JP2013224894A - マイクロアレイの解析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ポジティブコントロールを配置していないＤＮＡチップの解析においても、もしくは、サンプルに含まれるＤＮＡ量が少ないチップの解析においても、アライメント処理を適切に行うことが可能な解析方法および装置を提供する。
【解決手段】
凹凸形状を有する基板表面にプローブが配置されたマイクロアレイに励起光を照射し、励起光で励起された各プローブからの蛍光量を数値データとして得るマイクロアレイの解析方法であって、プローブの蛍光量を測定して蛍光画像データを取得するステップ（ａ）と、基板表面からの自家蛍光を受光して、該光の受光強度からマイクロアレイの基板表面の凹凸形状をアライメント用画像データとして取得するステップ（ｂ）と、前記アライメント用画像データに基づいて前記蛍光画像データにおける各プローブの位置を決定するステップ（ｃ）と、を含む、マイクロアレイの解析方法とする。
【選択図】図８

Description

本発明は、マイクロアレイの解析方法に関する。

１９９０年以降、生物学、医学、薬学方面でマイクロアレイと呼ばれる技術の開発が進み利用されるようになってきた。マイクロアレイは、ガラスやプラスチックなどの基板上に、数十から数万のプローブを固定したもので、蛍光分子などで標識されたサンプル（ターゲット）をこの基板にアプライし、プローブとサンプルとの結合反応を蛍光などで検出するものである。マイクロアレイの特徴としては一度に網羅的な測定が可能であり、今後テーラーメード医療に必須のものになると期待されている。

基板に固定するプローブの種類には、後述するようなものがあり、その種類により名称がつけられている。すなわち、プローブとしてＤＮＡを基板に固定したＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）、タンパク質を基板に固定したタンパク質マイクロアレイ、多数の微小標本を基板に固定化した組織マイクロアレイ、多数の低分子化合物を基板に固定化した化合物マイクロアレイなどが知られている。

このうち、ＤＮＡマイクロアレイ（以下ＤＮＡチップ）は、最も実用化が進んでおり、疾患に関連する遺伝子の探索や、その遺伝子を用いて検査、診断を行おうとする研究が活発に行われており、一部は実用化されている。

以下にマイクロアレイの一形態であるＤＮＡチップについて、詳細に説明する。

ＤＮＡチップとは、ガラスや樹脂等からなる基板の上にＤＮＡをグリッド状にスポット（固定化）したものをいう。ＤＮＡチップ上には、標識されるＤＮＡサンプルと特異的に反応可能なプローブとして、ＤＮＡ（プローブＤＮＡ）がスポットされている。一方、解析すべき未知のＤＮＡサンプルには光学的に検出可能な発光又は蛍光マークを付けておく。こうすると、解析すべき未知のＤＮＡサンプルを前記ＤＮＡチップ上に流し込むことで、該ＤＮＡサンプルが、スポットされたＤＮＡと相補的な関係にあれば、結びついて二重鎖になる。したがって、プローブＤＮＡと結びつかなかったＤＮＡサンプルをすべて洗い流し、ＤＮＡチップ上に残存する判定したいＤＮＡサンプルを発光させ、これを読取り装置（スキャナー）により読みとると、二重鎖となったＤＮＡの状況を画像として観察することができる。すなわち、ＤＮＡチップ上で発光するマークの分布を解析することで、求める遺伝子の存在や、ある遺伝子が発現しているか否か、またはどの程度発現しているかを解析することができる。このように、ＤＮＡチップ上に既知のプローブＤＮＡセットを構成し、このプローブＤＮＡを多種類ＤＮＡチップ上に搭載することで、遺伝子の変異や遺伝子の発現量などを検出することができる。

以下、図１に、ＤＮＡチップ解析の一連の処理工程の詳細を示す。

図１に示す前処理工程においては、検体から抽出したＤＮＡサンプル中に含まれる未知のＤＮＡを増幅し、これらのＤＮＡに蛍光マークを付与する。

次にハイブリダイゼーション工程において、多種類のプローブＤＮＡが搭載されたＤＮＡチップの基板上に、蛍光マーク（例えば、Ｃｙ３，Ｃｙ５など）を付与したＤＮＡサンプルを滴下する。ここで、ＤＮＡサンプルがスポットされたＤＮＡと相補的な関係にあれば、結びついて二重鎖になる。

次に、洗浄工程において、所定の洗浄液により、ハイブリダイズされたＤＮＡチップを洗浄する。これにより、グリッド状に配置されたプローブＤＮＡと結びつかなかったＤＮＡサンプルがすべて洗い流される。

続いて、洗浄されたＤＮＡチップをスキャニングする。スキャニング工程においては、読取り装置内にて、蛍光マーク（例えば、Ｃｙ３，Ｃｙ５など）を励起するのに適した所定の波長のレーザー光をＤＮＡチップに照射し走査する。これにより、スポットされた各ＤＮＡ（遺伝子）の発光量が測定され、それに基づいて解析処理を行う蛍光画像データを取得する。

解析工程においては、得られた蛍光画像データに対してテンプレートを利用して各スポットの蛍光強度を算出し、各種の解析を実行する。

ここで、図２に、ＤＮＡチップ解析に用いられるＤＮＡチップ１の一例を示す。図２に示すＤＮＡチップ１は、基板２の上に、個々の遺伝子に対応するプローブＤＮＡが行方向および列方向に所定数、マトリクス状に配列されたブロックを有している（以下、当該ブロックに配置されているプローブＤＮＡを「スポット」３と称する）。なお、基板２上に配置されるスポット３は、既にその塩基配列が解読されている互いに異なる遺伝子にそれぞれ対応するものであり、基板２上におけるその配置位置は予め定められている。

また、図３に、ＤＮＡチップの蛍光画像データに対して適用されるテンプレートの一例を示す。図３に示すように、テンプレートは、例えば１〜３２などの複数のブロックに分割されており、各ブロック内においてはｍ行ｎ列（図３では２２×２２）のマトリクス状に配置された検出エリア（ＤＮＡチップの個々のスポットに対応する）が設けられている。

