取得用的光源，优选可以使用激光光源(例如波长405nm、532nm、635nm)。在激光光源的情况下，由于为平行光，因此由于图3所说明的现象，能够在对准用图像数据中明确地检测到边缘(光强度差)。

这里，具体而言，在上述的装置构成中，为了取得对准用图像数据，优选由Cy5用的激光光源11照射激光，并且使用Cy3用的激发光截止滤光片15b。往往Cy3用的激发光截止滤光片15b一般使用透射550～600nm的带通滤光片，但该激发光截止滤光片15b一般略微透射Cy5的激发光的波长的光(635nm)(例如，635nm的光的OD值为约5)，因此如图5-1所示 那样，能够将DNA芯片100的凹凸形状进行图像化。即，不是接收来自通过特定波长的光激发发光了的荧光分子的荧光，而是接收来自基板表面的反射光、散射光，可以将该基板自身的凹凸形状进行图像化。

在取得对准用图像数据时，优选与焦点位置相比将DNA芯片100配置在靠近物镜13的场所。焦点位置可以如下来求出：固定物镜13的高度，使DNA芯片100沿高度方向(物镜13的光轴方向)变化来测定来自各DNA探针的荧光量，实测其值变为最大的高度，从而求出。相反也能够固定DNA芯片100的高度，使物镜13的高度上下。优选在接收DNA芯片100的表面的反射光、散射光时，基于上述α/f的关系，使DNA芯片100的表面(摄像对象面)的位置从焦点位置向透镜侧靠近100μm以上。更优选为200μm以上。关于靠近的距离的上限，只要为DNA芯片100与物镜13不碰撞的程度，则没有特别限制，在扫描仪1那样的装置中通常为3000μm以下。关于对准用图像数据取得用的光源，从可以使扫描仪的部件件数少考虑，优选使用出射用于激发荧光分子的激发光的光源，另一方面，也可以设置对准用图像数据取得用光源。

此外，在对准用图像数据的取得时，还可以采用不使用滤光片的方法。然而，在不使用滤光片的情况下，进入到图像取得部的光量变得过大，因此有损伤图像取得部的光检测机构的可能性。因此，如上述那样，在由Cy5用的激光光源11照射激光的情况下，优选使用激发光截止滤光片15b等，使用略微透射所照射的光源的波长的滤光片。相反地，可以由Cy3用的激光光源12照射激光，使用激发光截止滤光片15a。此外，也可以代替激发光截止滤光片15a、15b而使用ND滤光片，或不使用激发光截止滤光片15a、15b、ND滤光片而使激光的输出本身变弱来获得对准用图像数据。当然，也可以适用它们的组合。

另外，在图5-1～5-3中，将基板(DNA芯片100)从焦点位置向透镜侧靠近250μm来取得。这样，通过积极地从焦点位置将基板靠近透镜侧，积极地接收激光的反射光，从而获得如图5-1那样的、表现出基板表面的边缘形状的对准用图像数据。

如果使用这样取得的对准用图像数据，则能够准确地检测基板的边缘(凹部103的外缘)。以下，记载使用了DNA芯片100的情况下的、包含上述方法的对准的具体步骤例。图6为显示本实施方式所涉及的图像的对准处理的流程图。

首先，在扫描仪1上设置DNA芯片100，如上述那样，通过图像取得部17来读入荧光色素Cy5和Cy3的荧光图像数据(步骤S101)。接着，在设置DNA芯片100的状态下，由Cy5用的激光光源11照射激光，并且使用Cy3用的激发光截止滤光片15b，通过图像取得部17读入对准用图像数据(步骤S102)。此时，DNA芯片100，如上述那样，配置于与焦点位置相比靠近物镜13的位置。另外，在步骤S102中，可以由Cy3用的激光光源12照射激光，并且使用Cy5用的激发光截止滤光片15a。

然后，在步骤S103以后，使用对准用图像数据来确定荧光图像数据中的各DNA探针的位置，进行分析。

具体而言，首先，检测对准用图像数据中的至少3个基准点(步骤S103)。这里，作为至少3个基准点，可举出例如如图7所示，对准用图像中的四个角的坐标。这样的四个角的坐标的检测方法，可举出通过由检测部20a进行并使用了明暗信息的边缘检测判断上述凹部103的位置。

