KR20160108377A - 핵산 바코드를 이용하는 단일 세포와 관련된 핵산의 분석 - Google Patents

핵산 바코드를 이용하는 단일 세포와 관련된 핵산의 분석 Download PDF

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Abstract

본 명세서에서 핵산 바코드를 이용하여 단일 세포와 관련된 핵산을 분석하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에 따르면, 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 방법은 하나 이상의 샘플과 관련된 복수의 RNA를 얻는 단계(상기 샘플은 하나 이상의 대상체로부터 얻으며, 각각의 RNA는 단일 샘플과 관련되고, 각각의 샘플과 관련된 RNA는 별도의 반응 용적에 존재함); 각각의 샘플과 관련된 RNA에 어댑터 분자를 첨가하는 단계(어댑터 분자는 효소 반응을 이용하여 생성되고, 보편적인 프라이밍 서열, 바코드 서열 및 결합 부위를 포함함); 및 각각의 샘플과 관련된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 내로 바코드 서열을 혼입하고, 이에 의해 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 단계를 포함한다.

Description

핵산 바코드를 이용하는 단일 세포와 관련된 핵산의 분석{ANALYSIS OF NUCLEIC ACIDS ASSOCIATED WITH SINGLE CELLS USING NUCLEIC ACID BARCODES}
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2013년 12월 30일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/922,012호(발명의 명칭: Analysis of Nucleic Acids Associated with Single Cells using Nucleic Acid Barcodes)의 유익을 주장하며, 이 기초출원의 전체 내용은 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참고로 포함된다.
텍스트 파일로 제출된 "서열목록", 표 또는 컴퓨터 프로그램 목록 부록에 대 한 언급
2014년 12월 30일자로 생성된 파일 97519-920777.txt(18,227,200 바이트)(기계 형식 IBM-PC, MS-윈도우 작동 시스템)에 기재된 서열 목록은 그의 전문이 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참고로 포함된다. 표 18. 파일 표 18에 기재된 [바코드_부분1]. [바코드_부분1].txt, 2,039,808 바이트; 표 18. 파일 표 18에 기재된[바코드_부분2]. [바코드_부분2].txt, 90,112 바이트; 표 22. 표 22에 기재된 [i5 인덱스 프라이머]. [i5 인덱스 프라이머].txt, 4,096 바이트; 표 32. 표 32에 기재된 [웰-바코드]. [웰-바코드].txt, 4,096 바이트; 표 32. 표 32에 기재된 [플레이트-바코드]. [플레이트-바코드].txt, 4,096 바이트(모두 2014년 12월 24일자로 생성됨, 기계 형식 IBM-PC, MS-윈도우 작동 시스템)은 그들의 전문이 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참고로 포함된다.
가변 유전자, 예컨대 면역글로불린(Ig) 및 T 세포 수용체(TCR) 유전자는 접합 사이에 P/N 뉴클레오타이드 첨가를 지니는 V(D)J 유전자 세그먼트의 재배열로부터 형성된다. 전체 기능성 Ig 또는 TCR 단백질은 두 유전자의 결합(Ig에 대해 중쇄 및 경쇄 유전자, αβTCR에 대해 알파 및 베타 유전자 및 γδTCR에 대해 감마 및 델타 유전자)에 의해 형성된다. 이 조합 접근은 극도로 큰 다양성의 상이하게 가능한 서열을 초래한다.
이 레퍼토리는 유기체가 아직 접하지 않은 신규한 면역학적 발작에 면역계가 반응할 수 있게 한다. 면역글로불린 유전자는 또한 추가로 레퍼토리 크기를 증가시키는 체세포초돌연변이를 겪는다.
대응적으로, 기능적 특성을 조사하기 위해 천연 Ig 또는 TCR 단백질을 발현시키는 가변 유전자의 임의의 핵산 분석은 개개 B 세포(Ig 유전자에 대해) 또는 T 세포(TCR 유전자에 대해)의 서열분석을 필요로할 뿐만 아니라, 단백질을 구성하는 두 유전자의 천연 짝짓기를 필요로 한다. 이는 단일 세포 클로닝 및 생어 서열분석에 의해 행해질 수 있지만, 느리고 힘이 든다(예를 들어, 문헌[Wrammert et al., Nature, 2008, 453:667-671] 참조).
본래 짝지어진 유전자의 고속대량 서열분석을 위해 고속대량 방법이 개발되었고, 2가지 접근으로 나뉜다. 제1 접근은 세포로부터의 핵산에 대해 고유 핵산 바코드를 부착하며, 그들이 동일한 바코드를 공유한다면 유전자를 생물정보학적으로 함께 연결하는 것을 통해 짝짓기가 달성되고, 따라서, 동일한 세포로부터 유래된다(PCT/US2012/000221). 제2 접근은 두 유전자로부터의 핵산을 함께 물리적으로 연결하는 것이다(예를 들어, 미국 특허 제7,749,697호 참조).
제1 접근은 그것이 다수 유전자(예컨대 특이적 T 세포 또는 B 세포 서브세트를 동정하는 B 또는 T 세포 공동발현 유전자)에 대한 짝짓기를 허용하기 때문에 우수한 반면, 제2 접근은 소수의 핵산을 물리적으로 연결하는 것에 제한된다. 지금까지, 실험 데이터는 2개 이하의 핵산이 물리적으로 연결된 경우에만 존재한다.
단일 세포에 핵산을 분명하게 관련짓는 것(제1 접근)은 서로 연결을 통해 관련짓는 것(제2 접근)보다 이점이 있다. 핵산이 서로 관련될 때, 진정한 생물학적 변이로부터 PCR 및 서열분석 오류를 구별하는 것은 어려울 수 있다. 서열분석 플랫폼의 정확성에 관한 추정이 만들어졌고, 판독은 유사성 컷오프 백분율에 기반하여 상이한 서열에 임의로 부여되며, 즉, 95% 초과의 유사성을 지니는 모든 판독이 서열에 부여되고, 그들 사이의 임의의 차이는 서열분석 오류에 기인하는 것으로 추정된다. 이는 서로 매우 유사한 서열을 구별할 수 없다(문헌[Zhu et al., Frontiers in Microbiology, 2012, 3:315] 참조).
더 나아가, 얼마나 많은 세포가 동일한 서열을 공유하는지에 관한 추정은 서열에 부여된 판독의 상대적 빈도를 이용하여 만들어진다. 이는 대략적인 측정이며, 당업계에 잘 공지된 바와 같은 PCR 증폭 바이어스에 의해 영향을 받는다. 따라서, Ig 또는 TCR 핵산을 서로 결합하는 것은 근삿값 만을 제공하지만, 서열분석된 레퍼토리의 진정한 표현은 아니다(문헌[Zhu et al., Frontiers in Microbiology, 2012, 3:315]).
그러나, 핵산 바코드를 이용하여 단일 세포에 핵산을 결합시키는 것은 단일 B 또는 T 세포로부터의 유사하거나 또는 심지어 동일한 서열 사이의 모호하지 않은 차이를 허용하는데, 각각의 판독이 세포에 부여될 수 있기 때문이다.
더 나아가, 세포와 관련된 모든 판독을 지니는 공통 서열을 구성함으로써, 매우 정확하고 거의 완전하게 오류가 없는 서열이 얻어질 수 있고, 서열분석한 레퍼토리의 정확한 표시를 얻었다. 이는 또한 세포 내 모든 핵산의 분석에 대해 일반화될 수 있다.
여전히, 각각의 단일 세포에 고유 바코드를 전달하는 것에서의 기술적 어려움이 남아있다. 가변 유전자에 핵산 바코드를 부착하기 위한 현재의 최고의 기술은 수용액 중에서 고유 바코드를 갖는 것이며, 각각의 바코드는 가변 유전자 핵산에 바코드를 부착하는 반응 전조차 별도의 강한 용기에 존재하고(PCT/US2012/000221), 그렇지 않으면 핵산 바코드는 사용 전에 혼합될 것이다. 이는 개개 바코드를 함유하는데 필요한 매우 다수의 용기때문에, 수천개의 세포를 바코딩하는 것의 논리적 어려움을 만든다.
고유 바코드가 각각의 개개 반응 용기(이는 또한 단일 세포를 수용할 것임) 내로 개별적으로 피펫팅될 수 없는 경우에 매우 다수의 저장 용기에 대한 필요는 또한 이 접근이 임의의 접근과 양립가능하지 않게 만든다. 예로서 나노웰 접근과 같은 나노리터-크기의 반응 용기가 있는데, 여기서 수천 내지 수십만개 나노웰이 있기 때문에 각각의 나노웰에 고유 바코드를 피펫팅하는 것은 비현실적이다.
이는 또한 나노점적 접근에서 실행불가능한데, 이때, 수십만개의 나노점적은 소수의 수성 스트림에 의해서만 생성되기 때문에 유중수 에멀전을 이용하여 점적이 만들어지고(예를 들어, 돌로마이트 마이크로플루이딕스사(Dolomite Microfluidics) 또는 레인댄스 테크놀로지사(Raindance Technologies)에 의한 제품을 참조), 나노점적에 전달하기 전에 개개 저장에서 고유 바코드를 가질 수 없다.
개개 반응 용기에 고유 바코드를 전달하는 한 방법은 대다수의 반응 용기 내로 고유 바코드를 두기 위해 제한 희석을 이용하는 것에 의한다. 비드와 같은 조작가능한 물체에 부착된 바코드의 제한 희석을 수행할 수 있으며, 물체의 각각은 부착된 하나의 특정 바코드의 다수 복제물을 갖거나, 또는 용액 중에서 바코드의 제한 희석을 수행할 수 있다. 이러한 비드의 희석 시, 하나의 특정 핵산 바코드의 다수 복제물은 반응 용기에 존재하는 반면, 용액 중에서 바코드의 희석 시, 특정 핵산 바코트의 단일 복제물만이 반응 용기 내에 존재한다.
게다가, 반응 용기 내에 존재하는 관심 대상의 샘플 유래 핵산에 대한 핵산 바코드의 첨가는 도입된 바코드가 증폭된다면 더 완전하게 되어서, 반응 챔버 내에서 충분한 양으로 존재하는 것을 보장할 것이다. 예를 들어, 전형적인 포유류 세포는 mRNA의 대략 400,000개의 복제물을 함유한다. 전반적인 단일-세포 분석 효율을 최대로 하기 위해, 가능한 다수의 이들 mRNA 복제물은 바코딩되어야 한다. 따라서, mRNA 복제물이 있기 때문에 특정 핵산 바코드의 최소로 거의 동일한 수의 복제물은 반응 용기에 존재할 필요가 있다. 용액 중에서 바코드의 제한 희석은 반응 용기 내 특정 바코드의 단일 복제물만을 야기하는 반면, 바코드를 보유하는 작은(예를 들어, 직경이 1 내지 2㎛) 비드의 희석은 최대 수만개의 복제물을 제공하는 것으로 예상되었다. 따라서, 각 경우 중 하나에서 바코드의 증폭은 매우 다수의 샘플-유래 핵산에 대한 바코드의 성공적인 첨가가 일어나도록 반응 용기 내에서 충분한 양의 특정 핵산 바코드를 생성하는데 중요하다. 그러나, 비드는 상당히 더 많은 출발 물질을 제공하고 따라서 상당히 더 양호한 바코드 증폭을 제공하는 것으로 예상된다. 또한, 충분히 큰 비드는 수십만개의 핵산 바코드 분자를 함유할 수 있다. 이 경우에, 비드로부터의 핵산 바코드의 절단은 반응 용기에서 충분한 양의 특정 핵산 바코드를 생성하는데 충분할 수 있다.
더 나아가, 핵산이 고체 표면에 부착된다면, 그들은 용액 중의 핵산에 비해 자유롭게 이동할 수 없을 것이다. 고체상 역학은 핵산 상보적 염기 짝짓기에 대한 수성상 역학보다 훨씬 더 느리며, 관심 대상의 핵산에 대한 바코드의 훨씬 덜 효율적인 첨가를 초래할 수 있다. 바람직하게는, 핵산 바코드는 바코딩 반응에 참여하기 전에 수성상에 존재하여야 한다.
이런 현재의 발명은 각각의 샘플이 보통 단일세포이지만, 임의의 유형의 샘플에 대해 일반화될 수 있는 각각의 샘플에 대해 고유 바코드를 부착하는 선행 발명(PCT/US2012/000221)에 대해 개선된다. 현재의 발명은 임의의 유형의 반응 용기에 고유 바코드의 전달을 가능하게 하며, 또한 나노리터-크기의 반응 용기에 적합하고, 별도의 저장 용기에서 고유 핵산 바코드를 유지하는 것을 필요로 하지 않는다. 이는 개량될 수 있지만, 각각의 반응 용기 내로 고유 바코드를 수동으로 피펫팅하는 것을 필요로 하지 않는다. 이는 각각의 반응 용기 내로 고유 바코드 또는 고유 바코드 세트의 하나 이상의 복제물을 전달하며, 바코드는 빠른 수성상 역학에 의해 수성상에서 일어나는 반응에서 관심 대상의 핵산에 부착된다. 반응은 세포에서 관심 대상의 모든 핵산, 즉, 세포 내의 모든 역전사된 RNA에 바코드를 부착하기 때문에, 본 발명은 단일 세포 전사체학 분석을 가능하게 하고, 특이적 샘플에 면역글로불린 가변 유전자를 결합시키는 것으로 제한되지 않는다. 더 나아가, 증폭 반응은 관심대상의 핵산에 바코드를 첨가하기 위해 중온성 효소(다르게는 고온에서 불활성화됨)와 양립가능하도록 충분히 저온에서 일어날 수 있다.
본 명세서에서 핵산 바코드를 이용하여 단일 세포와 관련된 핵산을 분석하기 위한 방법 및 조성물이 개시된다. 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위해 본 명세서에 개시된 한 방법은 하나 이상의 샘플과 관련된 복수의 핵산을 얻는 단계를 포함하되, 상기 샘플은 하나 이상의 대상체로부터 얻어지고, 샘플과 관련된 핵산은 별도의 반응 용적에 존재한다. 핵산은 RNA 또는 DNA 분자(예를 들어, cDNA 분자)일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 어댑터 분자는 샘플과 관련된 핵산에 첨가된다. 몇몇 실시형태에서, 어댑터 분자는 효소 반응을 이용하여 생성되고, 보편적인 프라이밍 서열, 바코드 서열, 및 결합 부위를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 바코드 서열은 샘플과 관련된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 내로 혼입되고, 이에 의해 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 생성한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 샘플과 관련된 핵산에 어댑터 분자를 첨가하는 단계(상기 어댑터 분자는 효소 반응을 이용하여 생성되고, 보편적인 프라이밍 서열, 바코드 서열 및 결합 부위를 포함함); 및 샘플과 관련된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 내로 바코드 서열을 혼입하고, 이에 의해 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 하나 이상의 샘플과 관련된 복수의 RNA를 얻는 단계(상기 샘플은 하나 이상의 대상체로부터 얻으며, 샘플과 관련된 RNA는 별도의 반응 용적에 존재함); 샘플과 관련된 RNA에 어댑터 분자를 첨가하는 단계(어댑터 분자는 효소 반응을 이용하여 생성되고, 보편적인 프라이밍 서열, 바코드 서열 및 결합 부위를 포함함); 및 샘플과 관련된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 내로 바코드 서열을 혼입하고, 이에 의해 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 RNA, 또는 복수의 RNA 중 적어도 하나는 하나 이상의 샘플로부터의 단일 샘플과 관련된다. 상기 방법의 몇몇 실시형태는 효소 반응을 이용하여 어댑터 분자를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 어댑터 분자는 주형 분자를 하나 이상의 효소와 접촉시킴으로써 생성된다. 몇몇 실시형태에서, 주형 분자는 RNA 중합효소(RNAP) 프로모터를 포함하는 DNA 분자이고, 하나 이상의 효소는 RNA 중합효소를 포함한다. RNAP 프로모터는 T7, T3 및 SP6으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 주형 분자는 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 DNA 분자이고, 하나 이상의 효소는 틈내기 엔도뉴클레아제 및 가닥-치환 DNA 중합효소를 포함한다. 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위는 Nt.BbvCI, Nt.BspQI, Nt.BsmAI, Nt.BstNBI, Nt.AlwI 및 Nt.BsmAI로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 가닥-치환 DNA 중합효소는 클레노브 엑소-, Bst 거대 단편, 및 Bst 거대 단편의 공학처리된 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. DNA 분자는 이중-가닥 분자 또는 이중-가닥 분자를 생성하기 위한 주형으로서 유용한 단일-가닥 분자일 수있다.
몇몇 실시형태에서, 주형 분자는 고체 지지체에 결합되고, 고체 지지체는 수용액과 접촉되며, 어댑터 분자는 그것이 생성됨에 따라 수용액 내로 방출된다. 몇몇 실시형태에서, 하나의 샘플과 관련된 RNA에 어댑터 분자를 첨가하는 것은 수용액을 RNA가 존재하는 반응 용적과 합하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 수용액은 하나의 샘플과 관련된 RNA와 동일한 반응 용적에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 주형 분자는 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하며, 하나 이상의 효소는 제한 엔도뉴클레아제를 포함하고, 어댑터 분자는 주형 분자의 일부를 포함하며, 상기 일부는 주형 분자를 제한 엔도뉴클레아제와 접촉 시 생성되고 수용액 내로 방출된다. 몇몇 실시형태에서, 고체 지지체는 비드 또는 표면(예를 들어, 마이크로타이터 웰 또는 관의 표면)이다.
상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 어댑터 분자는 하나의 샘플과 관련된 RNA에 어댑터 분자를 첨가하기 전에 용액 중에서 유리된다. 몇몇 실시형태에서, 어댑터 분자는 구획 내에서 생성되고, 하나의 샘플과 관련된 RNA에 어댑터 분자를 첨가하는 것은 상기 구획을 RNA가 존재하는 반응 용적과 합하는 것을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 어댑터 분자는 어댑터 분자가 첨가된 RNA가 존재하는 반응 용적에서 생성된다. 몇몇 실시형태에서, 어댑터 분자는 어댑터 분자가 첨가된 RNA가 존재하는 반응 용적에서 생성되지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 효소 반응은 등온 반응이다. 몇몇 실시형태에서, 어댑터 분자는 고유 분자 식별자(unique molecular identifier: UMI) 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 어댑터 분자는 RNA 분자이다. 어댑터 분자는 RNAP를 이용하여 생성될 수 있다.
상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 어댑터 분자는 DNA 분자이다. 어댑터 분자는 DNAP를 이용하여 생성될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 것은 샘플과 관련된 RNA를 역전사시킴으로써, 복수의 제1 가닥 cDNA를 합성하는 것을 포함하고, 샘플과 관련된 RNA의 적어도 일부는 어댑터 분자의 결합 부위에 대해 상보성인 서열 영역을 포함하며, 바코드 서열이 샘플과 관련된 제1 가닥 cDNA 내로 혼입되도록, 어댑터 분자는 역전사를 위한 프라이머로서 사용된다. 이들 실시형태에서, 결합 부위는 폴리-T 트랙 또는 무작위 트랙을 포함할 수 있다. 결합 부위는 어댑터 분자의 3' 말단에서 생길 수 있다. 어댑터 분자는 구획 내에서 생성될 수 있고, 샘플과 관련된 RNA를 역전사시키는 것은 구획을 RNA가 존재하는 반응 용적과 합할 때 일어날 수 있다. 샘플과 관련된 RNA를 역전사시키는 것은 RNA에 첨가된 어댑터 분자가 생성된 경우와 동일한 반응 용적에서 생길 수 있다.
상기 방법의 몇몇 실시형태는 샘플과 관련된 RNA를 역전사시켜 복수의 cDNA를 얻는 단계를 추가로 포함하되, RNA를 역전사시키는 것은 역전사효소 및 제1 가닥 프라이머를 이용하여 cDNA의 제1 가닥을 합성하는 단계를 포함한다. 이들 실시형태에서, 역전사효소는 MMLV H-역전사효소일 수 있다. 어댑터 분자는 구획에서 생성될 수 있으며, 하나의 샘플과 관련된 RNA에 어댑터 분자를 첨가하는 것은 구획을 RNA가 존재하는 반응 용적과 합하는 것을 포함할 수 있다. cDNA의 제1 가닥은 구획을 반응 용적과 합하기 전에 또는 후속하여 합성될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 샘플과 관련된 RNA를 역전사시키는 것은 RNA에 첨가된 어댑터 분자가 생성된 경우와 동일한 반응 용적에서 생길 수 있다. 이들 실시형태에서, 반응 용적 중의 완충제는 pH 8.0 내지 pH 8.8의 pH 범위에서 트리스(Tris), 칼륨 이온, 염소 이온, 황산 이온, 암모늄 이온, 아세트산 이온 또는 망간 이온 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 역전사효소는 주형 전환 활성을 가지며, 샘플과 관련된 cDNA의 적어도 일부의 제1가닥은 3' 돌출부를 포함하고, 어댑터 분자의 결합 부위는 3' 돌출부에 대해 상보성인 3' 일부를 포함하며, 바코드 서열이 샘플과 관련된 cDNA의 제1 가닥 내로 혼입되도록 어댑터 분자는 역전사 효소에 대한 주형으로서 작용한다. 이들 실시형태에서, 3' 돌출부는 하나 이상의 C 뉴틀레오타이드를 포함할 수 있고, 결합 부위의 3' 일부는 하나 이상의 G 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 제1 가닥 프라이머는 폴리-T 트랙 또는 무작위 서열을 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 것은 제1(예를 들어, 정방향) 프라이머 및 제2(예를 들어, 역방향) 프라이머(제2 프라이머는 제1 가닥 프라이머의 적어도 일부와 동일한 서열을 가짐)를 이용하여 각각의 샘플에 대해 cDNA의 제1 가닥을 증폭시키는 단계를 포함하되, 제1 프라이머 또는 제2 프라이머는 어댑터 분자이다. 이들 실시형태에서, 제1 프라이머 또는 제2 프라이머는 어댑터 분자일 수 있다. 제1 가닥 프라이머는 폴리-T 트랙 또는 무작위 서열을 포함할 수 있다.
상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 각각의 샘플은 세포를 포함한다. 세포는 혈액 세포, 면역 세포, 조직 세포, 또는 종양 세포일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 B 세포 또는 T 세포이다. B 세포는 형질아세포, 기억 B 세포 또는 혈장 세포일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 샘플과 관련된 RNA는 mRNA, 예를 들어 적어도 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000 또는 1,000,000 mRNA를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 샘플과 관련된 RNA는 세포의 전사체 또는 세포의 총 RNA를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 샘플 당 적어도 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000 또는 1,000,000개의 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드가 생성된다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 샘플은 적어도 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000, 또는 1,000,000개의 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 샘플은 동일한 대상체로부터 얻어진다. 몇몇 실시형태는 샘플을 용해 완충제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태 샘플을 핵산 마커와 접촉시킴으로써, 핵산 마커를 샘플의 서브세트에 결합시키는 단계; 및 샘플을 세척함으로써, 핵산 마커가 결합되지 않은 샘플로부터 핵산 마커를 제거하는 단계를 추가로 포함하되, 서브세트 내의 샘플에 대해, 샘플과 관련된 RNA에 첨가된 어댑터 분자는 또한 핵산 마커에 첨가되고, 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 표지된 핵산 마커를 이용하여 생성된다. 이들 실시형태에서, 핵산 마커는 분자 표지에 결합된 핵산을 포함할 수 있다. 분자 표지는 항체, 항원 또는 단백질일 수 있다. 분자 표지는 하나 이상의 세포 표면 모이어티에 대한 친화도를 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵산은 RNA이다. 몇몇 실시형태에서, 핵산은 DNA이고, RNAP 프로모터를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 샘플은 제1 핵산 마커 및 제2 핵산 마커와 접촉되되, 제1 핵산 마커는 제1 분자 표지에 결합된 제1 핵산을 포함하고, 제2 핵산 마커는 제2 분자 표지에 결합된 제2 핵산을 포함한다. 제1 핵산과 제2 핵산은 상이한 서열 영역을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 분자 표지와 제2 분자 표지는 상이하다(예를 들어, 상이한 세포 표면 항원에 대해 2개의 상이한 항체). 따라서, 상기 방법은 샘플, 예컨대 단일 세포의 어댑터를 포함하는 핵산 마커에 의해 다중복합 표지하는 단계 및 샘플과 관련된 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 단계를 허용한다.
상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 샘플은 동일한 대상체로부터 얻어진다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 샘플은 적어도 3, 10, 30 또는 100명의 상이한 대상체로부터 얻는다.
또한 본 명세서에서 바코드 어댑터 작제물이 개시된다. 일부 이러한 바코드 어댑터 작제물은 RNAP 프로모터, 보편적인 프라이밍 서열, 바코드 서열 및 결합 부위를 포함한다. RNAP 프로모터는 T7, T3 및 SP6으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 바코드 어댑터 작제물은 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위, 보편적인 프라이밍 서열, 바코드 서열 및 결합 부위를 포함한다. 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위는 Nt.BbvCI, Nt.BspQI, Nt.BsmAI, Nt.BstNBI, Nt.AlwI 및 Nt.BsmAI로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
추가로 본 명세서에서 상기 기재한 바와 같은 바코드 어댑터 작제물을 포함하는 고체 지지체가 개시된다. 몇몇 실시형태에서, 바코드 어댑터 작제물 공유 결합을 통해 고체 지지체에 결합된다. 몇몇 실시형태에서, 바코드 어댑터 작제물의 다중 복제물은 고체 지지체에 결합된다. 예를 들어, 바코드 어댑터 작제물의 적어도 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000 또는 1,000,000개의 복제물이 고체 지지체에 결합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 바코드 어댑터 작제물의 각각의 복제물은 동일한 바코드 서열을 포함한다. 어댑터 작제물의 다중 복제물에 결합된 복수의 고체 지지체를 포함하는 어댑터 주형 라이브러리가 또한 본 명세서에 개시된다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 고체 지지체는 적어도 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000 또는 1,000,000개의 고체 지지체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 고체 지지체 중 적어도 둘은 상이한 바코드 서열 또는 UMI 서열을 지니는 어댑터 작제물을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 고체 지지체의 모든 고체 지지체는 상이한 바코드 서열 또는 상이한 UMI 서열을 지니는 어댑터 작제물을 포함한다.
또한 본 명세서에서 분자 표지에 결합된 핵산을 포함하는 핵산 마커가 개시된다. 몇몇 실시형태에서, 분자 표지는 항체, 항원 또는 단백질이다. 몇몇 실시형태에서, 분자 표지는 하나 이상의 세포 표면 모이어티에 대해 친화도를 가진다. 몇몇 실시형태에서, 핵산은 RNA이다. 몇몇 실시형태에서, 핵산은 DNA이다. DNA는 RNAP 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 복수 중 적어도 하나가 제1 분자 표지(즉, 제1 항체)를 포함하고, 복수 중 적어도 하나가 적어도 하나가 제2 분자 표지(즉, 제2 항체)를 포함하는, 복수의 핵산 마커가 기재된다. 몇몇 실시형태에서, 제1 분자 표지와 제2 분자 표지는 상이하며, 따라서 본 명세서에 기재된 핵산 마커를 이용하여 상이한 세포 표면 모이어티(예를 들어, 상이한 세포 표면 항원)를 다중복합 표지하는데 유용한 조성물을 제공한다.
추가로 본 명세서에 기재된 어댑터 작제물을 포함하는 키트가 개시된다. 상기 키트는 본 명세서에 기재된 어댑터 작제물에 결합된 복수의 고체 지지체를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는 복수의 어댑터 작제물을 포함하는 어댑터 주형 라이브러리를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는 복수의 고체 지지체에 결합된 복수의 어댑터 작제물을 포함하는 어댑터 주형 라이브러리를 포함한다. 상기 키트는 효소 반응에 의해 어댑터 작제물로부터 본 명세서에 기재된 어댑터 분자를 생성하기 위한 효소를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는 본 명세서에 기재된 세포 현탁 완충제를 포함한다.
추가로 본 명세서에서 삼투억제제를 포함하는 세포 현탁 완충제가 개시된다. 몇몇 실시형태에서, 삼투억제제는 베타인 또는 이의 밀접한 구조적 유사체이다. 예를 들어, 삼투억제제는 글리신 베타인일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 삼투억제제는 당 또는 폴리올이다. 예를 들어, 삼투억제제는 트레할로스일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 삼투억제제는 아미노산이다. 예를 들어, 삼투억제제는 프롤린일 수 있다. 세포 현탁 완충제의 몇몇 실시형태에서, 완충제의 삼투압몰농도는 약 250 내지 350mOsm/ℓ이다. 몇몇 실시형태에서, 삼투억제제는 완충제의 삼투압몰농도의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%까지 기여한다. 몇몇 실시형태에서, 완충제는 약 230 내지 330mM 베타인 및 약 10mM NaCl을 포함한다.
또한 본 명세서에서 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법이 개시되되, 폴리뉴클레오타이드는 바코드 서열을 함유한다. 상기 방법은: a) 역유화(inverse emulsion)의 친수성 구획을 생성하는 단계(친수성 구획은 고체 지지체, 바코드 서열을 포함하는 바코드 올리고뉴클레오타이드, 및 포획 모이어티를 통해 고체 지지체의 표면에 결합된 올리고뉴클레오타이드를 함유하되, 결합된 올리고뉴클레오타이드는 바코드 올리고뉴클레오타이드의 3' 서열에 대해 상보성인 3' 서열을 포함함); 및 b) 중합효소 연장 반응을 수행하여 고체 지지체 상에서 결합된 올리고뉴클레오타이드 내로 바코드 서열을 혼합시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 바코드 올리고뉴클레오타이드는 PCR 역방향 프라이머 서열에 대해 동일하거나 또는 상보성인 5' 서열을 추가로 포함한다. 이들 실시형태는 형광단-표지된 역방향 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 고체 지지체는 비드이다. 몇몇 실시형태에서, 포획 모이어티는 스트렙타비딘이다. 몇몇 실시형태에서, 포획 모이어티는 카복실기, 에폭시기 또는 하이드록실기를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 포획 모이어티는티올화된 올리고뉴클레오타이드를 포획하기 위해 금을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 바코드 올리고뉴클레오타이드는 보편적인 프라이밍 서열 및 결합 부위를 추가로 포함한다. 바코드 올리고뉴클레오타이드는 추가로 T7, T3 및 SP6으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNAP 프로모터를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 바코드 올리고뉴클레오타이드는 추가로 Nt.BbvCI, Nt.BspQI, Nt.BsmAI, Nt.BstNBI, Nt.AlwI 및 Nt.BsmAIBsmAI로 이루어진 군으로부터 선택되는 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함할 수 있다. 결합 부위는 하나 이상의 G 뉴클레오타이드일 수 있다.
고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 다늘 방법이 개시되되, 폴리뉴클레오타이드는 바코드 서열을 함유한다. 상기 방법은 a) 고체 지지체, W 서열을 포함하는 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드, 및 포획 모이어티를 통해 고체 지지체의 표면에 결합된 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계(결합된 올리고뉴클레오타이드는 (i) S1x 서열 및 (ii) 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드의 3' 서열에 대해 상보성인 서열을 포함함); b) 중합효소 연장 반응 또는 결찰 반응을 수행하여 W 서열을 결합된 올리고뉴클레오타이드 내로 혼입시키는 단계; c) (i) S2y 서열 및 (ii) 단계 b)로부터 생성된 결합된 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 대해 상보성인 3' 서열을 포함하는 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계; 및 d) 중합효소 연장 반응 또는 결찰 반응을 수행하여 S2y 서열을 결합된 올리고뉴클레오타이드를 혼입시킴으로써, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착시키는 단계를 포함하되, 폴리뉴클레오타이드는 바코드 서열을 함유하고, 바코드 서열은 S1x, W 및 S2y 서열을 포함한다.
본 발명의 몇몇 실시형태에서, 고체 지지체는 비드이다. 몇몇 실시형태에서, 포획 모이어티는 스트렙타비딘이다. 몇몇 실시형태에서, 포획 모이어티는 카복실기, 에폭시기 또는 하이드록실기를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 포획 모이어티는티올화된 올리고뉴클레오타이드를 포획하기 위해 금을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 선택된 바코드 올리고뉴클레오타이드(선택된 바코드 올리고뉴클레오타이드는 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드 또는 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드 중 하나임)는 보편적인 프라이밍 서열 및 결합 부위를 추가로 포함한다. 선택된 바코드 올리고뉴클레오타이드는 T7, T3 및 SP6으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNAP 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 선택된 바코드 올리고뉴클레오타이드는 Nt.BbvCI, Nt.BspQI, Nt.BsmAI, Nt.BstNBI, Nt.AlwI 및 Nt.BsmAI로 이루어진 군으로부터 선택되는 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위를 추가로 포함할 수 있다. 결합 부위는 하나 이상의 G 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 명세서에서 앞서 언급한 방법의 임의의 실시형태에 의해 제조된 고체 지지체가 추가로 개시되되, 고체 지지체는 폴리뉴클레오타이드에 부착되고, 폴리뉴클레오타이드는 바코드 서열을 함유한다. 또한 복수의 이들 고체 지지체를 포함하는 바코드 라이브러리가 개시된다.
추가로, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위한 세포, 바코드 어댑터 주형 및 시약을 캡슐화하기 위한 미세유체 점적 장치가 개시된다. 상기 장치는 (a) 3개의 독립적으로 제어되는 압력 공급원, (b) 3개의 미세유체 경로, (c) 3개의 유동 센서, (d) 2개의 샘플 루프, (e) 미세유체 점적 칩, 및 (f) 샘플 수집 용기를 포함하되, 각각의 압력 공급원은 미세유체 경로 중 하나에 결합되고 이를 통해 유체를 구동시키며, 유동 센서 중 하나는 각각의 압력 공급원 하류의 각각의 미세유체 경로를 따라 배치되고, 제1 미세유체 경로는 제1 샘플 루프를 통과하며, 제2 미세유체 경로는 제2 샘플 루프를 통과하고, 제1 샘플 루프 및 제2 샘플 루프는 열 냉각 유닛과 접촉되며, 제1 미세유체 경로와 제2 미세유체 경로는 제1 접합부에서 합쳐져서 조합 경로를 형성하고, 조합 경로와 제3 미세유체 경로는 제2 접합부에서 합쳐져서 샘플 경로를 형성하며, 제2 접합부는 미세유체 점적 칩 내에서 그리고 제1 접합부의 하류에서 생기고, 샘플 경로는 (a) 내지 (f)가 유동 연결되도록 제2 접합부 하류의 샘플 수집 용기 내로 통과한다.
상기 장치의 몇몇 실시형태에서, 각각의 압력 공급원은 압력 펌프를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 압력 공급원은 주사기 펌프를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 샘플 루프는 미세유체 점적 칩에 대해 수용액의 유동을 측정하도록 구성되되, 수용액은 세포 및 바코드 어댑터 주형을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 샘플 루프는 미세유체 점적 칩에 대해 반응 혼합물의 유동을 측정하도록 구성되되, 반응 혼합물은 세포 용해를 위한 시약 및 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위한 시약을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제3 미세유체 경로는 오일/계면활성제 혼합물을 미세유체 점적 칩에 전달하도록 구성된다. 몇몇 실시형태에서, 열 냉각 유닛은 펠티에 소자를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 열 냉각 유닛은 얼음 보관함을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 접합부는 점적 칩 내에서 생긴다. 몇몇 실시형태에서, 제3 미세유체 경로는 미세유체 점적 칩의 상류에서 2개의 하위경로로 분할되고, 2개의 하위경로는 제2 접합부에서 조합 경로와 합쳐지며, 제2 접합부는 유동-집속 기하구조를 가진다. 몇몇 실시형태에서, 제2 접합부는 t-접합부 기하구조를 가진다. 몇몇 실시형태에서, 제1 미세유체 경로는 세포를 수용하도록 구성되고, 제2 미세유체 경로는 고체 지지체에 결합된 바코드 어댑터 주형을 수용하도록 구성된다.