上記の解析工程においては、読みとったＤＮＡチップの蛍光画像データ中の個々のスポットに、解析ツールが提供するテンプレートの検出エリアを当てはめ（アラインメント）、当該検出エリアにおいて各スポットの蛍光強度を算出する。このとき、正確な解析を実行するためには画像上の個々のスポットに対してテンプレートの個々の検出エリアが正しく設定されるよう、アラインメント処理が正確に実行される必要がある。

このアライメントの方法としては、ブロック単位でアライメントを行うパターンマッチング法や投影法などがある。そして、特許文献１に示す通り、ポジティブコントロールと呼ばれる蛍光物質やどのような検体にでも含まれているハウスキーピング遺伝子をスポットしたチップを使用して、アライメントを正確に行なおうとする試みもなされている。

さらには、特許文献２に示す通り、基板からの反射光や散乱光で凹凸形状を画像化し、この画像からアライメントを行う方法も考案されている。

特開２００５−１７２８４０号公報 特開２００５−２４５３２号公報

しかしながら、ブロック単位でアライメントを行う典型的なパターンマッチング法や投影法は、いずれも、ハイブリダイズしたサンプルＤＮＡの量が多く、十分な強さの蛍光を発するスポットが１／４から半数程度存在しないと、正しくアライメント出来ない。そのため、検体から抽出したサンプル中に含まれるＤＮＡ量が少ない場合、アライメントが正常に行えない場合がある。一方、ポジティブコントロールと呼ばれる蛍光物質を配置する方法は、十分な強さの蛍光を発するスポットが少なくてもアライメントが行えるという利点があるものの、配置可能なＤＮＡ数が減少し、チップ製造時におけるコストアップ等の問題がある。また、蛍光物質をポジティブコントロールとして利用した場合、ハイブリダイゼーション中に、それが遊離し、ポジティブコントロールの周辺を汚染してしまい、データを得られない恐れもある。また、ハウスキーピング遺伝子に対応するＤＮＡプローブを配置した場合においては、サンプルに含まれるＤＮＡ量が少ない時、ポジティブコントロールからの蛍光も小さく、結果的にアライメントが困難になってしまうという問題もある。

また、基板からの凹凸形状を、基板からの反射光や散乱光で画像化し、これを元にアライメントをする方法では、基板表面の荒れや傷により、アライメントが正確に行えない場合もある。

本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであって、ポジティブコントロールを配置していないＤＮＡチップの解析においても、もしくは、サンプルに含まれるＤＮＡ量が少ないチップの解析や、基板表面に傷や荒れがあるチップの解析でも、アライメント処理を適切に行うことが可能な方法を提供することにある。

上記目的を達成する本発明は、以下のいずれかの構成を特徴とするものである。
（１） 凹凸形状を有する基板表面にプローブが配置されたマイクロアレイに励起光を照射し、励起光で励起された各プローブからの蛍光量を数値データとして得るマイクロアレイの解析方法であって、プローブの蛍光量を測定して蛍光画像データを取得するステップ（ａ）と、基板表面からの自家蛍光を受光して、該光の受光強度からマイクロアレイの基板表面の凹凸形状をアライメント用画像データとして取得するステップ（ｂ）と、前記アライメント用画像データに基づいて前記蛍光画像データにおける各プローブの位置を決定するステップ（ｃ）と、を含む、マイクロアレイの解析方法。
（２） 前記ステップ（ｃ）は、前記アライメント用画像データにおいて、受光強度の差に基づいて前記マイクロアレイの３つ以上の基準点Ａを検出するステップ（ｃ１）と、検出した基準点Ａを基に前記蛍光画像データの歪みを補正するステップ（ｃ２）とを含んでいる、前記（１）に記載のマイクロアレイの解析方法。
（３） 前記ステップ（ｃ１）は、少なくとも８つの所定の観察領域それぞれにおいて前記基板の輪郭線上の点である輪郭基準点aを算出するステップ（ｃ１１）と、重複しない所定の少なくとも２つの観察領域を組とし、各組において複数の輪郭基準点aに対する近似直線を求めるステップ（ｃ１２）と、各組で求めた近似直線の交点を算出して該交点を前記基準点Ａとするステップ（ｃ１３）とを含んでいる、前記（２）に記載のマイクロアレイの解析方法。
（４） 前記ステップ（ｃ２）が、前記基準点Ａからプローブを配置しているスポットの配列角度θｘ、θｙを得て、該スポットの配列角度θｘ、θｙおよび下記式から、前記蛍光画像データの剪断変形歪みを補正するものである、前記（２）または（３）に記載のマイクロアレイの解析方法。

（５） 前記ステップ（ｃ１）は、４つの基準点Ａを検出し、その４つの基準点Ａを直線で結んで形成される四角形が平行四辺形でない場合には、さらに該四角形を平行四辺形に近似し、該平行四辺形の頂点を基準点Ａとして設定しなおす、前記（２）〜（４）のいずれかに記載のマイクロアレイの解析方法。
（６） 前記マイクロアレイがＤＮＡマイクロアレイである、前記（１）〜（５）のいずれかに記載のマイクロアレイの解析方法。

本発明によれば、ポジティブコントロールを配置していないＤＮＡチップの解析や、サンプルに含まれるＤＮＡ量が少ないチップの解析の場合にも、アライメント処理を適切に行うことができ、解析が可能となる。

ＤＮＡチップ解析の一連の工程を示す概略図である。 ＤＮＡチップ解析に用いられるＤＮＡチップの一例を示す概略図である。 ＤＮＡチップ解析において、ＤＮＡチップの蛍光画像データに対して適用されるテンプレートの一例を示す模式図である。 本発明の一実施形態を示す、ＤＮＡチップの解析装置の概略模式図である。 ＤＮＡチップの読取り装置における光学系の一実施形態を示す概略模式図である。 スポット配列の行方向と列方向とが垂直に直交するＤＮＡチップをスキャニングしたにも関わらず歪みが生じて該スポット配列が垂直にならない蛍光画像データの一例を示す模式図である。 ＤＮＡチップの読取り装置で得られたアライメント用画像の一例である。 ＤＮＡチップの解析方法の一実施形態を示すブロック図である。 ＤＮＡチップの読取り装置で得られたアライメント用画像における四隅の座標を示す図である。 図６におけるＳｔｅｐ４、Ｓｔｅｐ５の処理を示す図である。 本発明で解析に供したアライメント用画像データ（ａ）ならびに蛍光画像データ（ｂ）、（ｃ）の一例である。 基準点の検出方法の一例を示す図である。 アライメント用画像データにおいてDNAチップに回転がかかっているときの一例である。 台形を平行四辺形に近似する方法を示す図である。 参考例にて取得したアライメント用画像である。 参考例にて取得した別のアライメント用画像である。