如图7所示那样，在DNA芯片100中，预先设定通过检测部20a可检测到凹部103的外缘的区域Ea1～Ea4、Eb1～Eb4，在各个区域中，测定图5-1所示那样的箭头P-P’间的光强度的变化，检测DNA芯片100的高度的差异。然后，检测部20a，使用在各区域Ea1～Ea4、Eb1～Eb4被检测到的高度的差异的中心位置，将区域Ea1的中心位置与区域Ea2的中心位置直线地连接而成为凹部103的外缘的一边。对于凹部103的外缘的其它三边，也将区域Ea3的中心位置和区域Ea4的中心位置、区域Eb1的中心位置和区域Eb2的中心位置、区域Eb3的中心位置和区域Eb4的中心位置分别直线地连接。由此，形成通过图像取得部17获得的对准图像中的凹部103的外缘。此外，通过求出分别连接而形成的直线彼此的交点(坐标)，可以获得凹部103的4角作为基准点110a～110d。

接着，在步骤S104、S105中，基于基准点来校正荧光图像数据的失真。

具体而言，校正部20b从例如上述的基准点110a～110d的坐标，检测凹部103的外缘中的各边的相对于x轴的倾斜角度θx、和相对于y轴的倾斜角度θy(步骤S104)。期望倾斜角度θx、θy为，对于连接四个角的坐标的4根线段，取该方向的(对置的)2根线段的角度的平均值。另外，即使基准点为3点，也能够算出倾斜角度θx、θy。而且，校正部20b，如图8(a)、(b)所示那样，使用与y轴对应的边(凹部103的外缘的边)的相对于y轴的倾斜角度θy作为校正角度，使荧光图像数据旋转，使凹部103的与y轴对应的边相对于y轴平行。此外，校正部20b，如图8(b)、(c)所示那样，使用与x轴对应的边(凹部103的外缘的边)的相对于x轴的倾斜角度θx作为校正角度，使荧光图像数据旋转，使凹部103的与x轴对应的边相对于x轴平行。转换后，如图8(c)所示那样，可以获得外缘相对于x轴、y轴分别平行的图像。

进一步，校正部20b，对于旋转后的图像，关于上述那样检测了的在两个方向上规则地排列了的点102，基于上述倾斜角度θx、θy和下述式(1)、式(2)，实施转换(剪切变形)(步骤S105)。由此，校正图像的剪切变形失真。这里，下述式(1)的(x，y)为转换前的坐标，(X，Y)为转换后的坐标。此外，与扫描仪的扫描机构的偏离(扫描机构的基准轴的正交度)相当的θxy，如下述式(1)、式(2)所示那样，从倾斜角度θx减去倾斜角度θy来求出。

[数2]

θxy＝θx-θy ···(2)

进一步，在DNA芯片100为树脂成型品的情况下，有时由于杂交工序、洗涤工序中的吸湿、温度变化而树脂膨胀。虽然与各工序中的处理时 间有关，但有时膨胀数十μm，对于对准的精度带来影响。

因此，校正部20b，例如从上述四个角的坐标算出x轴方向和y轴方向的芯片长度，并且以与设计值一致的方式，对荧光图像数据进行收缩膨胀校正(步骤S106、S107)。

接着，如上述那样进行操作，对于通过校正部20b实施了角度校正、剪切变形校正、收缩膨胀校正的荧光图像数据，确定部20c参照分析定义文件来进行荧光图像的对准。预先保存在分析定义文件中的模板中的各点的位置信息成为以例如芯片左上角(基准点110a)作为原点的、各点的中心坐标。因此，确定部20c，对于步骤S107中收缩校正后的图像，将例如左上角的坐标作为原点，计算各点界限，从而确定各点(探针)的位置，进行图9-1～9-3所示那样的对准(步骤S108)。另外，图9-1为显示对Cy3的荧光图像数据进行对准得到的结果的图像，图9-2为显示对Cy5的荧光图像数据进行对准得到的结果的图像。由此，对于各点102，可以拟合与各点102对应的模板(参照图15)，与检测区域关联。此外，作为一例，为了进行确认，将对对准用图像数据进行对准得到的结果示于图9-3中。如图9-3所示那样，可知通过对准处理，DNA芯片100的凹部103的外缘的一角中的直线部分在基准点1101正交。

然后，由步骤S108中求出的各点的中心坐标，对于点半径内的像素的信号强度，算出平均值、中值、标准偏差等的统计量，与点所属的块编号、点的行列编号、所配置的DNA探针名称一并，将各种数值数据以文件的方式输出(步骤S109)。通过上述处理，对所得的荧光图像数据进行失真等的修正，算出平均值、中值、标准偏差等的准确的统计量。