본 명세서에서 하나 이상의 대상체로부터 얻은 하나 이상의 샘플과 관련된 복수의 cDNA를 포함하는 cDNA 라이브러리를 얻는 단계를 포함하는 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 방법이 개시되되, 각각의 cDNA는 하나 이상의 샘플에서 단일 샘플과 결합되고, 각각의 샘플과 관련된 cDNA는 별도의 용기 또는 구획에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 어댑터 분자는 각각의 샘플과 관련된 cDNA에 첨가되어 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 생성한다. 몇몇 실시형태에서, 어댑터 분자는 보편적인 프라이밍 서열, 바코드, 및 cDNA 결합 부위를 포함하는 어댑터 작제물로부터 생성된다.
일부 양상에서, 어댑터 분자는 등온 반응을 이용하여 생성된다. 일부 양상에서, 어댑터 작제물은 RNA 중합효소(RNAP) 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, RNAP 프로모터는 T7, T3 및 SP6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, 어댑터 작제물은 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위는 Nt.BbvCI, Nt.BspQI, Nt.BsmAI, Nt.BstNBI, Nt.AlwI 및 Nt.BsmAI로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, 어댑터는 RNAP에 의해 생성된 RNA 어댑터이다. 일부 양상에서, 어댑터는 틈내기 엔도뉴클레아제 및 가닥 치환 DNA 중합효소에 의해 생성된 DNA 어댑터이다. 일부 양상에서, 가닥 치환 DNA 중합효소는 클레노브 엑소- 및 Bst 거대 단편 및 그의 공학처리된 변이체, 예컨대 Bst 2.0으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양상에서, 상기 방법은 어댑터 분자의 3' 말단이 라이브러리 내 각각의 cDNA의 3' 말단에 부착되게 하여 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양상에서, 어댑터는 역전사 반응 동안 cDNA의 3' 꼬리에 어댑터를 어닐링함으로써 첨가된다. 일부 양상에서, 각각의 cDNA는 적어도 하나의 C 뉴클레오타이드를 포함하되, C는 각각의 cDNA의 3' 말단에 위치되고, 어댑터 영역은 적어도 하나의 G 뉴클레오타이드를 포함하며, G는 어댑터 영역의 3' 말단에 위치되고, 어댑터 영역은 G와 C 사이의 결합을 통해 각각의 cDNA에 부착된다. 일부 양상에서, 어댑터 분자는 단일 가닥이며, 효소가 어댑터 분자 이중 가닥을 만들게 함으로써 각각의 cDNA 내로 어댑터 분자의 상보성을 혼입시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 어댑터 분자의 상보성은 각각의 cDNA 내로 혼입되어 MMLV H-역전사효소에 의해 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 생성한다.
일부 양상에서, 각각의 샘플은 세포를 포함한다. 일부 양상에서, 세포는 혈액 세포, 면역 세포, 조직 세포 또는 종양 세포이다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 B 세포 또는 T 세포이다. 일부 양상에서, B 세포는 형질아세포, 기억 B 세포 또는 혈장 세포이다.
또한 본 명세서에서 a) 역유화의 친수성 구획을 생성하는 단계로서, 친수성 구획은 그것에 함유된 고체 지지체(고체 지지체는 포획 모이어티를 통해 표면에 결합된 올리고뉴클레오타이드이고, 올리고뉴클레오타이드는 바코드 올리고뉴클레오타이드 상에서 3' 서열에 대해 3' 서열 상동성을 포함함); 결합된 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 상보성인 3' 서열을 포함하는 바코드 올리고뉴클레오타이드, 및 바코드 서열을 포함하는 단계; 및 b) 중합효소 연장 반응을 수행하여 고체 지지체 상에서 결합된 올리고뉴클레오타이드에 대해 바코드의 서열을 첨가하는 단계를 포함하는, 고체 지지체에 바코드를 부착하는 방법이 개시된다.
일부 양상에서, 바코드 올리고뉴클레오타이드는 역방향 PCR 프라이머에 대해 동일 또는 상보성인 5' 서열을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 형광단-표지된 역방향 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양상에서, 고체 지지체는 비드 또는 표면이다. 일부 양상에서, 포획 모이어티는 스트렙타비딘이다. 일부 양상에서, 바코드 올리고뉴클레오타이드는 RNA 중합효소(RNAP) 프로모터 및/또는 엔도뉴클레아제 제한 부위, 보편적인 프라이밍 서열, cDNA 결합 부위를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, RNAP 프로모터는 T7, T3 및 SP6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위는 Nt.BbvCI, Nt.BspQI, Nt.BsmAI, Nt.BstNBI, Nt.AlwI 및 Nt.BsmAI로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, cDNA 결합 부위는 하나 이상의 G 뉴클레오타이드이다.
또한 본 명세서에서 a) 포획 모이어티를 통해 고체 지지체에 결합된 올리고뉴클래오타이드를 지니는 고체 지지체를 제공하는 단계(올리고뉴클레오타이드는 S1x 서열, 및 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드 상의 3' 서열에 대해 상보성인 서열을 포함하고; 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드는 결합된 올리고뉴클레오타이드의 서열에 대해 상보성인 3' 서열, 및 W 서열을 포함함); 및 b) 중합효소 연장 반응 또는 결찰 반응을 수행하여 고체 지지체 상에서 결합된 올리고뉴클레오타이드의 S1x 서열에 W 서열을 첨가하는 단계; c) 단계 b)에서 연장된 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 대해 상보성인 3; 서열을 포함하는 S2y서열을 지니는 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계; d) 중합효소 연장 반응 또는 결찰 반응을 수행하여 고체 지지체 상에서 결합된 올리고뉴클레오타이드의 S1x 및 W 서열에 S2y 서열을 첨가하는 단계를 포함하는 고체 지지체에 바코드를 부착하는 방법이 개시되며, 바코드 서열은 S1x, W 및 S2y 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 고체 지지체는 비드이다. 일부 양상에서, 포획 모이어티는 스트렙타비딘이다. 일부 양상에서, 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드 또는 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드는 RNA 중합효소(RNAP) 프로모터 및/또는 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위, 보편적인 프라이밍 서열, cDNA 결합 부위를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, RNAP 프로모터는 T7, T3 및 SP6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, 엔도뉴클레아제 제한 부위는 Nt.BbvCI, Nt.BspQI, Nt.BsmAI, Nt.BstNBI, Nt.AlwI 및 Nt.BsmAI로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, cDNA 결합 부위는 하나 이상의 G 뉴클레오타이드이다.
또한 상기 개시한 임의의 방법에 의해 생성된 부착된 바코드를 지니는 고체 지지체가 개시된다. 또한 본 명세서에서 부착된 바코드와 함께 복수의 이러한 고체 지지체를 포함하는 비드가 붙은 바코드 라이브러리가 개시된다.
또한 본 명세서에서 보편적인 프라이밍 서열, 바코드, 및 cDNA 결합 부위를 포함하는 바코드 어댑터 작제물이 개시된다. 일부 양상에서, 작제물은 RNAP 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, RNAP 프로모터는 T7, T3 및 SP6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서,작제물은 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위는 Nt.BbvCI, Nt.BspQI, Nt.BsmAI, Nt.BstNBI, Nt.AlwI 및 Nt.BsmAI로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한 본 명세서에서 고체 지지체 및 포획 모이어티를 통해 고체 지지체에 결합된 바코드 어댑터 분자를 포함하는 바코드 어댑터 주형 비드가 개시되되, 바코드 어댑터 분자는 바코드 서열 및 cDNA 결합 부위를 포함한다. 일부 양상에서, cDNA 결합 부위는 하나 이상의 G 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 양상에서, 바코드 서열은 서열 S1x-W-S2y를 포함한다. 또한 본 명세서에서 상기 개시한 바와 같은 복수의 바코드 어댑터 주형을 포함하는 비드가 붙은 바코드 라이브러리가 개시된다.
또한 본 명세서에서 고체 지지체 및 포획 모이어티를 통해 고체 지지체에 결합된 바코드 어댑터 분자를 포함하는 복수의 바코드 어댑터 주형 비드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 라이브러리가 개시되되, 바코드 어댑터 분자는 바코드 서열 및 cDNA 결합 부위를 포함하고, cDNA 영역은 어댑터의 3' 말단에 결합된다.
일부 양상에서, cDNA 결합 부위는 하나 이상의 G 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 양상에서, 바코드 서열은 서열 S1x-W-S2y를 포함한다.
일부 양상에서, cDNA는 B 세포로부터 유래된다. 일부 양상에서, B 세포는 형질아세포, 기억 B 세포 또는 혈장 세포이다. 일부 양상에서, cDNA는 B-세포 유래 가변 면역글로불린 영역이다.
또한 본 명세서에서 도 17 내지 도 19에 나타낸 바와 같은 미세유체 점적 장치가 개시된다.
이들 및 다른 특징, 양상 및 이점은 다음의 설명 및 수반하는 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이다:
본 발명의 몇몇 실시형태에 따르면 도 1은 어댑터 분자, 또는 어댑터 분자를 생성하기 위한 주형 분자의 맵을 도시한 도면. 어댑터 분자의 서열은 RNA 중합효소 프로모터 및/또는 틈내기 엔도뉴클레아제 부위, 다음에 보편적인 프라이밍 서열(어닐링 프라이머에 대한 후속적 PCR 단계에서 사용됨), 이어서, 바코드 서열 및 핵산 결합 서열을 포함할 수 있다.
도 2A 및 도 2B는 본 발명의 몇몇 실시형태에 따라 어댑터 분자를 증폭하거나 또는 생성하는 방법을 도시한 도면. 도 2A에서, RNA 바코드 어댑터는 DNA 주형 상에서 프로모터 서열에 결합하고, 단일-가닥 바코드 어댑터 RNA를 합성하는 RNAP, 예컨대 T7에 의해 선형 증폭 반응에서 합성된다. 도 2B에서, 틈내기 엔도뉴클레아제, 예컨대 Nt.BbvCI(NEB)는 DNA 주형의 센스 가닥 상에서 틈을 도입하기 위해 사용된다. 이어서, DNA 바코드 어댑터는 틈을 연장하고 단일-가닥 바코드 어댑터를 치환하는 가닥-치환 효소, 예컨대 클레노브 엑소-에 의해 증폭 반응에서 합성된다.
도 3은 본 발명의 몇몇 실시형태에 따른 제1 가닥 cDNA 내로 바코드 서열의 혼입을 도시한 도면. 여기서 RNA 바코드 어댑터는 cDNA의 바코딩을 입증하기 위해 합성된다. DNA 바코드 어댑터(도 2B에서 합성)를 또한 사용할 수 있다. RNAP는 그의 프로모터의 프라이밍을 제거하고, RNA 바코드 어댑터를 합성한다(도 3, 상부 좌측). 동일한 반응에서, 역전사가 생기고, 제1 가닥 cDNA가 생긴다(상부 우측). MMLV-기반 H-역전사효소는 3' 꼬리 활성을 가지며, 제1 가닥 cDNA의 3' 말단에 몇몇 dC를 첨가한다. 꼬리 dC(하부)를 지니는 바코드 어댑터 염기쌍과 역전사효소는 주형으로서 바코드 어댑터를 이용하는 전사를 계속하여, 바코드 서열을 제1 가닥 cDNA 내로 혼입한다. 따라서 반응에서 모든 mRNA가 바코딩된다.
도 4는 본 발명의 실시형태에서 RNA 바코드 어댑터가 DNA 바코드 어댑터보다 더 적은 배경을 가진다는 것을 도시한 도면. 도 3의 바코딩 반응에서, 올리고(dT)와 바코드 어댑터는 둘 다 존재하며, 올리고 둘 다 역전사 반응을 프라이밍할 수 있다. 반응이 올리고(dT)에 의해 프라이밍될 때(도 4, 상부), 반응은 정상으로 진행된다. RT 반응이 DNA 바코드 어댑터에 의해 미스프라이밍될 때(중간), PCR 동안 정방향 프라이머는 센스가닥과 안티센스 가닥을 프라이밍 제거하고, 목적으로 하지 않는 산물의 증폭을 생성할 수 있다. RT 반응이 RNA 바코드 어댑터에 의해 프라이밍될 때(하부), 자라나는 가닥은 PCR1에서 프루프-리딩 DNA 중합효소를 이용할 때 주형으로으로서 RNA 뉴클레오타이드를 이용할 수 없고, 그 결과 미스프라이밍된 cDNA는 센스 가닥과 안티 센스 가닥 둘 다에 대해 바코드 어댑터 서열을 함유하지 않을 것이다. 따라서, 목적으로 하지 않는 산물은 기하급수적으로 증폭되어서는 안 되며, 상당히 더 적은 배경을 초래한다.
본 발명의 몇몇 실시형태에 따르면 도 5A 내지 도 5C는 바코드 어댑터를 생성하고 역전사를 수행하기 위한 반응 용적의 분리를 도시하는 도면. 바코드 어댑터 분자는 복수의 제1 반응 용적, 예컨대 점적에서 효소적으로 생성될 수 있으며, 이는 도 5A에서 수직선으로 표시한다. 각각의 제1 반응 용적은 수용액 중에 바코드 어댑터 분자를 함유할 수 있으며, 모두 동일한 바코드 서열을 지닌다. 별도로, RNA 분자는 복수의 제2 반응 용적에서 역전사될 수 있으며, 이는 도 5B에서 수평선으로 표시한다. 각각의 제2 반응 용적은 모두 동일한 샘플로부터 유래된 RNA 분자를 함유할 수 있다. 이어서, 제1 반응 용적 및 제2 반응 용적은 도 5C에서 교차선으로 표시하는 바와 같이, 예컨대 점적을 합함으로써 조합될 수 있다. 하나의 바코드 서열이 각각의 샘플에 대응하는 반응 용적 내로 도입되도록 도 5A 및 도 5B의 반응 생성물을 함께 혼합한다. 바코드 서열을 제1 가닥 cDNA 또는 PCR 산물 내로 혼입할 수 있다.
도 6A 내지 도 6D는 본 발명의 다양한 실시형태에서 바코드 어댑터 분자를 생성하기 위한 바코드 어댑터 주형의 증폭을 도시한 도면. 도 6A은 비드와 같은 고체 표면에 부착된 바코드 어댑터 주형을 나타낸다. 도 6B는 도 6A에서 바코드 어댑터 주형의 증폭으로부터 생성된 수용액 중의 바코드 어댑터 분자를 나타낸다. 도 6C는 단일 바코드 어댑터 주형 분자를 나타낸다. 분자는 수용액 중에 있으며, 용기 내부에 보유된다. 도 6D는 단일 주형 분자의 증폭으로부터 생성된 다중 바코드 어댑터 분자를 지니는도 6C의 용기를 나타낸다.
도 7A 내지 도 7D는 주형으로부터의 바코드 어댑터 분자의 생성을 나타내되, 주형은 고체 지지체에 부착되는 것을 도시한 도면. 생성 시, 바코드 어댑터 분자는 수용액 중에 있다. 도 7A 및 도 7B는 고체 표면에 부착된 바코드 어댑터 주형을 나타낸다. 도 7C는 도 7A에서 바코드 어댑터 주형으로부터 효소적으로 증폭된 바코드 어댑터 분자를 나타낸다. 도 7D는 고체 표면으로부터 도 7B에서의 바코드 어댑터 주형의 화학적 또는 효소적 절단 시 용액 내로 방출된 바코드 어댑터 분자를 나타낸다.
도 8은 DNA 바코드 어댑터를 이용하는 cDNA의 제1 가닥 내로 바코드 서열의 혼입을 도시한 도면. ( 상부) 3' 폴리-T 트랙을 포함하는 바코드 어댑터는 DNA 중합효소를 이용하여 바코드 어댑터로부터 생성된다. 바코드 어댑터 분자는 수용액 중에 있다. ( 하부) 바코드 어댑터는 mRNA의 폴리-A 꼬리에 대해 어닐링하고, 역전사를 위한 프라이머로서 작용한ㄷ. 바코드 서열은 cDNA의 제1 가닥의 5' 말단 내로 혼입된다.
도 9는 DNA 바코드 어댑터를 이용하는 cDNA의 제1 가닥 내로 바코드 서열의 혼입을 도시한 도면. ( 상부) 3' 무작위 또는 반-무작위 서열 트랙을 포함하는 바코드 어댑터는 DNA 중합효소를 이용하여 바코드 어댑터 주형으로부터 생성된다. 바코드 어댑터 분자는 수용액 중에 있다. ( 하부) 바코드 어댑터는, 3' 서열 트랙에 대해 적어도 부분적으로 상보성인 RNA의 영역에 대해 어닐링함으로써 역전사를 위한 프라이머로서 작용한다. 바코드 서열은 cDNA의 제1 가닥의 5' 말단 내로 혼입된다.
도 10은 개개 피펫팅 단계를 제거하는 바코딩 작업 흐름의 개략도를 도시한 도면. 간략하게, 바코팅 반응은 유중수 점적 중에서 일어나며, 여기서 세포 및 비드 함유 바코드 어댑터는 점적 생성 장치에 의해 분포된다. 바코드 어댑터는 비드와 같은 고체 표면으로부터 효소적으로 증폭 또는 방출되며, 바코드는 세포로부터 모든 전사체에 첨가된다.
도 11은 RT- PCR에 대해 정방향 프라이머로서 작용하는 DNA 바코드 어댑터를 이용하는 애플리콘 내로의 바코드 서열의 혼입을 도시한 도면. 바코드 어댑터는 DNA 중합효소(상부 좌측)를 이용하여 DNA 주형으로부터 효소적으로 생성된다. 바코드 어댑터 분자는 수용액 중에 있다. 별도의 반응 용적에서, 또는 동일한 반응 용적에서, cDNA의 제1 가닥은 mRNA 주형, 역전사효소, 폴리-T 트랙을 함유하는 프라이머, 및 주형-전환 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 합성된다(상부 우측). 주형-전환 올리고뉴클레오타이드는 바코드 어댑터에서 서열 영역에 상보성인 서열 영역을 함유한다. 이어서, 바코드 서열은 cDNA의 PCR 증폭 동안 앰플리콘 내로 혼입된다(하부). 바코드 어댑터는 PCR에 대한 정방향 프라이머로서 작용한다.
도 12는 RT- PCR에 대해 역방향 프라이머로서 작용하는 DNA 바코드 어댑터를 이용하는 앰플리콘 내로의 바코드 서열의 혼입을 도시한 도면. 바코드 어댑터는 DNA 중합효소(상부 좌측)를 이용하여 DNA 주형으로부터 효소적으로 생성된다. 바코드 어댑터 분자는 수용액 중에 있다. 별도의 반응 용적에서, 또는 동일한 반응 용적에서, cDNA의 제1 가닥은 mRNA 주형, 역전사효소, 폴리-T 트랙을 함유하는 프라이머, 및 주형-전환 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 합성된다(상부 우측). 프라이머는 바코드 어댑터에서 3' 서열 영역에 대해 상보성인 5' 서열 영역을 함유한다. 이어서, 바코드 서열은 cDNA의 PCR 증폭 동안 앰플리콘 내로 혼입된다(하부). 바코드 어댑터는 PCR에 대해 역방향 프라미어로서 작용한다.
도 13은 RT- PCR에 대해 역방향 프라이머로서 작용하는 DNA 바코드 어댑터를 이용하는 앰플리콘 내로의 바코드 서열의 혼입을 도시한 도면. 바코드 어댑터는 DNA 중합효소(상부 좌측)를 이용하여 DNA 주형으로부터 효소적으로 생성된다. 바코드 어댑터 분자는 수용액 중에 있다. 별도의 반응 용적에서, 또는 동일한 반응 용적에서, cDNA의 제1 가닥은 mRNA 주형, 역전사효소, 3' 무작위 서열을 함유하는 프라이머, 및 주형-전환 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 합성된다(상부 우측). 프라이머는 무작위 서열 트랙을 통해 mRNA에 어닐링될 수 있고, 또한 바코드 어댑터에서 3' 서열 영역에 대해 상보성인 5' 서열 영역을 함유한다. 이어서, 바코드 서열은 cDNA의 PCR 증폭 동안 앰플리콘 내로 혼입된다(하부). 바코드 어댑터는 PCR에 대해 역방향 프라미어로서 작용한다.
도 14A 내지 도 14C는 본 발명의 실시형태에 따른 핵산 마커를 이용하여 선택된 표현형에 대한 세포 집단의 정보를 얻는 방법을 도시한 도면. 세포로부터의 바코딩 RNA에 추가로, 비세포 공급원으로부터의 RNA를 포함하는 임의의 RNA를 바코딩할 수 있다. 비-세포 RNA는 임의의 수단에 의해, 예컨대 핵산 마커로 세포를 표지함으로써 반응 용적 내로 도입될 수 있다. 이 마커는 분자 표지에 결합된 핵산, 예컨대 항체(도 14A), 항원(도 14B) 또는 pMHC(도 14C)를 포함할 수 있다. 핵산 마커는 세포의 표현형 및 분자 표지에 대한 그들의 친화도에 따라서 집단 내 일부 또는 모든 세포에 결합할 수 있다. 이어서, 집단 내 모든 세포는 용해될 수 있고, 각각의 세포 내 mRNA는 바코딩될 수 있다. 핵산 마커에 결합하는 세포에 대해, 결합된 핵산도 마찬가지로 바코딩될 수 있다. 이 핵산은 RNAP 프로모터, 예컨대 T7, T3 또는 SP6 프로모터를 지니는 RNA, 또는 dsDNA 주형일 수 있다. 이어서, 서열분석은 비-내인성 RNA를 특이적 세포와 결합함으로써 분자 표지에 결합된 세포를 검출할 수 있다. 상이한 분자 표지는 상이한 핵산 서열에 결합되어 다수의 세포 표현형의 동정을 가능하게 할 수 있다.
도 15는 본 발명의 몇몇 실시형태에 따른 일 반응에서 바코드 어댑터 주형 비드의 합성을 나타낸다. ( 좌) 비드는 올리고뉴클레오타이드에 결합된다. 결합은 스트렙타비딘 코팅 비드 상에 바이오티닐화된 올리고를 결합함으로써 행해질 수 있고, 또한 당업계에 공지된 다른 수단을 이용하여 결합될 수 있다. ( 우) 결합된 비드, 정방향 및 역방향 프라이머, 및 바코드 서열 및 정방향 및 역방향 프라이머에 대해 상보성인 서열을 함유하는 바코드 올리고가 모두 반응 용기 내에 존재하며, 바코드 올리고는 바람직하게는 단일 복제물에만 존재한다. 이어서, PCR은 바코드 서열을 증폭시키기 위해 수행되고, 비드-결합 올리고뉴클레오타이드 내로 혼입되어 바코드 어댑터 주형 비드를 형성한다.
도 16은 본 발명의 몇몇 실시형태에 따른 다수 단계에서 바코드 어댑터 주형 비드의 합성을 도시한 도면. (상부) 비드는 고유 S1 서열을 함유하는 올리고뉴클레오타이드(의 다수 복제물)에 결합된다. 다수의, 별도의 결합 반응이 수행되며, 각각의 결합 반응은 상이한 고유 S1 서열을 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 이용한다. 이어서, 상이한 고유 S1 서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드에 각각 결합된 비드는 함께 풀링되어 S1x 서열을 갖는 비드의 라이브러리를 형성한다. ( 중간) 이어서, 이들 비드는 연장 반응에서 사용된다. 각각의 반응에서, 고유 W 서열을 함유하는 올리고뉴클레오타이드는 비드에 결합된 S1x-함유 올리고뉴클레오타이드와 상보적으로 염기쌍을 형성하고, DNA 중합효소를 이용하는 연장 반응을 수행한다. 모든 연장 반응으로부터의 비드를 풀링하고, S1x 서열 각각과 고유 W 서열의 조합을 함유하는 비드의 라이브러리를 형성한다. (하부) 이전의 단계로부터의 이중 가닥 DNA를 변성시키고, 안티센스 가닥은 비드를 세척한다. 추가적인, 별도의 연장 반응을 앞에서와 같은 비드 상에서 수행하지만, 비드에 결합된 S1x 및 W 함유 올리고뉴클레오타이드와 상보적으로 염기쌍을 만드는 올리고뉴클레오타이드는 각각의 별도의 반응에서 상이한 고유 S2 서열을 함유한다. 모든 연장 반응으로부터의 비드를 풀링하고 나서, 바코드 어댑터 주형을 함유하는 비드의 라이브러리를 얻고, S1x, W와 S2y 서열의 조합은 바코드 서열을 형성한다. 따라서 매우 다수의 고유 바코드 서열은 이런 조합적 접근에서 얻어질 수 있다. 더 나아가, 다수의 독특한 W 서열은 각각 S1x 및 S2y 서열과 조합되어, 일반식 S1x - Wz - S2y.의 바코드를 수득할 수 있다.
도 17은 본 발명의 실시형태에 따른 점적 장치를 나타낸다. 3개의 돌로마이트 P-펌프는 유동 센서를 구비한다. 제1 P-펌프를 T-접합부를 혼입하는 미세유체 관을 통해 2-시약 점적 칩에 직접 연결하여 선을 2개의 주입구로 분할한다. 이는 오일 주입선이다. 장치가 작동하는 동안 다른 2개의 P-펌프는 샘플을 냉각한 채로 유지하기 위해 펠티에 소자의 그루브 내에 맞는 FEP 샘플 루프에 대한 유동관을 통해 연결되고, 각각의 이들 루프는 2-시약 점적 칩에 연결된다. 각각의 샘플 루프는 그의 전단에서 4원 밸프를 혼입하고 따라서 샘플은 주사기에 의해 루프 내로 장입될 수 있다. 제1 샘플 루프는 세포 및 바코딩된 비드 현탁액으로 채워지는 한편, 제2 루프는 RT/용해 혼합물로 채워진다. 샘플 루프는 세포 및 비드가 이동하는 것이 어려울 수 있는 임의의 오르막 부분을 피하기 위해 수평으로 그리고 상부로 점적칩과 같은 높이로 배향될 수 있다.
도 18은 도 17에 나타낸 점적 장치의 배치의 상세한 설명을 제공하는 도면. IDEX H&S 부품 번호에 의해 제공된 부품: 1.0.A) 1528 (110㎜); 1.0.B) P-732; 1.0.C) P-232 / P-248; 1.0.D) 1688 (300㎜); 1.0.E) M-645; 1.0.F) P-630; 1.0.H) P-632; 1.0.J) P-702; 1.0.K) 1529 (50㎜); 1.0.L ) V-101D; 1.0.N) P-732; 1.0.O) P-624; 1.0.T) 1531 (900㎜); 1.2.A) P-630; 1.2.B) 1516 (500㎜); 1.2.C) P-702; 1.2.D) 1529(150㎜); 1.2.E) P-702; 1.2.G) 1560(150㎜); 1.3.A) 1528 (135㎜); 1.5.A) 1516(150㎜); 1.5.B) 1529 (300㎜); 1.7.A) 61005; 1.7.B) 65020; 2.0.A) 1477 (1254㎜); 2.0.B) 1527 (1254㎜); 2.0.C) 1520 (120㎜); 2.0.D) 1520 (600㎜); 2.0.E) 1520 (200㎜); 2.0.F) 1520 (200 mm). 배출관(칩으로부터 샘플 수집관까지)은 1562의 180 mm이다.
도 19는 본 명세서에 기재된 점적 장치의 대안의 실시형태를 도시한 도면. 샘플 루프는 얼음 보관함과 접촉된다.
도 20은 다단계 접근을 이용하여 만들어진 바코드 어댑터 주형 비드로부터 증폭된 RNA 바코드 어댑터를 도시한 도면. 바코드 어댑터 주형 비드는 시험관내 전사 반응에서 사용되었다. 밴드는 S1-올리고 + W-올리고-a + S2-올리고-a 및 S1-올리고 + w-올리고-b + S2-올리고-b를 각각 이용하여 생성된 비드로부터 제공된다.
도 21은 다양한 완충제 중에서 수행된 바코딩 반응을 도시한 도면. 1, 2 및 3은 이하에 기재하는 각각 0.5x MMLV, 1x 써포폴(Thermopol) DF 및 0.5x TAE 완충제인 3종의 반응 완충제를 지칭한다. K, L 및 G는 카파, 람다 및 감마 면역글로불린 쇄를 지칭한다. 사용한 상이한 반응 완충제 중에서 모든 쇄를 증폭시켰다.
도 22는 바코딩 반응이 RNA 바코드를 이용하여 더 잘 작용한다는 것을 도시한 도면. 1, 2 및 3은 RNA 바코드 어댑터를 이용하는 1x MMLV 및 0.5x MMLV 조건, 및 DNA 바코드 어댑터를 이용하는 1x MMLV인 3가지 반응 조건을 지칭한다. K, L 및 G는 카파, 람다 및 감마 면역글로불린 쇄를 지칭한다. DNA 어댑터를 이용하는 반응에서의 밴드는 높은 배경 때문에 모호하였다.
도 23은 바코드 어댑터 주형을 지니는 점적 반응 용기에서 바코딩 단일 B 세포로부터의 증폭된 산물을 도시한 도면. 카파 및 람다 경쇄("K/L") 및 뮤 중쇄("M")에 대응하는 밴드를 명학하게 볼 수 있다.
도 24는 유중수 에멀전 중에서 바코딩한 비드와 공동 캡슐화한 후 경쇄 ( 카파 /람다) 및 중쇄 (감마) 표적의 RT/ PCR 증폭을 도시한 도면. 각각의 샘플은 짝지어진 레인 - 카파/람다 경쇄에 대해 하나(좌) 및 감마 중쇄에 대해 하나(우)에서의 실행이다. 　에멀전 샘플은 세포 + 비드 공동 캡슐화한 실험 샘플(세포+비드)뿐만 아니라 하나는 바코드 주형 어댑터 비드를 수성 바코드 어댑터 주형(세포+수성 BC)로 대체하고 하나는 세포를 모든 세포로부터 얻은 정제된 인간 PBMC RNA 주형으로 대체한 것(RNA+비드)을 제외하고 동일하게 준비한 두 대조군 샘플을 포함하였다. 　에멀전 장치(각각 R- 및 R+1)에 유입되지 않은 벌크 양성 및 음성 대조군을 또한 포함하였다. 　산물 밴드는 실험 샘플 및 모든 양성 대조군에 대해 가시적이었고, 음성 대조군에는 없었다.
도 25는 다중 바코드 어댑터 주형 유형을 이용하는 바코드 어댑터 주형 비드의 제조방법을 도시한 도면. 바코드-함유 올리고를 성공적으로 생성하였다(예상 길이 82bp)(상부 좌측). 단색 바코드 어댑터 주형 비드를 성공적으로 얻었다(우측). 상부 그래프는 AF647- 비드 상에서 처음 게이팅되고, 하부 그래프는 FAM-Cy3- 비드 상에서 처음 게이팅되어서, 그래프 둘 다에서 도시한 게이트는 단색 비드만을 나타내었다. 비드를 바코딩 RNA에 대해 성공적으로 사용하였다(하부 좌측). 여기서, T 세포 수용체 알파 및 베타 쇄는 성공적으로 바코딩되고 증폭되었다. 앞서 생성한 비드를 양성 대조군으로서 사용하였고(레인 1 내지 2), 단색 바코드 어댑터 주형 비드(레인 4 내지 7)를 음성 대조군(레인 3)과 비교하였다. DNA를 2% 아가로스 겔 상에서 분석하였고, 100bp 사다리를 좌측 레인에 로딩하였다.
도 26은 다양한 크기의 점적에서 바코드 어댑터 주형 비드 및 세포를 캡슐화하는 것에 의한 T 세포 수용체 알파쇄의 효율적인 바코딩을 도시한 도면. 바코딩한 후에 바코딩한 RNA를 증폭시키고, 2% 아가로스 겔 상에서 분석하였다.
도 27은 TCR 알파 및 베타 쇄의 라이브러리 PCR 증폭 산물을 도시한 도면. 산물을 2% 아가로스 겔 상에서 시각화하였다. 100bp 사다리를 우측 레인에서 로딩하였다.
도 28은 IFNγ , CD8 및 CD4 유전자의 라이브러리 PCR 증폭 산물을 도시한 도면. 산물을 2% 아가로스 겔 상에서 시각화하였다. 100bp 사다리를 우측 레인에서 로딩하였다.
도 29는 전사체학 라이브러리의 라이브러리 PCR 증폭 산물을 도시한 도면. 산물을 2% 아가로스 겔 상에서 시각화하였다. 100bp 사다리를 우측 레인에서 로딩하였다.
정의
본 명세서에서 사용되는 용어 폴리뉴클레오타이드 내로 서열을 "혼입하는"은 포스포다이에스터 결합에 의해 폴리뉴클레오타이드의 나머지와, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드의 3' 또는 5' 말단에서, 일련의 뉴클레오타이드를 공유 결합하되, 뉴클레오타이드가 서열에 의해 미리 정해진 순서로 연결되는 것을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드가 서열 또는 이의 상보체를 함유한다면, 서열은 폴리뉴클레오타이드 내로 "혼입"되거나, 또는 동등하게 폴리뉴클레오타이드는 서열을 "혼입한다". 폴리뉴클레오타이드 내로 서열의 혼입은 효소적으로(예를 들어, 결찰 또는 중합에 의해) 또는 화학적 합성을 이용하여(예를 들어, 포스포르아미다이트 화학에 의해) 일어날 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "증폭하다" 및 "증폭"은 서열 또는 이의 상보체를 또한 함유하는 더 많은 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위해 전체적으로 또는 부분적으로 폴리뉴클레오타이드 서열을 효소적으로 복제하는 것을 지칭한다. 복제되는 서열은 주형 서열로서 지칭된다. 증폭의 예는 RNA 중합효소에 의한 DNA-주형 RNA 합성, 역전사효소에 의한 RNA-주형 제1 가닥 cDNA 합성, 및 열안정성 DNA 중합효소를 이용하는 DNA-주형 PCR 증폭을 포함한다. 증폭은 모든 프라이머-연장 반응을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "등온"은 일정한 온도 또는 온도 범위에서 수행되는 효소 반응과 같은 반응을 지칭한다.
용어 "관련된"은 본 명세서에서 샘플과 해당 샘플로부터 비롯되거나 또는 유래된 DNA 분자, RNA 분자 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 사이의 관계를 지칭하기 위해 사용된다. 폴리뉴클레오타이드는 그것이 내인성 폴리뉴클레오타이드라면, 즉, 샘플이 선택된 시간에 샘플에서 생기거나, 또는 내인성 폴리뉴클레오타이드로부터 유래된다면 샘플과 관련된다. 예를 들어, 세포에 대해 내인성인 mRNA는 해당 세포와 관련된다. 이들 mRNA의 역전사로부터 초래된 cDNA 및 cDNA의 PCR 증폭으로부터 초래된 DNA 앰플리콘은 mRNA의 서열을 함유하며, 또한 세포와 관련된다. 샘플과 관련된 폴리뉴클레오타이드는 샘플 내에 위치되거나 또는 샘플 내에서 합성될 필요가 없으며, 샘플이 파괴된 후(예를 들어, 세포가 용해된 후) 조차 샘플과 관련된 것으로 고려된다. 분자 바코딩 또는 다른 기법은 혼합물 내 폴리뉴클레오타이드가 특정 샘플과 관련되는지를 결정하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "반응 용적"(또는 동등하게는 "용기" 또는 "구획")은 액체의 용적, 예를 들어 수용액이 보유되고 액체 또는 주위의 매질 다른 이러한 용적으로부터 분리된(예를 들어, 단리된) 채로 남아있는 공간에 대해 사용된다. 반응 용적과 그의 주의 사이의 분리는 반응 용적을 둘러싼 고체 장벽으로부터 또는 상 분리로부터 초래될 수 있다. 예를 들어, 소수성 담체 유체에서 현탁된 수성 미세유체 점적은 반응 용적을 구성할 수 있는데, 물이 담체 유체에서 비혼화성이기 때문이다. 따라서, 담체 유체 내 각각의 다른 점적으로부터 분리된 2개의 점적은 분리된 채로 남아있고, 하나의 점적 중에 용해된 핵산 또는 다른 친수성 종은 점적을 배출할 수 없거나 또는 다른 점적에 대해 수송될 수 없다. 반응 용적은 또한, 예를 들어, 플라스크, 비커, 원심분리관 및 다중 웰 플레이트 내의 웰에 의해 정할 수 있다.