本発明のマイクロアレイの解析装置は、プローブとしてのＤＮＡを基板に固定したＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）や、プローブとしてのタンパク質を基板に固定したタンパク質マイクロアレイ、多数の微小標本を基板に固定化した組織マイクロアレイ、多数の低分子化合物を基板に固定化した化合物マイクロアレイなどを解析する装置であって、マイクロアレイの基板表面の凹凸形状を利用して、得られる蛍光画像データのアライメントを行うものである。該解析装置においては、凹凸形状を有する基板表面にプローブが配置されたマイクロアレイに励起光を照射し、励起光で励起された各プローブからの蛍光量を数値データとして得るが、その際、プローブの蛍光量を測定して蛍光画像データを取得するとともに（ステップ（ａ））、該ステップ（ａ）とは別に、基板表面からの自家蛍光を受光して、該自家蛍光の受光強度からマイクロアレイの基板表面の凹凸形状をアライメント用画像データとして取得する（ステップ（ｂ））。そして、ステップ（ｂ）で得られたアライメント用画像データに基づいて、ステップ（ａ）で得られた蛍光画像データにおける各プローブの位置を決定する（ステップ（ｃ））。

本発明でいうマイクロアレイとは、ガラスやプラスチックなどの基板上に、例えば数十から数万のプローブを固定したものである。蛍光分子などで標識されたサンプル（ターゲット）をこのマイクロアレイの基板にアプライし、プローブとサンプルとの結合反応を蛍光で検出する。前述のように、基板に固定するプローブの種類により、名称がつけられおり、プローブとしてＤＮＡを基板に固定したＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）、タンパク質を基板に固定したタンパク質マイクロアレイ、多数の微小標本を基板に固定化した組織マイクロアレイ、多数の低分子化合物を基板に固定化した化合物マイクロアレイなどが挙げられる。

以下、本発明を、マイクロアレイの代表例であるＤＮＡチップの解析方法および解析装置を例に、説明する。

ＤＮＡチップなどのマイクロアレイの解析は、例えば図４に示すように、スキャナー４と、スキャナー制御用ＰＣ５と、画像サーバー６と、解析用ＰＣ７などを用いて行われる。

スキャナー４は、レーザー光源、光学フィルタ、対物光学系、蛍光画像データおよびアライメント用画像データを取得する検出器、等から構成される。さらに詳しくは、スキャナー４は、例えば図５に示すように、ＤＮＡチップ１などの基板を二方向に走査するための走査機構（図示しない、また本明細書においてはチップの長手方向をｙ軸、それに直交する方向をｘ軸とする）と、ＤＮＡチップなどの基板を複数載置するオートローダー機構（図示しない）と、それぞれ特定波長の励起光を基板表面に出射するレーザー光源５０１、５０２と、該励起光を受光したプローブからの光（蛍光）および基板表面からの自家蛍光の光束を平行光にする対物レンズ５０４と、レーザー光源５０１からの励起光をカットしつつプローブからの蛍光を透過させる励起光カットフィルタ５０８と、レーザー光源５０２からの励起光をカットしつつプローブからの蛍光を透過させる励起光カットフィルタ５０７と、プローブからの蛍光を受光・結像することによって蛍光画像データを取得するとともに、基板表面からの自家蛍光を受光・結像し、その受光強度からマイクロアレイの基板表面の凹凸形状をアライメント用画像データとして取得する、結像レンズ５０９および検出器５１１とを備えている。

なお、図５に示す態様においては、装置を小さくするために、励起光をミラー５１２、５１３により屈折させてＤＮＡチップ１に到達させる。

また、走査機構の基準軸は、歪みの無い画像を得るために、直交していることが好ましい。走査機構としては、一般的に２軸共、スライダーを用いることが好ましい。

上記実施態様は、ＤＮＡサンプルに２種の蛍光マークを付け、それらの読み取りを行う装置としたため、当該２種の蛍光マークに対応した波長の光を出射するレーザー光源５０１、５０２と、出射される励起光の波長にそれぞれ対応した励起光カットフィルタ５０８、５０７とを備えている。しかしながら、ＤＮＡサンプルに１種のみの蛍光マークをつけ、その読みとりを行う装置としてもよいし、３種以上の蛍光マークをつけ、それらの読み取りを行う装置としてもよい。いずれの場合も、用いる蛍光色素に対応したレーザー光源と励起光カットフィルタを設ければよい。

解析用ＰＣ７（演算処理装置）には、前記検出器５１１で取得するアライメント用画像に基づいて蛍光画像データにおける各プローブの位置を検出するための演算処理を行うプログラムが導入されている。

以上のような装置においては、基本的に、発光性のマーカーによりマーキングされたＤＮＡサンプルを滴下したＤＮＡチップを、レーザー光により励起し、蛍光画像データを取得する。蛍光画像データを取得する際には、スキャナー制御用ＰＣ５により、スキャナー４におけるＤＮＡチップ１の走査や画像取得の制御を行う。当該スキャナー制御用ＰＣ５としては、汎用パーソナルコンピュータなどを用いる。

得られた蛍光画像データは、ＤＮＡチップ画像ファイル８として画像サーバー６に保存される。ＤＮＡチップ１は、後述するように、例えば蛍光色素Ｃｙ３，Ｃｙ５に対応する励起波長でスキャンされ、１つのＤＮＡチップ１に対応してそれぞれの励起波長に対応した蛍光画像データが得られるが、この蛍光画像データは、例えば、１６ビットグレイスケールＴｉｆｆフォーマット、ＢＭＰフォーマット、ＪＰＥＧフォーマットなどのファイル形式で保存される。