另外，上述步骤S101、S102的顺序、和步骤S106、S107的顺序可以改换。

在本发明中，通过这样地操作而将基于DNA样品对DNA探针的杂交而得的荧光图像数据进行处理来取得所期望的数值数据，所得的各种数值数据是用于分析检体内要求的基因的存在、是否表达某基因、或以何种程度表达等。

此外，在以上那样的DNA芯片100的分析中，利用形成于DNA芯片100的凹凸来进行图像的校正、对准。因此，对于由检体提取的样品中所包含的DNA量少、发光的DNA探针少的图像、以及通过扫描机构的精度差的读取装置获得的图像，也能够高精度地执行DNA芯片100上所配置的检测区域的定位处理。

根据上述实施方式，使DNA芯片100的摄像对象表面在与焦点位置(表面位置P0)相比靠近物镜13的位置(表面位置P2)来取得对准用图像数据，因此可以取得能够准确地检测基板的高度的差异的图像。由此，即使在未配置阳性对照的DNA芯片的分析、样品所包含的DNA量少的芯片的分析的情况下，也可以适当地进行对准处理，能够进行分析。

这里，图10显示适合于本发明所使用的扫描仪的光学系统的其它方式。另外，图10中，与图1所示的扫描仪1的构成要素相同的构成要素附上相同的符号。图10所示的扫描仪2，通过代替扫描仪1的开孔镜体14而使用微小镜体14a，从而具有下述功能：利用微小镜体14a使激发光反射而入射至DNA芯片100，并且在光读取时，为了不使成为噪声的来自DNA芯片100的正反射光导入至图像取得部17侧，将荧光或激发光的反射光(检测光)与正反射光进行几何学分离。由此，可以将正反射光从光路N3分离。对于该构成，也可以获得与上述扫描仪1同样的效果。

在上述实施方式中，说明了在基板上点样了DNA探针的DNA芯片的实施方式，但本发明对于点样了RNA、蛋白质、微小标本、低分子化合物、细胞等的芯片也能够适用。

例如，在上述所说明的具有凹凸形状的DNA芯片100中，代替DNA探针而将蛋白质(抗体)固定化，利用荧光来检测与检体的反应的有无、定量化的情况下，也可以使用同样的方法。有下述方法等：在将试样细胞的溶解液中存在的蛋白质以Cy5进行标记，将对照细胞溶解液中存在的蛋白质以Cy3进行标记，将两者混合来与抗体阵列反应的情况下，和/或代替将蛋白质进行荧光标记而进行生物素标记，与抗体阵列结合后，使用酶标记抗生物素蛋白将信号敏化的方法等。即使在这样的情况下，通过本发明， 也能够高精度地对准，能够将荧光强度的各种数值数据以文件的方式输出。即使在RNA阵列的情况下，也可以在利用荧光来检测具有凹凸形状的基板(点102)上固定化了的RNA与荧光标记了的DNA、RNA的杂交的情况下，使用本方法。对于微小标本、细胞阵列，在通过荧光来检测具有凹凸形状的基板上固定化了的微小标本、细胞与荧光标记检体(例如抗体)的结合反应时，能够适应本发明。

实施例

以下举出实施例等来说明本发明，但本发明不受这些例子限定。

通过超精密机械加工，制作与图14所示的DNA芯片100那样的形状的基板对应的模具，通过使用该模具来进行注射成型，从而制作包含PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)的基板作为DNA芯片100。对于模具，具有由工具带来的切削痕迹，因此，基板也为转印了工具切削痕迹的状态。关于由切削痕迹带来的基板高度的混乱，进行了实测，结果为1μm以下。

在制作的DNA芯片100的凸部(点102)上面固定DNA探针，进行直至杂交，利用DNA芯片扫描仪(3D-Gene Scanner(3D-Gene(注册商标)))进行荧光图像和对准用图像的取得。荧光图像和对准用图像的取得所涉及的装置构成和条件如下(1)～(4)所示。