샘플과 관련된 RNA에 바코드 어댑터를 "첨가하는 것"은 RNA가 바코딩 반응에 참여할 수 있도록 반응 용적 내로 어댑터 분자를 도입하는 것을 수반한다. 일단 첨가되면, 바코드 어댑터는, 예를 들어 RNA와 혼성화함으로써 하나 이상의 RNA와 직접적으로 반응할 수 있거나, 또는 RNA 분자가 주형으로서 작용하는 중합 반응 또는 일련의 반응(예를 들어, 역전사 또는 RT-PCR)에 참여할 수 있다.
일부 양상에서, 조성물은 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오타이드(들)"는 핵산, 예컨대 DNA 분자 및 RNA 분자 및 이들의 유사체(예를 들어, 뉴클레오타이드 유사체를 이용하거나 또는 핵산 화학을 이용하여 생성된 DNA 또는 RNA)를 지칭한다. 원한다면, 폴리뉴클레오타이드는 합성으로, 예를 들어, 당업계에 인식된 핵산 핵산 화학을 이용하거나 또는 효소적으로 예를 들어, 중합효소를 이용하여 생성될 수 있으며, 원한다면, 변형될 수 있다. 전형적인 변형은 메틸화, 바이오티닐화 및 키다 당업계에 공지된 변형을 포함한다. 추가로, 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중가닥일 수 있고, 원한다면, 검출가능한 모이어티에 연결된다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, DNA 및 RNA를 포함하는 혼성 분자를 포함할 수 있다.
"G," "C," "A," "T" 및 "U"는 각각 일반적으로 염기로서 구아닌, 사이토신, 아데닌, 티미딘 및 유라실을 각각 함유하는 뉴클레오타이드에 대한 가닥이다. 그러나, 용어 "리보뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드"는 또한 변형된 뉴클레오타이드 또는 대용의 대체 모이어티를 지칭할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 당업자는 구아닌, 사이토신, 아데닌 및 유라실이 이러한 대체 모이어티를 보유하는 올리고뉴클레오타이드의 염기 짯직기 특성을 실질적으로 변경하는 일 없이 다른 모이어티에 의해 대체될 수 있다는 것을 잘 인식한다. 예를 들어, 제한 없이, 염기로서 이노신을 포함하는 뉴클레오타이드는 아데닌, 사이토신 또는 유라실을 함유하는 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성할 수 있다. 이런 이유로, 유라실, 구아닌 또는 아데닌을 함유하는 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열에서, 예를 들어, 이노신을 함유하는 뉴클레오타이드로 대체될 수 있다. 다른 예에서, 올리고뉴클레오타이드에서 어디에서나 아데닌 및 사이토신은 각각 구아닌 및 유라실로 대체되어 표적 mRNA와 G-U 워블 염기쌍을 형성할 수 있다. 이러한 대체 모이어티를 함유하는 서열은 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 적합하다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "상보성"은, 제1 뉴클레오타이드 서열을 제2 뉴클레오타이드 서열에 관련하여 설명하기 위해 사용될 때, 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 특정 조건 하에서 이중가닥 구조를 형성하고 혼성화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 능력을 지칭한다. 이러한 조건은, 예를 들어, 엄격한 조건일 수 있으며, 엄격한 조건은 하기를 포함할 수 있다: 12 내지 16시간 동안 400mM NaCl, 40mM PIPES pH 6.4, 1mM EDTA, 50℃ 또는 70℃ 다음에 세척. 유기체 내부에서 접할 수 있는 다른 조건, 예컨대 생리적으로 적절한 조건을 사용할 수 있다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오타이드의 궁극의 적용에 따라 두 서열의 상보성의 시험을 위한 가장 적절한 조건의 설정을 결정할 수 있을 것이다.
상보적 서열은 뉴클레오타이드 서열 중 하나 또는 둘 다의 길이에 걸쳐 또는 길이의 일부에 걸쳐 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 영역의 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 영역에 대한 염기 짝짓기를 포함한다. 이러한 서열은 본 명세서에서 서로에 대해 "상보성"으로서 지칭될 수 있다. 그러나, 제1 서열이 본 명세서에서 제2 서열에 대해 "실질적으로 상보성"으로서 지칭되는 경우, 두 서열은 상보성일 수 있거나, 또는 그들은 염기가 짝지어진 영역 내에서 하나 이상, 그러나 일반적으로는 약 5, 4, 3 또는 2개 이하의 미스매칭된 염기쌍을 포함할 수 있다. 미스매칭된 염기쌍을 지니는 두 서열에 대해, 서열은 두 뉴클레오타이드 서열이 염기짝짓기을 통해 서로에 결합하는 한 "실질적으로 상보성"으로 고려될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "상보적" 서열은 또한 그들이 혼성화하는 능력에 대한 상기 실시형태가 충족되는 한, 비-왓슨 크릭 염기쌍 및/또는 비천연 및 변형된 뉴클레오타이드로부터 형성된 염기쌍을 포함하거나 또는 이들로부터 완전히 형성될 수 있다. 이러한 비-왓슨 크릭 염기쌍은 G:U 워블 또는 후그스틴 염기쌍을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
2 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 용어 "동일성" 백분율은 이하에 기재하는 서열 비교 알고리즘(예를 들어, BLASTP 및 BLASTN 또는 당업자가 이용가능한 다른 알고리즘) 중 하나를 이용하거나 또는 육안검사에 의해 측정된 바와 같은 최대 대응도에 대해 비교하고 정렬할 때, 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 구체화된 백분율을 갖는 2 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 적용에 따라서, "동일성" 백분율은 비교 중인 서열의 영역에 걸쳐, 예를 들어, 기능성 도메인에 걸쳐 존재하거나, 또는 대안적으로, 비교될 두 서열의 전장에 걸쳐 존재할 수 있다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 시험 및 기준 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요하다면 하위 서열 좌표가 설계되며, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 설계된다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 설계된 프로그램 매개변수에 기반하여 기준 서열에 대한 시험 서열(들)의 서열 동일성 백분율을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행에 의해(위스콘신주 메디슨 575 사이언스 드라이브에 소재한 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 육안 검사에 의해(일반적으로 문헌[Ausubel et al., 이하 참조] 참조) 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 적합한 알고리즘의 일 예는 BLAST 알고리즘인데, 이는 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information) 웹 사이트를 통해 공개적으로 입수가능하다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 민감성 및 정렬 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열에 대해)은 디폴트로서 단어 길이(W) 11, 예상치(E) 또는 10, M=5, N=-4 및 가닥 둘 다의 비교를 사용한다.
동일한 서열은 뉴클레오타이드 서열 중 하나 또는 둘 다의 전체 길이에 걸쳐 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 대한 100% 동일성을 포함한다. 이러한 서열은 본 명세서에서 서로에 대해 "완전히 동일한"으로서 지칭될 수 있다. 그러나, 일부 양상에서, 제1 서열이 본 명세서의 제2 서열과 "실질적으로 동일한' 것으로 지칭되는 경우, 두 서열은 완전히 상보성일 수 있거나, 또는 그들은 정렬 시 하나 이상, 그러나 일반적으로는 약 5, 4, 3 또는 2개 이하의 미스매칭된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 제1 서열이 본 명세서의 제2 서열에 대해 "실질적으로 동일한" 것으로 지칭되는 경우, 두 서열은 완전히 상보성일 수 있거나, 또는 그들은 서로 적어도 약 50, 60, 70, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일할 수 있다. 본 명세서에 기재된 두 뉴클레오타이드 서열의 동일성 백분율을 결정하기 위해, 상기 기재한 BLASTN 디폴트 설정을 사용할 수 있다.
제1 서열이 본 명세서의 제2 서열의 동일성에 대해 "별도"로서 지칭되는 경우, 두 서열은 정렬 시 적어도 하나 이상의 미스매칭된 뉴클레오타이드를 가진다. 일부 양상에서, 별도의 서열은 정렬 시 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 미스매칭된 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 일부 양상에서, 별도의 서열은 서로 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 미만으로 동일할 수 있다. 일부 양상에서, 제1 서열이 본 명세서의 제2 서열에 대해 "별도"로서 지칭되는 경우, 두 서열은 실질적으로 또는 완전히 동일한 서열을 가질 수 있지만, 대신에 서열 내에서 상이한 변형 패턴에 기반하여 서로 다를 수 있다. 이러한 변형은 일반적으로 공지되어 있다(예를 들어, 메틸화).
일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리에 존재할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 라이브러리는 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 복수의 폴리뉴클레오타이드에서 각각의 폴리뉴클레오타이드는 단일 샘플로부터 유래될 수 있다. 일부 양상에서, 단일 샘플은 단일 세포, 예컨대 B 세포를 포함할 수 있다.
뉴클레오타이드 서열을 기재하기 위해 본 명세서에서 전통적인 표기법이 사용된다: 단일-가닥 뉴클레오타이드 서열의 좌선 말단은 5'-말단이고, 이중-가닥 뉴클레오타이드 서열의 좌선 방향은 5'-방향으로서 지칭된다. 초기 RNA 전사체에 대한 뉴클레오타이드의 5'에서 3'으로의 첨가 방향은 전사 방향으로서 지칭된다. mRNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥은 "암호 가닥"으로서 지칭되며; 해당 DNA로부터 전사된 mRNA와 동일한 서열을 갖고 RNA 전사체의 5'-말단에 대해 5'에 위치된 DNA 가닥 상의 서열은 "상류의 서열"로서 지칭되며; RNA와 동일한 서열을 갖고 암화 RNA 전사체의 3' 말단에 대해 3'에 있는 DNA 가닥 상의 서열은 "하류의 서열"로서 지칭된다.
용어 "전령 RNA" 또는 "mRNA"는 인트론이 없고 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 RNA를 지칭한다.
용어 "cDNA"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태 중 하나로 mRNA에 대해 상보성이거나 또는 동일한 DNA를 지칭한다.
용어 "앰플리콘"은 핵산 증폭 반응, 예를 들어, RT-PCR의 증폭된 산물을 지칭한다.
용어 "혼성화하다"는 상보적 핵산과의 서열 특이적 비공유 결합 상호작용을 지칭한다. 혼성화는 핵산 서열의 모두 또는 일부를 지칭할 수 있다. 당업자는 핵산 듀플렉스, 또는 혼성체의 안정성은 Tm에 의해 결정될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 혼성화 조건에 관한 추가적인 안내는 이하에서 찾을 수 있다: 문헌[Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6] 및 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol. 3]에서의 현재의 프로토콜.
본 명세서에서 사용되는 "영역"은 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열의 인접한 부분을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 영역의 예는 동정 영역, 샘플 동정 영역, 플레이트 동정 영역, 어댑터 영역 등을 포함한다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 2 미만, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 영역은 결합될 수 있다. 일부 양상에서, 영역은 작동가능하게 결합될 수 있다. 일부 양상에서, 영역은 물리적으로 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "가변 영역"은 최종의 발현된 유전자 산물을 생성하기 위한 유전자 재조합 또는 유전자 전환 사건, 예컨대 상류의 VH 유전자 세그먼트와 재배열된 VDJ 유전자 사이의 V(D)J 재조합 및 상동성 재조합으로부터 생기는 가변 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 예는 면역글로불린 유전자 및 세포 수용체 유전자이지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 관심 대상의 T 세포 또는 B 세포, 예컨대 활성화된 T 세포 또는 활성화된 B 세포로부터 단리된 면역글로불린 또는 T 세포 수용체 서열의 V, J 및/또는 D 영역을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "B 세포 가변 면역글로불린 영역"은 B 세포로부터 단리된 가변 면역글로불린 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 가변 면역글로불린 서열은 관심 대상의 B 세포, 예컨대 기억 B 세포, 활성화된 B 세포 또는 형질아세포로부터 단리된 면역글로불린 서열의 V, J 및/또는 D 영역을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "바코드" 또는 "바코드 서열"은, 예를 들어, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열의 이후의 동정을 위해 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열에 결합될 수 있는 임의의 고유한 서열 표지를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는, "바코드 세트"는 샘플로부터의 뉴클레오타이드 서열에 결합될 수 있는 임의의 고유한 서열 세트를 지칭하며, 여기서 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열의 이후의 동정을 위해 세트 내 하나의 바코드 서열에 결합된다.
용어 "바코드 어댑터", "바코딩된 어댑터" 및 "바코드 어댑터 분자"는 고유 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭하기 위해서 본 명세서에서 상호호환적으로 사용된다.
용어 "바코드 어댑터 주형", "어댑터 주형", "주형 분자", "바코드 어댑터 작제물" 및 "어댑터 작제물"은 단일 가닥 바코드 어댑터 분자를 증폭 및 생성하기 위해 주형으로서 사용될 수 있는 바코드 서열을 포함하는 핵산 분자를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "바코드 어댑터 주형 비드"는 하나 이상의 바코드 어댑터 주형에 결합된 비드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "바코딩" 또는 "바코딩 반응"은 바코드 서열 또는 바코드 서열의 상보체를 핵산과 연결하는 반응을 지칭한다. 바코드 어댑터는 반드시 핵산과 공유 연결될 필요는 없지만, 바코드 서열 정보 그 자체는 핵산과 연결되거나 또는 핵산 내로 혼입된다. "바코딩 핵산", "바코딩 세포", "세포로부터의 바코딩 핵산", "반응 용기로부터의 바코딩 핵산" 및 "바코딩 반응 용기"는 상호호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 "동정 영역"은, 예를 들어, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열의 이후의 동정을 위해 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열에 결합될 수 있는 뉴클레오타이드 서열 표지(예를 들어, 고유 바코드 서열)를 지칭한다. 일부 양상에서, 바코드 서열은 샘플 동정 영역으로서 사용된다. 일부 양상에서, 바코드 세트는 샘플 동정 영역으로서 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "면역글로불린 영역"은 항체의 쇄 중 하나 또는 둘 다(중쇄 및 경쇄)로부터의 뉴클레오타이드 서열의 인접한 부분을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "어댑터 영역" 또는 "어댑터 분자"는 제1 뉴클레오타이드 서열을 제2 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 링커를 지칭한다. 일부 양상에서, 어댑터 영역은 링커로서 작용하는 뉴클레오타이드 서열의 인접한 부분을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 어댑터 영역 또는 어댑터 분자는 결합 부위, 예컨대 cDNA 결합 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 결합 부위는 서열 GGG를 가질 수 있고, GGG와 CCC 사이의 결합을 통해 제1 서열을 제2 서열에 결합한다. 일 부 양상에서, 어댑터 영역 또는 어댑터 분자는 RNA 중합효소 프로모터, 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위, 보편적인 프라이밍 서열, 바코드 및 cDNA 결합 부위와 같은 구성요소를 포함할 수 있다.
용어 "샘플"은 대상체(예를 들어, 포유류 대상체, 동물 대상체, 인간 대상체 또는 비인간 동물 대상체)로부터 취한 RNA, DNA, 단일 세포 또는 다중 세포 또는 세포의 단편 또는 체액의 분취액을 포함할 수 있다. 샘플은 원심분리, 정맥 천자, 채혈, 배설물, 면봉, 사정, 마사지, 생검, 바늘 흡입법, 세척 샘플, 스크레이핑, 수술 절개, 레이저 포획 현미해부, 구배 분리 또는 당업계에 공지된 개입 또는 다른 수단을 포함하는 현재 공지된 또는 이후에 발견되는 임의의 수단에 의해 당업자에 의해 선택될 수 있다. 샘플은 또한 관심 대상의 샘플과 관련된 것으로 공지된 하나 이상의 마커를 이용하여 당업자에 의해 선택될 수 있다. 샘플은 또한 세포선별 및 FACS와 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 선택될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 실시형태는 핵산 바코딩된 어댑터가 수성상 중에 있지만 그들이 생성된 주형은 고체 표면(예컨대 비드에 부착됨)에 부착되거나 또는 용액 중에서 유리될 수 있도록 각각의 반응 용기에서 고유 핵산 바코딩된 어댑터를 생성하는 방법을 제공한다. 핵산 바코딩된 어댑터는 고유 바코드 서열을 포함하는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열이고, 변형(예를 들어, 바이오티닐화되거나 또는 C18 스페이서를 함유함)을 가질 수도 있거나 갖지 않을 수도 있거나 또는 변형된 폴리뉴클레오타이드(예컨대 2'-O-메틸 RNA 염기)를 함유한다.
또한 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 생성되니 조성물이 제공된다. 따라서, 본 발명은 RNA 및 DNA 어댑터 및 그들의 생성을 위한 작제물의 조성물을 제공한다. 또한 특히 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리, RNA 바코드 어댑터가 부하된 에멀전 점적 라이브러리, 세포와 함께 바코드 라이브러리를 함유하는 에멀전, 바코딩된 cDNA 라이브러리, 및 미세유체 점적 생성 장치가 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 바코딩된 어댑터 주형은 다음의 서열: 5'-T7 프로모터 - 보편적인 프라이밍 서열 - 바코드 서열 - 결합 서열 -3'을 포함하는 이중 가닥 DNA (dsDNA) 주형이다. T7 프로모터 서열은 T7 RNA 중합효소에 의해 주형으로부터 RNA 바코딩된 어댑터를 합성하게 한다. 보편적인 프라이밍 서열은 하류에서 사용된 PCR 프라이머에 대한 상보성을 위해 사용된다. 결합 서열은 1개 이상의 구아닌 염기(G)로 이루어지고, 제1 가닥 cDNA의 3' 말단에 대해 바코딩된 어댑터의 상보적 염기 짝짓기를 허용한다(도 1).
T3 및 SP6 RNA 중합효소에 의해 각각 RNA 바코딩된 어댑터의 합성을 허용하는 다른 프로모터 서열, 예컨대 이하로 제한되는 것은 아니지만 T3 및 SP6 프로모터 서열이 사용될 수 있다. 사례들의 큰 분획에서 전장 또는 거의 전장의 바코딩된 어댑터가 합성된다면, 특이적 프로모터 서열을 갖지 않는 다른 RNA 중합효소가 사용될 수 있다(도 2A). 사례들의 큰 분획에서 전장 또는 거의 전장의 바코딩된 어댑터가 합성된다면, Bst 거대 단편 및 클레노브 3'→5'엑소-와 같은 가닥-치환 활성을 지니는 DNA 중합효소를 전형적으로 이용하여 등온 증폭이 또한 사용될 수 있다. 특이적 프라이머 또는 틈내기 엔도뉴클레아제 서열은 사용한 등온 증폭 방법에 따라서 프로모터 서열 대신 사용될 수 있다(도 2B). 이렇게 생성된 바코딩된 어댑터는 RNA 뉴클레오타이드 대신 DNA 뉴클레오타이드를 포함할 것이다. RNA 또는 DNA 바코딩된 어댑터는 둘 다 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드에 부착될 수 있다.
제1 가닥 cDNA의 3' 말단에 바코딩된 어댑터를 부착하는 것은 앞서 기재되었다(PCT/US2012/000221). 간략하게, H- MMLV 역전사효소는 3' dC 꼬리 활성을 가지며, 제1 가닥 cDNA에 대해 비주형 dC를 첨가한다. 적어도 1 G에서 끝나는 바코딩된 어댑터가 또한 존재한다면, 어댑터는 제1 가닥 cDNA의 3' dC와 염기 짝짓기를 할 수 있고, 역전사효소는 주형 전환을 겪고, 주형으로서 바코딩된 어댑터를 이용하여 전사를 계속한다. 따라서 역전사효소는 포스포다이에스터 결합을 통해 제1 가닥 cDNA의 3' 말단에 바코드 서열을 공유적으로 첨가한다(도 3).
몇몇 실시형태에서, 바코딩된 어댑터는 T7 RNA 중합효소를 이용하여 5' T7 프로모터를 함유하는 이중 가닥 DNA(dsDNA)로부터 선형 증폭된다. 몇몇 실시형태에서, 바코딩된 어댑터는 역전사 반응과 동일한 반응에서 선형 증폭된다. dsDNA 주형으로부터 바코딩된 어댑터를 증폭시키는 것은 적어도 다음의 이점을 제공한다:
1. 바코딩된 어댑터 주형은 비드에 부착될 수 있고(비드 당 고유 바코드) 동일한 저장 용기에 저장될 수 있다
2. 고유 바코딩된 어댑터의 다수의 복제물은 개개 피펫팅 단계의 사용 없이 반응 용기 내로 전달될 수 있다
3. 바코딩된 어댑터가 증폭되어 각각의 비드에 부착될 수 있는 제한된 양의 폴리뉴클레오타이드를 극복한다
4. 증폭된 바코드는 수성상에 있으며, 고체상 역학보다 훨씬 더 빠른 액체상을 이용한다
또한 DNA 바코딩된 어댑터보다는 RNA 바코딩된 어댑터를 이용하는 것과 관련된 이점이 있다:
1. RNA 바코딩된 어댑터는 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드에 바코드 서열을 부착하는 주형 전환 반응에서 더 효율적일 수 있는데 역전사효소는 주형으로서 DNA보다는 RNA를 전형적으로 이용하고 주형 전환은 레트로바이러스의 복제에서 RNA 주형으로 전환을 위해 생체내에서 역전사 효소에 의해 사용되기 때문이다.
2. 어댑터로서 전체적으로 RNA 전사체를 이용하는 것은 하류의 PCR 반응에서 프루프리딩 DNA 중합효소를 이용할 때 더 적은 배경을 야기한다. 바코드 어댑터가 미스프라이밍하고 역전사를 개시할 때 배경이 생겨서, 바코드 어댑터 서열이 제1 가닥 cDNA의 5'과 3' 말단 둘 다에 첨가되게 한다. 이들은 바코드 어댑터에 대해 상보성인 단지 하나의 프라이머에 의해 PCR에서 증폭될 수 있다. 그러나, 프루프-리딩 DNA 중합효소가 PCR 동안 사용된다면, 그들은 RNA 프라이머를 전사하지 않아서(도 4), 바코드 어댑터 미스프라이밍으로부터 배경을 제거할 것이다.
수반된 매우 다수의 바코딩 반응에 기인하여, 넥스트겐(NextGen) 서열분석은 서로 동일한 반응 용기로부터 핵산을 생물정보학적으로 결합하는 바코딩된 핵산을 서열분석하기에 가장 적합하다. 추가적인 바코드는 샘플의 다른 세트와 별개인 샘플의 세트와 관련될 수 있고, 고유 바코드 서열을 지니는 PCR을 이용하여 관련될 수 있다. 이들 추가적인 바코드는 또한 플레이트-ID로서 지칭된다. 플레이트-ID는 동일한 서열분석 실행에서 상이한 세트의 샘플 간을 구별하는 것, 또는 생물정보학적 추적 및 상이한 세트의 샘플 간의 임의의 잠재적 오염을 제거하는 것과 같은 이점을 부여한다.
PCR 및 넥스트겐(NextGen) 서열분석 오류는 회피할 수 없기 때문에, 본 명세서에서 기재된 바코드는 서열 공간과 떨어진 적정한 거리(예를 들어, 해밍(Hamming) 또는 편집 거리)가 되도록 설계될 수 있고 , 따라서, 임의의 두 바코드의 서열은 적어도 몇몇 뉴클레오타이드에 의해 서로 다를 것이다. 따라서, 대다수의 바코드 서열분석 판독은 정확하게 부여될 수 있고, 부여되지 않은 그리고 잘못 부여된 바코드는 적은 비율이다.
몇몇 실시형태에서, 사전 결정된 바코드 서열은 최소 해밍 또는 편집 거리로 떨어져서 설계된다. 몇몇 실시형태에서, 바코드는 무작위 뉴클레오타이드, 예컨대 N)15를 포함하는데, 이는 415, 또는 대략 십억개의 고유 바코드 서열의 총 가능한 공간을 초래한다. 바코딩될 샘플의 수가 이 총 공간보다 훨씬 더 적다면(예를 들어 백만, 또는 0.1%의 총 바코드 공간), 본 발명자들은 대다수의 바코드가 정확하게 부여되도록 바코드가 서로로부터 충분한 거리를 가져야 한다는 것을 예상한다.
잘못 부여된 비율이 충분히 낮다면, 잘못 부여된 서열분석 판독은 검출되고, 단순히 폐기될 수 있는데, 잘못 부여된 바코드 서열에 연결된 핵산은 공통 서열과 상이하기 때문이다. 본 발명자들은 바코드 서열로서 정확하게 부여된 판독으로부터 어셈블될 바코드 서열에 관련된 각각의 유전자의 공동 서열(예를 들어, 감마 중쇄, TCR 알파 쇄)이 충분한 거리 간격을 갖도록 설계되었다는 것을 예상한다.
반응 용기 내 샘플은 고유 바코드 또는 고유 바코드 세트 중 하나로 바코딩될 수 있다. 고유 바코드 세트는, 예를 들어 반응 용기 당 2 이상의 바코드 어댑터 주형 비드를 전달함으로써 사용될 수 있고, 샘플의 각각의 핵산은 고유 바코드 세트에서 바코드 중 하나로 바코딩된다. 이어서, 핵산은 고유 바코드 세트의 사용에 의해 샘플에 관련된다.
샘플에 대해 사용한 바코드 세트를 구별하는 한 방법은 넥스트겐 서열분석으로부터의 판독을 시험하는 것에 의한다. 각각의 바코드 서열은 고유 바코드 세트에서 재사용되기 때문에 상이한 샘플로부터의 어셈블된 콘틱(contig)과 관련되는 것으로 예상된다. 그러나 동일한 샘플로부터의 콘틱은 동일한 것으로 예상된다. 예를 들어, 동일한 면역글로불린 감마 중쇄 콘틱은 바코드 서열 a, b 및 c를 이용하는 것으로 관찰될 수 있다. 그리고 바코드 서열 a, b 및 d는 다른 면역글로불린 감마 중쇄 콘틱과 관련되는 것으로 관찰될 수 있다. 이로부터, 본 발명자들은, 이어서, a, b 및 c가 바코드 세트1, 및 a, b 및 d 바코드 세트 2를 포함한다는 결론을 내릴 수 있다.
몇몇 실시형태에서, N 고유 바코드 서열의 바코드 어댑터 주형 비드의 라이브러리는 대다수의 샘플이 고유 바코드 또는 고유 바코드 세트 중 하나로 바코딩되도록 바코드 n 샘플에 대해 충분히 다양하다. 바코드 어댑터 주형 비드의 수가 N을 크게 초과한다면, 치환을 지니는 샘플링은 근사치를 낼 수 있고, 고유 바코드인 U로 바코딩된 샘플의 수는 이항분포에 따르며 하기와 같이 주어진다:
Figure pct00001
식 중, k = 1이고, p = 1/N이다.
고유 바코드로 바코딩되지 않은(그리고 따라서 서로 관련된 2 이상의 샘플을 갖는) 샘플의 분획은 하기와 같이 주어진다
Figure pct00002
N, n과 고유 바코드로 바코딩되지 않은 샘플의 분획 사이의 관계를 표 1에 제공한다.
Figure pct00003
알 수 있는 바와 같이, N = 10n이라면, 90% 초과의 샘플은 고유 바코드로 바코딩될 것이다.
세트에서 x 바코드를 지니는 고유 바코드 세트, 즉, U 세트 로 바코딩된 샘플의 수는 또한 이항분포에 따르며,
Figure pct00004
고유 바코드 조합을 지니는 바코드 라이브러리로서 생각될 수 있으며(N은 조합이 본질적으로 반복 없도록 충분히 큰 것으로 추정됨), nx 바코드는 바코드 n개 샘플에 대해 사용되고, 하기와 같이 주어진다:
Figure pct00005
여기서 k = 1이고,
Figure pct00006
임.
고유 바코드로 바코딩되지 않은(따라서 서로 관련된 2 이상의 샘플을 가짐) 샘플의 분획은 하기와 같이 주어진다.
Figure pct00007
N, n, x와 고유 바코드로 바코딩되지 않은 샘플 분획 사이의 관계를 표 2 및 표 3에 제공한다.
Figure pct00008
Figure pct00009
알 수 있는 바와 같이, 고유 바코드 대신 고유 바코드 세트를 이용할 때, 대다수의 샘플이 고유 바코드 세트를 이용하여 동정될 수 있도록, 바코드 어댑터 라이브러리에서 훨씬 소수의 고유 바코드가 유사한 수의 샘플을 바코딩하는데 필요하다.
I. 방법
A. 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드의 생성
일부 양상에서, 본 발명은 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 생성 방법을 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 바코딩된 핵산, 예를 들어 바코드를 함유하는 cDNA 또는 DNA 앰플리콘일 수 있되, 통상적인 바코드 또는 바코드 세트는 폴리뉴클레오타이드의 그룹이 동일한 샘플로부터 유래된다는 것을 표시한다. 상기 방법에 따르면, 하나 이상의 샘플과 관련된 복수의 RNA를 이하에 기재하는 바와 같이 얻는다. 각각의 샘플과 관련된 RNA는 별도의 반응 용적에서 존재한다. 이어서, 어댑터 분자는 RNA로부터 유래된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 내로 바코드 서열을 혼입하기 위해 각각의 샘플과 관련된 RNA에 첨가된다.
바코딩 반응 역학을 최대화하기 위해, 바코드 어댑터는 RNA가 첨가되기 전에 또는 첨가되는 것과 동시에 용액 중에서 바람직하게 유리된다. 바코드 어댑터를 첨가하는 것은 피펫팅에 의해, 하나의 반응 용적을 다른 것에 쏟음으로써, 또는 2 이상의 반응 용적을 합함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 바코드 어댑터는 하나의 반응 용적에서 생성 및/또는 캡슐화될 수 있고, 이는 이어서, 하나의 샘플과 관련된 RNA를 함유하는 다른 반응 용적과 조합될 수 있다(도 5A 내지 도 5C). 몇몇 실시형태에서, 샘플로부터의 RNA에 첨가된 바코드 어댑터는 RNA가 존재하는 반응 용적에서 인시추로 생성된다.
몇몇 실시형태에서, 바코드 어댑터는 바코드 어댑터 주형으로부터 효소적으로 생성된다. 바코드 어댑터 주형은 바코드 어댑터의 생성 및 후속적인 핵산의 바코딩을 용이하게 하기 위해 바코드 서열뿐만 아니라 다른 서열 영역을 함유하는 이중 가닥 DNA 분자일 수 있다(도 1). 바코드 어댑터 주형은 표준 분자 클로닝 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 바코드 어댑터 주형은 RNA 중합효소에 대한 프로모터(RNAP), 예컨대 T7, T3 또는 SP6 프로모터를 포함한다. 이어서, RNA 바코드 어댑터는 주형 분자를 적절한 RNAP와 접촉시키고, 시험관내 전사가 일어나게 함으로써 생성될 수 있다(도 2A). 몇몇 실시형태에서, 바코드 어댑터 주형은 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위, 예컨대 Nt.BbvCI, Nt.BspQI, Nt.BsmAI, Nt.BstNBI, Nt.AlwI 또는 Nt.BsmAI 부위를 포함한다. DNA 바코드 어댑터는 주형을 제한 부위에 특이적인 틈내기 엔도뉴클레아제와 접촉시키고, 이어서, 주형을 가닥-치환 DNA 중합효소에 노출시킴으로써 이러한 주형으로부터 생성될 수 있다(도 2B). 적합한 가닥-치환 DNA 중합효소의 예는 클레노브 엑소- 단편, Bst 거대 단편, 및 이들의 공학 처리된 변이체를 포함한다. 일반적으로, 바코드 어댑터는 주형을 하나 이상의 효소와 접촉시킴으로써 바코드 어댑터 주형으로부터 생성된다. 몇몇 실시형태에서, 효소 반응은 등온 반응이다.
바코드 어댑터 주형은 바코드 어댑터를 생성하기 위해 사용할 때, 또는 그것이 고체 지지체에 결합될 수 있을 때, 용액 중에서 유리될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물의 실시형태에서 사용될 수 있는 고체 지지체의 예는 비드, 크로마토그래피 수지, 멀티웰 플레이트, 마이크로원심분리관 또는 고체 표면을 갖는 다른 물체를 포함한다. 바코드 어댑터 주형은 임의의 목적으로 하는 메커니즘 또는 포획 화학, 예를 들어 바이오틴-아비딘, 바이오틴-스트렙타비딘, 또는 금-티올 상호작용을 이용하여 고체 지지체에 결합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 바코드 어댑터 주형이 부착된 임의의 고체 지지체는 수용액과 접촉되고, 주형으로부터 생성된 바코드 어댑터 분자는 그들이 생성됨에 따라 이 용액 내로 방출된다(도 6A, 도 6B, 도 7A 내지 도 7D). 수용액은 바코드 어댑터 분자가 첨가될 샘플과 관련된 RNA 분자와 동일한 반응 용적 내에 있을 수 있다. 즉, 바코드 어댑터 분자는 바코딩 반응에 대해 인시추로 생성될 수 있다. 대안적으로, 바코드 어댑터 주형에 대해 고체 지지체를 접촉시키는 수용액은 표적 RNA와 상이한 반응 용적 중에 보유될 수 있고, 주형으로부터 생성된 바코드 어댑터는 두 반응 용적을 조합할 때 이들 RNA에 첨가될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 바코드 어댑터는 고체 지지체로부터 바코드 어댑터 주형을 절단함으로써 생성된다(도 7B 및 도 7D). 주형 분자는 적절한 효소에 노출 시 주형 분자의 적절한 효소(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)에 노출 시 주형 분자의 절단을 용이하게 하는 엔도뉴클레아제 제한 부위를 함유한다. 이러한 절단 시 용액 내로 방출된 핵산 분자는 바코드 어댑터로서 작용하고 바코딩 반응에 직접 참여할 수 있거나, 또는 어댑터 분자를 생성하기 위한 추가적인 효소 반응(예를 들어, 시험관내 전사)을 실시할 수 있다.
바코드 어댑터 분자가 생성되는 방법에도 불구하고, 이들 분자의 라이브러리는 다수의 샘플로부터의 바코드 핵산에 대해 제조될 수 있다. 각각의 반응 용적이, 예를 들어 평균적으로 하나의 어댑터 분자를 함유하도록, 어댑터 분자는 상이한 반응 용적으로 분리될 수 있다. 대안적으로, 각각의 반응 용적은 어댑터 분자의 다수의 복제물을 함유할 수 있되, 각각의 복제물은 동일한 바코드 서열을 함유한다. 반응 용적은 미세유체 점적일 수 있거나 또는 원심분리관 또는 다른 용기 내에 동봉될 수 있다.
바코드 어댑터 분자는 바코드 서열에 추가로, 이하의 "조성물" 하에 기재하는 바와 같은 보편적인 프라이밍 서열 또는 보편적인 프라이밍 영역 및 결합 부위를 포함할 수 있다. 어댑터 분자는 또한 고유 분자 식별자(UMI) 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, UMI 서열은 무작위화된 뉴클레오타이드를 함유하고, 독립적으로 바코드 서열의 바코드 어댑터(또는 어댑터로부터 생성된 바코드 어댑터 주형) 내로 혼입된다. 따라서, 동일한 바코드 서열을 함유하는 바코드 어댑터 분자의 세트는 상이한 UMI 서열을 함유할 수 있다. 동일한 바코드 서열을 함유하지만 상이한 UMI 서열을 함유하는 바코드 어댑터 분자의 세트가 하나의 샘플과 관련된 RNA에 첨가될 경우의 실시형태에서, 모든 RNA 서열은 바코딩 동안 상이한 UMI 서열에 연결될 수 있다. UMI 서열을 지니는 바코드 어댑터 주형 비드를 제조하는 방법은 이하의 실시예 12 및 13에 개시되되, 각각의 비드 상의 주형 분자는 동일한 바코드 서열 및 상이한 UMI 서열의 라이브러리를 함유한다.