解析用ＰＣ７は、画像サーバー６に保存されたＤＮＡチップ画像ファイル８を読み込む。さらに解析実行用のパラメータ等を定義する解析定義ファイル９を読み込んで、ＤＮＡチップ画像の解析を実行し、数値化された解析結果データを数値化データファイル１０として出力する。この解析用ＰＣ７には、後述のアライメント処理を含んだ解析処理を実行するためのプログラムが導入される。

基本的には以上のような方法でＤＮＡチップなどマイクロアレイの解析が行われるが、本発明においては、蛍光画像データを取得する工程（（上記ステップ（ａ））とは別に、マイクロアレイの基板表面からの自家蛍光を受光して、該基板の凹凸形状をアライメント用画像データとして取得し（上記ステップ（ｂ））、得られたアライメント用画像データに基づいてアライメント処理を行って蛍光画像データにおける各プローブの位置を決定する（上記ステップ（ｃ））。

次に、スキャナー４での蛍光画像データおよびアライメント用画像データの取得方法とアライメント処理方法について詳しく説明する。

まず、図５を用いて上記ステップ（ａ）に対応する画像取得方法について説明する。なお、以下では蛍光色素としてＣｙ５、Ｃｙ３を用いた態様を説明するが、サンプルを標識するための蛍光色素はいずれか一方でもよいし、またこれらに限定されるものではない。蛍光色素としては例えば、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ｒｏｄａｍｉｎｅ、Ｃｙ３．５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＴＡＭＵＲＡ、Ｏｙｓｔｅｒ ６５０、Ｃｙ５．５などを用いることができる。

例えば、最初に蛍光色素Ｃｙ５を読み取るために、Ｃｙ５用のレーザー光源５０１（例えば波長６３５ｎｍのレーザー光源）からレーザー光（すなわち蛍光色素Ｃｙ５の励起光）を照射する。レーザー光は、穴あきミラー５０３および対物レンズ５０４を介してＤＮＡチップ１に照射される。照射されたレーザー光により励起発光したＤＮＡサンプルに含まれる蛍光分子からの蛍光５０５ならびにチップ表面で反射および／または散乱したレーザー光５０６は、対物レンズ５０４で互いに略平行となるよう集光される。その後、該蛍光５０５ならびにレーザー光５０６は、穴あきミラー５０３で反射され、Ｃｙ５用の励起光カットフィルタ５０８に入射する。なお、チップ表面で正反射したレーザー光は、穴あきミラー５０３の穴を通過する。励起発光したＤＮＡサンプルに含まれる蛍光分子からの蛍光５０５は、この励起光カットフィルタ５０８を透過し、結像レンズ５０９で集光される。一方、励起光カットフィルタ５０８に到達した励起光（チップ表面で反射および／または散乱した光）はカットされる。結像レンズ５０９で集光された蛍光５０５は、ピンホール５１０により、結像レンズ５０９の焦点位置付近以外の光がカットされ、検出器５１１に入射する。検出器５１１は、光の強弱に応じた電気信号を出力する。このような工程を、スキャナー制御用ＰＣ５により、ＤＮＡチップ１を二方向に走査させて繰り返しつつ、検出器５１１から出力された電気信号をＡ／Ｄ変換して蛍光画像データを作成する。

続いて、蛍光色素Ｃｙ３の読み込みを行う。蛍光色素Ｃｙ３の読み込みは、Ｃｙ５用のレーザー光源５０１をＣｙ３用のレーザー光源５０２（例えばレーザー波長５３２ｎｍのレーザー光源）に置き換えるとともに、Ｃｙ５用の励起光カットフィルタ５０８をＣｙ３用の励起光カットフィルタ５０７に置き換える以外は、蛍光色素Ｃｙ５の読み込みと同様に行えばよい。すなわち、Ｃｙ３用のレーザー光源５０２からレーザー光（すなわち蛍光色素Ｃｙ３の励起光）を照射するとともに、Ｃｙ３用の励起光カットフィルタ５０７にて該励起光カットフィルタ５０７に到達した励起光（すなわちチップ表面で反射および／または散乱した光）を除去することで、Ｃｙ５と同様に蛍光画像データを作成する。

ここで、スキャナーの走査機構が２つのスライダーを備えたものである場合、これらスライダーが必ずしも直交しているとは限らない。装置組み立て時、もしくは時間の経過等に伴って、ずれてしまうことある。そのため、スキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像も、例えば図６（ａ）に示すように傾いている可能性がある。このように、走査機構のｘ軸とｙ軸が直交しない場合は得られた蛍光画像データが歪んでしまい、テンプレートの検出エリアを得られた画像に正しく位置合わせすることが出来ない。

このため、画像から直交度のズレを検出して、スライダーが直交する走査機構で得られる画像と同等になるように補正することが好ましい。より具体的には、蛍光画像データをｘ軸に対してｙ軸方向に投影し、座標Ｘ毎の積算強度（各画素値の積算値）を算出する。この処理を、座標原点周りに蛍光画像データを予め設定した角度ずつ回転させて繰り返す。投影方向とスポットのｙ軸方向の配列方向がずれている場合の積算強度グラフは、図６（ｂ）に示すように振幅のないグラフになる。一方、投影方向とスポットのｙ軸方向の配列方向が一致した場合の積算強度グラフは、図６（ｃ）に示すとおり、信号の振幅が最大となる。投影データのこのような特徴を利用し、積算強度の標準偏差が最大値をとる角度を求めることで、スポットのｙ軸に対する配列の角度を検出することができる。同様にｘ軸に対する配列の角度を求め、せん断変形等の画像処理を施すことでスポットの配列方向を直交させることが可能である。

以上のようにして蛍光画像データを取得する場合、検体から抽出したサンプル中に含まれるＤＮＡが非常に少ないと、Ｃｙ５、Ｃｙ３ともに、発光するスポット数が少なくなるためブロックの境界がわからず、また画像の直交度補正も出来ないため、アライメント処理が不可能となる。