(1)扫描仪的光学系统使用了图1所示的扫描仪1的光学系统。即，具有用于向DNA芯片100入射激光，并且，通过来自基板的正反射光的开孔镜体14。

(2)在来自点102的荧光取得时，使DNA芯片100的高度(物镜13与DNA芯片100的距离)变化，将荧光强度变为最强的高度位置设为0。该位置为激光的焦点位置(表面位置P0)。本实施例中，使用以Cy5标记化了的DNA样品，因此使用波长635nm的激光和Cy5用的带通滤光片。另外，本扫描仪具有可以调整基板与透镜的距离的功能。

(3)使用测定Cy5的荧光的激光(波长635nm)，作为滤光片使用与测定Cy3时所使用的带通滤光片相同的滤光片。本实施例中使用的Cy3用的滤光片在635nm下OD值为约5，略微透射635nm的波长。通过将激光与滤 光片的组合设为上述组合，从而能够取得来自基板表面的反射、散射光，进行图像数据化。

(4)偏移位置(从焦点位置至基板表面的距离)在-500μm～+1500μm变化，进行反射、散射光的图像的比较(图3)。另外，偏移位置为0的表达表示基板处于通过物镜被集中了的激光的焦点位置(表面位置P0)。此外，在偏移位置的符号为负的情况下，表示将焦点位置作为基准，基板处于距离物镜远的位置(表面位置P1)，在符号为正的情况下，表示将焦点位置作为基准，基板处于靠近物镜的位置(表面位置P2)。

图11(图11-1～图11-12)为本发明的实施例所涉及的由扫描仪1读取的DNA芯片100(基板)的图像(A)和光强度变化的图(B)。这里，图11-1为表示偏移位置为0的情况下的图像、和图像中的箭头P₁-P₁’间的光强度变化的图。图11-2～图11-9为表示偏移位置为+100、+200、+300、+400、+500、+750、+1000、+1500的情况下的图像、和图像中的箭头P₂-P₂’间、箭头P₃-P₃’间、箭头P₄-P₄’间、箭头P₅-P₅’间、箭头P₆-P₆’间、箭头P₇-P₇’间、箭头P₈-P₈’间、箭头P₉-P₉’间的光强度变化的图。图11-10～图11-12为表示偏移位置为-100、-200、-500的情况下的图像、和图像中的箭头P₁₀-P₁₀’间、箭头P₁₁-P₁₁’间、箭头P₁₂-P₁₂’间的光强度变化的图。另外，图11所示的图像为与通过上述校正部20b进行了校正的对准用图像数据对应的图像。

如图11所示那样，在偏移位置为+200μm以上的情况下，获得了与基板的边缘部分(实际的高度差90μm，图4-1所示的倾斜角度θ为70度)对应的具有明确对比度的图像和光强度变化的图(图11-3A、11-3B～图11-9A、11-9B)。另一方面，在偏移位置为0μm时，由于切削痕迹导致的基板表面的粗糙(高度1μm以下)，因而发生漫反射，与90μm的凹凸形状不一致，但发生了与切削痕迹一致的反射强度的混乱(图11-1B)。在偏移位置为+100μm的情况下，与0μm相比，虽然切削痕迹的影响变小，但其影响残存(图11-2B)。此外，在偏移位置为-100μm、-200μm时，由于切削痕迹导致的基板表面的粗糙(高度1μm以下)，因而发生漫反射，发生了反射 强度的混乱(图11-10B、图11-11B)。在偏移位置为-500μm时，不能取得基板表面的图像(图11-12A)。

通过以上的结果，在偏移位置为+200μm以上+1000μm以下之间，获得了基板的边缘部分暗的特别优选的图像。另外，在偏移位置为+1500μm时，虽然可以识别边缘部分，但可见整体上变暗的倾向。在偏移位置为负的情况下，只能得到完全不能识别边缘的图像。

此外，基于这些结果，使取得对准用图像时的偏移位置变为-500μm、0μm、+100μm、+200μm、+500um、+1000μm、+1250μm、+1500μm，通过以下步骤(1)’～(5)’进行图像的对准处理是否能适当进行的评价。

(1)’准备合计20片杂交处理完的DNA芯片。另外，DNA芯片的基板的形状如图14所示。边缘部分的高度差为90μm，图4-1所示的角度θ为70度。

(2)’关于各个DNA芯片，在偏移位置为0μm(焦点位置)，取得了Cy5的荧光图像。

(3)’将偏移位置设为-100μm、0μm、+100μm、+200μm、+500μm、+750μm、+1000μm、+1250μm、+1500μm，在各位置分别取得了对准用图像。此时，使用测定Cy5的荧光的激光(波长635nm)，作为滤光片，使用了与测定Cy3时所使用的带通滤光片相同的滤光片。