바코드 어댑터는 RNA 또는 DNA 분자, 또는 RNA-DNA 혼성체일 수 있다. 예를 들어, 어댑터는 통상적인 올리고뉴클레오타이드 가닥에서 DNA 뉴클레오타이드에 공유적으로 연결된 RNA 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 바코드 어댑터는 또한 단일-가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥이라면, 바코드 어댑터는 하나 이상의 평활 말단 또는 단일 가닥 돌출부를 지니는 말단을 가질 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 바코드 어댑터는 단일-가닥 DNA 분자이고, 역전사를 위한 프라이머로서 작용한다. 바코드 어댑터는 DNA 중합효소(DNAP)를 이용하여 생성될 수 있다. 여기서, 바코드 어댑터의 결합 부위는 RNA 결합 부위(예를 들어, mRNA 결합 부위)이며, 하나 이상의 RNA 내 서열 영역에 상보성인 서열 영역을 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 결합 부위는 바코드 어댑터가 첨가된 샘플 내 모든 RNA에 대해 공통인 서열 영역에 대해 상보적이다. 예를 들어, 결합 부위는 진핵생물 mRNA의 폴리-A 꼬리에 상보성인 폴리-T 트랙일 수 있다(도 8). 대안적으로 또는 추가로, 결합 부위는 무작위 서열 트랙을 포함할 수 있다(도 9). 샘플과 관련된 RNA에 대한 바코드 어댑터의 첨가 시, 역전사가 일어날 수 있고, 바코드 서열이 cDNA의 제1 가닥 내로 혼입되도록 cDNA의 제1 가닥이 합성될 수 있다. 역전사가 적절한 조건, 예를 들어 적절한 완충제 및 역전사효소 효소의 존재, 및 RNA에 대한 바코드 어댑터의 어닐링 및 효소 활성에 적절한 온도를 필요로 한다는 것이 인식될 것이다. 또한 DNA 프라이머 및 RNA 주형을 수반하는 역전사는, 프라이머의 3' 말단이 주형에 대해 상보성이고, 주형에 직접 어닐링할 수 있을 때 가장 효율적이라는 것이 인식될 것이다. 따라서, 어댑터 분자의 3' 말단에서 일어나도록 바코드 어댑터가 설계될 수 있다.
바코드 어댑터가 역전사에서 제1 가닥 cDNA에 대한 프라이머로서 사용될 때, 그리고 역전사를 수반하는 본 발명의 방법의 다른 실시형태(이하에 기재)에서, 역전사 반응은 바코드 어댑터가 생기는 경우와 동일한 반응 용적에서 생길 수 있다. 따라서, 바코드 어댑터는 샘플 또는 샘플과 관련된 RNA에 첨가될 수 있고, 동시에 바코드 어댑터가 생성된다. 예를 들어, 미세유체 점적은 바코드 어댑터 주형이 결합된 비드 및 세포를 함유할 수 있다(도 10). 하나 이상의 효소, 예컨대 틈내기 엔도뉴클레아제, 가닥-치환 DNA 중합효소 또는 RNA 중합효소가 또한 점적 내에 존재한다면, 바코드 어댑터 분자가 생성될 수 있다. 이어서, 용해 시약이 세포로부터 RNA를 방출시키기 위해 점적 내에 존재한다면, 그리고 역전사효소, 프라이머 및 다른 적절한 시약이 존재한다면, 역전사가 일어날 수 있다. 바코드 어댑터를 생성하고, 용해 및 역전사를 용이하게 하기 위한 효소 및 시약은 모두 한번에, 예를 들어 효소 및 시약을 함유하는 점적을 비드 및 세포를 함유하는 점적과 합함으로써 점적에 첨가될 수 있거나, 또는 단계들에 첨가될 수 있다.
본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 각각의 샘플과 관련된 RNA는 역전사되지만, 바코드 어댑터는 제1 가닥 cDNA 합성을 프라이밍하지 않는다. 대신에, 폴리-T 트랙, 무작위 서열, 또는 다른 RNA 결합 부위를 함유하는 표준 DNA 프라이머가 사용된다. 이들 실시형태에서, 제1 가닥 cDNA 합성이 일어나는 동일한 구획 또는 반응 용적에서 바코드 어댑터가 생성될 수 있다. 이 경우에, 약 8.0 내지 8.8의 pH에서 트리스, 칼륨 이온, 염소 이온, 황산 이온, 암모늄 이온, 아세트산 이온 및/또는 마그네슘 이온을 지니는 반응 용적 중의 완충제를 포함하는 것이 유리할 수 있다. 대안적으로, 바코드 어댑터가 생성될 수 있고, 제1 가닥 cDNA 합성은 상이한 구획에서 일어날 수 있으며, 이 경우에 구획은 원한다면 제1 가닥 cDNA 합성 전에 또는 후에 조합될 수 있다. 구획은 또한 바코드 어댑터가 생성되기 전에 또는 후에 조합될 수 있다. 효소 반응을 수행하고 구획을 조합하기 위한 상이한 가능성은 반응 조건을 최적화하기 위한 유연성을 제공한다. 바코드 어댑터가 샘플과 관련된 RNA에 첨가되는 방법에도 불구하고, 그러나, 바코드 어댑터는 제1 가닥 cDNA 합성 동안 또는 직후에 효소 바코딩 반응에 참여할 수 있다.
상기 기재한 바와 같이, 본 발명의 방법은 주형 RNA의 5' 말단에 도달 시 인접한 cDNA 가닥의 말단에 하나 이상의 비-주형 뉴클레오타이드(예컨대, C)를 첨가하는 역전사효소(예를 들어 MMLV H-역전사효소)를 사용할 수 있다. 이들 뉴클레오타이드는 RNA/DNA 이중가닥의 하나의 말단에서 3' DNA 돌출부를 형성한다. 제2 RNA 분자가, 비-주형 뉴클레오타이드에 대해 상보성이고, 비주형 뉴클레오타이드에 결합하는 서열 영역, 예를 들어 그의 3' 말단에서 폴리-G 트랙을 함유한다면, 역전사효소는 이제 주형으로서 제2 RNA 분자를 이용하여 주형을 전환하고 cDNA의 연장을 계속할 수 있다. 이러한 제2 RNA 분자는 본 명세서에서 언급되며, 당업계에서 주형-전환 올리고뉴클레오타이드로서 공지되어 있다.
본 방법의 실시형태에서, 바코드 어댑터는 역전사를 위한 주형-전환 올리고뉴클레오타이드로서 작용한다(도 3). 따라서, 바코드 서열은 주형 전환 후에 cDNA의 제1 가닥 내로 혼입되고, cDNA의 제1 가닥의 증폭(예를 들어, PCR에 의함)으로부터 초래된 DNA 분자 내에 존재한다. 이들 실시형태에서, 주형 전환 활성을 갖는 임의의 역전사 효소가 사용될 수 있다. 바코드 어댑터의 결합 부위는 cDNA 결합 부위이고, 바람직하게는 어댑터 분자의 3' 말단에서 일어난다. 결합 부위는 G-트랙(하나 이상의 G 뉴클레오타이드를 포함함), 또는 역전사효소에 의해 생성된 3' 돌출부의 서열에 대해 적어도 부분적으로 상보성인 임의의 다른 서열을 포함할 수 있다. 돌출부 서열, 및 그에 따라 바코드 어댑터의 결합 부위에 대해 적절한 서열은 상기 방법에서 사용되는 역전사효소의 선택에 의존할 수 있다는 것이 인식될 것이다.
다른 실시형태에서, 각각의 샘플과 관련된 RNA는 역전사되지만, 바코드 서열은 cDNA의 제1 가닥 내로 전혀 혼입되지 않는다. 즉, 바코드 어댑터는 제1 가닥 cDNA 합성을 위한 프라이머로서 또는 가닥-전환 올리고뉴클레오타이드로서 작용하지 않는다. 오히려, 바코드 어댑터는 cDNA의 제1 가닥 또는 그의 구획의 PCR 증폭을 위한 프라이머로서 작용한다. 이들 실시형태에서, 역방향 프라이머가 제1 가닥 cDNA 합성에 대한 프라이머의 적어도 일부와 동일한 서열을 갖는 경우 cDNA는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 증폭된다. 바코드 어댑터는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머 중 하나일 수 있고, 단일-가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드이다. 바코드 어댑터가 정방향 프라이머일 때, 가닥-전환 후 cDNA의 연장으로부터 초래되는 제1 가닥 cDNA(또는 그의 구획)의 부분에 대해 어닐링할 수 있다(도 11). 대안적으로, 바코드 어댑터는 샘플로부터 RNA 상에서 주형이 된 제1 가닥 cDNA의 부분에 대해 어닐링할 수 있다. 따라서, 주형 전환, 및 반용 용적에 대한 주형-전환 올리고뉴클레오타이드의 첨가는 본 발명의 이들 실시형태를 수행하기 위해 일어날 필요가 없다. 바코드 어댑터가 역방향 프라이머일 때, 무작위 서열을 포함하는 프라이머를 포함하는 제1 가닥 cDNA 합성에 대한 임의의 프라이머와의 컨쥬게이션에서 사용될 수 있다(도 12 및 도 13).
본 발명의 방법은 임의의 목적으로 하는 샘플을 이용하여 실행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 샘플은 세포를 포함하고, 예를 들어 단일 세포일 수 있다. 세포는 반응 용적, 예컨대 미세유체 점적에 동봉될 수 있고, 원한다면 RNA 분자를 반응 용적 내로 방출하도록 용해될 수 있다. 이 목적을 위해, 세포는 임의의 편리한 시간에 용해 완충제와 접촉될 수 있다. 세포는 B 세포, 예를 들어, 형질아세포, 기억 B 세포, 또는 혈장 세포, 또는 임의의 다른 종류의 세포일 수 있다.
본 발명자들은 용해 전에 삼투억제제를 포함하는 세포 현탁 완충제 중에서 세포가 유리하게 현탁될 수 있다는 것을 발견하였다. 삼투억제제는 세포를 삼투스트레스로부터 보호할 수 있고, 세포 생리학이 바코딩 전에 안정하게 또는 동요되지 않고 남아있다는 것을 보장한다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 바코드 어댑터 분자 및/또는 바코드 어댑터 주형와 함께 세포 현탁 완충제 중에서 현탁된다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 역전사, PCR 및/또는 용해를 위해 시약과 접촉되기 전에 세포 현탁 완충제 중에서 현탁된다. 세포 현탁 완충제는 임의의 반응 용적에 포함될 수 있고, 수성 반응 용적을 형성하고 조합하기 위해 본 명세서에 기재된 방법과 양립가능하다.
몇 실시형태에서, 세포 현탁 완충제 중의 삼투억제제는 베타인 또는 이의 밀접한 구조적 유사체이다. 베타인 및 가까운 구조적 유사체의 예는 글리신 베타인(또한 N,N,N-트라이메틸글리신으로 불림), 프롤린 베타인(또한 스타키드린으로 불림), 베타-알라닌 베타인, 엑토인, 콜린-O-설페이트, 트리고넬린, 다이메틸설포니오프로피오네이트(DMSP) 및 다이메틸테틴을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 삼투억제제는 글리신 베타인이다. 삼투억제제로서의 작용에 추가로, 베타인은 PCR에서 2차 구조의 형성을 감소시키고 증폭의 특이성을 개선시키는 것으로 나타났다. 따라서 베타인은 일반적으로 본 방법에서 포함되기에 유리할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 삼투억제제는 당 또는 폴리올, 예컨대 트레할로스이다. 다른 유용한 당 또는 폴리올은 수크로스, 프럭토스, 라피노스, 만니톨 및 미오-이노시톨을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 삼투억제제는 아미노산, 예컨대 프롤린이다. 단일 삼투억제제는 세포 현탁 완충제에 포함될 수 있거나, 또는 다중 삼투억제제는 조합되어 포함될 수 있다. 각각의 삼투억제제는 임의의 유용한 농도로 존재할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 세포 현탁 완충제의 삼투압몰농도는 약 250 내지 350 mOsm/ℓ이다. 몇몇 실시형태에서, 삼투억제제는 완충제의 삼투압몰농도의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%를 구성한다. 본 명세서에서 사용된 예시적인 세포 현탁 완충제(예를 들어, 실시예 7 내지 9, 11 및 14 참조)는 약 230 내지 330mM 베타인 및 약 10mM NaCl을 포함한다.
각각의 샘플이 적어도 하나의 세포를 포함하는 실시형태에서, 샘플과 관련된 RNA는 mRNA를 포함할 수 있다. 샘플은, 예를 들어, 적어도 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000 또는 1,000,000개의 mRNA 분자를 포함할 수 있는데, 이는 다수의 유전자, 대립유전자, 리딩 프레임 또는 별개의 서열을 나타낼 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 샘플과 관련된 RNA는 샘플로부터의 모든 mRNA, 세포의 전체 또는 부분적 전사체 또는 세포로부터의 총 RNA를 포함한다.
샘플마다 더 많은 RNA가 바코딩될 수 있고, 매우 다수의 바코드 어댑터 분자가 각각의 샘플에 대해 반응 용적에 전달될 수 있다면, 관심 대상의 더 많은 폴리뉴클레오타이드가 생성될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 그러나, 임의의 이론에 의해 구속되는 일 없이, 본 발명은 샘플마다 바코딩될 수 있는 RNA 수에 대한 제한을 두지 않으며, 따라서, 샘플마다 생성된 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드의 수는 적어도 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000 또는 1,000,000개일 수 있다. 관심 대상의 각각의 폴리뉴클레오타이드는 다수의 복제물에 존재할 수 있다. 더 나아가, 상기 방법의 하나의 실행에서 바코딩될 수 있는 세포 또는 샘플의 수는 고유 바코드 서열을 지니는 다수의 바코드 어댑터 주형을 제조하는 시험감염(상기 논의함)에 의해서만 제한된다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 샘플은 적어도 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000 또는 1,000,000개의 세포를 포함한다. 샘플(예를 들어, 각각의 단일 세포임)은 동일한 대상체 또는 상이한 대상체로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100명의 상이한 대상체가 샘플을 제공할 수 있다.
본 방법은 또한 핵산 마커를 이용하여 관심 대상의 표현형에 대한 세포 집단의 정보를 얻는데 사용될 수 있다. 핵산 마커는 표현형이 존재하거나 또는 존재하지 않는 집단으로부터 세포의 서브세트에 특이적으로 결합하는 결합제에 연결된 핵산을 포함한다. 예를 들어, 결합제는 특정 단백질, 당단백질, 당지질 또는 일부 세포의 표면 상에 존재하는 다른 모이어티에 결합할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 결합제는 분자 표지, 예컨대 항체, 항원 또는 단백질이다(도　14A 내지 도 14C). 몇몇 실시형태에서, 결합제는 펩타이드-MHC 복합체이다. 핵산은 비공유적 포획 모이어티, 또는 원한다면 다른 것을 이용하여 공유적으로 결합제에 연결될 수 있다.
표현형에 대한 세포의 정보를 얻기 위해, 세포를 핵산 마커와 접촉시키고, 이어서, 세척하였다. 따라서, 핵산 마커는 결합제가 결합한느 세포에 대해서만 보유된다. 이어서, 세포를 반용 용적에 동봉하고, 상기 기재한 바와 같이 용해할 수 있고, 따라서, 세포 내 RNA는 바코딩될 수 있다. 바코딩 반응 동안, 핵산 마커의 핵산은 또한 바코딩되며, 따라서 마커 서열은 마커를 보유하는 세포에 대한 RNA 또는 앰플리콘 서열분석 데이터에서 나타난다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 마커의 핵산은 본 집단의 세포에 대해 내인성이 아닌 서열을 지니는 RNA 분자이다. 몇몇 실시형태에서, 핵산은 RNAP 프로모터를 포함하는 이중 가닥 DNA 분자이다. 따라서, 핵산은 전사될 수 있는 반면, 세포(또는 이의 용해물)과 동일한 반응 용적에서, 그리고 얻어진 RNA 분자는 세포로부터의 RNA와 마찬가지로 바코딩될 수 있다.
세포는 상이한 핵산 서열에 연결된 상이한 결합제를 각각 포함하는 다중 핵산 마커를 이용하여 다중 표현형에 대한 정보를 얻을 수 있다. 예를 들어, 세포는 제1 핵산 마커 및 제2 핵산 마커와 접촉될 수 있되, 각각의 핵산 마커는 핵산에 연결된 분자 표지를 포함한다. 두 핵산 마커의 분자 표지는 서로 상이할 수 있다(예를 들어, 상이한 단백질이거나 또는 상이한 세포 표면 모이어티에 대해 친화도를 가질 수 있다). 이들 분자 표지에 연결된 핵산은 전체적으로 또는 부분적으로 서로 상이한 서열을 함유할 수 있다. 세포는 2 이상의 핵산 마커와 동시에 또는 순차적으로 접촉될 수 있다.
추가 예로서, 3개의 항체는 상이한 비-내인성 RNA 서열에 연결될 수 있고, 이들 항체로 처리된 세포에 대한 바코딩된 서열분석 데이터는 각각의 세포가 항체에 대한 표적을 제공하지 않거나, 각각의 세포가 항체 일부 또는 모두에 대한 표적을 제공하는지의 여부를 나타낼 수 있다. 바코딩된 앰플리콘의 복제수는 또한 모이어티가 핵산 마커에 의해 표적화되는 경우, 예를 들어 상이한 세포에 대한 세포 표면 모이어티의 상대적 존재비의 정도에 의해 표현형을 나타낼 수 있다.
B. 고체 지지체에 대한 폴리뉴클레오타이드의 부착
본 발명의 다른 양상은 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법을 제공하되, 폴리뉴클레오타이드는 바코드 서열을 함유한다. 폴리뉴클레오타이드는 이러한 주형에 대해 바코드 어댑터 주형 또는 전구체일 수 있다. 따라서 폴리뉴클레오타이드는 바코드 어댑터를 효소적으로 생성하고 RNA로부터 유래된 앰플리콘 내로 바코드 서열을 혼입하기 위해 상기 기재한 바와 같이 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 역유화의 친수성 구획(즉, 수성 점적)을 생성하는 단계를 수반한다. 구획은 원한다면, 예를 들어 소수성 담체 유체 중에서 수용액을 혼합하고, 선택적으로 혼합물을 교반시킴으로써 생성될 수 있다. 수용액은 그 안에 고체 지지체, 올리고뉴클레오타이드, 및 현탁된 시약을 가질 수 있고, 따라서 각각의 구획은 구획이 형성될 때 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하기 위한 모든 필수 성분을 함유한다. 이들 실시형태에서, 구획에 고체 지지체를 첨가하기 전에, 올리고뉴클레오타이드는 포획 모이어티를 통해 고체 지지체의 표면에 결합된다. 이 올리고뉴클레오타이드는 본 명세서에서 "결합된 올리고뉴클레오타이드"로서 지칭되고, 바코드 올리고뉴클레오타이드의 3' 서열에 상보성인 3' 서열을 함유한다. 따라서 폴리뉴클레오타이드는 결합된 올리고뉴클레오타이드 및 바코드 올리고뉴클레오타이드를 수반하는 중합효소 연장 반응을 통해 고체 지지체 상에서 형성되고, 이 반응은 구획 내에서 일어난다.
바람직한 실시형태에서, 친수성 구획이 형성될 때, 바코드 올리고뉴클레오타이드는 낮은 또는 제한된 농도로 존재한다(예를 들어, 구획 당 하나의 분자). 이 농도는 무작위화된 서열을 갖는 바코드 올리고뉴클레오타이드가 복수의 바코드 주형 비드를 제조하기 위해 사용될 때에 편리하다. 모든 바코드 올리고뉴클레오타이드가 상이한 바코드 서열을 갖는 것으로 추정되고, 각각의 구획 내의 고체 지지체가 단지 하나의 바코드 서열을 가질 것으로 요망된다면, 하나의 바코드 올리고뉴클레오타이드(대부분 또는 평균적으로)는 구획 당 존재할 수 있다. 일단 이 조건이 충족되면, 다중 고체 지지체(예를 들어, 다중 비드)가 구획 내에 존재할 수 있거나, 또는 결합된 올리고뉴클레오타이드의 다중 복제물이 각각의 고체 지지체에 결합될 수 있지만, 구획 내 중합효소 연장 반응으로부터 초래된 모든 폴리뉴클레오타이드는 동일한 바코드 서열을 함유할 것이다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 바람직한 고체 지지체는 비드, 예를 들어 금속 및/또는 중합체 물질로 이루어지고 직경이 대략 0.1 내지 10 마이크로미터인 구체 비드이다. 다른 특징을 갖는 비드는 대신에 또는 추가로 사용될 수 있다. 고체 지지체는 표면에 결합된 올리고뉴클레오타이드를 부착하기 위해 포획 모이어티에 의해 작용기화될 수 있다(도 15, 좌). 포획 모이어티의 예는 아비딘, 스트렙타비딘, 바이오틴, 카복실기, 에폭시기, 하이드록실기, 티올기 및 금을 포함한다. 일부 포획 모이어티는 그들이 특이적으로 그리고 비공유적으로 결합되는 결합 상대를 가진다. 예를 들어, 스트렙타비딘은 그의 결합 상대로서 바이오틴을 취한다. 이러한 포획 모이어티는 고체 지지체에 직접(예를 들어, 공유적으로) 결합될 수 있고, 결합 상대는 결합된 올리고뉴클레오타이드에 결합될 수 있거나, 또는 그 반대이고, 따라서 결합된 올리고뉴클레오타이드는 비공유 상호작용을 통해 고체 지지체에 결합된다. 다른 포획 모이어티는 결합된 올리고뉴클레오타이드와 고체 지지체 사이의 직접 공유 결합을 제공한다.
결합된 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 그의 5' 말단에서 고체 지지체에 결합된 단일-가닥 DNA 분자이다. 따라서, 결합된 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단이 용액 중에서 유리되고, 바코드 올리고뉴클레오타이드에 대해 혼성화될 때, DNA 중합효소와 같은 효소에 의해 연장될 수 있다. 연장 반응은 바코드 올리고뉴클레오타이드 동안 주형으로 되며, 따라서 바코드 서열은 비드에 결합된 DNA 가닥 내로 혼입된다. 원한다면, 결합된 올리고뉴클레오타이드 및/또는 바코드 올리고뉴클레오타이드는 분자내 2차 구조를 최소화하도록 설계된 서열을 가질 수 있다.
바코드 올리고뉴클레오타이드는 보편적인 프라이밍 서열 및/또는 결합 부위와 같은 상기 논의한 서열 영역을 함유할 수 있다. 결합된 올리고뉴클레오타이드 및 바코드 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 프라이머 연장 반응을 수행할 때, 이들 서열 영역은 고체 지지체에 결합된 폴리뉴클레오타이드 내로 혼입될 것이다. 폴리뉴클레오타이드가 후속적으로 바코드 어댑터 주형으로서 사용된다면, 서열 영역은 또한 주형으로부터 생성된 바코드 어댑터 분자에 존재할 것이다. 다른 서열, 예컨대 RNAP 프로모터 및/또는 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위는 바코드 올리고뉴클레오타이드에 포함되어 바코드 어댑터 분자의 효소적 생성을 용이하게 할 수 있다. RNAP 프로모터는 T7, T3 및 SP6 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위는 Nt.BbvCI, Nt.BspQI, Nt.BsmAI, Nt.BstNBI, Nt.AlwI 및 Nt.BsmAI 부위로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바코드 올리고뉴클레오타이드 내의 결합 부위는 하나 이상의 G 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 바코드 서열 및 다른 서열 영역은 결합된 올리고뉴클레오타이드 및/또는 PCR을 이용하여 고체 지지체에 부착된 폴리뉴클레오타이드 내로 혼입된다(도 15, 우측). 이들 실시형태에서, 바코드 올리고뉴클레오타이드는 PCR에 대한 주형으로서 작용하고, 결합된 올리고뉴클레오타이드는 프라이머로서 작용하며, 결합된 올리고뉴클레오타이드의 효소적 연장은 그의 3' 말단으로부터 진행된다. 바코드 올리고뉴클레오타이드는 또한 PCR 역방향 프라이머 서열에 대해 동일하거나 또는 상보성인 5' 서열을 포함한다. 따라서, 역방향 프라이머는 바코드 올리고뉴클레오타이드(또는 그의 상보체) 및 결합된 올리고뉴클레오타이드의 반대 반향으로의 프라임 연장의 5' 말단에 대해 어닐링될 수 있다. 원한다면, 이 역방향 프라이머는 형광단-표지될 수 있고, 따라서 PCR에 의해 생성되고 고체 지지체에 부착된 폴리뉴클레오타이드는 형광이다. 표지는 고체 지지체(예를 들어, 비드)가 바코드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 성공적으로 부착되었는지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
상기 방법은 단일 단계로 수행될 수 있다. 본 방법의 다른 실시형태에서, 바코드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드는 다단계로 고체 지지체에 부착된다. 이들 실시형태에서, 바코드 서열은 몇몇 서열 영역, 예를 들어 S1x, W 및 S2y 영역으로 구성된다. 이들 서열 영역은 2 이상의 바코드 올리고뉴클레오타이드의 부분으로서 폴리뉴클레오타이드 내로 도입될 수 있고, 각각의 바코드 올리고뉴클레오타이드는 별도의 단계 또는 효소 반응으로 사용된다. 별도의 단계로부터 초래되는 폴리뉴클레오타이드에서, S1x, W 및 S2y 영역은 반드시 인접해있지는 않다. 다양한 S1x, W 및 S2y 서열은 상이한 고체 지지체 상에서 조합되어 상이한 바코드 서열 또는 바코드 서열의 라이브러리를 형성할 수 있다.
다단계로 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하기 위해, 폴리뉴클레오타이드는 바코드 서열을 함유하며, 고체 지지체 및 고체 지지체에 결합된 올리고뉴클레오타이드는 상기 기재한 바와 같이 제공된다. 고체 지지체 및 결합된 올리고뉴클레오타이드는 에멀전의 친수성 구획에 또는 임의의 다른 목적으로 하는 반응 용적에 제공될 수 있다. 또한 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드가 제공된다(도 16, 상부 및 중간). 결합된 올리고뉴클레오타이드는 S1x 서열 및 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드의 3' 서열에 상보성인 서열을 포함한다. 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드는 W 서열을 포함한다. 다단계 절차의 제1 단계에서, 결합된 올리고뉴클레오타이드 내로 W 서열을 혼입하기 위해 중합효소 연장 반응 또는 결찰 반응이 수행된다. 따라서, 이 단계 후에, S1x 서열 및 W 서열은 고체 지지체에 결합된 동일한 핵산 가닥에서 존재한다. 연장 반응이 사용된다면, 결합된 올리고뉴클레오타이드는 프라이머로서 작용할 수 있고, 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드는 단일 단계 절차에 대해 상기 논의한 바와 같은 주형으로서 작용할 수 있으며, 따라서, 결합된 올리고뉴클레오타이드는 그의 3' 말단으로부터 연장된다. 몇몇 실시형태에서, 결합된 올리고뉴클레오타이드 내 S1x 서열에 대해 상보성인 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드의 일부는 이노신 트랙을 함유한다.
후속적으로, 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드는 결합된 올리고뉴클레오타이드 내로 S2y 서열을 혼입하기 위해 제공된다(도 16, 하부). 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드는 S2y 서열뿐만 아니라 다단계 절차의 제1 단계로부터 생성된 3' 말단에 대해 상보성인 3' 서열을 포함한다. 따라서, 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드는 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드의 일부에 대해 상보성이거나 또는 동일한 서열 영역을 포함할 수 있다. 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드는 중합효소 연장 반응 또는 결찰 반응을 통해 결합된 올리고뉴클레오타이드(이제 S1x 서열 및 W 서열을 둘 다 포함하도록 연장됨)와 반응된다. 이 단계 후에, S1x, W 및 S2y 서열은 고체 지지체에 결합된 동일한 핵산 가닥 중에 모두 존재한다.
원한다면, 폴리뉴클레오타이드를 고체 지지체에 부착하기 위한 다단계 절차의 제1 및 제2 단계에 대해 동일 또는 상이한 반응 조건이 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드 및 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드의 반응에 대해, 동일한 효소가 더 편리하기는 하지만, 동일한 효소(예를 들어, DNA 중합효소) 또는 상이한 효소(예를 들어, DNA 중합효소 및 리가제)가 사용될 수 있다. 연속 단계에 대해 시약과 고체 지지체를 혼합하기 위해, 시약은 반응 용적으로 나누어질 수 있고, 반응 용적은 분할, 조합 또 다르게는 조작될 수 있고, 모두 요망될 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체 및 결합된 올리고뉴클레오타이드는 다수의 반응 용적으로 분포될 수 있고, 상이한 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드가 각각의 반응 용적에 첨가될 수 있으며, 따라서 상이한 W 서열은 동일한 S1x 서열에 결합된다. 각각의 이들 반응 용적은 결국 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드의 첨가를 위해 다수의 더 많은 용적으로 분할될 수 있고, 따라서 다수의 S2y 서열은 각각의 W 서열에 결합된다. 몇몇 실시형태에서, 고체 지지체는 비결합 올리고뉴클레오타이드를 제거하기 위해 세척된다. 몇몇 실시형태에서, 고체 지지체는 W 서열을 결합된 올리고뉴클레오타이드 내로 혼입한 후에 가열되어,결합된 올리고뉴클레오타이드 및 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드의 이중가닥을 용융하고, 결합된 올리고뉴클레오타이드 및 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드가 어닐링되게 한다.
바코드 어댑터 분자 및/또는 바코드 어댑터 주형, 예컨대 보편적인 프라이밍 서열, 결합 부위, RNAP 프로모터, 또는 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위에 포함될 수 있는 서열 영역은 원한다면 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드와 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드 사이에 분포될 수 있다. 예를 들어, 모든 이러한 서열은 하나의 바코드 올리고뉴클레오타이드에 포함될 수 있거나, 또는 일부가 하나의 바코드 올리고뉴클레오타이드에 포함될 수 있고 일부는 다른 것에 포함될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드 또는 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드 중 하나가 되는 선택된 바코드 올리고뉴클레오타이드는 보편적인 프라이밍 서열 및 결합 부위를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 이 선택된 바코드 올리고뉴클레오타이드는 또한 RNAP 프로모터 또는 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함한다. 본 발명은 상이한 서열 영역을 바코드 어댑터 주형 내로 혼입하기 위한 다수의 선택사항을 제공한다는 것이 인식될 것이다. 이들 주형 및 그들을 준비하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 최적의 설계는 메커니즘이 바코드 어댑터 분자를 효소적으로 생성하고 RNA를 바코딩하기 위해 사용되는 것에 의존할 수 있다.
고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착시키기 위해 본 명세서에 기재된 임으의 방법은 샘플, 세포 또는 RNA를 바코딩함에 있어서 사용하기 위한 하나 이상의 고체 지지체를 제조하는데 사용될 수 있다. 각각의 고체 지지체에 부착된 폴리뉴클레오타이드(들)는 바코드 서열을 포함하고, 바코드 어댑터 주형으로서 작용할 수 있다. 본 발명은 또한 각각 바코드 서열과 관련된 복수의 고체 지지체를 포함하는 바코드 라이브러리를 준비하기 위해 사용될 수 있다. 임의의 두 고체 지지체(예를 들어, 비드)는 전체적으로 또는 부분적으로 서로 상이한 바코드 서열을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 바코드 라이브러리에서 모든 고체 지지체는 상이한 바코드 서열과 관련된다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 바코드 어댑터 주형 비드는 바코드 어댑터 주형에 결합된 비드를 포함한다. 비드는 주형 분자의 다중 복제물, 예를 들어 적어도 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000 또는 1,000,000개의 복제물에 결합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 하나의 비드에 결합된 주형 분자의 각각의 복제물은 동일한 바코드 서열을 포함한다. 주형 분자가 형태 S1x-W-S2y의 바코드 서열을 갖는 경우의 실시형태에서, 하나의 비드에 결합된 주형 분자의 각각의 복제물은 동일한 S1x, W 및/또는 S2y 서열을 포함한다. 본 방법은 또한 복수의 바코드 어댑터 주형 비드를 포함하는 비드가 붙은 바코드 라이브러리를 제조하게 한다. 라이브러리에서 모든 비드는 상이한 바코드 서열과 관련될 수 있으며, 각각의 비드 상의 바코드 어댑터 주형의 복제물은 동일한 바코드 서열을 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 바코드 어댑터 주형 비드 상의 하나 이상의 샘플(예를 들어, 세포)로부터 제조되거나 또는 얻은 cDNA를 물리적으로 포획함으로써 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 제조하는데 사용될 수 있다. 각각의 비드는 3' 말단에서 cDNA 결합 부위를 지니는 주형 분자를 포함한다. 비드는 효소와 접촉되어 결합 부위 단일-가닥을 제공할 수 있다(예를 들어, 용액 중에서 유리된 주형 분자의 말단에서 3' 돌출부를 이탈함). 이어서, cDNA가 결합 부위를 통해 주형 분자의 복제물에 결합되도록 비드 샘플로부터의 하나 이상의 cDNA와 접촉된다. 바람직한 실시형태에서, 결합 부위는 하나 이상의 G 뉴클레오타이드, 예를 들어 폴리-G 트랙을 포함하고, 역전사효소에 의해 cDNA의 말단에 첨가된 비주형의 폴리-C 트랙에 상보성이 된다.
폴리뉴클레오타이드 라이브러리에서 비드는 원한다면, 예를 들어 복수의 샘플로부터 cDNA를 서열분석하기 위해 또는 상이한 샘플로부터 cDNA를 분리하기 위해 사용될 수 있다. 후자의 경우에, 상이한 샘플에 대응하는 비드는 원심분리 또는 자성을 이용하여 펠렛화될 수 있고, 이어서, 표준 방법을 이용하여 재현탁되고 분리된다. 원한다면, 비드 상의 주형 분자에 cDNA를 결합한 후에, 주형 분자는 효소적으로 연장될 수 있고, 이에 의해 cDNA 서열을 비드에 결합된 DNA 이중가닥 내로 혼입하고 이들 서열을 바코드 서열과 연결할 수 있다. 샘플로부터의 cDNA 분자의 복제물의 수가 비드 상의 바코드 어댑터 주형의 복제물의 수와 비슷하다면, 이들 cDNA 분자는 적은 수의 비드 상(예를 들어, 샘플 당 약 1, 3, 10, 30, 100, 300 또는 1000개 이하의 비드)에서 포획될 수 있다. 샘플로부터의 RNA는 표준 방법 또는 cDNA를 생성하기 위해 상기 논의한 바와 같은 방법을 이용하여 역전사될 수 있다. B 세포(예를 들어, 형질아세포, 기억 B 세포 및 혈장 세포)는 샘플로서 사용될 수 있고, 일부 실시형태에서, cDNA는 B-세포 유래 가변 면역글로불린 영역이다.
II. 조성물
A. 폴리뉴클레오타이드
일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 cDNA 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 샘플 동정(바코드)-어댑터 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 샘플 동정(바코드) 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 어댑터 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 보편적 프라이머 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 앰플리콘 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 플레이트 동정 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 제1 플레이트 동정 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 제2 플레이트 동정 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 제한 부위 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 제1 제한 부위 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 제2 제한 부위 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열분석 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 제1 서열분석 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 제2 서열분석 영역을 포함할 수 있다.
일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 복수의 임의의 여역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 제1 샘플 동정(바코드) 영역 및 제2 샘플 동정(바코드) 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 제1 샘플 동정(바코드) 영역 및 제2 샘플 동정(바코드) 영역은 동일하거나 또는 실질적으로 동일하다. 일부 양상에서, 제1 샘플 동정(바코드) 영역 및 제2 샘플(바코드) 동정 영역은 별개이다. 일부 양상에서, 동정(바코드) 영역은 가변 면역글로불린 영역에 결합된다.