そこで本発明においては、上記のような蛍光画像データの他に、チップを再セットすることなく以下のようなアライメント用画像データも取得する（上記ステップ（ｂ））。すなわち、ＤＮＡチップ１に光を照射し、該チップの基板表面からの自家蛍光を受光することで、アライメント用画像データを得る。これは、凹凸形状を有する基板表面からの自家蛍光を積極的に受光し、該自家蛍光の受光強度に基づいて基板表面の凹凸形状を画像化し、該凹凸形状をアライメントに用いるためである。

ＤＮＡチップにおけるスポット位置は、該ＤＮＡチップを再セットするまで変化しない。そのため、アライメント用画像データにおけるスポット位置とＣｙ５およびＣｙ３の蛍光画像データにおけるスポット配置とは一致する。したがって、本発明においては、アライメント用画像データで得られるアライメント結果をＣｙ５およびＣｙ３の蛍光画像データへ適用することで、該蛍光画像データのアライメント処理が可能になる。

ここで、具体的に上記した構成の装置においてアライメント用画像データを取得するには、スキャナーの部品点数を少なく出来ることから、Ｃｙ３の励起に用いる５３２ｎｍのレーザーと、それに対応する５５０〜６００ｎｍのバンドパスフィルターとのセットで基板の自家蛍光を得、それを画像化することが好ましい。すなわち、プローブの蛍光色素Ｃｙ３を測定する場合と基本的には同じ構成である。但し、基板の自家蛍光は一般的に微弱であるので、プローブの蛍光色素から蛍光を読み取る場合に比較し、検出器５１１の増感倍率をあげることが必要である。検出器５１１には、多くの場合、光電子増倍管が使われているが、このコントロール電圧を高く設定し、光電子増倍管のゲインを高く設定することで、自家蛍光をはっきりと読み取ることができる。より具体的には、基板の自家蛍光を得る場合、プローブの蛍光色素を読み取る場合よりも、光電子増倍管のゲインを３〜３００倍の値に設定することが好ましい。なお、このような条件ではプローブの蛍光色素からの蛍光強度の測定値は、サチュレーションしてしまい、データとしては使用できない場合が多い。このように基板の自家蛍光を用いてアライメント用画像を取得することで、基板表面の微細な荒れや、傷による影響を少なくし、アライメントの正確性、信頼性を増すことがきる。

このように自家蛍光により、例えば図７（ａ）に示すとおり、DNAチップの凹凸形状を画像化することが可能である。すなわち、特定波長の光によって励起発光した蛍光分子からの蛍光ではなく、基板表面からの自家蛍光を受光して、該基板そのものの凹凸形状を画像化することができる。なお、図７（ａ）のP−P‘線分における画素値のプロファイルを図７（ｂ）に、対応する場所のＤＮＡチップの高さプロファイルを図７（ｃ）に示す。この例の場合、励起光の焦点を基板の凹凸形状の凸部上面に合わせている。そのため、対物レンズ５０４の焦点位置にある基板の凸部の自家蛍光の受光強度が、焦点位置より遠くにある凹部の自家蛍光の受光強度と比較して、強くなり、その結果、図７（ａ）のような、基板表面の凹凸形状が表れたアライメント用画像データが得られる。

上述の態様では、アライメント用画像データ取得用の光源として、Ｃｙ３の励起に用いる５３２ｎｍのレーザーを用い、バンドパスフィルターとして、５５０〜６００ｎｍのバンドパスフィルターとをセットで用いたが、これらに特に制限はない。一般的なレーザー光源と（例えば、波長４０５ｎｍ、５３２ｎｍ、６３５ｎｍ）、それらのレーザーを基板に照射した際に発する基板からの自家蛍光を取りこむことができるフィルターとの組み合わせであればよい。なお、一般的に励起光が短波長になればなるほど、基板からの自家蛍光が大きくなる傾向がある。そのため、励起光としては、波長５５０ｎｍ以下の光源を好ましく用いることができ、特に好ましくは波長５３２ｎｍのレーザー光源を最も好ましく用いることができる。また、基板の凹凸形状に対応する自家蛍光からなるアライメント用画像を得る場合、微弱な自家蛍光を検出することとなるので、プローブの蛍光量を測定する場合よりも、スキャナーの感度設定は高くすることが多い。

基板の材料としては、特には限定されないが、凹凸形状を射出成型などで大量に作製することが可能なので樹脂が好ましい。

なお、アライメント用画像データには、ＤＮＡチップをスキャナーにセットする際に回転ずれや位置ずれが生じる虞がある。しかし、これらの回転ずれや位置ずれの量も、ＤＮＡチップを再セットするまで一定である。このため、アライメント用画像データにおけるスポット位置とＣｙ５およびＣｙ３の蛍光画像データにおけるスポット配置とは一致する。

次に、このアライメント用画像データに基づいて蛍光画像データにおける各プローブの位置を決定し（上記ステップ（ｃ））、マイクロアレイの解析を行う。以下に、この方法の詳細について、図８に示すブロック図を用いて説明する。ただし、図８におけるＳｔｅｐ１，２は前記した工程に相当する工程である。

まず、Ｓｔｅｐ１では、スキャナーにＤＮＡチップをセットし、前述のとおり、蛍光色素Ｃｙ５およびＣｙ３の蛍光画像データを読み込む（上記ステップ（ａ））。続いて、Ｓｔｅｐ２では、ＤＮＡチップをセットしたまま、例えば、Ｃｙ３の励起に用いる５３２ｎｍのレーザーと、それに対応する５５０〜６００ｎｍのバンドパスフィルターとのセット（プローブの蛍光色素Ｃｙ３を測定する場合と基本的には同じ構成）で基板の自家蛍光を得、アライメント用画像を読み込む。（上記ステップ（ｂ））。このとき、光電子増倍管のゲインは、プローブの蛍光画像を読み取る場合の例えば３〜３００倍の値に設定することが好ましい。また、Ｃｙ５の励起に用いるレーザー（６３５ｎｍ）とそれに対応する６５０〜７００ｎｍのバンドパスフィルターを用いても良いし、また別の光源を用意して、その光のＤＮＡチップからの自家蛍光を受光して、アライメント用画像を取得してもよい。