(4)’基于各个对准用图像数据，通过使用了明暗信息的边缘检测法来检测与图7的基准点110a～110d相当的基准点。

(5)’进行直至图6的步骤S104～S108的工序，在偏移位置为-100μm、0μm、+100μm、+200μm、+500μm、+1000μm、+1250μm、+1500μm的位置，对于各20片DNA芯片，确认了荧光图像是否正确地对准了。将其结果示于表1中。

[表1]

偏移位置(μm)	对准成功的芯片数	对准的成功比例
			-100	0	0％
0	6	30％
			+100	19	95％
+200	20	100％
			+500	20	100％
+1000	20	100％
			+1250	16	80％
+1500	14	70％

如以上那样，在取得对准用图像时，通过使DNA芯片相对于焦点位置靠近物镜，从而对准的可靠性明显地增加了。可知在上述实施例中，取得对准用图像时，通过与焦点位置相比将基板向物镜侧靠近+200μm来设置，从而可靠性大幅增加。

另外，本实施例所涉及的扫描仪1所搭载的物镜的f值为6.0mm。因此，根据上述结果，在偏移位置(α)为+100～+1000的范围时，α/f的优选范围为0.017(100/6000)～0.17(1000/6000)的范围。在该范围时，成功概率为95％以上。进一步优选地，偏移位置为+200～+1000的范围，α/f的范围为0.033(200/6000)～0.17(1000/6000)。如果为该范围，则对准的成功概率为100％。

(参考例)

在平坦的载玻片上粘贴厚度150μm的带，将其设置于上述扫描仪1。在偏移量+250μm的状态下，使用测定Cy5的荧光的激光(波长635nm)，作为滤光片，使用与测定Cy3时所使用的带通滤光片相同的滤光片，获得了与对准用图像相当的图像数据。该条件下，图4-1所示的角度θ相当于90度。将其结果示于图12-1～12-3中。

图12-1～12-3为本参考例所涉及的载玻片的图像和荧光强度的图。图 12-1为通过扫描仪1获得的图像。图12-2为显示图12-1的图像中的箭头P₁₃-P₁₃’间的光强度变化的图。图12-3为显示图12-1的图像中的箭头P₁₃-P₁₃’间的载玻片上的高度的差异的图。由此可知，即使为粘贴于载玻片的带，也可以由光的强度变化来把握高度的差异。另外认为，与边缘相当的部分变暗，即使角度θ为90度也没有问题。

产业可利用性

本发明所涉及的检测方法、微阵列的分析方法和荧光读取装置取得能够准确地检测基板的高度的差异的图像，适合于适当地进行对准处理。

符号的说明

1、2 扫描仪

11、12 激光光源

13 物镜

14 开孔镜体

14a 微小镜体

15 截止滤光片

15a、15b 激发光截止滤光片

16 成像透镜

17 图像取得部

18、19 镜体

20 控制部

20a 检测部

20b 校正部

20c 确定部

21 驱动部

100 DNA芯片

101 块

102 点

103 凹部

104 保持部

140 孔。

Claims (7)

1.一种检测方法，其特征在于，是将通过透镜而被聚光后的激光照射于具有凹凸形状的基板，取得来自该基板的反射光和/或散射光的光强度作为图像数据，检测所述凹凸形状的高度的差异的检测方法，

在与所述透镜的焦点位置相比靠近所述透镜的位置配置所述基板的光照射面，接收来自该光照射面的反射光和/或散射光作为检测光，基于该接收到的光的强度的变化，检测所述基板的高度的差异，

在将所述透镜的焦点距离设为f，将所述基板从所述焦点位置靠近所述透镜的距离设为α时，在与α所对应的位置配置所述基板的光照射面，所述α是以α/f成为0.017～0.17的范围内的方式设定的，

所述高度的差异的含义是指基板的凹凸的边缘的位置。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，使用在将所述基板的光照射面配置于所述焦点位置的情况下，将来自该光照射面的正反射光从所述检测光中分离的光学系统。

3.一种微阵列的分析方法，其特征在于，是对形成有凹凸形状、配置有能够与各自经荧光标记的样品结合的多个探针的微阵列，经由物镜照射包含所述荧光标记的激发波长的光，并且接收来自所述微阵列的光，根据基于该接收到的光的图像进行所述微阵列的分析的微阵列的分析方法，其包括下述步骤：