일부 양상에서, 영역의 서열은 적어도 PCR 반응에서 프라이머 또는 프로브에 대한 표적 서열로서 작용하기에 충분히 길 것이다. 일부 양상에서, 영역은 길이로 1 내지 5000개 초과의 염기쌍일 수 있다. 예를 들어, 영역은 길이로 1 내지 10,000개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 길이로 2 내지 30개의 뉴클레오타이드(그 사이의 모든 하위 범위를 포함함)일 수 있다. 비제한적 예로서, 영역은 1 내지 30개의 뉴클레오타이드, 1 내지 26개의 뉴클레오타이드, 1 내지 23개의 뉴클레오타이드, 1 내지 22개의 뉴클레오타이드, 1 내지 21개의 뉴클레오타이드, 1 내지 20개의 뉴클레오타이드, 1 내지 19 개의 뉴클레오타이드, 1 내지 18개의 뉴클레오타이드, 1 내지 17개의 뉴클레오타이드, 18 내지 30개의 뉴클레오타이드, 18 내지 26개의 뉴클레오타이드, 18 내지 23개의 뉴클레오타이드, 18 내지 22개의 뉴클레오타이드, 18 내지 21개의 뉴클레오타이드, 18 내지 20개의 뉴클레오타이드, 19 내지 30개의 뉴클레오타이드, 19 내지 26개의 뉴클레오타이드, 19 내지 23개의 뉴클레오타이드, 19 내지 22개의 뉴클레오타이드, 19 내지 21개의 뉴클레오타이드, 19 내지 20개의 뉴클레오타이드, 20 내지 30개의 뉴클레오타이드, 20 내지 26개의 뉴클레오타이드, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드, 20 내지 24개의 뉴클레오타이드, 20 내지 23개의 뉴클레오타이드, 20 내지 22개의 뉴클레오타이드, 20 내지 21개의 뉴클레오타이드, 21 내지 30개의 뉴클레오타이드, 21 내지 26개의 뉴클레오타이드, 21 내지 25개의 뉴클레오타이드, 21 내지 24개의 뉴클레오타이드, 21 내지 23개의 뉴클레오타이드 또는 21 내지 22 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 양상에서, 영역은 길이로 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 양상에서, 영역은 길이로 50개 미만, 50 내지 100, 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 700 내지 800, 800 내지 900, 900 내지 1000, 또는 1000개 초과의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 양상에서, 영역은 길이로 1000개 미만, 1000 내지 2000, 2000 내지 3000, 3000 내지 4000, 4000 내지 5000, 5000 내지 6000, 6000 내지 7000, 7000 내지 8000, 8000 내지 9000, 9000 내지 10000, 또는 10000개 초과의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 양상에서, 영역은 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드의 적어도 2개의 뉴클레오타이드, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 단일 샘플로부터 유래되거나 또는 관련될 수 있다. 일부 양상에서, 영역은 단일 샘플로부터 유래되거나 또는 관련될 수 있다. 일부 양상에서, cDNA 영역은 단일 샘플로부터 유래되거나 또는 관련될 수 있다. 일부 양상에서, 앰플리콘 영역은 단일 샘플로부터 유래되거나 또는 관련될 수 있다. "단일 샘플"은 단일 공급원으로부터 취한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 샘플을 포함한다. 일부 양상에서, 단일 공급원은 특정 시점에 또는 특정 위치에서, 예를 들어 대상체에서 또는 세포의 플라스크 또는 세포의 플레이트에서 취한 샘플을 포함한다. 일부 양상에서, 제1 단일 샘플은 제1 시점에 제1 대상체로부터 취하고, 제2 단일 샘플은 제1 시점과 별도의 제2 시점에 제1 대상체로부터 취한다. 일부 양상에서, 제1 단일 샘플은 제1 위치에서 제1 대상체로부터 취하고, 제2 샘플은 제1 위치와 별도의 제2 위치에서 제1 대상체로부터 취한다. 일부 양상에서, 제1 단일 샘플은 어느 시점에 제1 대상체로부터 취하고, 제2 단일 샘플은 어느 시점에 제2 대상체로부터 취한다. 일부 양상에서, 제1 단일 샘플은 어느 위치에서 제1 대상체로부터 취하고, 제2 샘플은 어느 위치에서 제2 대상체로부터 취한다. 일 실시형태에서, 샘플은 하나 이상의 B 세포로부터 유래된 mRNA를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 샘플은 하나 이상의 B 세포로부터 유래된 cDNA를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 단일 샘플은 96-웰 또는 384-웰 플레이트의 단일 웰내로 분류되는 하나 이상의 B 세포로부터 유래된 mRNA를 포함한다. 샘플은 일반적으로 원핵 세포(들)(예를 들어, 박테리아 세포(들)), 진핵생물 세포(들) (예를 들어, 포유류 세포 및 효모 세포(들)), 또는 유전자 물질의 다른 공급원, 예컨대 바이러스 또는 파지로부터 유래된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "포유류" 또는 "포유 동물"은 인간과 비인간을 둘 다 포함하며, 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 뮤린, 소, 말 및 돼지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 양상에서, 본 발명의 방법은 적어도 96 웰, 적어도 384 웰, 적어도 1536 웰 또는 그 이상의 웰을 지니는 플레이트에서 단일 샘플에 적용된다. 추가 양상에서, 본 발명의 방법은 각각 적어도 96웰을 지니는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 30개 이상의 플레이트에서 단일 샘플에 적용된다.
일부 양상에서, 5' 어댑터 영역 서열 및/또는 샘플 동정 영역은, 예를 들어, RT 동안 그리고 Ig 유전자에 대해서만이 아닌, 단일 샘플로부터의 모든 cDNA에 첨가된다. 일부 양상에서, 3' 유전자 특이적 프라이머(GSP)는 단일 샘플 내 임의의 발현 유전자를 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 양상에서, 관심 대상의 유전자(들)를 증폭하기 위해 5' 프라이머를 다회 축퇴시킬 필요 없이 5' 가변 영역, 예를 들어, T 세포 수용체 및 B 세포 수용체를 갖는 유전자를 증폭시킨다. GSP는 IgG, IgM, IgD, IgA, IgE, TCR 쇄 및 관심 대상의 다른 유전자에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다.
일부 양상에서, 예를 들어, 내포된(nested) GSP를 이용하여 PCR의 다회 라운드가 또한 수행될 수 있다. 이러한 내포된 GSP에 대해, PCR의 제2 라운드에 대한 GSP는 해당 위치에 대한 서열이 PCR의 제1 라운드에서 사용한 GSP에 의해 혼성화되는 것을 따라 위치 5'에서 그의 표적 유전자 서열에 혼성화된다.
일부 양상에서, cDNA 영역 또는 앰플리콘 영역은 DNA 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, cDNA 영역 또는 앰플리콘 영역은 cDNA 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, cDNA 영역 또는 앰플리콘 영역은 DNA 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, cDNA 영역 또는 앰플리콘 영역은 cDNA 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 mRNA 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일부 양상에서, 보편적 프라이머 영역은 임의의 인간 엑손에 대해 완전히 상보성이 아니다. 일부 양상에서, 보편적 프라이머 영역은 임의의 발현된 인간 유전자에 대해 완전히 상보성이 아니다. 일부 양상에서, 보편적 프라이머 영역은 최소 2차 구조를 가진다.
일부 양상에서, 앰플리콘 영역은 면역글로불린 중쇄 앰플리콘 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 앰플리콘 영역은 면역글로불린 경쇄 앰플리콘 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 앰플리콘 영역은 T 세포 수용체 알파 앰플리콘 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 앰플리콘 영역은 T 세포 수용체 베타 앰플리콘 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리에 존재하고, 폴리뉴클레오타이드의 영역에 기반하여 라이브러리에 존재하는 다른 폴리뉴클레오타이드로부터 분화될 수 있다.
일부 양상에서, 제1 단일 샘플로부터 유래된 라이브러리 내 각각의 폴리뉴클레오타이드의 샘플 동정 영역의 서열은 제1 단일 샘플과 별도인 하나 이상의 샘플로부터 유래된 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오타이드의 샘플 동정 영역의 서열과 별도이다. 일부 양상에서, 제1 단일 샘플로부터 유래된 라이브러리 내 각각의 폴리뉴클레오타이드의 샘플 동정 영역의 서열은 제1 단일 샘플과 별도인 하나 이상의 샘플로부터 유래된 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오타이드의 샘플 동정 영역의 서열과 적어도 1개의 뉴클레오타이드만큼 상이하다. 일부 양상에서, 제1 단일 샘플로부터 유래된 라이브러리 내 각각의 폴리뉴클레오타이드의 샘플 동정 영역의 서열은 제1 단일 샘플과 별도인 하나 이상의 샘플로부터 유래된 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오타이드의 샘플 동정 영역의 서열과 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 뉴클레오타이드만큼 상이하다. 일부 양상에서, 제1 단일 샘플로부터 유래된 라이브러리 내 각각의 폴리뉴클레오타이드의 샘플 동정 영역의 서열은 제1 단일 샘플과 별도인 하나 이상의 샘플로부터 유래된 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오타이드의 샘플 동정 영역의 서열에 대해 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 미만으로 동일할 수 있다. 일부 양상에서, 제1 단일 샘플로부터 유래된 라이브러리 내 각각의 폴리뉴클레오타이드의 샘플 동정 영역의 서열은 제1 단일 샘플과 별도인 하나 이상의 샘플로부터 유래된 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오타이드의 샘플 동정 영역의 서열에 대해 100% 미만으로 동일하다. 일부 양상에서, 샘플 동정 영역은 단일 샘플로부터 역전사된 모든 제1 가닥 cDNA 상에서 디지털 바코드로서 작용한다. 일부 양상에서, 샘플 동정 영역은 길이로 적어도 1개의 뉴클레오타이드이다. 일부 양상에서, 샘플-동정 영역은 적어도 3개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 샘플-동정 영역은 적어도 1개의 뉴클레오타이드만큼 서로 상이할 수 있다. 일 실시형태에서, 샘플-동정 영역은 길이로 3 내지 15개의 뉴클레오타이드이고, 적어도 1개의 뉴클레오타이드만큼 서로 상이하다. 일부 양상에서, 샘플-동정 영역은 적어도 64개의 변이체(각각의 샘플 ID가 서로 적어도 1개의 뉴클레오타이드만큼 상이한 길이로 3개의 뉴클레오타이드인 샘플 동정 영역을 이용함), 또는 일부 양상에서 더 다수의 변이체를 포함할 수 있다. 일부 양상에서,샘플-동정 영역에 대해 3'에 부착된 서열은 적어도 1개의 G을 포함하는 어댑터 영역일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 샘플-동정 영역에 대해 3'에 부착된 서열은 적어도 2개의 G을 포함하는 어댑터 영역일 수 있다. 일 실시형태에서, 샘플-동정 영역의 5' 말단에 부착된 서열은 5' 보편적 프라이머 서열의 (결찰 또는 다른 방법에 의한) 후속적 첨가 또는 가변 5' 영역을 지니는 유전자를 증폭시키기 위한 다중 축퇴 5' 프라이머의 사용에 대한 필요를 회피하기 위해 PCR 증폭 동안 사용될 수 있는 보편적 프라이머 서열이다. 일부 양상에서, 단일 샘플의 제1 세트로부터 유래된 라이브러리에서 각각의 폴리뉴클레오타이드의 제1 플레이트 동정 영역의 서열은 단일 샘플의 제1 세트와 별도인 하나 이상의 단일 샘플 세트로부터 유래된 라이브러리에서 다른 폴리뉴클레오타이드의 제1 플레이트 동정 영역 서열과 별도이다. 일부 양상에서, 단일 샘플의 제1 세트로부터 유래된 라이브러리에서 각각의 폴리뉴클레오타이드의 제1 플레이트 동정 영역의 서열은 단일 샘플의 제1 세트와 별도인 하나 이상의 단일 샘플 세트로부터 유래된 라이브러리에서 다른 폴리뉴클레오타이드의 제1 플레이트 동정 영역 서열과 적어도 1개의 뉴클레오타이드만큼 상이하다. 일부 양상에서, 제1 단일 샘플의 세트로부터 유래된 라이브러리 내 각각의 폴리뉴클레오타이드의 제1 플레이트 동정 영역의 서열은 제1 단일 샘플의 세트과 별도인 하나 이상의 단일 샘플 세트로부터 유래된 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오타이드의 제1 플레이트 동정 영역의 서열과 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 뉴클레오타이드만큼 상이하다. 일부 양상에서, 제1 단일 샘플의 세트로부터 유래된 라이브러리 내 각각의 폴리뉴클레오타이드의 제1 플레이트 동정 영역의 서열은 제1 단일 샘플의 세트과 별도인 하나 이상의 단일 샘플 세트로부터 유래된 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오타이드의 제1 플레이트 동정 영역의 서열에 대해 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 미만으로 동일할 수 있다. 일부 양상에서, 단일 샘플의 제1 세트로부터 유래된 라이브러리에서 각각의 폴리뉴클레오타이드의 제1 플레이트 동정 영역의 서열은 단일 샘플의 제1 세트와 별도인 하나 이상의 단일 샘플 세트로부터 유래된 라이브러리에서 다른 폴리뉴클레오타이드의 제1 플레이트 동정 영역 서열에 대해 100% 미만으로 동일하다. 일부 양상에서, 단일 샘플의 제1 세트로부터 유래된 라이브러리에서 각각의 폴리뉴클레오타이드의 제2 플레이트 동정 영역의 서열은 단일 샘플의 제1 세트와 별도인 하나 이상의 단일 샘플 세트로부터 유래된 라이브러리에서 다른 폴리뉴클레오타이드의 제2 플레이트 동정 영역 서열과 별도이다. 일부 양상에서, 단일 샘플의 제1 세트로부터 유래된 라이브러리에서 각각의 폴리뉴클레오타이드의 제2 플레이트 동정 영역의 서열은 단일 샘플의 제1 세트와 별도인 하나 이상의 단일 샘플 세트로부터 유래된 라이브러리에서 다른 폴리뉴클레오타이드의 제2 플레이트 동정 영역 서열과 적어도 1개의 뉴클레오타이드만큼 상이하다. 일부 양상에서, 제1 단일 샘플의 세트로부터 유래된 라이브러리 내 각각의 폴리뉴클레오타이드의 제2 플레이트 동정 영역의 서열은 제1 단일 샘플의 세트과 별도인 하나 이상의 단일 샘플 세트로부터 유래된 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오타이드의 제2 플레이트 동정 영역의 서열과 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 뉴클레오타이드만큼 상이하다. 일부 양상에서, 제2 플레이트 동정 영역의 서열은 폴리뉴클레오타이드 상에서 제1 플레이트 동정 영역의 서열과 동일하다. 일부 양상에서, 제1 단일 샘플의 세트로부터 유래된 라이브러리 내 각각의 폴리뉴클레오타이드의 제2 플레이트 동정 영역의 서열은 제1 단일 샘플의 세트과 별도인 하나 이상의 단일 샘플 세트로부터 유래된 라이브러리 내의 다른 폴리뉴클레오타이드의 제2 플레이트 동정 영역의 서열에 대해 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 미만으로 동일할 수 있다. 일부 양상에서, 단일 샘플의 제1 세트로부터 유래된 라이브러리에서 각각의 폴리뉴클레오타이드의 제2 플레이트 동정 영역의 서열은 단일 샘플의 제1 세트와 별도인 하나 이상의 단일 샘플 세트로부터 유래된 라이브러리에서 다른 폴리뉴클레오타이드의 제2 플레이트 동정 영역 서열에 대해 100% 미만으로 동일하다. 일부 양상에서, 플레이트-동정 영역(예를 들어, 제1 플레이트 동정 영역 또는 제2 플레이트 동정 영역)은 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 플레이트-동정 영역은 적어도 1개의뉴클레오타이드만큼 서로 상이하다. 일 실시형태에서, 플레이트-동정 영역은 길이로 2 내지 10개의 뉴클레오타이드이고, 적어도 1개의 뉴클레오타이드만큼 서로 상이하다. 일부 양상에서, 플레이트-동정 영역의 사용은 일부 실시형태에서만 발견되는데, 매우 다수의 상이한 샘플-동정 영역(분석 될 단일 샘플 당 하나)의 사용이 플레이트-동정 영역에 대한 필요를 제거할 수 있기 때문이다. 일부 양상에서, 플레이트-동정 영역은 합성될 필요가 있는 샘플-동정 영역을 함유하는 고유 올리고뉴클레오타이드 수를 감소시키기 위해 사용된다.
일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 어댑터 영역을 포함한다. 일부 양상에서, 어댑터 영역은 하나 이상의 G을 포함한다. 일부 양상에서, 어댑터 영역은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 G를 포함한다. 일부 양상에서, 어댑터 영역은 MMLV H-역전사효소의 주형 전환 특성을 이용하여 cDNA의 3' 말단에 부착된다. 5' 측접 어댑터 영역 서열을 지니는 프라이머를 이용하는 PCR, 접착성 및 평활 말단 결찰, 뉴클레오타이드의 주형-전환-매개 첨가 또는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에, 3' 말단에 또는 5'과 3' 말단에 뉴클레오타이드를 공유적으로 부착하는 다른 방법을 행하는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 어댑터 영역을 부착하는 상이한 방법이 존재한다. 이들 방법은 분자 생물학에서 통상적으로 사용되는 효소의 특성을 사용할 수 있다. PCR은, 예를 들어, 호열성 DNA 중합효소를 사용할 수 있다. 상보성 또는 실질적으로 상보성인 접착성 말단은 돌출된 말단을 이탈하는 제한 효소를 이용하여 dsDNA를 절단하거나 또는 TdT(말단의 트랜스퍼라제)와 같은 효소의 3' 꼬리 활성을 통해 생성된다. 이어서, 접착성 말단 및 평활 말단은 T4 리가제와 같은 리가제를 이용하여 상보성 어댑터 영역과 결찰될 수 있다. 주형-전환은 cDNA의 3' 말단에 하나 이상의 사이토신(C)을 첨가하는 MMLV H-역전사효소의 3' 꼬리 활성 및 상보적 G를 지니는 어댑터 영역에 mRNA로부터 주형을 전환하는 그의 능력을 이용한다. 일부 양상에서, cDNA는 그의 3' 말단 상에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 C를 포함한다.
일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 제한 부위 영역을 포함한다. 제한 부위 영역은 하나 이상의 제한 부위를 포함한다. 제한 부위는 하기를 포함한다: NheI, XhoI, BstBI, EcoRI, SacII, BbvCI, PspXI, AgeI, ApaI, KpnI, Acc65I, XmaI, BstEII, DraIII, PacI, FseI, AsiSI 및 AscI. 일부 양상에서, 임의의 희귀 8-커터 효소 제한 부위가 사용될 수 있다.
일부 양상에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 영역은 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 다른 영역에 작동가능하게 결합될 수 있다. 일부 양상에서, 단일 폴리뉴클레오타이드의 2 이상의 별도의 영역은 작동가능하게 결합될 수 있다. 예를 들어, 보편적 프라이머 영역은 어댑터 영역에 작동가능하게 결합될 수 있다. 일부 양상에서 서열에서 서로 실질적으로 동일하거나 또는 설명에서 동일한 2 이상의 영역이 함께 작동가능하게 결합될 수 있다. 예를 들어, 제1 샘플 동정 영역은 제2 샘플 동정 영역에 작동가능하게 결합될 수 있다. 일부 양상에서, 제1 샘플 동정 영역과 제2 샘플 동정 영역의 서열은 동일하거나 또는 실질적으로 동일하다. 일부 양상에서, 제1 샘플 동정 영역과 제2 샘플 동정 영역의 서열은 상이하거나 또는 별도이다.
일부 양상에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 영역은 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 다른 영역에 결합될 수 있다. 일부 양상에서, 단일 폴리뉴클레오타이드의 2 이상의 별도의 영역은 결합될 수 있다. 예를 들어, 보편적 프라이머 영역은 어댑터 영역에 결합될 수 있다. 일부 양상에서 서열에서 서로 실질적으로 동일하거나 또는 설명에서 동일한 2 이상의 영역이 함께 결합될 수 있다. 예를 들어, 제1 샘플 동정 영역은 제2 샘플 동정 영역에 결합될 수 있다. 일부 양상에서, 제1 샘플 동정 영역과 제2 샘플 동정 영역의 서열은 동일하거나 또는 실질적으로 동일하다. 일부 양상에서, 제1 샘플 동정 영역과 제2 샘플 동정 영역의 서열은 상이하거나 또는 별도이다.
일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 5'-A-B-3'을 포함하되, A는 샘플 동정 영역이고, B는 어댑터 영역이다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 5'-A-B-C-3'을 포함하되, A는 보편적 프라이머 영역이고, B는 샘플 동정 영역이며, C는 어댑터 영역이다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 5'-A-B-C-3'을 포함하되, A는 샘플 동정 영역이고, B는 어댑터 영역이며, C는 단일 샘플로부터 유래된 앰플리콘 영역이다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 5'-A-B-C-D-3'을 포함하되, A는 보편적 프라이머 영역이고, B는 샘플 동정 영역이며, C는 어댑터 영역이고, D는 단일 샘플로부터 유래된 앰플리콘 영역이다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 5'-A-B-C-D-E-3'을 포함하되, A는 플레이트 동정 영역이고, B는 보편적 프라이머 영역이며, C는 샘플 동정 영역이고, D는 어댑터 영역이며, E는 단일 샘플로부터 유래된 앰플리콘 영역이다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 5'-A-B-C-D-E-F-3'을 포함하되, A는 제1 제한 부위 영역이고, B는 보편적 프라이머 영역이며, C는 샘플 동정 영역이고, D는 어댑터 영역이며, E는 단일 샘플로부터 유래된 앰플리콘 영역이고, F는 제2 제한 부위 영역이다.
일부 양상에서, 상기 서열의 각각의 영역은 상이한 순서로 재배열될 수 있다(예를 들어, 5'-C-A-D-B-3' 또는 5'-E-A-C-B-D-F-3' 또는 5'-B-A-3'). 일부 양상에서, 상기 서열의 하나 이상의 영역은 결실될 수 있다(예를 들어, 5'-A-D-3' 또는 5'-B-C-3'). 일부 양상에서, 하나 이상의 추가적인 영역은 상기 서열에 첨가될 수 있다(예를 들어, 5'-A-A2-B-3' 또는 5'-A-B-C-D-E-F-G-3'). 이러한 예에서, 하나 이상의 추가적인 영역은 본 명세서에 개시된 임의의 영역 또는 이의 동등물일 수 있다. 일부 양상에서, 상기 서열의 하나 이상의 영역은 변형되고, 예를 들어 메틸화될 수 있다.
일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 어댑터 분자를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터 분자는 보편적 프라이머 영역, 샘플 동정 영역 및 어댑터 영역을 포함할 수 있되, 보편적 프라이머 영역의 3' 말단은 샘플 동정 영역의 5' 말단에 결합되고, 샘플 동정 영역의 3' 말단은 어댑터 영역의 5' 말단에 결합된다. 일부 양상에서, 어댑터 분자는 제1 가닥 cDNA의 3' 말단에서 역전사효소에 의해 첨가된 C에 결합되는 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 양상에서, 어댑터 분자는 3 내지 6개의 G(DNA G)을 포함하는 데옥시리보스 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 어댑터 분자는 3 내지 6개의 G(RNA G)으로 이루어진 리보스 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 어댑터 분자는 뉴클레오타이드 유사체, 이러한 잠긴 핵산(LNA), 예를 들어, LNA G을 이용할 수 있다. 다른 실시형태에서, 뉴클레오타이드 염기는 또한 C뿐만 아니라 다른 뉴클레오타이드에 대해 임의의 조합으로 염기짝짓기할 수 있는 보편적 또는 축퇴 염기, 예컨대 5-나이트로인돌 및 3-나이트로피롤일 수 있다.
일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 프라이머는 보편적 프라이머 영역 및 플레이트 동정 영역을 포함할 수 있되, 플레이트 동정 영역의 3' 말단은 보편적 프라이머 영역의 5' 말단에 결합된다.
일부 양상에서, 조성물은 폴리뉴클레오타이드 조성물 라이브러리를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드 조성물 라이브러리는 복수의 폴리뉴클레오타이드 조성물을 포함한다. 일부 양상에서 각각의 조성물은 별도의 용기에 존재한다. 일부 양상에서, 용기는 시험관일 수 있다. 일부 양상에서, 용기는 플레이트 내 웰일 수 있다. 일부 양상에서, 용기는 96-웰 플레이트 내 웰일 수 있다. 일부 양상에서, 용기는 384-웰 플레이트 내 웰일 수 있다. 일부 양상에서, 각각의 조성물은 단일 샘플로부터 유래된 cDNA 영역을 포함한다. 일부 양상에서, 각각의 조성물은 어댑터 영역에 결합된 샘플 동정 영역을 포함하는 샘플 동정-어댑터 영역을 포함한다. 일부 양상에서 라이브러리 내 각각의 샘플 동정-어댑터 영역의 샘플 동정 영역의 서열은 라이브러리 내 각각의 별도의 용기에 존재하는 다른 샘플 동정-어댑터 영역의 샘플 동정 영역의 뉴클레오타이드 서열과 별도이다. 일부 양상에서, 샘플 동정-어댑터 영역은 cDNA 영역에 부착된다. 일부 양상에서, 샘플 동정-어댑터 영역은 그들의 3' 영역 사이의 결합에 의해 cDNA 영역에 부착된다. 일부 양상에서, 샘플 동정-어댑터 영역은 G:C 결합에 의해 cDNA 영역에 부착된다. 일부 양상에서, cDNA 영역은 DNA 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 양상에서, cDNA 영역은 cDNA 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 mRNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드 라이브러리 내 복수의 폴리뉴클레오타이드 조성물은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 10, 적어도 30, 적어도 100, 적어도 300, 적어도 1000, 적어도 3000, 적어도 10,000, 적어도 30,000, 적어도 100,000, 적어도 300, 000, 적어도 1,000,000, 적어도 3,000,000, 적어도 10,000,000, 적어도 30,000,000개 이상의 구성원을 포함할 수 있다. 다른 양상에서, 폴리뉴클레오타이드 라이브러리 내 복수의 폴리뉴클레오타이드 조성물은 세포 샘플의 전체 전사체의 적어도 2, 적어도 3, 적어도 10, 적어도 30, 적어도 100, 적어도 300, 적어도 1000, 적어도 3000, 적어도 10,000, 적어도 30,000개 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 다른 양상에서, 폴리뉴클레오타이드 라이브러리 내 복수의 폴리뉴클레오타이드 조성물은 개체의 혈액 내에 존재하는 상이한 항체 종의 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 10, 적어도 30, 적어도 100, 적어도 300, 적어도 1000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 1,000,000, 적어도 10,000,000, 적어도 1,000,000,000개 이상을 포함한다. 이들 항체 종은 형질아세포, 혈장 세포, 기억 B 세포, 장수 혈장 세포, 나이브 B 세포, 다른 B 계통 세포 또는 이들의 조합물에 의해 발현될 수 있다.
B. 벡터
일부 양상에서, 조성물은 벡터를 포함할 수 있다. 용어 "벡터"는 핵산 서열이 그것이 복제될 수 있는 세포 내로 도입을 위하 삽입될 수 있는 담체 핵산 분자를 지칭하기 위해 사용된다. 벡터는 핵산 서열을 이용하는 숙주 세포의 형질전환에서 사용될 수 있다. 일부 양상에서, 벡터는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 표적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 라이브러리는 세포 집단 내로 도입될 수 있고, 이에 의해 라이브러리가 선별되게 한다. 핵산 서열은 "외인성" 또는 "이종성"일 수 있는데, 이는 벡터가 도입되는 세포 에 대해 외래이거나 또는 서열이 세포 내 서열에 대해 상동성이지만 서열이 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 위치에 있다는 것을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들어, 박테리오파지)를 포함한다. 당업자는 문헌[Maniatis et al., 1988 및 Ausubel et al., 1994]에 기재된 표준 재조합 기법을 통해 벡터를 구성할 수 있으며, 이들 참고문헌 둘 다 본 명세서에 참고로 포함된다. 일부 양상에서, 벡터는 사전 공학처리된 항체의 불변 영역을 지니는 벡터일 수 있다. 이런 방법으로, 당업자는 관심 대상의 항체의 단지 VDJ 영역을 클로닝하고, 해당 영역을 사전 공학처리한 벡터내로 클로닝할 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 유전자 산물의 적어도 일부에 대해 핵산 서열 암호를 함유하는 벡터를 지칭한다. 일부 경우에, 이어서, RNA 분자는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터는 다양한 "제어 서열"을 함유할 수 있으며, 이는 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 암호 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 대한 핵산을 지칭한다. 전사 및 번역을 지배하는 제어 서열에 추가로, 벡터 및 발현 벡터는 다른 작용도 하는 핵산 서열을 함유할 수 있다.
일부 양상에서, 벡터는 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 벡터는 인핸서를 포함할 수 있다. "프로모터"는 전사의 개시 및 속도가 제어되는 핵산 서열의 영역인 제어 서열이다. 이는 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전자 구성요소, 예컨대 RNA 중합효소 및 다른 전사 인자를 함유할 수 있다. 어구 "작동가능하게 위치된", "작동가능하게 연결된", "제어 하에서" 및 "전사 제어 하에서"는 프로모터가 해당 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하기 위해 핵산 서열에 대해 정확한 작용 위치 및/또는 배향에 있다는 것을 의미한다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 수반된 시스-작용성 조절 서열을 지칭하는 "인핸서"와의 컨쥬게이션에서 사용될 수도 있고 사용되지 않을 수 있다.
프로모터는 암호 세그먼트 및/또는 엑손의 상류에 위치된 5' 비-암호 서열을 단리시킴으로써 얻을 수 있는 것과 같은 유전자 또는 서열과 자연적으로 결합되는 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로서 지칭될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 해당 서열의 하류 또는 상류에 위치된 핵산 서열과 자연적으로 결합된 것일 수 있다. 대안적으로, 특정 이점은 천연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 결합되지 않는 프로모터를 지칭하는 이종성 프로모터 또는 재조합체의 제어 하에서 암호 핵산 세그먼트를 위치시킴으로써 얻을 것이다. 재조합체 또는 이종성 인핸서는 또한 그의 천연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 결합하지 않는 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 원핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서 및 "자연적으로 생기지" 않는, 즉, 상이한 전사 조절 영역의 상이한 구성요소 및/또는 발현을 변경하는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 인핸서의 핵산 서열을 합성으로 생성하는 것에 추가로, 서열은 본 명세서에 개시된 조성물과 관련하여 재조합 클로닝 및/또는 PCR을 포함하는 핵산 증폭 기법을 이용하여 생성될 수 있다(미국 특허 제4,683,202호, 미국 특허 제 5,928,906호를 참조하며, 각각은 본 명세서에 참고로 포함됨).
일부 양상에서, 프로모터 및/또는 인핸서는 발현을 위해 선택된 세포 유형에서 DNA 세그먼트의 발현을 효과적으로 지시한다. 사용될 수 있는 이러한 프로모터의 일 예는 이콜라이 아라비노스 또는 T7 프로모터이다. 분자 생물학의 당업자는 일반적으로 프로모터, 인핸서 및 단백질 발현을 위한 세포 유형 조합의 사용에 익숙하다, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Sambrook et al. (1989)] 참조. 사용되는 프로모터는 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대규모 생성에서 유리한 것과 같은 도입된 DNA 세그먼트의 고수준 발현을 지시하는 적절한 조건 하에서 구성적, 조직-특이적, 유도성 및/또는 유용할 수 있다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.
일부 양상에서, 벡터는 개시 신호 및/또는 내부 리보솜 결합 부위를 포함할 수 있다. 특이적 개시 신호는 또한 암호 서열의 효율적인 번역을 위해 포함될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접한 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 제어 신호가 제공될 필요가 있을 수 있다. 당업자는 이를 용이하게 결정할 수 있고 필요한 신호를 제공할 수 있다. 완전한 삽입의 번역을 보장하기 위해 개시 코돈은 목적으로 하는 암호 서열의 리딩 프레임과 "프레임 내"에 있어야 한다는 것은 잘 공지되어 있다. 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 또는 합성일 수 있다. 발현의 효율성은 적절한 전사 인핸서 구성요소의 포함에 의해 향상될 수 있다.
일부 양상에서, 벡터는 관심 대상의 유전자를 암호화하는 DNA 세그먼트의 발현 수준을 증가시키거나 또는 최적화하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예는 발현된 mRNA에서 인트론의 첨가를 포함한다(Brinster, R.L. et al. (1988) Introns increase 전사체ional efficiency in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 836-40; Choi, T. et al. (1991) A generic intron increases gene expression in transgenic mice. Mol. Cell. Biol. 11, 3070-4). DNA 세그먼트의 발현을 최적화하기 위한 방법의 다른 예는 "코돈 최적화"이다. 코돈 최적화는 단백질 번역을 최적화시키기 위해 희귀 코돈의 사용을 감소시키는 DNA 세그먼트 내 침묵 돌연변이의 삽입을 수반한다(Codon engineering for improved antibody expression in mammalian cells. Carton JM, Sauerwald T, Hawley-Nelson P, Morse B, Peffer N, Beck H, Lu J, Cotty A, Amegadzie B, Sweet R. Protein Expr Purif. 2007 Oct;55(2):279-86. Epub 2007 Jun 16.).
일부 양상에서, 벡터는 다중 클로닝 부위를 포함할 수 있다. 벡터는 다중 제한 효소 부위를 함유하는 핵산 영역인 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함할 수 있으며, 이 중 임의는 벡터를 분해하는 표준 재조합 기법과 함께 사용될 수 있다(본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, and Cocea, 1997]). "제한 효소 분해"는 핵산 분자 내 특이적 위치에서만 작용하는 효소를 이용하는 핵산 분자의 촉매적 절단을 지칭한다. 다수의 이들 제한 효소는 상업적으로 입수가능하다. 이러한 효소의 용도는 당업자에 의해 이해된다. 빈번하게는, 벡터는 외인성 서열이 벡터에 결찰될 수 있게 하는 MCS 내에서 절단되는 제한 효소를 이용하여 선형화되거나 또는 단편화된다. "결찰"은 서로 인접할 수 있거나 인접하지 않을 수도 있는 두 핵산 단편 사이에 포스포다이에스터 결합을 형성하는 과정을 지칭한다. 제한 효소 및 결찰 반응을 수반하는 기법은 재조합 기법의 당업자에게 잘 공지되어 있다.
일부 양상에서, 벡터는 종결 신호를 포함할 수 있다. 벡터 또는 작제물은 일반적으로 적어도 하나의 종결 신호를 포함할 것이다. "종결 신호" 또는 "종결자"는 RNA 중합효소에 의해 RNA 전사체의 특이적 말단에 수반된 DNA 서열을 포함한다. 따라서, 특정 실시형태에서, RNA 전사체의 생성이 끝나는 종결 신호가 상정된다. 종결자는 바?珠颱? 메세지 수준을 달성하기 위해 생체내에서 필수적일 수 있다.
사용을 위해 상정된 종결자는 본 명세서에 기재되거나 또는 당업자에게 공지된 임의의 공지된 전사 종결자(예를 들어, 로(rho) 의존적 또는 로 독립적 종결자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 종결 신호는 서열 절단에 기인하는 것과 같은 전사가능한 또는 번역가능한 서열의 결여일 수 있다.
일부 양상에서, 벡터는 복제기점을 포함할 수 있다.
숙주 세포에서 벡터를 증식시키기 위해, 복제가 개시된 특이적 핵산 서열인 하나 이상의 복제 기점 부위(종종 "ori"로 칭해짐)를 함유할 수 있다.
일부 양상에서, 벡터는 하나 이상의 선택가능한 및/또는 선별가능한 마커를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 핵산 작제물을 함유하는 세포는 발현 벡터 내 마커를 포함함으로써 시험관내 또는 생체내에서 동정될 수 있다. 이러한 마커는 세포에 동정가능한 변화를 부여하여 발현 벡터를 함유하는 세포를 용이하게 동정하게 한다. 일반적으로, 선택가능한 마커는 선택을 가능하게 하는 특성을 부여하는 것이다. 양성 선택가능 마커는 마커의 존재가 그의 선택을 가능하게 하는 것인 반면, 음성 선택가능 마커는 그의 존재가 그의 선택을 방지하는 것이다. 양성 선택가능 마커의 예는 약물 내성 마커이다.
보통 약물 선택 마커의 포함은 형질전환체의 클로닝 및 동정에 도움을 주며, 예를 들어, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티딘올에 내성을 부여하는 유전자가 유용한 선택가능 마커이다. 조건의 실행에 기반한 형질전환체의 차별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커에 추가로, 선별가능한 마커, 예컨대 GFP(이는 비색분석에 기반함)를 포함하는 다른 유형의 마커가 또한 상정된다. 대안적으로, 선별가능한 효소, 예컨대 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)가 이용될 수 있다. 당업자는 또한 가능하게는 FACS 분석과 함께 면역학적 마커를 사용하는 방법을 알 것이다. 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있다면, 사용한 마커는 중요한 것으로 믿어지지 않는다. 선택가능한 그리고 선별가능한 마커의 추가적인 예는 당업자에게 잘 공지되어 있다.