そして、Ｓｔｅｐ３以降で、アライメント用画像データを使用して蛍光画像データにおける各プローブの位置を決定し（上記ステップ（ｃ））、解析する。

具体的には、まずＳｔｅｐ３で、アライメント用画像データにおける少なくとも３つの基準点Ａを検出する（ステップ（ｃ１））。ここで、少なくとも３つの基準点Ａとしては、例えば図９に示すとおり、アライメント用画像での４隅の座標を挙げることができる。かかる四隅の座標の検出方法は、明暗情報を用いたエッジ検出や、同様に明暗情報を用いる、四隅の画像をマスタ画像としたパターンマッチング等が望ましい。

続いて、Ｓｔｅｐ４、５において、前記基準点Ａに基づいて蛍光画像データの歪みを補正する（ステップ（ｃ２））。

具体的には、Ｓｔｅｐ４において、例えば前述の四隅の座標から、スポットのｘ軸に対する配列角度（最も近くに隣接するスポットを直線的に結んだ線のｘ軸に対する傾斜角度）θｘ、スポットのｙ軸に対する配列角度（最も近くに隣接するスポットを直線的に結んだ線のｙ軸に対する傾斜角度）θｙを検出する。θｘ、θｙは、四隅の座標を結んだ４本の線分について、該当方向の２本の線分の角度の平均値を取ることが望ましい。なお、基準点が３点であっても、θｘ、θｙを算出可能である。そして、図１０（ａ）、（ｂ）に示すとおり、スポットのｙ軸に対する配列角度θｙを補正角度として用い、蛍光画像データを回転させて、スポットをｙ軸に対して平行にする。

さらに、Ｓｔｅｐ５において、回転後の画像に対して、上述のように検出した二方向に規則的に配列されているスポットの配列角度θｘ、θｙおよび下記式に基づいて、変換（せん断変形）を実施する。これにより、画像のせん断変形歪みを補正する。この変換後の画像を図１０（ｃ）に示す。なお、下記式の（ｘ、ｙ）は変換前の座標、（Ｘ、Ｙ）は変換後の座標である。また、スキャナーの走査機構のずれ（走査機構の基準軸の直交度）に相当するθｘｙは、数４に示すように、スポットのｘ軸に対する配列角度θｘからｙ軸に対する配列角度θｙを減じて求める。

さらに、ＤＮＡチップ１が樹脂成型品である場合、ハイブリダイゼーション工程や洗浄工程での吸湿や温度変化により樹脂が膨張する場合がある。各工程での処理時間にもよるが、数十μｍ膨張する場合があり、アライメントの精度に影響を与える。

このため、Ｓｔｅｐ６、７において、例えば前記四隅の座標からｘ軸方向およびｙ軸方向のチップ長さを算出するとともに、設計値と一致するように、蛍光画像データを収縮させる。

続いて、上記のようにして、回転補正、せん断変形補正、収縮補正をした蛍光画像データに対して、アライメントを行なう。予め解析定義ファイルに保存しているテンプレートにおける各スポットの位置情報は、例えばチップ左上の隅を原点とした、各スポットの中心座標となっている。このため、Ｓｔｅｐ７で収縮補正した後の画像について、例えば左上隅の座標を原点とし、各スポット枠を計算することで、図１１（ｂ）、（ｃ）に示すとおりアライメントが可能である（Ｓｔｅｐ８）。なお、図１１（ｂ）がＣｙ３の蛍光画像データに対してアライメントを行った結果を示す画像、図１１（ｃ）がＣｙ５の蛍光画像データに対してアライメントを行った結果を示す画像である。また、確認のため、Ｓｔｅｐ２で得られたアライメント用画像データに対してアライメントを行った結果を図１１（ａ）に示す。各図において点線で描画した円の内部が、テンプレートで規定された検出エリアである。

その後、Ｓｔｅｐ９においては、Ｓｔｅｐ８で求めた各スポットの中心座標から、スポット半径内の画素の信号強度について、平均値、メディアン値、標準偏差等の統計量を算出し、スポットの属するブロック番号、スポットの行列番号、配置されているプローブＤＮＡ名と合わせて、各種数値データをファイルとして出力する。

なお、上記のような図８に示す工程において、上記Ｓｔｅｐ１、２の順序は入れ替わってもよい。

また、ハイブリダイゼーションの際の検体流動性を良くするためなどの理由から、DNAチップの四隅は角が丸く成形されている場合がある。このため、Ｓｔｅｐ３での基準点Ａの検出に際しては、ＤＮＡチップの輪郭線上の点の座標に基づいて基準点Ａを検出することが望ましい。

すなわち、図１２に示すように、ＤＮＡチップの四隅それぞれの近傍に、実質的にｘ軸方向に続く輪郭線を含むような輪郭点検出用ウインドウ（観察領域）Ｗｙと、実質的にｙ軸方向に続く輪郭線を含むような輪郭点検出用ウインドウＷｘを設定する。そして、該輪郭点検出用ウインドウＷｘ、Ｗｙそれぞれにおいて、ＤＮＡチップの輪郭線上の一点に相当する輪郭基準点ａを検出し、ウインドウＷｙにおける輪郭基準点ａのｙ座標と、ウインドウＷｘにおける輪郭基準点ａのｘ座標とから、ＤＮＡチップの角に相当する基準点Ａの座標を算出する。これをたとえば四隅について行う。

さらに、四隅のそれぞれに対して輪郭点検出用ウインドウＷｘ、Ｗｙがそれぞれ１つずつしか設定されていない場合、DNAチップがスキャナーの固定治具に斜めに固定されたりすると、図１３（ａ）、及び図１３（a）の二点鎖線で囲まれた部分を拡大した図１３（ｂ）に示すように、検出すべき基準点Ａの位置と実際に検出された基準点Ａとの位置に誤差が生じ、スポットをうまくアライメントできない。