荧光图像数据取得步骤，检测来自所述荧光标记的荧光，取得荧光图像数据，

对准用图像数据取得步骤，检测来自所述微阵列的表面的光，取得进行所述荧光图像数据的对准的对准用图像数据，

检测步骤，根据所述对准用图像数据的光强度的变化，检测所述凹凸形状的高度的差异，

校正步骤，基于通过所述检测步骤检测到的所述凹凸形状的高度的差异，校正所述荧光图像数据，以及

位置确定步骤，确定通过所述校正步骤校正后的所述荧光图像数据中的各探针的位置，

所述对准用图像数据取得步骤，在将所述微阵列的表面配置于相对于所述物镜的焦点位置靠近该物镜的位置的状态下，取得所述对准用图像数据，在将所述物镜的焦点距离设为f，将所述微阵列从所述焦点位置靠近所述物镜的距离设为α时，在与α所对应的位置配置所述微阵列的表面，取得所述对准用图像数据，所述α是以α/f成为0.017～0.17的范围内的方式设定的，

所述高度的差异的含义是指基板的凹凸的边缘的位置。

4.根据权利要求3所述的微阵列的分析方法，其特征在于，所述检测步骤，在所述对准用图像数据中，基于所述光强度的变化，检测3个以上基准点，

所述校正步骤，根据检测到的基准点，校正所述荧光图像数据的失真。

5.根据权利要求4所述的微阵列的分析方法，其特征在于，所述校正步骤，取得基于所述基准点的所述对准用图像数据的倾斜角度θx、θy，根据该倾斜角度θx、θy和下述式(1)、式(2)，校正所述荧光图像数据的剪切变形失真，

<mrow> <mfenced open = "(" close = ")"> <mtable> <mtr> <mtd> <mi>X</mi> </mtd> </mtr> <mtr> <mtd> <mi>Y</mi> </mtd> </mtr> </mtable> </mfenced> <mo>=</mo> <mfenced open = "(" close = ")"> <mtable> <mtr> <mtd> <mn>1</mn> </mtd> <mtd> <mn>0</mn> </mtd> </mtr> <mtr> <mtd> <mrow> <mo>-</mo> <mi>t</mi> <mi>a</mi> <mi>n</mi> <mi>&amp;theta;</mi> <mi>x</mi> <mi>y</mi> </mrow> </mtd> <mtd> <mn>1</mn> </mtd> </mtr> </mtable> </mfenced> <mfenced open = "(" close = ")"> <mtable> <mtr> <mtd> <mi>x</mi> </mtd> </mtr> <mtr> <mtd> <mi>y</mi> </mtd> </mtr> </mtable> </mfenced> <mo>...</mo> <mrow> <mo>(</mo> <mn>1</mn> <mo>)</mo> </mrow> </mrow>

θXy＝θX-θy ···(2)。

6.根据权利要求3～5的任一项所述的微阵列的分析方法，其特征在于，所述微阵列为DNA微阵列。

7.一种荧光读取装置，其特征在于，是从形成有凹凸形状、配置有能够与各自经荧光标记的样品结合的多个探针的基板，接收包含所述荧光标记的荧光的光，取得基于该接收到的光的图像数据的荧光读取装置，

所述荧光读取装置具备：

光源，其出射至少包含规定波长的激发光的照明光，

物镜，其将所述照明光照射于所述基板，并且接收来自照射了该照明光的所述基板的表面的光，

图像取得部，其检测所述物镜接收到的光，取得该检测到的荧光的荧光图像数据和来自所述基板的光的基板图像数据，

检测部，其根据通过图像取得部取得的所述基板图像数据，检测所述凹凸形状的高度的差异，

校正部，其根据通过所述检测部检测到的所述凹凸形状的高度的差异，校正所述荧光图像数据，

保持机构，其保持所述基板，以及

驱动部，其使所述保持机构沿着所述物镜的光轴移动，

所述驱动部，在通过所述图像取得部取得所述基板图像数据时，以在相对于所述物镜的焦点位置靠近所述物镜的位置配置所述基板的方式使所述保持机构移动，在将所述物镜的焦点距离设为f，将所述基板从所述焦点位置靠近所述物镜的距离设为α时，以在与α所对应的位置配置所述基板的方式使所述保持机构移动，所述α是以α/f成为0.017～0.17的范围内的方式设定的，

所述高度的差异的含义是指基板的凹凸的边缘的位置。