일 양상에서, 벡터는 관심 대상의 다중 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 세그먼트를 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 둘 다 암호화하는 DNA 세그먼트는 단일 벡터에 의해 암호화되고 발현될 수 있다. 일 양상에서, DNA 세그먼트는 둘 다 별개의 폴리펩타이드로서 DNA 세그먼트의 발현을 가능하게 하기 위해 사용되는 동일한 발현된 RNA 및 내부 리보솜 결합 부위(IRES) 상에 포함될 수 있다(Pinkstaff JK, Chappell SA, Mauro VP, Edelman GM, Krushel LA., Internal initiation of translation of five dendritically localized neuronal mRNAs., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Feb 27;98(5):2770-5. Epub 2001 Feb 20.). 다른 양상에서, 각각의 DNA 세그먼트는 별도의 mRNA의 발현을 초래하는 그 자체의 프로모터 영역을 가진다(Andersen CR, Nielsen LS, Baer A, Tolstrup AB, Weilguny D. Efficient Expression from One CMV Enhancer Controlling Two Core Promoters. Mol Biotechnol. 2010 Nov 27. [Epub ahead of print]).
C. 숙주 세포 및 발현 시스템
일부 양상에서, 조성물은 숙주 세포를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 숙주 세포는 진핵 세포(예를 들어, 곤충, 효모 또는 포유류) 또는 원핵 세포(예를 들어, 박테리아)를 포함할 수 있다. 이종성 핵산 서열의 발현과 관련하여, "숙주 세포"는 원핵 세포를 지칭할 수 있으며, 벡터를 복제할 수 있고/있거나 벡터에 의해 암호화된 이종성 유전자를 발현시킬 수 있는 임의의 번역가능한 유기체를 포함한다. 숙주 세포는 벡터를 위한 수용자로서 사용될 수 있고, 사용되었다. 숙주 세포는 "형질감염" 또는 "형질전환"될 수 있으며, 이는 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달 또는 도입되는 과정을 지칭한다. 형질전환된 세포는 1차 대상체 세포 및 그의 자손을 포함한다.
특정 실시형태에서, 숙주 세포는 그램 음성 세포이다. 이들 박테리아는 내부 막과 외부 막 사이에 주변 세포질 공간, 특히, 세포직 막으로서도 알려진 주변세포질과 세포질 사이의 앞서 언급한 내막을 가진다는 점에서 사용에 적합하다. 그와 같이 이러한 주변세포질 공간을 지니는 임의의 다른 세포가 사용될 수 있었다. 그램 음성 박테리아의 예는 이콜라이(E. coli), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 보르도텔라 퍼투시(Bordotella pertussi), 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 리조븀 종(Rhizobium sp)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 그램 음성 박테리아 세포는 또한 선택된 리간드에 결합할 수 있는 후보 결합 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드의 암호 서열에 의해 형질전환된 박테리아 세포로서 추가로 정의될 수 있다. 폴리펩타이드는 세포질막의 외면에 고정되고, 주변세포질 공간에 접하며, 항체 암호 서열 또는 다른 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드의 발현을 위한 하나의 수단은 이러한 지시를 야기할 수 ?榮? 폴리펩타이드에 리더 서열을 부착시키는 것에 의한다.
수많은 원핵 세포주 및 배양물은 숙주 세포로서 사용을 위해 이용가능하며, 그들은 살아있는 배양물 및 유전자 물질에 대한 보관소로서의 역할을 하는 기관인 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection: ATCC)를 통해 얻을 수 있다. 적절한 숙주는 벡터 백본 및 목적으로 하는 결과에 기반하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 플라스미드 또는 코스미드는, 예를 들어, 다수 벡터의 복제를 위해 원핵 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터 복제 및/또는 발현을 위한 숙주 세포로서 사용되는 박테리아 세포는 DH5-알파, JM109 및 KC8뿐만 아니라 다수의 상업적으로 입수가능한 박테리아 숙주, 예컨대 슈어(SURE)(상표명) 적격 세포 및 솔로팩(SOLOPACK)(상표명) 금 세포(스트라타겐(STRATAGENE)(상표명), 라호이아에 소재)를 포함한다. 일부 양상에서, 다른 박테리아 세포, 예컨대 이콜라이 LE392는 숙주 세포로서 사용을 위해 상정된다.
다양한 세포 유형 및 유기체로부터의 다수의 숙주 세포는 입수가능하며, 당업자에게 공지되어 있다. 유사하게, 바이러스 벡터는 원핵 숙주 세포, 특히 벡터의 복제 또는 발현을 위해 허용되는 것과 함께 사용될 수 있다. 일부 벡터는 원핵과 진핵 세포 둘 다에서 복제 및/또는 발현되는 제어 서열을 사용할 수 있다. 당업자는 상기 기재한 숙주 세포 모두를 인큐베이션하여 이들을 유지하고 벡터를 복제하는 조건 하에서 추가로 이해된다. 또한 벡터의 대규모 생성뿐만 아니라 벡터에 의해 암호화된 핵산의 생성 및 그들의 동족 폴리펩타이드, 단백질 또는 펩타이드의 생성을 허용하는 기법 및 조건이 이해되고 공지되어 있다.
일부 양상에서, 숙주 세포는 포유류이다. 예는 CHO 세포, CHO-K1 세포 또는 CHO-S 세포를 포함한다. 다른 포유류 숙주 세포는 NS0 세포 및 dhfr-인 CHO 세포, 예를 들어, CHO-dhfr-, DUKX-B11 CHO 세포 및 DG44 CHO 세포를 포함한다.
본 명세서에 개시된 조성물 중 적어도 일부 또는 모두를 포함할 수 있는 수많은 발현 시스템이 존재한다. 발현 시스템은 진핵생물 발현 시스템 및 원핵생물 발현 시스템을 포함할 수 있다. 이러한 시스템은, 예를 들어, 특정 리간드를 결합할 수 있는 것으로 동정된 폴리펩타이드 산물의 생성을 위해 사용될 수 있었다. 원핵생물 기잠 시스템은 핵산 서열, 또는 그들의 동족 폴리펩타이드, 단백질 및 펩타이드를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 다수의 이러한 시스템은 상업적으로 그리고 광범위하게 입수가능하다. 발현 시스템의 다른 예는 강한 원핵생물 프로모터, 예컨대 T7, Tac, Trc, BAD, 람다 pL, 테트라사이클린 또는 Lac 프로모터, pET 발현 시스템 및 이콜라이 발현 시스템을 함유하는 벡터를 포함한다.
D. 폴리펩타이드
일부 양상에서, 조성물은 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드는, 예를 들어, 숙주 세포로부터 발현될 수 있다. 용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 천연 단백질, 즉, 자연적으로 생기는 그리고 비재조합 세포에 의해 생성된 단백질의 아미노산 서열을 갖는 거대분자를 포함하거나; 또는 유전자 공학처리된 또는 재조합 세포에 의해 생성되고, 천연 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 천연 서열의 하나 이상의 아미노산으로부터의 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 분자를 포함한다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 자연적으로 생기는 아미노산 및 중합체의 화학적 유사체인 아미노산 중합체를 포함한다. 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 항원-결합 단백질의 하나 이상의 아미노산으로부터의 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 항원 결합 단백질, 항체 또는 서열을 포함한다. 용어 "폴리펩타이드 단편"은 아미노-말단 결실, 카복시-말단 결실, 및/또는 전장 천연 단백질과 비교하여 내부 결실을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 단편은 또한 천연 단백질과 비교하여 변형된 아미노산을 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 단편은 약 5 내지 500개의 아미노산 길이이다. 예를 들어, 단편은 적어도 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 450개 아미노산 길이일 수 있다. 유용한 폴리펩타이드 단편은 결합 도메인을 포함하는 항체의 면역학적으로 기능성인 단편을 포함한다. 결합 항체의 경우에, 유용한 단편은 CDR 영역, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인, 항체쇄의 일부 또는 2개의 CDR을 포함하는 단지 그의 가변 영역 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "단리된 단백질"은 대상 단백질이 (1) 그것이 정상적으로 발견되는 적어도 일부의 다른 단백질이 없고, (2) 동일한 공급원으로부터의, 예를 들어 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 본질적으로 없으며, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되고, (4) 폴리뉴클레오타이드, 지질, 탄수화물 또는 그것이 천연에서 결합되는 다른 물질의 적어도 약 50%로부터 분리되었으며, (5) 그것이 천연에서 결합되지 않은 폴리펩타이드와 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 작동가능하게 결합되고, 또는 (6) 천연에서 생기지 않는다는 것을 의미한다. 전형적으로, "단리된 단백질"은 주어진 샘플의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25% 또는 적어도 약 50%를 구성한다. 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 다른 RNA, 합성 유래의 핵산, 또는 이들의 임의의 조합은 이러한 단리된 단백질을 암호화할 수 있다. 바람직하게는, 단리된 단백질은 그의 치료적, 진단적, 예방적, 연구 또는 기타 용도를 방해하는 천연 환경에서 발견되는 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 다른 오염물질이 실질적으로 없다.
일부 양상에서, 폴리펩타이드는 항원 결합 단백질(ABP)을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "항원 결합 단백질"("ABP")은 구체화된 표적 항원에 결합하는 임의의 단백질을 의미한다. "항원 결합 단백질"은 항체 및 이의 결합 부분, 예컨대 면역학적으로 기능성인 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 펩티바디는 항원 결합 단백질의 다른 예이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 항체 또는 면역글로불린 쇄(중쇄 또는 경쇄) 항원 결합 단백질의 용어 "면역학적으로 기능성인 단편"(또는 단순히 "단편")은 전장쇄에 존재하는 적어도 일부의 아미노산을 결여하지만 또한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 일부(해당 부분이 얻어지거나 합성되는 방법과 상관없이)를 포함하는 항원 결합 단백질의 종이다. 이러한 단편은 그들이 표적 항원에 결합하고 주어진 에피토프에 대한 결합을 위해 무결함 항체를 포함하는 다른 항원 결합 단백질과 경쟁할 수 있다는 점에서 생물학적으로 활성이다. 몇몇 실시형태에서, 단편은 중화 단편이다. 이들 생물학적으로 활성인 단편은 재조합 DNA 기법에 의해 생성될 수 있거나, 또는 무결함 항체를 포함하는 항원 결합 단백질의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 면역학적으로 기능성인 면역글로불린 단편은 Fab, 다이아바디(동일한 쇄 상에서 두 도메인 간을 짝짓게 하기에 너무 짧은 펩타이드 링커를 통해 연결된 경쇄 가변 도메인과 동일한 폴리펩타이드 상의 중쇄 가변 도메인), Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체 및 단쇄 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 인간, 마우스, 래트, 카멜리드 또는 토끼를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 포유류 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 개시된 항원 결합 단백질의 기능성 부분, 예를 들어, 하나 이상의 CDR은 제2 단백질에 또는 소분자에 공유 결합되어 신체 내 특정 표적과 관련되고 2작용성 치료 특성을 갖거나 또는 장기간의 혈청 반감기를 갖는 치료제를 생성할 수 있었다는 것이 추가로 상정된다. 당업자에 의해 인식될 바와 같이, 항원 결합 단백질은 비단백질 구획을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질 및 항체, 예컨대 변형, 변이체, 제조방법 및 선별방법에 관한 추가적인 상세할 설명은 모든 목적을 위하여 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 공개 제20110027287호에서 찾을 수 있다.
일부 양상에서, 폴리펩타이드는 항체를 포함할 수 있다. 용어 "항체"는 표적 항원에 대한 특이적 결합을 위해 무결함 항체와 경쟁할 수 있고, 예를 들어, 키메라, 인간화된, 완전 인간 및 이중 특이성 항체를 포함하는 임의의 아이소타입의 무결함 면역글로불린 또는 이의 단편을 지칭한다. "항체"는 항원 결합 단백질의 종이다. 무결함 항체 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함할 것이지만, 일부 예에서 더 소수의 쇄, 예컨대 중쇄만을 포함할 수 있는 카멜리드에서 자연적으로 생기는 항체를 포함할 수 있다. 항체는 단일 공급원으로부터만 유래될 수 있거나, 또는 "키메라"일 수 있고, 즉, 항체의 상이한 부분은 두 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 항원 결합 단백질, 항체, 또는 결합 단편은 하이브리도마로, 재조합 DNA 기법에 의해 또는 무결함 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 달리 표시되지 않는 한, 용어 "항체"는 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체에 추가로, 이의 유도체, 변이체, 단편 및 뮤테인을 포함한다. 더 나아가, 달리 명확하게 제외되지 않는 한, 항체는 단클론성 항체, 이중특이성 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체(때때로 본 명세서에서 "항체 모방체"로서 지칭됨), 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 항체 융합(때때로 본 명세서에서 "항체 컨쥬게이트"로서 지칭됨), 및 이들의 단편을 각각 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 용어는 또한 펩티바디를 포함한다.
치료적 유효량의 ABP는 치료가 필요한 대상체에게 투여될 수 있다. ABP는 약제학적 조성물에서 제형화될 수 있다. 이들 조성물은 ABP 중 하나 이상에 추가로, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정제 또는 당업자에게 잘 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비독성이어야 하고, 활성제의 효능을 방해해서는 안 된다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 투여 경로, 예를 들어, 경구, 정맥내, 피부 또는 피하, 비강, 근육내, 복막내 경로에 의존할 수 있다.
경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 젤라틴 또는 애주번트와 같은 고체 담체를 포함할 수 있다. 액체 약제학적 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예컨대 물, 석유, 동물 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성 오일을 포함한다. 생리 식염수 용액, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사 또는 고통 부위의 주사를 위해, 활성 성분은 무발열원이고 적합한 pH, 등장성 및 안정성인 비경구로 허용가능한 수용액의 형태일 것이다. 당업자는, 예를 들어, 등장 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락트산 링거 주사액을 이용하여 적합한 용액을 제대로 제조할 수 있다. 필요하다면, 보존제, 안정제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 포함될 수 있다.
ABP 투여는 바람직하게는 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"(예방이 치료를 고려할 수 있음에도 불구하고, 상기 경우가 있을 수 있음)이며, 이는 개체에에 이점을 보여주기에 충분하다. 투여될 실제양, 및 투여 속도 및 시간-과정은 치료될 질환의 특성 및 중증도에 의존할 것이다. 치료의 처방, 예를 들어 투약량 등에 대한 결정은 일반적 실행자, 의사의 책임 내이며, 전형적으로 치료될 장애, 개개 환자의 병태, 전달 부위, 투여 방법 및 실행자에게 공지된 다른 인자를 고려한다. 상기 언급한 기법 및 프로토콜의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980]에서 찾을 수 있다.
조성물은 단독으로 또는 다른 치료와 조합하여 치료될 병태에 따라서 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
III. 면역 세포
샘플은 면역 세포를 포함할 수 있다. 면역 세포는 T 세포 및 B 세포를 포함할 수 있다. T-세포(T 림프구)는, 예를 들어, T 세포 수용체를 발현시키는 세포를 포함한다. B-세포는, 예를 들어, 활성화된 B 세포, 블라스팅 B 세포, 혈장 세포, 형질아세포, 기억 B 세포, B1 세포, B2 세포, 대역 B 세포, 및 여포성 B 세포를 포함한다. T 세포는 활성화된 T 세포, 블라스팅 T 세포, 헬퍼 T 세포(효과기 T 세포 또는 Th 세포), 세포독성 T 세포(CTL), 기억 T 세포, 중추 기억 T 세포, 효과기 기억 T 세포 및 조절 T 세포를 포함한다. 샘플은 단일 세포 (예를 들어, 단일 T 또는 B 세포) 또는 적어도 1,000, 적어도 10,000, 적어도 100,000, 적어도 250,000, 적어도 500,000, 적어도 750,000 또는 적어도 1,000,000개의 세포를 포함할 수 있다.
A. B 세포
본 명세서에서 사용되는 "B 세포"는 적어도 하나의 재배열된 면역글로불린 유전자 좌위를 갖는 임의의 세포를 지칭한다. B 세포는 적어도 하나의 재배열된 면역글로불린 중쇄 좌위 또는 적어도 하나의 재배열된 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함할 수 있다. B 세포는 적어도 하나의 재배열된 면역글로불린 중쇄 좌위 및 적어도 하나의 재배열된 면역글로불린 경쇄 좌위를 포함할 수 있다. B 세포는 적응 면역계의 부분인 림프구이다. B 세포는 세포 표면 상에서 B-세포 수용체(BCR)로서 또는 분비 항체로서 막결합 형태로 항체를 발현시키는 임의의 세포를 포함할 수 있다. B 세포는 면역글로불린(항체, B 세포 수용체)을 발현시킬 수 있다. 항체는 중쇄 및 경쇄 면역글로불린쇄로부터 형성된 이형이합체를 포함할 수 있다. 중쇄는 불변 영역에 결합되는 가변 영역을 형성하기 위한 가변, 다양성 및 접합부(VDJ) 유전자의 유전자 재배열로부터 형성된다. 경쇄는 가변 및 접합부(VJ) 유전자의 유전자 재배열로부터 형성되어 가변 영역을 형성하고, 이어서 불변 영역에 결합된다. 접합부 조합의 크게 가능한 수 때문에, 항체 유전자(또한 BCR임)의 가변 영역은 큰 밀도를 가져서, B 세포가 임의의 외래 항원을 인식하고 그에 대한 반응을 시작할 수 있게 한다.
B. B-세포 활성화 및 분화
B 세포는 그들이 염증 면역 반응과 관련하여 항원을 인식할 때 활성화되고 분화된다. 그들은 보통 활성화되는 2 신호를 포함한다(하나의 신호는 BCR(재배열된 면역글로불린의 막 결합 형태)을 통해 전달되고, 다른 하나의 신호는 CD40 또는 다른 공자극 분자를 통해 전달됨). 이 2차 신호는 그들의 표면 상에서 CD40(CD40L)에 대한 리간드를 발현시키는 헬퍼 T 세포와의 상호작용을 통해 제공될 수 있다. 이어서, B 세포는 증식되고, 체세포초돌연변이를 겪을 수 있으며, 항체 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 무작위 변화가 이루어지고, 항체가 더 큰 친화도 B 세포를 갖는 B 세포가 선택된다. 그들은 또한 "종류-전환(class-switching)"을 겪을 수 있고, 이때 IgM 아이소타입을 암호화하는 중쇄의 불변 영역은 IgG, IgA 또는 IgE 아이소타입을 암호화하는 불변 영역으로 전환된다. 일부 기억 B 세포가 여전히 IgM 아이소타입을 가짐에도 불구하고, 분화되는 B 세포는 결국 기억 B 세포가 될 수 있는데, 이는 보통 더 높은 친화도를 가지고 종류 전환된다. 기억 B 세포는 또한 활성화될 수 있고, 형질아세포로, 그리고 궁극적으로는 혈장 세포로 분화된다. 분화 B 세포는 또한 처음에 형질아세포로 될 수 있으며, 이어서, 혈장 세포로 분화될 수 있다.
C. 친화도 성숙 및 클론 패밀리
클론 패밀리는 일반적으로 2 이상의 샘플에 의한 관련된 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 V(D)J 서열의 사용에 의해 정해진다. 관련된 면역글로불린 중쇄 V(D)J 서열은 게놈에서 암호화된 V(D)J 유전자 세그먼트의 그들의 공유된 용법에 의해 동정될 수 있다. 클론 패밀리 내에서, 일반적으로 B 세포 유전자 재조합 및 체세포초돌연변이 동안 생길 수 있는 그들의 V(D)J 세그먼트 내에서 공유된 돌연변이에 기반하여 다른 서브패밀리가 있다.
활성화된 B 세포는 그들이 친화도 성숙을 겪는 경우 림프 또는 다른 조직 내에서 이동하고 배중심을 형성한다. B 세포는 또한 배중심 밖의 친화도 성숙을 겪을 수 있다. 친화도 성숙 동안, B 세포는 그들의 항체 유전자에서 무작위 돌연변이를 겪으며, 유전자의 상보성 결정 영역(CDR)에서 농축되는데, 이는 B 세포가 활성화된 표적 항원에 직접 결합하고 인식하는 항체의 부분을 암호화한다. 이는 본래의 클론과 그리고 서로 약간 상이한 면역글로불린을 발현시키는 본래의 증폭 B 세포로부터 서브클론을 생성한다. 항원 및 고친화도 클론과 경쟁하는 클론이 선택되는 한편, 저친화도 클론은 세포자멸사에 의해 사멸된다. 이 과정은 B 세포의 "친화도 성숙"을 야기하고, 결과적으로 더 높은 친화도로 항원에 결합하는 면역글로불린을 발현시키는 B 세포의 생성을 야기한다. 동일한 '모' B 세포로부터 유래된 모든 B 세포는 클론 패밀리를 형성하고, 이들 클론 패밀리는 동일 또는 유사한 항원 에피토프를 인식하는 B 세포를 포함한다. 일부 양상에서, 본 발명자들은 더 높은 빈도로 존재하는 클론이 더 높은 친화도로 항원에 결합하는 클론을 나타낸다는 것을 예상하는데, 가장 높은 친화도 클론이 친화도 성숙 동안 선택되기 때문이다. 일부 양상에서, 상이한 V(D)J 세그먼트 용법을 지니는 클론은 상이한 결합 특징을 나타낸다. 일부 양상에서, 동일한 V(D)J 세그먼트 용법을 지니지만 상이한 돌연변이를 지니는 클론은 상이한 결합 특징을 나타낸다.
D. 기억 B 세포
기억 B 세포는 보통 친화도 성숙 B 세포이고, 종류 전환될 수 있다. 이들은 후속 항원 시험감염에 더 빠르게 반응하여 나이브 유기체에서 대략 14일로부터 대략 7일까지 항원에 대한 친화도 성숙 항체 분비에 대해 포함된 시간을 상당히 감소시킬 수 있는 세포이다.
E. 형질아세포 및 혈장 세포
혈장 세포는 장시간 살 수 있거나 또는 단시간 살 수 있다. 장시간 사는 혈장 세포는 유기체의 수명 동안 생존할 수 있는 반면, 단시간 사는 혈장 세포는 3 내지 4일 동안 지속할 수 있다. 장시간 사는 혈장 세포는 염증 구역에서, 점막 구역에서(IgA-분비 혈장 세포의 경우에), 2차 림프 조직에서(예컨대, 비장 또는 림프절) 또는 골수에 존재한다. 이들 분기 구역에 도달하기 위해, 장시간 사는 혈장 세포가 되게 한 형질아세포를 적절한 구역에 대한 수송에 대해 다양한 케모카인 구배를 이용하기 전에 혈류를 통해 처음 이동시킬 수 있다. 형질아세포는 친화도 성숙인 세포이며, 전형적으로 종류-전환되고, 혈장 세포에 의해 생성된 항체의 양보다 더 낮은 양이긴 하지만, 보통 항체를 분비한다. 혈장 세포는 전용 항체 분비자이다.
F. TCR 및 BCR 유전자의 특징
재조합을 동정하는 것은 각각의 개개 적응 면역 세포뿐만 아니라 그들의 관련된 RNA 전사체의 DNA 중에 존재하기 때문에, RNA 또는 DNA 중 하나가 서열분석될 수 있다. T-세포 또는 B-세포로부터의 재조합 서열은 또한 클론형으로서 지칭될 수 있다. DNA 또는 RNA는 항체를 암호화하는 T-세포 수용체(TCR) 유전자 또는 면역글로불린(Ig) 유전자로부터의 서열에 대응할 수 있다. 예를 들어, DNA 및 RNA는 TCR의 알파, 베타, 감마 또는 델타쇄를 암호화하는 서열에 대응할 수 있다. 대다수의 T-세포에서, TCR은 알파-쇄 및 베타-쇄로 이루어진 이형이합체이다. TCR-알파 쇄는 VJ 재조합에 의해 생성되고, 베타쇄 수용체는 V(D)J 재조합에 의해 생성된다. TCR-베타 쇄에 대해, 인간에서 48 V 세그먼트, 2 D 세그먼트, 및 13 J 세그먼트가 있다. 몇몇 염기는 각각의 두 접합부에서 결실되고 다른 것이 첨가될 수 있다(N 및 P 뉴클레오타이드로 불림). 소수의 T-세포에서, TCR은 감마 및 델타쇄로 이루어진다. TCR 감마 쇄는 VJ 재조합에 의해 생성되고, TCR 델타 쇄는 V(D)J 재조합에 의해 생성된다(Kenneth Murphy, Paul Travers, and Mark Walport, Janeway's Immunology 7th edition, Garland Science, 2007, 본 명세서에 그의 전문이 참고로 포함됨).
상기 방법에서 분석된 DNA 및 RNA는 불변 영역(알파, 델타, 감마, 엡실론 또는 뮤)을 지니는 중쇄 면역글로불린(IgH) 또는 불변 영역 람다 또는 카파를 지니는 경쇄 면역글로불린(IgK 또는 IgL)을 암호화하는 서열에 대응할 수 있다. 각각의 항체는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄를 가질 수 있다. 각각의 쇄는 불변(C) 및 가변 영역으로 구성된다. 중쇄에 대해, 가변 영역은 가변(V), 다양성(D), 및 결합(J) 세그먼트로 구성된다. 각각의 유형의 이들 세그먼트에 대한 몇몇 별개의 서열은 게놈 내에 존재한다. 특이적 VDJ 재조합 사건은 B-세포의 발생 동안 일어나며, 특이적 중쇄를 생성하기 위해 해당 세포를 마킹한다. 경쇄 내 다양성은 D 영역이 없고 따라서 VJ 재조합만이 있다는 것을 제외하고 유사한 방식으로 생성된다. 체세포 돌연변이는 종종 재조합 부위와 가깝게 일어나서, 몇몇 뉴클레오타이드의 첨가 또는 결실을 야기하고, B-세포에 의해 생성된 중쇄 및 경쇄의 다양성을 추가로 증가시킨다. 이어서, B-세포에 의해 생성된 항체의 가능한 다양성은 상이한 중쇄 및 경쇄의 생성물이다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원 인식(또는 결합) 영역 또는 부위를 형성하는데 기여한다. 이 다양성에 일부 에피토프에 대해 특이적 반응이 시작된 후에 생길 수 있는 체세포초돌연변이 과정이 첨가된다. 이 과정에서,돌연변이는 특이적 에피토프를 인식할 수 있는 해당 B-세포에서 생겨서 특이적 에피토프에 더 강하게 결합할 수 있는 항체의 더 큰 다양성을 야기한다. 모든 이들 인자는 B-세포에 의해 생성된 항체의 큰 다양성에 기여한다. 수십억 그리고 아마도 삼십억 이상의 별도의 항체가 생성될 수 있다. T-세포 다양성을 생성하기 위한 기본적 전제는 B-세포에 의해 항체를 생성하기 위한 전제와 유사하다. T-세포 및 B-세포 활성화의 구성요소는 에피토프에 대한 그들의 결합이다. 특이적 세포의 활성화는 클론 확장을 야기하는 더 많은 동일한 유형의 세포의 생성을 야기한다.
상보성 결정 영역(CDR), 또는 초가변 영역은 항원에 결합할 수 있는 항원 수용체(예를 들어, T 세포 수용체 및 면역글로불린)의 가변 도메인 내 서열이다. 각각의 항원 수용체의 쇄는 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 함유한다. T 세포(알파 및 베타) 및 면역글로불린(IgH 및 IgK 또는 IgL)을 생성하는 두 폴리뉴클레오타이드는 3개의 CDR의 형성에 기여한다.
TCR-베타에 의해 암호화된 CDR1 및 CDR2의 부분은 47개의 기능적 V 세그먼트 중 하나 내에 놓인다. CDR의 대부분의 다양성은 CDR3에서 발견되며, 다양성은 T 림프구의 발생 동안 체세포 재조합 사건에 의해 생성된다.
개체간 및 개체 내에 큰 다양성의 BCR이 존재한다. BCR은 항체 중쇄 및 경쇄에 대해 암호화하는 두 유전자 IgH 및 IgK(또는 IgL)로 구성된다. 항원 및 MHC 분자에 결합하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR) 서열은 IgH 및 IgK(또는 IgL)에서 가장 큰 다양성을 가진다. IgH에 대해 암호화된 CDR1 및 CDR2의 부분은 44개의 기능적 V 세그먼트 중 하나 내에 놓여있다. 나이브 B 세포에서 대부분의 다양성은 B 림프구의 발생 동안 체세포 재조합 사건을 통해 CDR3의 생성에서 나타난다. 재조합은 각각의 V, D 및 J 세그먼트 중 하나를 지니는 분자를 생성할 수 있다. 인간에서, 44 V, 27 D 및 6 J 세그먼트가 있으며; 따라서, 7,000개 초과의 조합의 이론적 가능성이 있다. BCR의 소 분획에서(약 5%) 2개의 D 세그먼트가 발견된다. 더 나아가, 큰 정도의 다양성을 생성하는 각각 2개의 접합부에서 몇몇 염기는 결실되고 나머지는 첨가될 수 있다(N 및 P 뉴클레오타이드로 불림). B 세포 활성화 후에 체세포초돌연변이를 통한 친화도 성숙 과정이 일어난다. 이 과정에서 활성화된 B 세포의 자손 세포는 CDR 영역에서 더 높은 돌연변이 농도로 유전자 전체적으로 별도의 체세포 돌연변이를 축적하여 항원에 대해 더 높은 친화도로 항체를 생성하는 것을 야기한다. 체세포초돌연변이에 추가로, 활성화된 B 세포는 아이소타입 전환 과정을 겪는다. 동일한 가변 세그먼트를 지니는 항체는 불변 세그먼트에 따라서 상이한 형태(아이소타입)를 가질 수 있다. 모든 나이브 B 세포는 IgM(또는 IgD)를 발현시키는 반면, 활성화된 B 세포는 대부분 IgG뿐만 아니라 IgM, IgA 및 IgE를 발현시킨다. IgM(및/또는 IgD)으로부터 IgG, IgA 또는 IgE까지의 이런 발현 전환은 재조합 사건을 통해 일어나서 특이적 아이소타입을 생성함에 있어서 하나의 세포가 전문화되도록 한다. 각각의 IgM, IgD 및 IgE에 대해 하나의 세그먼트, IgA에 대해 2개의 세그먼트, 및 IgG에 대해 4개의 세그먼트가 있다.
IV. 컴퓨터 실행
일부 양상에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법은 컴퓨터 상에서 실행될 수 있다. 일 실시형태에서, 컴퓨터는 칩셋에 결합된 적어도 하나의 프로세서를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 칩셋은 메모리, 저장 장치, 키보드, 그래픽 어댑터, 위치 결정 장치 및/또는 네트워크 어댑터에 결합된다. 디스플레이는 전형적으로 그래픽 어댑터에 결합된다. 일 실시형태에서, 칩셋의 기능성은 기억 컨트롤러 허브 및 I/O 컨트롤러 허브에 의해 제공된다. 다른 실시형태에서, 메모리는 칩셋 대신에 프로세서에 직접 결합된다.
저장 장치는 하드 디스크, 컴팩트 디스크 읽기 전용 메모리(CD-ROM), DVD, 또는 고체 상태 메모리 장치와 같이 데이터를 보유할 수 있는 임의의 장치이다. 메모리는 설명서 및 프로세서에 의해 사용된 데이터를 보유한다. 위치 결정 장치는 마우스, 트랙볼 또는 다른 유형의 위치 결정 장치일 수있으며, 컴퓨터 시스템 내로 데이터를 입력하기 위해 키보드와 함께 사용된다. 그래픽 어댑터는 이미지 및 기타 정보를 디스플레이 상에 보여준다. 네트워크 어댑터는 국소 또는 광역 네트워크에 컴퓨터 시스템을 결합한다.
당업계에 공지된 바와 같이, 컴퓨터는 앞서 기재한 것과 상이하고/하거나 다른 부품을 가질 수 있다. 추가로, 컴퓨터는 특정 부품이 없을 수 있다. 게다가, 저장 장치는 지역적이고/이거나 컴퓨터로부터 원거리(예컨대 저장 지역 네트워크(storage area network: SAN) 내에서 구현됨)에 있을 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같이, 컴퓨터는 본 명세서에 기재된 기능성을 제공하기 위해 컴퓨터 프로그램 모듈을 실행하는데 적합하다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "모듈"은 구체화된 기능성을 제공하기 위해 이용되는 컴퓨터 프로그램 로직(computer program logic)을 지칭한다. 따라서, 분자는 하드웨어, 펌웨어 및/또는 소프트웨어에서 실행될 수 있다. 일 실시형태에서, 프로그램 모듈은 저장 장치에 저장되고, 메모리에 부하된 다음, 프로세서에 의해 실행된다.
본 명세서에 기재된 독립체의 실시형태는 본 명세서에 기재된 것과 다른 및/또는 상이한 모듈을 포함할 수 있다. 추가로, 모듈에 기인하는 기능성은 다른 실시형태에서 다른 또는 상이한 모듈에 의해 수행될 수 있다. 게다가, 이 설명은 때때로 명확함 및 편리함의 목적을 위해 용어 "모듈"을 생략한다.
V. 키트
본 명세서에 기재된 어댑터 작제물을 포함하는 키트가 본 명세서에 추가로 개시된다. 키트는 본 명세서에 기재된 어댑터 작제물에 결합된 복수의 고체 지지체를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는 복수의 어댑터 주형을 포함하는 어댑터 주형 라이브러리를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는 복수의 고체 지지체에 결합된 복수의 어댑터 주형을 포함하는 어댑터 주형 라이브러리를 포함한다. 키트는 효소 반응에 의해 어댑터 주형 작제물로부터 본 명세서에 기재된 어댑터 분자(예를 들어, 바코드 어댑터 분자)를 생성하기 위한 효소를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는 본 명세서에 기재된 세포 현탁 완충제를 포함한다.
키트는 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 라이브러리, 벡터 및/또는 숙주 세포 및 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 본 명세서에 개시된 적합한 용기에서, 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 라이브러리, 벡터 및/또는 숙주 세포, 하나 이상의 대조군 및 다양한 완충제, 시약, 효소 및 당업계에 잘 공지된 다른 표준 성분을 포함할 수 있다.
상기 용기는 하나 이상의 웰을 포함하는 플레이트 상에서 적어도 하나의 웰을 포함할 수 있다. 상기 용기는 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 보틀, 주사기 또는, 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 라이브러리, 벡터 및/또는 숙주 세포가 배치될 수 있고, 일부 예에서 적합하게 분취되는 다른 용기 수단을 포함할 수 있다. 추가적인 구성성분이 제공되는 경우, 키트는 이 구성성분이 배치될 수 있는 추가적인 용기를 함유할 수 있다. 키트는 또한 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 라이브러리, 벡터 및/또는 숙주 세포를 수용하기 위한 수단 및 상업적 판매용의 단단히 밀봉한 임의의 다른 시약 용기를 포함할 수 있다. 이러한 용기는 목적으로 하는 바이알이 보유된 사출 성형 또는 중공 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다. 용기는 사용 및/또는 경고를 위한 지침을 지니는 라벨링을 포함할 수 있다.
VI. 장치
본 발명의 실시형태는 반응 용적을 생성 및 수송하는 장치를 포함한다. 이들 용적은 미세유체 규모로 생길 수 있고, 담체 유체로부터 상분리될 수 있다. 장치에 의해 조절될 수 있는 반응 용적의 예는 역유화(즉, 물/오일 에멀전)에서 수성 점적을 포함한다. 상기 장치는 바코드 어댑터 주형, 바코드 어댑터 분자, 샘플(예를 들어, 세포) 및/또는 이들 샘플로부터 얻은 RNA가 별개로 또는 함께 점적 내에서 캡슐화되게 한다. 상기 장치는 또한 시약이 점적 내로 도입되게 하고, 따라서 바코드 어댑터 분자는 효소적으로 생성될 수 있고, 개개 샘플로부터의 RNA는 바코딩될 수 있다.