そのため、本発明においては、輪郭点検出用ウインドウＷｘ、Ｗｙをそれぞれ少なくとも４つずつ、すなわち合計８つ以上設定することが好ましい。具体的には、図１３（ｃ）に示すとおり、四隅それぞれに対して、少なくとも２つの輪郭点検出用ウインドウＷｘ（１３０１，１３０２）、ならびに少なくとも２つの輪郭点検出用ウインドウＷｙ（１３０３，１３０４）を設定することが好ましい（ステップ（ｃ１１））。

そして、四隅それぞれに対して、それら少なくとも２つの輪郭点検出用ウインドウＷｘ（１３０１，１３０２）を組とし、該組における複数の輪郭基準点ａに対する近似直線を求めるとともに、少なくとも２つの輪郭点検出用ウインドウＷｙ（１３０３，１３０４）を組として、該組における複数の輪郭基準点ａに対する近似直線を求める（ステップ（ｃ１２））。このようにして得られた２本の近似直線の交点を求め、該交点を基準点Ａとする（ステップ（ｃ１３））。

このようにすることで、チップが斜めに固定された場合でも精度良く基準点Ａを検出することが可能となる。

なお、本発明においては、必ずしも四隅で基準点Ａを求める必要がなく、三隅で基準点Ａを算出するのでもよい。

さらに、上記のように基準点Ａを検出する場合、検出部にキズやゴミ等があると測定誤差が生じる。そのため、基板の四隅の角に相当する４つの基準点Ａを検出しても、それら４つの基準点Ａを結んで形成される形状が平行四辺形（長方形・正方形を含む）でない、台形などの四角形になる場合がある。しかしながら、後の処理Ｓｔｅｐ５におけるせん断変形歪みの補正は、検出した基準点で形成される形が平行四辺形であることが前提であり、そのため、上記のような場合にはスポットをうまくアライメントできないおそれがある。

そこで本発明においては、図１４に示すように、一旦検出した４つの基準点Ａ６００〜６０３で形成される四角形が平行四辺形（長方形および正方向を含む）でない場合には、平行四辺形に近似し、近似した平行四辺形の頂点を改めて基準点Ａ７００〜７０３として設定しなおすことが好ましい。

最初に検出した４つの基準点Ａ６００〜６０３で形成される四角形を平行四辺形に近似するにあたっては、たとえば、対辺となる２つの線分１４０１と１４０２の傾きの平均と線分１４０１と１４０２それぞれの中点を求め、これら中点を通りかつ前記平均傾きを有する２本の直線を求める。これを別の２つの線分についても同様に行い、得られた４本の直線の交点を平行四辺形近似後の基準点Ａ７００〜７０３として改めて設定する。これにより、一旦検出された基準点に測定誤差がある場合でも、精度よくアライメントを行うことができる。

本発明においては、このようにして遺伝子の発現に基づいて得られた蛍光画像データを処理して所望の数値データを取得するが、得られる各種の数値データは、検体内で、求める遺伝子の存在や、ある遺伝子が発現しているか否か、またはどの程度発現しているかを解析するため等に用いられる。

また、以上のようなＤＮＡチップの解析においては、ＤＮＡチップの凹凸を利用して画像の補正、アライメントを行う。そのため、検体から抽出したサンプル中に含まれるＤＮＡ量が少なく発光するスポットが少ない画像、さらに、走査機構の精度が悪い読取り装置によって得られた画像に対しても、ＤＮＡチップの基板上に配置された検出エリアの位置決め処理を高精度に実行可能となる。

上記実施形態においては、マイクロアレイにＤＮＡがスポットされたＤＮＡチップの実施形態を説明したが、本発明は、ＲＮＡ、タンパク質、微小標本、低分子化合物、細胞等をスポットしたチップに対しても適用可能である。

例えば、上記で説明した凹凸形状を有するDNAチップの基板にＤＮＡの代わりにタンパク質（抗体）を固定化し、検体との反応の有無や定量化を蛍光にて検出する場合でも、同様な方法を用いることができる。試料細胞の溶解液に存在するタンパクをＣｙ５、コントロール細胞溶解液に存在するタンパクをＣｙ３で標識して、両者を混合して抗体アレイと反応する場合や、タンパクを蛍光標識する代わりにビオチン標識し、抗体アレイに結合後、酵素標識アビジンを用いてシグナルを増感する手法などがある。このような場合でも、本発明により、精度よくアライメントが可能となり、蛍光強度の各種数値データをファイルとして出力可能である。ＲＮＡアレイの場合でも、凹凸形状を有する基板上に固定化されたＲＮＡと蛍光標識したＤＮＡやＲＮＡとのハイブリダイゼーションを蛍光で検出する場合に本手法を用いることができる。微小標本・細胞アレイにおいても、凹凸形状を有する基板上に固定化された微小標本や細胞と蛍光標識検体（例えば抗体）との結合反応を蛍光により検出する際に、本発明を適応することが可能である。

超精密機械加工により、図２に示すような形状のチップに対応する金型を作製し、この金型を用い射出成型により、ＰＭＭＭ（ポリメチルメタクリレート）からなる基板を製作した。金型には、工具による切削跡があり、そのため、基板にも工具切削跡が転写されている状態であった。切削跡による基板高さの乱れは、実測したところ１μｍ以下であった。

この基板の凸部上面にＤＮＡをスポットし、ハイブリダイゼーションまで行い、図４、図５に示す装置構成を用いて、まず、プローブの蛍光画像データをＣｙ３およびＣｙ５の両方について取得した。ついで、上述したように、基板の自家蛍光でアライメント用画像を取得した（図１５（ａ）、図１６（ａ））。また、比較として、基板からの反射／散乱光でアライメント用画像を取得した（図１５（ｂ）、図１６（ｂ））。なお、図１５（ａ）、図１６（ａ）の画像を取得する際には、光源としてＣｙ３の蛍光を測定する場合に使用するレーザー（波長５３２ｎｍ）を、フィルターとしてＣｙ３の蛍光を取得するためのバンドパスフィルター（透過波長５６０〜６００ｎｍ）を、用いた。このときの光電子増倍管のゲインは、蛍光画像データを取得した際の２０倍に設定した。また、図１５（ｂ）、図１６（ｂ）の画像を取得する際には、光電子増倍管のゲインをプローブの蛍光画像を読み取る場合と同じ値に設定し、かつ、光源としてはＣｙ５の蛍光を測定するレーザー（波長６３５ｎｍ）を、フィルターとしてはＣｙ３を測定する際に使用するバンドパスフィルターを、用いた。当該Ｃｙ３用のフィルターは、６３５ｎｍでＯＤ値が約５であり、わずかに６３５ｎｍの波長を透過するものであった。

図１５の（ａ）、（ｂ）、図１６（ａ）、（ｂ）に示すように、両者の画像を比較すると自家蛍光に基づくアライメント用画像では、基板の凹凸形状（高さの差９０μｍ）に応じた明確なコントラストが得られたのに対し、反射／散乱光に基づくアライメント用画像では、切削跡による基板表面の荒れ（高さ１μｍ未満）が原因で乱反射が生じ、９０μｍの凹凸形状とは一致しないが切削跡とは一致するコントラストも現れた。

また、それぞれのアライメント用画像について、図１１の記号１１０１や図１２の（ｂ）のＡに相当する四隅の基準点を、明暗情報を用いたエッジ検出で取得することを試みた。すなわち１枚あたり合計８箇所のエッジの検出を試みた。これを２０枚の基板で試みたところ、自家蛍光を用いた場合は１００％の確率（２０／２０）で１枚当り４箇所の基準点Ａの検出に成功したが、反射光を用いた場合は、成功確率は３０％（６／２０）であった。

そしてエッジ検出に成功した場合において、上記Ｓｔｅｐ４（スポットのｘ、ｙ軸に対する配列角度θｘ、θｙの検出）、Ｓｔｅｐ５（蛍光画像データのせん断変形歪み補正）、Ｓｔｅｐ６、７（ｘ、ｙ軸方向について、チップの設計値と一致するように蛍光画像データのサイズ補正）、Ｓｔｅｐ８（テンプレートを用いてのアライメント）の工程を実施したところ、Ｃｙ３、Ｃｙ５の両方の蛍光画像データで問題なくアライメントが行えていることを確認した。

以上のことから、自家蛍光をから得られたアライメント用画像を用いると、基板表面の傷や荒れに影響されずに凹凸を有する基板形状を画像化でき、確実なアライメントを行うことが可能である。

１ ＤＮＡチップ
２ 基板
３ スポット
４ スキャナー
５ スキャナー制御用ＰＣ
６ 画像サーバー
７ 解析用ＰＣ
８ ＤＮＡチップ画像ファイル
９ 解析定義ファイル
１０ 数値化データファイル
５０１ レーザー光源（Ｃｙ５用）
５０２ レーザー光源（Ｃｙ３用）
５０３ 穴あきミラー
５０４ 対物レンズ
５０５ 蛍光分子からの蛍光
５０６ 基板表面で反射および／または散乱したレーザー光
５０７ 励起光カットフィルタ（Ｃｙ３用）
５０８ 励起光カットフィルタ（Ｃｙ５用）
５０９ 結像レンズ
５１０ ピンホール
５１１ 検出器
５１２ ミラー
５１３ ミラー
６００〜６０３ 一旦検出された基準点Ａ
７００〜７０３ 平行四辺形に近似後の基準点Ａ
１１０１ アライメント用画像の基準点
１１０２ 計算されたスポット枠
１３０１、１３０２ 輪郭点検出用ウインドウＷｘ
１３０３、１３０４ 輪郭点検出用ウインドウＷｙ
１４０１〜１４０２ 線分

Claims (6)

1. 凹凸形状を有する基板表面にプローブが配置されたマイクロアレイに励起光を照射し、励起光で励起された各プローブからの蛍光量を数値データとして得るマイクロアレイの解析方法であって、プローブの蛍光量を測定して蛍光画像データを取得するステップ（ａ）と、基板表面からの自家蛍光を受光して、該光の受光強度からマイクロアレイの基板表面の凹凸形状をアライメント用画像データとして取得するステップ（ｂ）と、前記アライメント用画像データに基づいて前記蛍光画像データにおける各プローブの位置を決定するステップ（ｃ）と、を含む、マイクロアレイの解析方法。
2. 前記ステップ（ｃ）は、前記アライメント用画像データにおいて、受光強度の差に基づいて前記マイクロアレイの３つ以上の基準点Ａを検出するステップ（ｃ１）と、検出した基準点Ａを基に前記蛍光画像データの歪みを補正するステップ（ｃ２）とを含んでいる、請求項１に記載のマイクロアレイの解析方法。
3. 前記ステップ（ｃ１）は、少なくとも８つの所定の観察領域それぞれにおいて前記基板の輪郭線上の点である輪郭基準点aを算出するステップ（ｃ１１）と、重複しない所定の少なくとも２つの観察領域を組とし、各組において複数の輪郭基準点aに対する近似直線を求めるステップ（ｃ１２）と、各組で求めた近似直線の交点を算出して該交点を前記基準点Ａとするステップ（ｃ１３）とを含んでいる、請求項２に記載のマイクロアレイの解析方法。
4. 前記ステップ（ｃ２）が、前記基準点Ａからプローブを配置しているスポットの配列角度θｘ、θｙを得て、該スポットの配列角度θｘ、θｙおよび下記式から、前記蛍光画像データの剪断変形歪みを補正するものである、請求項２または３に記載のマイクロアレイの解析方法。
   
5. 前記ステップ（ｃ１）は、４つの基準点Ａを検出し、その４つの基準点Ａを直線で結んで形成される四角形が平行四辺形でない場合には、さらに該四角形を平行四辺形に近似し、該平行四辺形の頂点を基準点Ａとして設定しなおす、請求項２〜４のいずれかに記載のマイクロアレイの解析方法。
6. 前記マイクロアレイがＤＮＡマイクロアレイである、請求項１〜５のいずれかに記載のマイクロアレイの解析方法。