본 명세서에서 사용되고 청구되는 장치의 비제한적 예는 도 17 내지 도 19에서 도시된다. 당업자는 이들 장치의 변형이 또한 본 방법에서 구성되고 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 장치는 일반적으로 압력 공급원 및 유동 센서에 각각 결합된 3개의 미세유체 경로를 포함한다. 미세유체 경로에 대한 압력 공급원은 경로를 통해 유체를 구동하고, 압력 공급원 하류에서 생기는 유동센서는 경로를 통한 유동 속를 측정하는데 사용될 수있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 경로(101)와 제2 경로(102)는 제1 접합부(104)에서 합쳐져서 조합된 경로를 형성하고, 이는 이어서, 제2 접합부(105)에서 제3 경로(103)와 합쳐진다. 제2 접합부는 미세유체 점적 칩에서 생기며, 미세유체 점적이 생기는 부위일 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 장치는 IDEX 코포레이션사(IDEX Corporation)(미국 일리노이주 레이크 포러스트에 소재)로부터 이용가능한 관 및 유체로부터, 그리고 돌로마이트 마이크로플루이딕스사(Dolomite Microfluidics)(미국 매사추세츠주 샤를스타운에 소재)로부터 입수가능한 미세유체 점적칩을 이용하여 조립될 수 있다. 미세유체 점적 칩의 일부 특징은 미국 특허 제7,268,167호, 제7,375,140호, 제7,717,615호, 제7,772,287호, 제8,741,192호, 및 제8,883,864호에 기재되어 있으며, 이들은 본 명세서에 참고로 포함된다. 적합한 압력 공급원은 주사기 펌프 및 압력 펌프를 포함한다. 압력 펌프는 돌로마이트 마이크로플루이딕스사로부터 입수가능하다. 압력 공급원은 독립적으로 제어될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 제1 미세유체 경로 및 제2 미세유체 경로는 수용액을 수송한다. 각각의 경로는 경로를 따라 주입 포트에 도입된 용액을 가져오기 위해 주입 포트 및 밸브(예를 들어, 4원 밸브)를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 수성 담체 유체를 보유하는 저장소는 각각의 4원 밸브의 상류에 배치된다. 담체 유체가 하류에서 구동되거나, 또는 제1 접합부에 대해 하류에 수용액의 플러그를 밀어냄에 따라 수성 담체 유체는 4원 밸브에서 수용액과 혼합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 유동 저항기는 각각의 미세유체 경로에 배치된다.
일단 수용액이 제1 또는 제2 미세유체 경로 내로 도입되면, 제1 접합부에 대한 용액의 유동을 측정하는 샘플 루프를 통과할 수 있다. 원한다면, 예를 들어 샘플 루프를 따라 배치된 유동 저항 또는 밸브를 이용하여 측정이 달성될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 하나의 샘플 루프는 제1 미세유체 경로 및 제2 미세유체 경로의 각각과 연결되고, 샘플 루프는 열 냉각 유닛과 접촉된다. 열 냉각 유닛은 수용액 중에서 효소, 핵산 또는 다른 생물학적 구성요소의 열변성을 방지하기 위해 또는 효소 반응에 대한 최적의 온도를 확립하기 위해 포함될 수 있다. 제1 미세유체 경로 및 제2 미세유체 경로에 대해 샘플 루프와 접촉되는 열 냉각 유닛의 일부는 독립적으로 또는 공동으로 제어될 수 있다. 임의의 물질 또는 장치는 열 냉각 유닛으로서 사용될 수 있으며, 단, 샘플 루프를 통해서 수용액의 온도가 주위 온도로부터 벗어나게 할 수 있다. 적합한 열 냉각 장치의 예는 펠티에 소자 및 얼음 보관함이다.
몇몇 실시형태에서, 제1 미세유체 경로를 통해 수송된 수용액은 세포 및 바코드 어댑터 주형 비드를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 미세유체 경로를 통해 수송된 수용액은 세포 용해용 시약 및 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위한 시약(예를 들어, 바코드 어댑터 분자를 생성하기 위한 효소)을 함유한다. 각각의 미세유체 경로와 결합된 주입 포트, 밸브,및/또는 샘플 루프는 해당 경로를 통과한 수용액의 내용물을 수용하도록 구성되거나 또는 맞춤될 수 있다. 예를 들어, 제1 미세유체 경로와 결합된 샘플 루프는 확장된 내부 직경을 가져서 세포 및 비드를 수용할 수 있다. 제1 미세유체 경로와 제2 미세유체 경로 사이에 세포, 비드 및 시약을 배정하기 위한 다수의 다른 선택사항이 존재하고, 따라서 모든 이들 구성성분이 제1 접합부와 조합된다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 세포는 제1 미세유체 경로를 통해 수송될 수 있고, 비드는 제2 미세유체 경로를 통해 수송될 수 있다. 원한다면 운반하는 수용액의 함량을 고려하여 각각의 경로가 구성될 수 있다.
제1 미세유체 경로와 제2 미세유체 경로의 합침으로부터 초래된 조합된 경로는 결국 미세유체 점적 칩에서 제3 미세유체 경로와 합쳐진다. 이는 제1 접합부로부터 하류인 제2 접합부에서 일어난다. 임의의 목적으로 하는 거리가 제1 접합부와 제2 접합부 사이에 확립될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1 접합부는 미세유체 점적 칩 내에 위치된다. 몇몇 실시형태에서, 제1 접합부는 제2 접합부의 바로 상류에 있으며, 따라서 조합 경로 내의 유체는 제3 미세유체 경로로부터의 유체와 조합되기 전에 무시할 만한 거리(예를 들어, 10, 3, 1, 0.3 또는 0.1cm 미만) 를 이동한다. 배열은 조합된 경로에서 구성성분의 혼합을 감소시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 미세유체 점적 칩 내부 및/또는 외부의 장치에서 미세유체 경로의 치수는 유체의 이동이 층류에 의해 지배되게 하는 것이다.
제3 미세유체 경로는 오일/계면활성제 혼합물을 미세유체 점적 칩에 전달하도록 구성될 수 있다. 따라서, 장치 내 제2 접합부에서, 수성 및 소수성 상은 혼합될 수 있고, 미세유체 점적이 형성될 수 있다. 제2 접합부의 기하구조는 이들 점적이 목적으로 하는 특징을 갖는 것을 보장하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 기하구조는 미세유체 경로에서의 적합한 유동 속도에서 목적으로 하는 크기를 갖고 목적으로 하는 거리만큼 서로로부터 이격된 단분산 점적의 형성을 용이하게 하도록 선택될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제3 미세유체 경로는 미세유체 점적 칩 상류에서 2개의 하위 경로로 분할되고, 이는 이어서 제2 접합부에서 조합된(수성) 경로를 따라서 함께 합쳐진다. 2개의 하위경로는 서로 큰 각도로(예를 들어, 대략 또는 적어도 30, 60, 90, 120, 150 또는 180도) 접근할 수 있고, 따라서 오일/계면활성제 혼합물은 그것이 제2 접합부로 유입됨에 따라 수성 혼합물 주위에 피복을 형성한다. 이 기하구조에 의해, 수성 점적은 수성 혼합물로부터'꺼내지고' 그들이 접합부를 나감에 따라 수성 혼합물과 거의 동일한 방향으로 유동한다. 점적을 생성하는 이런 접근은 유동 포커싱으로서 당업계에 공지되어 있다. 다른 실시형태에서, 조합된 수성 경로는 직각으로 제3 미세유체 경로와 교차되고, 따라서 제2 접합부를 t-접합부 기하구조에 제공한다. 이들 실시형태에서, 오일/계면활성제 혼합물은 접합부를 통해 곧장 유동한다. 수성 혼합물은 이 혼합물로부터 형성된 점적이 접합부로부터 휩쓸리는 것과 수직 방향으로 접합부에 접근한다. 다양한 미세유체 기하구조에서의 점적 형성의 물리학은 문헌[Thorsen et al., Phys. Rev. Lett . 86, 4163-4166, 2001] 및 다른 곳에 기재되어 있다..
수성 혼합물을 함유하는 조합된 경로와 오일/계면활성제 혼합물을 함유하는 제3의 미세유체 경로를 합침으로써 초래되는 점적을 함유하는 유체 경로는 샘플 경로를 구성한다. 샘플 경로는 샘플 수집 용기로 전달되는데, 이는 제2 접합부의 하류에서 일어난다. 샘플 수집 용기에서, 점적은 열 순환이 실시될 수 있다. 점적은 또한 파괴하여 열 수 있고, 바코딩된 핵산은 채취될 수 있다.
작동 시, 본 명세서에 기재된 장치는 바코드 어댑터 주형 비드 및 세포를 수성 미세유체 점적 내로 캡슐화하는데 사용될 수 있고, 따라서 각각의 점적은 평균적으로 대략 하나의 비드 및 하나의 세포를 함유한다. 각각의 점적에서 비드 및 세포의 수는 원한다면, 예를 들어 장치 내로 장입된 비드 또는 세포의 농도를 조절함으로써, 또는 3개의 미세유체 경로에서 유동 속도를 조절함으로써 조정될 수 있다. 각각의 점적에 포함된 시약은 바코드 어댑터 분자가 점적 내 하나의 비드로부터 효소적으로 생성되게 한다. 이들 시약은 또한 하나의 세포가 용해되게 하며, 세포로부터의 RNA가 바코딩 반응을 겪게 한다. 따라서, 세포로부터의 RNA는 점적 내에서 바코딩될 수 있고, 이들 RNA로부터 유래된(그리고 바코드 서열을 함유하는) 핵산은 이후에 다중 세포로부터의 핵산이 혼합될 때 하나의 세포에 대해 추적될 수 있다.
VII. 실시예
A. 실시예 1: 단일 반응에서 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리의 제조.
각각의 비드에 고유 바코드 어댑터 주형을 부착하기 위해 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행한 경우, 에멀전 PCR을 이용하는 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리를 생성하기 위해 이하에 기재한 방법을 사용하였다(도 15 참조).
단일 반응에서 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리를 제조하기 위해 사용한 올리고
프라이머 명칭 서열(서열번호)
emB-T7브릿지2 이중-바이오틴-C18스페이서-C18스페이서-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAT AAA GCG GCC GCA AAT (1)
emB-BC브릿지2 mCmCC CCT GTT TAA ACC THH HTH HHH THH HHT HHH THH
HHA TTT GCG GCC GCT TTA T (2) (HH HTH HHH THH HHT HHH THH HH (3)의 무작위 조합은 318 또는 387 x106 가능성을 가져서, 3억 8천 7백만개의 고유 바코드를 제공한다)
emB-T7무 브릿지(bridgefree) TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAT AAA GCG GCC GCA AAT (4)
emB-Rv3 알렉사플루오르(AlexaFluor)647-C18스페이서-mCmCC CCT GTT TAA ACC T (5)
스트렙타비딘-코팅된 M-270 Dyna비드(등록상표)(라이프 테크놀로지즈(라이프 테크놀로지즈)를 바이오티닐화된 올리고뉴클레오타이드("emB_T7브릿지2")와 결합하였다:
1. 비드를 부드럽게 교반시킴으로써 재현탁시켰다
2. 1㎖의 M270 비드(대략 6.7 x 108개 비드)를 총 3㎖에 대해 각각 3개의 1.5㎖ 마이크로원심분리관에 넣었다.
3. 3분 동안 자기에 두었다.
4. 각각의 관으로부터 상청액을 제거하고 나서, 1㎖(1x 용적) 결합/세척 완충제(BWB; 1M NaCl, 5mM 트리스, 0.5mM EDTA) 중에서 재현탁시켰다
5. 단계 4를 2회 이상 반복한 다음에, 540㎕ 용적 BWB 중에서 최종 재현탁시켰다
6. 60㎕의 100μM emB_T7브릿지2를 비드에 첨가하고 나서, 부드럽게 교반시키면서 15분 동안 인큐베이션시켰다
7. 인큐베이션 후에, 비드를 1㎖ BWB 완충제로 3x 세척하였고, 단일관에 합하였다
8. 비드를 4℃에서 0.01% 아자이드나트륨과 함께 저장하였다
9. 비드를 사용 전에 10mM 트리스로 3회 세척하였다.
바코드 올리고뉴클레오타이드 및 정방향 및 역방향 프라이머를 에멀전-기반 PCR에서 상기로부터의 결합된 비드에 첨가하였다:
1. 다음의 PCR 혼합물(3㎖ 총 용적)을 3개의 1.5㎖ 마이크로원심분리관(VWR 카탈로그 번호 20170-650)에서 제조하였다:
ddH2O 715.9㎕
10X HiFi PCR 완충제 100㎕
50mM MgSO4 50㎕
10mM dNTP 혼합물 20㎕
emB_T7브릿지2-표지된 다이나비즈(Dynabeads)(1.2x107 비드/㎕) 50㎕
emB_T7무 브릿지(10μM) 4㎕
emB_BCand브릿지2 (1 pM) 16.6㎕
emB_Rv3(100μM) 30㎕
열안정성 무기 파이로포스파타제(NEB 2,000단위/㎖) 1.5㎕
백금 태그 Hifi(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 5 단위/㎕) 12㎕
총 용적 1000㎕
2. 오일-계면활성제 혼합물을 준비하였다(1㎖ 총 용적):
a. 광유(시그마(Sigma)) 900㎕
b. EM90(에보닉(Evonik)) 100㎕
3. 800㎕의 오일-계면활성제 혼합물 및 200㎕의 PCR 혼합물을 각각의 15 악시겐(Axygen) 2.0㎖ 맥시뭄 리커버리 코니칼형(Maxymum Recovery conical-bottom) 원심분리관(MCT-200 내지 L-C) 내로 합하였다. 관을 밀봉하고, 3초 동안 진탕시켰다.
4. 관을 퀴아젠 조직용해기 II(Qiagen TissueLyzer II)에 넣고, 5분 동안 14㎐에서 진탕시켰다
5. 에멀전을 VWR 96-웰 PCR 플레이트(83007-374)의 웰 중에서 나누고, 160㎕의 에멀전을 웰마다 첨가하였다
6. 다음의 프로그램을 이용하여 관을 열순환시켰다:
Figure pct00010
에멀전을 파괴하고, 비드를 회수하였다:
1. PCR 플레이트의 내용물을 관마다 0.5㎖ 이하의 에멀전 용적을 지니는 1.5㎖ 마이크로원심분리관(VWR 20170-650) 내로 옮겼다
2. 100㎕의 1μM emB_T7무 브릿지 프라이머를 각각의 관에 첨가하였다
3. 관을 아이소부탄올로 가득채우고, 밀봉하고 나서, 진탕시켜 철저하게 혼합하였다
4. 관을 1분 동안 14,000rpm에서 원심분리시켰다
5. 관을 자기 스트립 상에 두어서 관의 측면에 대해 비드를 끌어당기고, 이어서, 가능한 많은 상청액을 흡입하는 한편, 펠렛화된 비드를 뒤에 남겨두었다
6. 1㎖의 아이소부탄올을 첨가하고, 남아있는 오일/에멀전 용적이 아이소부탄올 내로 분산될 때까지 위아래로 피펫팅함으로써 혼합하였다
7. 관을 자기 스트립 상에 두어서 관의 측면에 비드를 끌어당기고, 이어서, 아이소부탄올을 흡입하였다. 비드가 조합되는 관으로부터의 상청액을 처음에 흡입함으로써 모든 관으로부터의 비드를 단일관 내로 합하였고, 이어서, 다른 관으로부터의 전체 용적을 옮겨서, 비드가 자기에서 수집되는 시간을 허용하고, 이어서, 상청액을 흡입한 다음 반복한다
8. 1㎖의 새로운 아이소부탄올을 첨가하고 나서, 잘 혼합하고, 60초 동안 둔다
9. 아이소부탄올을 흡입하였다
10. 1㎖의 100% 에탄올을 첨가하고 나서, 잘 혼합하고, 60초 동안 둔다
11. 에탄올을 흡입하였다
12. 단계 10 및 11을 반복하였다
13. 1㎖의 70% 에탄올을 첨가하고 나서, 잘 혼합하고, 60초 동안 둔다
14. 에탄올을 흡입하였다
15. 단계 13 및 14를 반복하였다
16. 1㎖ PBS를 첨가하고 나서, 잘 혼합하고, 60초 동안 둔다.
17. PBS를 흡입하였다
18. 단계 16 및 17을 반복하였다
이어서, 바코드 어댑터 주형이 혼입된 비드를 emB_Rv3 역방향 프라이머 내로 혼입된 알렉사 플루오르 647 염료로부터의 형광을 이용하여 벡톤 디켄슨 FACS 아리아 III(Becton Dickenson FACS Aria III)을 사용하여 비-바코딩 비드로부터 분류하였다.
비드를 4℃에서 저장을 위해 0.01% 아자이드나트륨에서 저장하였다.
이 실시예는 T7 RNAP에 의한 바코드 어댑터의 증폭을 위해 T7 RNAP 프로모터 서열을 지니는 바코드 어댑터 주형 비드를 제조한다는 것을 주목한다. emB-T7브릿지2에서 T7 RNAP 프로모터 서열 "TAA TAC GAC TCA CTA TAG G"(서열번호 6)를 다른 RNAP 프로모터 서열로 대체함으로써, 다른 RNAP를 이용하여 바코드 어댑터를 증폭시킬 수 있다. 또한 프로모터 서열을 틈내기 엔도뉴클레아제 부위, 예컨대 Nt.BbvCI의 "CCT CAG C"로 대체함으로써, 틈내기 엔도뉴클레아제(예를 들어 Nt.BbvCI) 및 가닥-치환 DNAP, 예컨대 클레노브 엑소-를 이용하여 바코드 어댑터를 증폭시킬 수 있다.
또한, emB-BC브릿지2에서 "HH HTH HHH THH HHT HHH THH HH"(서열번호 3)는 대략 3억 8천 7백만개의 고유 바코드를 제공한다. 심지어, 예를 들어, 1천만개의 세포를 바코딩하기 위해 이 바코드 라이브러리를 사용할 때, 단지 2.5%의 고유 바코드를 사용한다. 넥스트겐 서열분석으로부터의 대다수의 바코드 서열 판독이 PCR 및 서열분석 오류와 상관없이 서로로부터(판독의 일부는 폐기됨) 용이하게 구별될 수 있도록 대다수의 바코드가 서로로부터 충분한 거리를 갖는 것을 예상한다.
에멀전은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 생성할 수 있고, 이 경우에 진탕 방법을 이용하여 생성되며, 얻어진 점적은 다분산되며, 대략 25㎛의 평균 점적 직경을 지닌다. 바코드 올리고뉴클레오타이드를 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 증폭시키고, 역방향 프라이머를 형광 태그(이 실시예에서, 알렉사 플루오르 647임)로 표지하며, 따라서 바코드 어댑터 주형이 혼입된 비드는 비표지 비드와 구별될 수 있다. 이어서, 바코드 어댑터 주형이 혼입된 밝은 형광 비드는 흐릿한 비표지 비드로부터 분류된 FACS였다.
이 실시예에서 비드 및 바코드 올리고뉴클레오타이드의 구체화된 농도에서, 푸아송 분포에 의해 비드를 평균적으로 점적 당 대략 7개의 비드로 점적 내에 로딩하고, 본 발명자들은 거의 28%의 점적이 고유 바코드 올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 복제물을 함유하는 한편, 점적의 나머지는 바코드 올리고뉴클레오타이드를 전혀 함유하지 않았다는 것을 관찰하였다. 적어도 하나의 바코드 올리고뉴클레오타이드를 함유한 점적 중에서, 대략 70%는 정확하게 하나의 바코드 올리고뉴클레오타이드를 함유하여야 하는 반면, 남아있는 대략 30%는 2 이상의 바코드를 함유하여야 한다. 따라서, 대략 70%의 바코드 주형 어댑터 비드 라이브러리는 단클론성(비드 당 하나의 고유 바코드 서열)이고 대략 30%는 다클론성이었다.
이하에 기재하는 방법의 최종 수율은 거의 1천 2백만개의 바코드 어댑터 주형 비드이며, 이 중 8백 4십만개는 단클론성 바코드 어댑터 주형 비드이다. 그리고 점적이 평균적으로 점적 당 대략 7개 비드로 채워짐에도 불구하고, 에멀전의 파괴 후 비드의 수율은 대략 2%였다. 이항분포에 기반하여, 7백 7십만개의 고유 바코드 서열이 이 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리에 존재하였다.
비드 및 바코드 올리고뉴클레오타이드의 농도를 조절하여 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리를 얻을 수 있고, 단클론성 및 다클론성 비드의 비율은 상이하고, 상이한 수의 고유 바코드 서열이 존재한다. 이는 단일 세포로부터의 핵산 바코딩을 가능하게 하여 고유 바코드, 또는 고유 바코드의 세트를 통해 단일 세포와 결합된 상이한 비율의 핵산을 달성할 것이고, 또한 추가 분석으로부터 폐기되는 바코딩된 핵산의 비율을 변화시킬 것이다.
이 바코드 어댑터 주형 비드 제조 과정은, 예를 들어, 90%:10%, 99%:1%, 또는 임의의 다른 비의 단클론성:다클론성 비드의 비를 달성하도록 최적화될 수 있다. 현재 대략 70%:30% 비에 걸친 이런 개선은 바코드 서열(이 경우에 emB-BC브릿지2)을 함유하는 올리고의 추가 희석을 포함하는 몇몇 상이한 방법에 의해 달성할 수 있고, 따라서 소수의 복제물이 에멀전 중의 점적 중에서 분할되어, 임의의 주어진 점적에서 캡슐화되는 다중 바코드 서열의 감소된 발생률을 초래한다.
B. 실시예 2: 단일 반응 II에서 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리의 제조.
에멀전 PCR을 이용하여 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리를 생성하기 위해 이하에 기재하는 방법을 사용하였고, 여기서 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하여 고유 바코드 어댑터 주형을 각각의 비드에 부착하였다(도 15 참조).
단일 반응 II에서 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리를 제조하기 위해 사용한 올리고
프라이머 명칭 서열(서열번호)
emB-T7브릿지IsceI 이중-바이오틴-C18스페이서-C18스페이서-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAT AGG GAT AAC AGG GTA ATA GGA (7)
emB_BC브릿지ISceI_2 mCmCC CCA GTT TAA ACT CCTH HHT HHH HTH HHH THH HTH HHH TCC TAT TAC CCT GTT ATC CC (8)
(HH HTH HHH THH HHT HHH THH HH (3)의 무작위 조합은 318 또는 387 x106가지의 가능성을 가져서, 3억 8천 7백만개의 고유 바코드를 제공한다)
emB-
T7무 브릿지IsceI_2		 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAT AG GGATAACAGGGTAATAGGA (9)
emB_IsceI_RV 알렉사플루오르647-C18스페이서-mCmCC CCA GTT TAA ACT CCT (10)
스트렙타비딘-코팅된 M-270 다이나비즈(등록상표)(라이프 테크놀로지즈)를 바이오티닐화된 올리고뉴클레오타이드("emB_T7브릿지IsceI")와 결합하였다:
1. 비드를 부드럽게 교반시킴으로써 재현탁시켰다
2. 1㎖의 M270 비드(대략 6.7 x 108개 비드)를 총 3㎖에 대해 각각 3개의 1.5㎖ 마이크로원심분리관에 넣었다
3. 3분 동안 자기에 두었다.
4. 각각의 관으로부터 상청액을 제거하고 나서, 1㎖(1x 용적) 결합/세척 완충제(BWB; 1M NaCl, 5mM 트리스, 0.5mM EDTA) 중에서 재현탁시켰다
5. 단계 4를 2회 이상 반복한 다음에, 540㎕ 용적 BWB 중에서 최종 재현탁시켰다
6. 60㎕의 100μM emB_T7브릿지Isce를 비드에 첨가하고 나서, 부드럽게 교반시키면서 15분 동안 인큐베이션시켰다.
7. 인큐베이션 후에, 비드를 1㎖ BWB 완충제로 3x 세척하였고, 단일관에 합하였다
8. 비드를 4℃에서 0.01% 아자이드나트륨과 함께 저장하였다
9. 비드를 사용 전에 10mM 트리스로 3회 세척하였다
바코드 올리고뉴클레오타이드 및 정방향 및 역방향 프라이머를 에멀전-기반 PCR에서 상기로부터의 결합된 비드에 첨가하였다:
1. 다음의 PCR 혼합물(3㎖ 총 용적)을 3개의 1.5㎖ 마이크로원심분리관(VWR 카탈로그 번호 20170-650)에서 제조하였다:
ddH20 715.9㎕
10X HiFi PCR 완충제 100㎕
50mM MgSO4 50㎕
10mM dNTP 혼합물 20㎕
emB_T7브릿지IsceI-표지된 다이나비즈 (1.2x107 비드/㎕) 50㎕
emB_T7무 브릿지IsceI_2 (10μM) 4㎕
emB_BC브릿지ISceI_2 (1 pM) 16.6㎕
emB_IsceI_RV (100μM) 30㎕
열안정성 무기 파이로포스파타제(NEB 2,000단위/㎖) 1.5㎕
백금 태그 Hifi(라이프 테크놀로지즈, 5 단위/㎕) 12㎕
총 용적 1000㎕
2. 오일-계면활성제 혼합물을 준비하였다(1㎖ 총 용적):
a. 광유(시그마(Sigma)) 900㎕
b. EM90(에보닉) 100㎕
3. 800㎕의 오일-계면활성제 혼합물 및 200㎕의 PCR 혼합물을 각각의 15 악시겐 2.0㎖ 맥시뭄 리커버리 코니칼형 원심분리관(MCT-200 내지 L-C) 내로 합하였다. 관을 밀봉하고, 3초 동안 진탕시켰다
4. 관을 퀴아젠 조직용해기 II에 넣고, 5분 동안 14㎐에서 진탕시켰다
5. 에멀전을 VWR 96-웰 PCR 플레이트(83007-374)의 웰 중에서 나누고, 160㎕의 에멀전을 웰마다 첨가하였다
6. 다음의 프로그램을 이용하여 관을 열순환시켰다:
Figure pct00011
에멀전을 파괴하고, 비드를 회수하였다:
1. PCR 플레이트의 내용물을 관마다 0.5㎖ 이하의 에멀전 용적을 지니는 1.5㎖ 마이크로원심분리관(VWR 20170-650) 내로 옮겼다
2. 100㎕의 1μM emB_T7무 브릿지IsceI_2 프라이머를 각각의 관에 첨가하였다
3. 관을 아이소부탄올로 가득채우고, 밀봉하고 나서, 진탕시켜 철저하게 혼합하였다
4. 관을 1분 동안 14,000rpm에서 원심분리시켰다
5. 관을 자기 스트립 상에 두어서 관의 측면에 대해 비드를 끌어당기고, 이어서, 가능한 많은 상청액을 흡입하는 한편, 펠렛화된 비드를 뒤에 남겨두었다
6. 1㎖의 아이소부탄올을 첨가하고, 남아있는 오일/에멀전 용적이 아이소부탄올 내로 분산될 때까지 위아래로 피펫팅함으로써 혼합하였다
7. 관을 자기 스트립 상에 두어서 관의 측면에 비드를 끌어당기고, 이어서, 아이소부탄올을 흡입하였다. 비드가 조합되는 관으로부터의 상청액을 처음에 흡입함으로써 모든 관으로부터의 비드를 단일관 내로 합하였고, 이어서, 다른 관으로부터의 전체 용적을 옮겨서, 비드가 자기에서 수집되는 시간을 허용하고, 이어서, 상청액을 흡입한 다음 반복한다
8. 1㎖의 새로운 아이소부탄올을 첨가하고 나서, 잘 혼합하고, 60초 동안 둔다
9. 아이소부탄올을 흡입하였다
10. 1㎖의 100% 에탄올을 첨가하고 나서, 잘 혼합하고, 60초 동안 둔다
11. 에탄올을 흡입하였다
12. 단계 10 및 11을 반복하였다
13. 1㎖의 70% 에탄올을 첨가하고 나서, 잘 혼합하고, 60초 동안 둔다
14. 에탄올을 흡입하였다
15. 단계 13 및 14를 반복하였다
16. 1㎖ PBS를 첨가하고 나서, 잘 혼합하고, 60초 동안 둔다.
17. PBS를 흡입하였다
18. 단계 16 및 17을 반복하였다
이어서, 바코드 어댑터 주형이 혼입된 비드를 emB_IsceI_RV 역방향 프라이머 내로 혼입된 알렉사 플루오르 647 염료로부터의 형광을 이용하여 벡톤 디켄슨 FACS 아리아 III을 사용하여 비-바코딩 비드로부터 분류하였다.
비드를 4℃에서 저장을 위해 0.01% 아자이드나트륨에서 저장하였다.
이 실시예는 T7 RNAP에 의한 바코드 어댑터의 증폭을 위해 T7 RNAP 프로모터 서열을 지니는 바코드 어댑터 주형 비드를 제조한다는 것을 주목한다. emB-T7브릿지IsceI에서 T7 RNAP 프로모터 서열 "TAA TAC GAC TCA CTA TAG G"(서열번호6)를 다른 RNAP 프로모터 서열로 대체함으로써, 다른 RNAP를 이용하여 바코드 어댑터를 증폭시킬 수 있다. 또한 프로모터 서열을 틈내기 엔도뉴클레아제 부위, 예컨대 Nt.BbvCI의 "CCT CAG C"로 대체함으로써, 틈내기 엔도뉴클레아제(예를 들어 Nt.BbvCI) 및 가닥-치환 DNAP, 예컨대 클레노브 엑소-를 이용하여 바코드 어댑터를 증폭시킬 수 있다.
또한, emB-BC브릿지IsceI_2 중의 "HH HTH HHH THH HHT HHH THH HH"(서열번호3)는 3억 8천 7백만개의 고유 바코드를 제공한다. 심지어, 예를 들어, 1천만개의 세포를 바코딩하기 위해 이 바코드 라이브러리를 사용할 때, 단지 2.5%의 고유 바코드를 사용한다. 넥스트겐 서열분석으로부터의 대다수의 바코드 서열 판독이 PCR 및 서열분석 오류와 상관없이 서로로부터(판독의 일부는 폐기됨) 용이하게 구별될 수 있도록 대다수의 바코드가 서로로부터 충분한 거리를 갖는 것을 예상한다.
이 실시예에서 비드 및 바코드 올리고뉴클레오타이드의 구체화된 농도에서, 푸아송 분포에 의해 비드를 평균적으로 점적 당 대략 7개의 비드로 점적 내에 로딩하고, 본 발명자들은 거의 25%의 점적이 고유 바코드 올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 복제물을 함유하는 한편, 점적의 나머지는 바코드 올리고뉴클레오타이드를 전혀 함유하지 않았다는 것을 관찰하였다. 적어도 하나의 바코드 올리고뉴클레오타이드를 함유한 점적 중에서, 대략 75%는 정확하게 하나의 바코드 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 반면, 남아있는 대략 25%는 2 이상의 바코드를 함유한다. 따라서, 대략 75%의 바코드 주형 어댑터 비드 라이브러리는 단클론성(비드 당 하나의 고유 바코드 서열)이고 대략 25%는 다클론성이었다.
이하에 기재하는 방법의 최종 수율은 거의 5천만개의 바코드 어댑터 주형 비드이며, 이 중 3천 7백 5십만개는 단클론성 바코드 어댑터 주형 비드이다. 점적이 평균적으로 점적 당 대략 7개 비드로 채워짐에도 불구하고, 에멀전의 파괴 후 비드의 수율은 대략 11%였다. 이항분포에 기반하여, 고유 바코드 서열을 지니는 대략 2천 8백만개의 단클론성 비드가 존재하였다.
비드 및 바코드 올리고뉴클레오타이드의 농도를 조절하여 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리를 얻을 수 있고, 단클론성 및 다클론성 비드의 비율은 상이하고, 상이한 수의 고유 바코드 서열이 존재한다. 이는 단일 세포로부터의 핵산 바코딩을 가능하게 하여 고유 바코드, 또는 고유 바코드의 세트를 통해 단일 세포와 결합된 상이한 비율의 핵산을 달성할 것이고, 또한 추가 분석으로부터 폐기되는 바코딩된 핵산의 비율을 변화시킬 것이다.
C. 실시예 3: 다단계에서 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리의 제조.
이 실시예에서 지 하나의 S1, 하나의 W 및 하나의 S2 바코드 서열을 사용한 것을 제외하고 도 16에 따라 반응을 행하였다. 따라서, 상이한 S1 서열에 결합된 비드의 풀링은 일어나지 않았고, 유사하게 S1 올리고에 W 서열을 첨가하는 중합효소 연장 반응 후에 비드는 풀링되지 않았다.
이 실시예는 고유 바코드 서열을 지니는 다중 S1-올리고, W-올리고 및 S2-올리고를 가짐으로써 단순히 도 16에 따라 행하도록 용이하게 연장할 수 있다.
단일 반응에서 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리를 제조하기 위해 사용한 올리고
프라이머 명칭 서열(서열번호)
S1-올리고 데스티오바이오틴-C18스페이서-ATA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGC ATA GGG ATA ACA GGG TAA TGA [S1] AG (11), 여기서 S1=GATGGAT
W-올리고-a CCT CCT CCT CCT CCC [W] CTI III III TCA TTA CCC TGT TAT CCC TAT GCC (12),여기서 W=AGTGAGCTGCGT
W-올리고-b CT CCT CCT CCC [W] CTI III III TCA TTA CCC TGT TAT CCC TAT GCC (13), 여기서 W=AGTGAGCTGCGT
S2-올리고-a mCmCC CT [S2] TCC TCC TCC TCC TCC C (14), 여기서 S2=CCTAACC
S2-올리고-b mCmCC CT [S2] CTC CTC CTC CC (15), 여기서 S2=CCTAACC
스트렙타비딘-코팅된 M-270 다이나비즈(등록상표)(라이프 테크놀로지즈)를 개개 반응에서 S1 서열을 함유하는 바이오티닐화된 올리고뉴클레오타이드와 결합하였다:
1. 비드를 부드럽게 교반시킴으로써 재현탁시켰다
2. M270 비드(라이프 테크놀로지즈)를 3분 동안 자기에 두었다.
3. 각각의 관으로부터 상청액을 제거하고 나서, (1x 용적) 0.5x 결합/세척 완충제(BWB; 1M NaCl, 5mM 트리스, 0.5mM EDTA) 중에서 재현탁시켰다
4. 단계 4를 2회 이상 반복한 다음에, BWB 완충제 중에서 최종 재현탁시켰다
5. 10μM S1-올리고 비드에 첨가하고 나서, 부드럽게 교반시키면서 15분 동안 인큐베이션시켰다
6. 인큐베이션 후에, 비드를 BWB 완충제로 3x 세척하였다
7. 비드를 4℃에서 0.01% 아자이드나트륨과 함께 저장하였다
8. 비드를 사용 전에 10mM 트리스로 3회 세척하였다
이어서, 결합된 비드를 함께 풀링하고, w-올리고를 이용하여 연장 반응을 수행하였다.
w 연장 반응에 대해:
ddH2O 26.1㎕
10x 태그 완충제 5㎕
100mM MgCl2 4.25㎕
20% 트윈 20 0.125㎕
100X BSA 5㎕
S1-결합된 비드(20㎕ 중의 1㎎) 5㎕
dNTP 1㎕
Taq (NEB) 0.5㎕
TIPP (NEB) 0.025㎕
100μM W-올리고-a 또는 W-올리고-b 3㎕
진탕 인큐베이터에서 55℃에서 밤새 인큐베이션시키고, 800rpm에서 진탕시킨다.
비드를 풀링하고 나서, 1x BWB 완충제로 3회 세척하였다. 이어서, 안티센트 가닥을 70℃ 용융 완충제(50mM NaCl, 10mM 트리스 pH 8.0)에서 용융시켰다. 비드를 자기를 이용하여 펠렛화하고, 상청액을 완전히 제거한 다음, 비드를 1㎖ TE0.1 중에서 3회 세척하고, 1㎎/20㎕로 TE0.1에서 재현탁시켰다.
s2 연장 반응(250㎍ 비드 당)에 대해:
ddH2O 24.5㎕
10x 태그 완충제 5㎕
100mM MgCl2 4.25㎕
20% 트윈 20 0.125㎕
100X BSA 5㎕
S1+w-a 또는 S1+w-b 비즈 5㎕
dNTP 1㎕
100μM S2-올리고-a OR S2-올리고-b 3㎕
S2-올리고-a를 S1+w-a 비드와 함께 사용하고, S2-올리고-b를 S1+w-b 비드와 함께 사용하였다. 60℃에서 10분 동안 인큐베이션시키고, 이어서, 37℃로 서서히 냉각시켰다. 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고, 800rpm에서 진탕시켰다. 이어서, 반응물을 실온으로 냉각시켰다.
이어서, 다음을 첨가하였다:
dNTP (NEB) 1㎕
이콜라이 파이로포스파타제(NEB) 0.1㎕
클레노브 단편(NEB) 1㎕
반응물을 25℃에서 3시간 동안 인큐베이션시키고, 800rpm에서 진탕시켰다. 1㎕ dNTP를 이용하여 매시간 반응물을 새롭게 하였다.
비드를 풀링하고 나서, 1x BWB 완충제로 3회 세척하였다. 비드를 4℃에서 0.01% 아자이드나트륨과 함께 저장하고 나서, 사용 전에 10mM 트리스를 이용하여 3x 세척하였다.
바코드 어댑터 주형 비드의 적은 분취액을 또한 T7 RNAP를 이용하는 시험관내 전사 반응에서 사용하여 비드의 제조가 성공적이었는지의 여부를 결정하였다. 성공적이라면, T7 RNAP는 s1-올리고 서열에 존재하는 이중 가닥 T7 프로모터를 벗어나서 RNA를 전사시킬 수 있을 것이다. 메가스크립트 T7 키트(메가스크립트 T7 키트)(라이프 테크놀로지즈)를 사용하고, 제조업자의 설명서에 따랐다. RNA 플래시겔(RNA Flashgel)(론자) 상에서 5㎕의 반응을 실행하였다. 도 20 참조.
S1, W 및 S2 서열의 조합으로부터 형성된 고유 바코드 서열의 수는 원한다면 증가 또는 감소될 수 있다. 예를 들어, 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 고유 바코드 수가 이항분포에 의해 결정되는 바와 같이 바코딩될 세포의 수보다 대략 10x 더 크다면, 본 발명자들은 세포의 대략 10%가 동일한 바코드를 공유하고 따라서 핵산의 다른 핵산에 대한 생물정보학적 연결 동안 폐기된다는 것을 예상할 수 있고(이는 서로 결합되는 하나 이상의 가변 유전자 핵산, 예컨대 2개의 면역글로불린 중쇄 또는 2개의 TCR 알파 쇄로서 검출가능하다) 따라서, 이러한 라이브러리로부터, 본 발명자들은 대략 90%의 바코딩된 세포가 성공적으로 바코딩되고 고유 서열은 서로에 대해 핵산의 적절한 정보 연결을 가능하게 한다는 것을 예상할 수 있다.
따라서, 필요한 S1x, W 및 S2y 서열의 수는 바코딩될 세포의 목적으로 하는 수에 따른다. 표 7에서, W-연장 반응은 96-웰 플레이트에서 일어나는 것으로 생각되며, 동일한 수의 S1x 및 S2y 서열이 사용된다. 알 수 있는 바와 같이, 1천만개의 세포를 바코딩하기 위해, 거의 323개의 S1x 및 S2y 올리고 및 960 Wz 올리고가 필요하다. 이들은 관리가능한 수이다, 특히 반응이 96-웰 플레이트에서 행해진다면, 목적으로 하는 크기의 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리를 제조하는 반응을 수행하는데 총 18개의 96-웰 플레이트만이 필요하다.
목적으로 하는 수의 세포로부터 핵산을 바코딩하기에 충분한 크기의 바코드 어댑터 주형 라이브러리를 얻는데 필요한 S1x, Wz 및 S2y 서열의 수
바코딩될 세포의 수 1,000 10,000 100,000 1,000,000 10,000,000
필요한 고유 비드의 수 10,000 100,000 1,000,000 10,000,000 100,000,000
96 w라면 필요한 S1/S2의 수 11 33 103 323 1021
960 w라면 필요한 S1/S2의 수 4 11 33 103 323
9600 w라면 필요한 S1/S2의 수 2 4 11 33 103
또한, S1x, S2y 및 Wz 내 바코드는 최소 해밍거리만큼 떨어지도록 설계되는 것이 바람직하며, 이 최소값은 2이다. 이 최소값을 이용하여, 바코드 서열만을 넥스트겐 서열분석으로부터 판독하며 바코드 서열과의 정확한 매칭을 사용하고; 오류가 있는 바코드 서열 판독을 폐기하였다. 사용한 해밍 거리 또는 편집 거리가 최소값 3으로 증가된다면, 오류 정정이 가능하다.
이 실시예는 T7 RNAP에 의한 바코드 어댑터의 증폭을 위해 T7 RNAP 프로모터 서열을 지니는 바코드 어댑터 주형 비드를 제조한다는 것을 주목한다. emB-T7브릿지2에서 T7 RNAP 프로모터 서열 "TAA TAC GAC TCA CTA TAG G"(서열번호6)를 다른 RNAP 프로모터 서열로 대체함으로써, 다른 RNAP를 이용하여 바코드 어댑터를 증폭시킬 수 있다. 또한 프로모터 서열을 틈내기 엔도뉴클레아제 부위, 예컨대 Nt.BbvCI의 "CCT CAG C"로 대체함으로써, 틈내기 엔도뉴클레아제(예를 들어 Nt.BbvCI) 및 가닥-치환 DNAP, 예컨대 클레노브 엑소-를 이용하여 바코드 어댑터를 증폭시킬 수 있다.
D. 실시예 4: 수성 바코드 어댑터 주형의 제조.
이 실시예에서, 비드에 결합되지 않은 수성 바코드 어댑터 주형을 합성하여 본 방법의 넓은 적용가능성을 입증하였다.
이하에 기재하는 바와 같이 반응 혼합물을 제조하였다:
ddH2O 353㎕
10x HiFi 완충제 50㎕
50mM MgSO4 20㎕
10mM dNTP 혼합물 10㎕
10μM emB_T7브릿지2(표 4를 참고) 25㎕
1 pM emB_BC브릿지2(표 4를 참고) 13㎕
10μM emB_RV3(표 4를 참고) 25㎕
백금 태그 HiFi (라이프 테크놀로지즈) 4㎕
총 용적 500㎕
이어서, 반응 혼합물을 웰 당 25㎕로 96-웰 PCR 플레이트 내로 분취하고 나서, 다음과 같이 열순환시켰다:
Figure pct00012
이어서, 바코드 어댑터 주형인 얻어진 PCR 산물을 평활화시켜 A 돌출부를 제거하였다:
NE완충제 2 162㎕
10mM dNTP 30㎕
T4 DNA 중합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스) 2㎕
2.5㎕의 평활화 혼합물을 각각의 25㎕ 반응 용적에 첨가하고 나서, 12℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 1㎕의 250mM EDTA를 각각 25㎕ 반응 용적에 첨가하고 나서, 75℃로 20분 동안 가열하여 효소를 불활성화시켰다.
반응물을 세정하고 정량화하였다:
1. 이어서, 반응물을 풀링하고 제조업자 설명서에 따라 자이모 리서치 RNA 세정 및 농축 키트(Zymo Research RNA Clean and Concentrator 키트)를 이용하여 세정하였다
2. 피코그린(Picogreen) 정량화 키트(라이프 테크놀로지즈)를 사용하여 DNA를 정량화하고, 바코드 어댑터 주형 농도를 55ng/㎕로 조절하였다
이 실시예는 T7 RNAP에 의한 바코드 어댑터의 증폭을 위해 T7 RNAP 프로모터 서열을 지니는 바코드 어댑터 주형 비드를 제조한다는 것을 주목한다. emB-T7브릿지2에서 T7 RNAP 프로모터 서열 "TAA TAC GAC TCA CTA TAG G"(서열번호 6)를 다른 RNAP 프로모터 서열로 대체함으로써, 다른 RNAP를 이용하여 바코드 어댑터를 증폭시킬 수 있다. 또한 프로모터 서열을 틈내기 엔도뉴클레아제 부위, 예컨대 Nt.BbvCI의 "CCT CAG C"로 대체함으로써, 틈내기 엔도뉴클레아제(예를 들어 Nt.BbvCI) 및 가닥-치환 DNAP, 예컨대 클레노브 엑소-를 이용하여 바코드 어댑터를 증폭시킬 수 있다.
E. 실시예 5: 상이한 반응 완충제에서 mRNA에 대한 바코드 어댑터 주형으로부터의 바코드의 첨가.
이 실시예는 본 방법이 다양한 상이한 완충제에서 사용가능하다는 것을 나타낸다. 바코드 어댑터 주형을 실시예 4에서 상기 기재한 바와 같이 제조하였다.
Figure pct00013
다음의 반응을 설정하였다:
0.5x MMLV 완충제를 이용
ddH2O 4.8㎕
10x MMLV 완충제 (NEB) 1.25㎕
100X BSA (NEB) 1.25㎕
100mM MgCl2 1.75㎕
50μM 올리고(dT)20VN (서열번호 16) 0.5㎕
NTP 혼합물(라이프 테크놀로지즈 메가스크립트 SP6 키트) 2㎕
dNTP(NEB) 1.25㎕
바코드 어댑터 주형(55ng/㎕) 0.6㎕
리보락(Ribolock)(써모 사이언티픽) 0.6㎕
총 PBMC RNA(50ng/㎕) 4㎕
상기를 55℃로 3분 동안 가열하고, 이어서, 다음을 첨가하였다:
리보락(써모 사이언티픽) 0.4㎕
이콜라이 무기 파이로포스파타제 (NEB) 2㎕
T7 RNAP (NEB) 1㎕
T4gp32 (NEB) 0.6㎕
맥시마(Maxima) H- RTase(써모 사이언티픽) 3㎕
바코드 어댑터 주형으로부터의 바코드 어댑터의 T7 RNAP 선형 증폭, 역전사 및 제1 가닥 cDNA에 대한 바코드의 첨가를 42℃에서 2시간 동안 수행하였다.
써모폴 완충제를 이용:
ddH2O 3.3㎕
10x 써모폴 DF(NEB) 2.5㎕
1M DTT 0.25㎕
100X BSA(NEB) 1.25㎕
100mM MgCl2 1.75㎕
50μM 올리고(dT)20VN(서열번호 16) 0.5㎕
NTP 혼합물(라이프 테크놀로지즈 메가스크립트 SP6 키트) 2㎕
dNTP(NEB) 1.25㎕
바코드 어댑터 주형(55ng/㎕) 0.6㎕
리보락(써모 사이언티픽) 0.6㎕
총 PBMC RNA(50ng/㎕) 4㎕
상기를 55℃로 3분 동안 가열하고, 이어서, 다음을 첨가하였다:
리보락(써모 사이언티픽) 0.4㎕
이콜라이 무기 파이로포스파타제 (NEB) 2㎕
T7 RNAP(NEB) 1㎕
T4gp32(NEB) 0.6㎕
맥시마(Maxima) H-RTase(써모 사이언티픽) 3㎕
바코드 어댑터 주형으로부터의 바코드 어댑터의 T7 RNAP 선형 증폭, 역전사 및 제1 가닥 cDNA에 대한 바코드의 첨가를 42℃에서 2시간 동안 수행하였다.
TAE 완충제를 이용:
ddH2O 4.55㎕
5x TAE 1.25㎕
1M DTT 0.25㎕
100X BSA (NEB) 1.25㎕
100mM MgCl2 1.75㎕
50μM 올리고(dT)20VN (서열번호 16) 0.5㎕
NTP 혼합물(라이프 테크놀로지즈 메가스크립트 SP6 키트) 2㎕
dNTP (NEB) 1.25㎕
바코드 어댑터 주형(55ng/㎕) 0.6㎕
리보락(써모 사이언티픽) 0.6㎕
총 PBMC RNA (50ng/㎕) 4㎕
상기를 55℃로 3분 동안 가열하고, 이어서, 다음을 첨가하였다:
리보락(써모 사이언티픽) 0.4㎕
이콜라이 무기 파이로포스파타제 (NEB) 2㎕
T7 RNAP(NEB) 1㎕
T4gp32(NEB) 0.6㎕
맥시마 H-RTase(써모 사이언티픽) 3㎕
바코드 어댑터 주형으로부터의 바코드 어댑터의 T7 RNAP 선형 증폭, 역전사 및 제1 가닥 cDNA에 대한 바코드의 첨가를 42℃에서 2시간 동안 수행하였다.
이어서, 변형된 전통적인 페놀/클로로폼 방법을 이용하여 반응물을 세정하였다:
1. 200㎕의 TE0.1(10mM 트리스 pH 8.0, 0.1mM EDTA)를 각각의 반응 혼합물에 첨가하였다
2. 200㎕의 페놀/클로로폼/아이소아밀 알코올(시그마)를 각각의 반응 혼합물에 첨가하고, 사전 교반시킨 겔상 락 튜브(Gel Phase Lock tube)(5프라임(5Prime))에서 격렬하게 진탕시켰다
3. 겔상 락 튜브를 14,000g에서 3분 동안 원심분리하고 나서, 상부 수성 분획을 아미콘 100kDa 칼럼(밀리포어(Millipore)) 내로 피펫팅하고 나서, 14,000g에서 3분 동안 교반시켰다
4. 이어서, 450㎕ TE(10mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA)를 아미콘 칼럼 내로 피펫팅하고 나서, 14,000g에서 3분 동안 교반시켰다
5. 이어서, 450㎕의 10mM 트리스(pH8.0)를 아미콘 칼럼 내로 피펫팅하고 나서, 14,000g에서 5분 동안 교반시켰다
6. 아미콘 칼럼을 새로운 수집관 내로 뒤집어 넣고, 1000g에서 2분 동안 교반시켜 용리액을 수집하고, 이는 정제된 mRNA/제1 가닥 cDNA 이중가닥을 함유하였다
이어서, 2 라운드의 PCR(PCR1 및 PCR2)을 수행하였다:
Figure pct00014
다음의 PCR1 퓨전(Phusion)(써모 사이언티픽) 반응 혼합물을 RT 반응 당 설정하였다:
H2O 11.28㎕
5x GC 완충제 5㎕
MgCl2 0.15㎕
DMSO 1㎕
dNTP 0.5㎕
10μM FW1-쇼트 1㎕
10μM BC장 1㎕
10μM K-GSP1 0.56㎕
10μM L-GSP1 1.25㎕
10μM G-GSP1 0.56㎕
ET-SSB (NEB) 0.25㎕
BSA 0.25㎕
퓨전 0.2㎕
cDNA 주형 2㎕
Figure pct00015
이어서, PCR1로부터의 반응물을 50x 희석시키고 나서, 3개의 별도의 PCR2 반응(카파 경쇄에 대해 하나, 람다 경쇄에 대해 하나 및 감마 중쇄에 대해 하나)에서 주형으로서 사용하였다.
다음의 PCR2 퓨전(써모 사이언티픽) 반응 혼합물을 RT 반응 당 설정하였다:
H2O 17.82㎕
5x GC 완충제 6㎕
MgCl2 0.18㎕
DMSO 1㎕
dNTP 0.6㎕
10μM 2FW 1.2㎕
10μM K 또는 L 또는 G-GSP2 0.6㎕
BSA 0.3㎕
퓨전 0.3㎕
희석. PCR1 주형 2㎕
Figure pct00016
5㎕의 생성물을 겔 상에서 실행하였다(도 21). 알 수 있는 바와 같이, 바코딩 반응은 칼륨, 암모늄, 염화물, 황산염 및 아세트산염 이온과 같은 다양한 상이한 이온을 함유하는 다양한 상이한 완충제에서 잘 작용한다.
F. 실시예 6: 바코드 어댑터 주형으로부터 증폭된 RNA 바코드 어댑터는 비증폭 DNA 바코드 어댑터보다 더 양호하게 작용한다.
이 실시예는 본 방법이 상이한 염 농도를 지니는 다양한 상이한 완충제에서 사용가능하다는 것을 나타낸다. 또한, 바코드 어댑터 주형으로부터 생성된 증폭된 RNA 바코드 어댑터를 이용하는 것은 반응 내로 DNA 바코드 어댑터를 단지 첨가하는 것보다 더 양호하게 작용하는데(즉, 목적으로 하는 증폭된 반응 산물을 생성함), RNA 바코드 어댑터를 지니는 반응이 더 낮은 배경을 야기할 가능성이 있기 때문이다(도 4 참조). 바코드 어댑터 주형을 실시예 4에서 상기 기재한 바와 같이 제조하였다.
Figure pct00017
다음의 반응을 설정하였고, 완충제 조성물은 표 8과 같다:
1x MMLV 완충제를 이용
ddH2O 3.55㎕
10x MMLV 완충제(NEB) 2.5㎕
100X BSA (NEB) 1.25㎕
100mM MgCl2 1.75㎕
50μM 올리고(dT)20VN (서열번호 16) 0.5㎕
NTP 혼합물(라이프 테크놀로지즈 메가스크립트 SP6 키트) 2㎕
dNTP (NEB) 1.25㎕
바코드 어댑터 주형(55ng/㎕) 0.6㎕
리보락(써모 사이언티픽) 0.6㎕
총 PBMC RNA(50ng/㎕) 4㎕
상기를 55℃로 3분 동안 가열하고, 이어서, 다음을 첨가하였다:
리보락(써모 사이언티픽) 0.4㎕
이콜라이 무기 파이로포스파타제(NEB) 2㎕
T7 RNAP(NEB) 1㎕
T4gp32(NEB) 0.6㎕
맥시마(Maxima) H-RTase(써모 사이언티픽) 3㎕
바코드 어댑터 주형으로부터의 바코드 어댑터의 T7 RNAP 선형 증폭, 역전사 및 제1 가닥 cDNA에 대한 바코드의 첨가를 42℃에서 2시간 동안 수행하였다.
0.5x MMLV 완충제를 이용
ddH2O 4.8㎕
10x MMLV 완충제 (NEB) 1.25㎕
100X BSA(NEB) 1.25㎕
100mM MgCl2 1.75㎕
50μM 올리고(dT)20VN(서열번호 16) 0.5㎕
NTP 혼합물(라이프 테크놀로지즈 메가스크립트 SP6 키트) 2㎕
dNTP (NEB) 1.25㎕
바코드 어댑터 주형(55ng/㎕) 0.6㎕
리보락(써모 사이언티픽) 0.6㎕
총 PBMC RNA (50ng/㎕) 4㎕
상기를 55℃로 3분 동안 가열하고, 이어서, 다음을 첨가하였다:
리보락(써모 사이언티픽) 0.4㎕
이콜라이 무기 파이로포스파타제(NEB) 2㎕
T7 RNAP(NEB) 1㎕
T4gp32(NEB) 0.6㎕
맥시마 H-RTase(써모 사이언티픽) 3㎕
바코드 어댑터 주형으로부터의 바코드 어댑터의 T7 RNAP 선형 증폭, 역전사 및 제1 가닥 cDNA에 대한 바코드의 첨가를 42℃에서 2시간 동안 수행하였다.
DNA 바코드 어댑터를 이용
ddH2O 13㎕
10x MMLV 완충제(NEB) 2.5㎕
100X BSA(NEB) 0.25㎕
100mM MgCl2 0.75㎕
50μM 올리고(dT)20VN(서열번호 16) 1㎕
10μM DNA 바코드 어댑터 w24 2.5㎕
리보락(써모 사이언티픽) 0.6㎕
총 PBMC RNA (50ng/㎕) 2㎕
상기를 55℃로 3분 동안 가열하고, 이어서, 다음을 첨가하였다:
리보락(써모 사이언티픽) 0.4㎕
T4gp32 (NEB) 1㎕
맥시마 H-RTase(써모 사이언티픽) 1㎕
역전사 및 제1 가닥 cDNA에 대한 바코드의 첨가를 42℃에서 2시간 동안 수행하였다.
이어서, 변형된 전통적인 페놀/클로로폼 방법을 이용하여 반응물을 세정하였다:
1. 200㎕의 TE0.1(10mM 트리스 pH 8.0, 0.1mM EDTA)를 각각의 반응 혼합물에 첨가하였다
2. 200㎕의 페놀/클로로폼/아이소아밀 알코올(시그마)를 각각의 반응 혼합물에 첨가하고, 사전 교반시킨 겔상 락 튜브(Gel Phase Lock tube)(5프라임)에서 격렬하게 진탕시켰다
3. 겔상 락 튜브를 14,000g에서 3분 동안 원심분리하고 나서, 상부 수성 분획을 아미콘 100kDa 칼럼(밀리포어) 내로 피펫팅하고 나서, 14,000g에서 3분 동안 교반시켰다
4. 이어서, 450㎕ TE (10mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA)를 아미콘 칼럼 내로 피펫팅하고 나서, 14,000g에서 3분 동안 교반시켰다
5. 이어서, 450㎕의 10mM 트리스(pH8.0)를 아미콘 칼럼 내로 피펫팅하고 나서, 14,000g에서 5분 동안 교반시켰다
6. 아미콘 칼럼을 새로운 수집관 내로 뒤집어 넣고, 1000g에서 2분 동안 교반시켜 용리액을 수집하고, 이는 정제된 mRNA/제1 가닥 cDNA 이중가닥을 함유하였다
이어서, 2 라운드의 PCR(PCR1 및 PCR2)을 수행하였다:
다음의 PCR1 퓨전(써모 사이언티픽) 반응 혼합물을 바코드 어댑터 주형을 사용한 RT 반응마다 설정하였다:
H2O 11.28㎕
5x GC 완충제 5㎕
MgCl2 0.15㎕
DMSO 1㎕
dNTP 0.5㎕
10μM FW1-쇼트 1㎕
10μM BC장 1㎕
10μM K-GSP1 0.56㎕
10μM L-GSP1 1.25㎕
10μM G-GSP1 0.56㎕
ET-SSB (NEB) 0.25㎕
BSA 0.25㎕
퓨전 0.2㎕
cDNA 주형 2㎕
다음의 PCR1 퓨전(써모 사이언티픽) 반응 혼합물을 DNA 바코드 어댑터를 사용한 RT 반응마다 설정하였다:
H2O 11.28㎕
5x GC 완충제 5㎕
MgCl2 0.15㎕
DMSO 1㎕
dNTP 0.5㎕
10μM FW1-쇼트 1㎕
10μM FW-장 1㎕
10μM K-GSP1 0.56㎕
10μM L-GSP1 1.25㎕
10μM G-GSP1 0.56㎕
ET-SSB (NEB) 0.25㎕
BSA 0.25㎕
퓨전 0.2㎕
cDNA 주형 2㎕
Figure pct00018
이어서, PCR1로부터의 반응물을 50x 희석시키고 나서, 3개의 별도의 PCR2 반응(카파 경쇄에 대해 하나, 람다 경쇄에 대해 하나 및 감마 중쇄에 대해 하나)에서 주형으로서 사용하였다.
다음의 PCR2 퓨전(써모 사이언티픽) 반응 혼합물을 PCR1 반응 당 설정하였다:
H2O 17.82㎕
5x GC 완충제 6㎕
MgCl2 0.18㎕
DMSO 1㎕
dNTP 0.6㎕
10μM 2FW 1.2㎕
10μM K 또는 L 또는 G-GSP2 0.6㎕
BSA 0.3㎕
퓨전 0.3㎕
희석. PCR1 주형 2㎕
Figure pct00019
5㎕의 생성물을 겔 상에서 실행하였다(도 22). 알 수 있는 바와 같이, 바코딩 반응은 상이한 염 농도를 지니는 완충제에서 잘 작용한다. 반응은 T7 RNAP의 염 민감도에 기인하여 저염 완충제(0.5x MMLV)에서 잘 작용하지만, 이는 또한 더 고염의 완충제에서 작용한다(1x MMLV). DNA 바코드 어댑터를 이용할 때 RT 단계 동안의 비특이적 프라이밍에 기인하여(도 4를 참고), 예외적으로 높은 배경이 있고 목적으로 하는 밴드는 보기 어렵게 되었다는 것을 주목한다.
G. 실시예 7: 미세유체 점적 장치를 이용하여 만든 점적에서 수성 바코드 어댑터 주형을 이용하는 세포로부터의 핵산의 바코딩 .
단분산 에멀전을 생성하기 위한 장치를 사용하여 바코딩된 비드 및 바코딩 분석에 필수적인 다른 시약과 함께 단일 세포를 캡슐화하였다. 3개의 돌로마이트 P-펌프는 유동 센서(돌로마이트 3200016, 3200095 및 3200098)를 구비하였다. 제1 P-펌프를 T-접합부를 혼입한 미세유체관을 통해 2-시약 점적 칩(돌로마이트 3200287)에 직접 연결하여 선을 2개의 주입구로 분할하였다. 이는 오일 주입선이었다. 다른 2개의 P-펌프를 냉각시킨 샘플을 유지하는 역할을 하는 얼음 보관함 주위에서 코일링한 PEEK 샘플 루프에 유동관을 통해 연결하는 한편, 장치를 작동시키고, 각각의 이들 루프를 2-시약 점적 칩에 연결하였다. 각각의 샘플 루프는 그의 전단에서 4-원 밸브를 혼입하였고, 따라서 샘플을 주사기 수단에 의해 루프 내로 장입할 수 있었다. 제1 샘플 루프를 세포로 채운 반면, 제2 루프를 RT/바코딩/용해 혼합물로 채웠다. 장치 입체배지의 예는 도 17 내지 도 19에 나타낸 바와 같다. 사용 전에 얼음 보관함을 얼음으로 채웠다.
뮤린 B220+ B 세포 집단을 FACS 분류하고 나서, 현탁 완충제로서 10mM NaCl 및 0.5㎎/㎖ BSA와 함께 300mM 베타인을 이용하여 세포 현탁액을 제조하였다. 4,500개 세포/㎕의 농도에서 세포를 사용하였다.
RT/수성 바코드 혼합물을 다음과 같이 제조하였다:
10X 써모폴 DF 30㎕
1M DTT 3㎕
1M MgCl2 3.6㎕
50μM 올리고(dT)20VN (서열번호 16) 6㎕
NTP 혼합물(라이프 테크놀로지즈 메가스크립트 SP6 키트) 48㎕
dNTP (NEB) 15㎕
바코드 어댑터 주형 (55 ng/㎕) 7.2㎕
10% 트윈-20 1㎕
리보락(써모 사이언티픽) 12㎕
이콜라이 무기 파이로포스파타제(NEB) 24㎕
T7 RNAP(NEB) 12㎕
T4gp32(NEB) 7.2㎕
맥시마 H-RTase(써모 사이언티픽) 36㎕
총 용적 205㎕
세포 현탁액을 하나의 샘플 루프에 장입하고 나서, RT/바코딩/용해 혼합물을 주사기를 이용하여 다른 샘플 루프에 장입하였다. 단일 점적에서 다중 세포 또는 바코드의 발생을 최소화하는 방법으로 세포 및 바코드 농도를 선택하는 한편, 해당 농도를 충분히 높게 유지해서 다수의 충분한 수의 세포를 바코드와 함께 캡슐화하였다. 4-원 밸브를 전환하였고, 따라서 샘플 루프는 펌프와 연결되고, 모두 3개의 펌프가 활성화되었다. 2개의 수성 주입물을 그들이 1:2(세포 현탁액: RT/바코딩/용해 혼합물) 비로 혼합되는 속도로 유동시켰다. 수성 및 오일 주입물을 직경이 대략 50㎛인 점적이 형성되는 속도로, 그리고 세포가 장치를 통해 유동되기에 충분히 높은 속도로 유동시켰다. 에멀전을 소렌슨 바이오사이언스(Sorenson Bioscience) 0.2㎖ PCR 관에서 수집하였다. 샘플이 생성된 후에, 사전 가열 단계(55℃에서 3분)가 처음에 제공되었고, 이어서, 42℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켜 반응이 진행되게 하였다. 반응 후에, 이하에 기재하는 "비-비드 에멀전 파괴" 과정을 이용하여 에멀전을 파괴하였다. 이는 후속적 PCR 증폭 및 서열분석에 대해 cDNA의 정제된 샘플을 생성하였다.
비-비드 에멀전을 다음과 같이 파괴하였다:
1. 200㎕ TE, 400㎕ 페놀/클로로폼/아이소아밀 알코올, 800㎕ 클로로폼을 사전 교반 겔상 잠금관 내로 피펫팅하였다
2. 각각의 샘플을 대응하는 겔 잠금관 내로 피펫팅하였다
3. 관을 14,000g에서 3분 동안 교반시켰다
4. 수층을 100kDa 아미콘 관(Amicon tubes)(밀리포어) 내로 피펫팅하였다.
5. 관을 14,000g에서 3분 동안 교반시켰다
6. 450㎕의 TE를 아미콘 관 내로 피펫팅하였다
7. 관을 14,000g에서 3분 동안 교반시켰다
8. 450㎕의 10mM 트리스를 아미콘 관에 첨가하였다
9. 관을 14,000g에서 5분 동안 교반시켰다
10. 아미콘 관을 새로운 수집관 내로 뒤집어서 넣었다
11. 관을 1,000g에서 2분 동안 교반시켰다
이어서, 표 9에서 열거한 일부 프라이머 서열에 추가로 다음의 프라이머를 이용하여 2 라운드의 PCR(PCR1 및 PCR2)을 수행하였다.
Figure pct00020
다음의 PCR1 퓨전(써모 사이언티픽) 반응 혼합물을 바코드 어댑터 주형을 사용한 RT 반응마다 설정하였다:
H2O 10.53㎕
5x GC 완충제 5㎕
MgCl2 0.15㎕
DMSO 1㎕
dNTP 0.5㎕
10μM FW1-쇼트 1㎕
10μM BC장 1㎕
10μM mK-GSP1 0.5㎕
10μM㎖-GSP1 0.5㎕
10μM mG-GSP1 0.56㎕
10μM mM-GSP1 0.56㎕
ET-SSB (NEB) 0.25㎕
BSA 0.25㎕
퓨전 0.2㎕
cDNA 주형 2㎕
이어서, PCR1로부터의 반응물을 50x 희석시키고 나서, 3개의 별도의 PCR2 반응(카파 및 람다 경쇄에 대해 하나, 뮤 중쇄에 대해 하나 및 감마 중쇄에 대해 하나)에서 주형으로서 사용하였다.
다음의 PCR2 퓨전(써모 사이언티픽) 반응 혼합물을 PCR1 반응 당 설정하였다:
H2O 30㎕까지
5x GC 완충제 6㎕
MgCl2 0.18㎕
DMSO 1㎕
dNTP 0.6㎕
10μM 2FW 1.2㎕
10μM mK 및 ㎖ 또는 mM-GSP2 0.6㎕
BSA 0.3㎕
퓨전 0.3㎕
희석. PCR1 주형 2㎕
Figure pct00022
5㎕의 PCR 산물을 겔 상에서 실행하였다(도 23). 카파 및 람다 경쇄에, 그리고 뮤 중쇄에 대응하는 밴드가 명확하게 보였다. 대다수의 B220+ B 세포는 IgM+인 나이브 B 세포인 것으로 예상되었기 때문에, 뮤 중쇄만을 증폭시켰다.
이렇게 증폭시킨 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 정제하고, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 454 서열분석과 같은 차세대 서열 분석을 위해 제조할 수 있다. 이 실시예는 반응 용기 당 1개 초과의 복제물의 농도로 바코드 어댑터 주형을 사용하였기 때문에, 바코드의 고유 세트를 고유 바코드보다는 각각의 반응 용기 내 핵산에 혼입시켰다. 짝지어진 면역글로불린 중쇄 및 경쇄는 고유 바코드보다는 그들을 바코드의 고유 세트와 공유함으로써 서로 관련될 수 있다.
바코드 어댑터 주형은 또한 희석을 제한함으로써 바코드 어댑터 주형을 함유하는 대다수의 반응 용기가 반응 용기 당 1개의 복제물을 함유하는 농도에서 사용할 수 있다. 이 경우에, 짝지어진 면역글로불린 중쇄 및 경쇄는 그들을 고유 바코드 서열과 공유함으로써 서로 관련될 수 있다.
H. 실시예 8: 미세유체 점적 장치를 이용하여 만든 점적에서 바코드 어댑터 주형 비드를 이용하는 세포로부터의 핵산의 바코딩.
이 실시예는 실제로 달성한 결과보다는 예측한 결과에 기반하여 본 발명의 실시형태를 기재한다. 실시예 7에서 기재한 바와 같은 점적을 생성하기 위한 미세유체 장치를 사용하고, 제1 샘플 루프가 실시예 1, 2 또는 3에서 제조한 바와 같은 세포와 바코드 어댑터 주형 비드를 둘 다 함유한다는 것만 차이가 있었다.
뮤린 B220+ B 세포 집단을 FACS 분류하고, 세포 및 바코드 어댑터 주형 비드 현탁액을 현탁 완충제로서 10mM NaCl 및 0.5 ㎎/㎖ BSA와 함께 300mM 베타인을 이용하여 제조한다. 세포를 4,500개 세포/㎕의 농도로 포함시키고, 비드를 60,000 비드/㎕의 농도에서 사용한다.
RT 혼합물을 다음과 같이 제조한다:
ddH2O 7.4㎕
10X 써모폴 DF 36㎕
1 M DTT 3.6㎕
1 M MgCl2 4.3㎕
50μM 올리고(dT) 7.2㎕
NTP 혼합물(라이프 테크놀로지즈 메가스크립트 SP6 키트) 57.6㎕
dNTP (NEB) 18㎕
10% 트윈-20 1.2㎕
리보락(써모 사이언티픽) 14.4㎕
이콜라이 무기 파이로포스파타제 (NEB) 28.8㎕
T7 RNAP (NEB) 14.4㎕
T4gp32 (NEB) 8.6㎕
맥시마 H-RTase(써모 사이언티픽) 43.2㎕
총 용적 244.8㎕
세포 및 바코딩된 비드 현탁액을 현탁액을 하나의 샘플 루프에 장입하고 나서, RT/바코딩/용해 혼합물을 주사기를 이용하여 다른 샘플 루프에 장입한다. 4-원 밸브를 전환하고, 따라서 샘플 루프는 펌프와 연결되고, 모두 3개의 펌프가 활성화된다. 2개의 수성 주입물을 그들이 1:2(세포 현탁액: RT/바코딩/용해 혼합물) 비로 혼합되는 속도로 유동시킨다. 수성 및 오일 주입물을 직경이 대략 50㎛인 점적이 형성되는 속도로, 그리고 세포 및 비드가 장치를 통해 유동되기에 충분히 높은 속도로 유동시킨다. 에멀전을 소렌슨 바이오사이언스(Sorenson Bioscience) 0.2㎖ PCR 관에서 수집한다. 샘플이 생성된 후에, 사전 가열 단계(55℃에서 3분)가 처음에 제공되었고, 이어서, 42℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켜 RT/바코딩 반응이 진행되게 한다. 바코딩 반응 후에, 실시예 7에 기재하는 "비-비드 에멀전 파괴" 과정을 이용하여 에멀전을 파괴한다. 후속 PCR 반응을 실시예 7에서와 같이 수행한다.
이렇게 증폭시킨 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 정제하고, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 454 서열분석과 같은 차세대 서열 분석을 위해 제조한다. 이 실시예는 반응 용기마다 대략 1개의 비드로 바코드 어댑터 주형 비드를 사용하기 때문에, 짝지어진 면역글로불린 중쇄 및 경쇄는 고유 바코드 서열의 그들의 공유된 용도에 의해 짝지어진다.
I. 실시예 9: DNA 중합효소를 이용하여 바코드 어댑터 주형 비드로부터 증폭된 바코드 어댑터를 이용하는 세포로부터의 핵산의 바코딩 .
이 실시예는 실제로 달성한 결과보다는 예측한 결과에 기반하여 본 발명의 실시형태를 기재한다. 실시예 7에서 기재한 바와 같은 점적을 생성하기 위한 미세유체 장치를 사용하고, 제1 샘플 루프가 실시예 1, 2 또는 3에서 제조한 바와 같은 세포와 바코드 어댑터 주형 비드를 둘 다 함유한다는 것만 차이가 있었다. 이 실시예에서, 바코드 어댑터 주형 비드는 T7 RNAP 프로모터 서열보다는 5' Nt.BbvCI 틈내기 엔도뉴클레아제 서열을 포함하여 DNA 중합효소에 의해 바코드 어댑터를 증폭시킨다.
뮤린 B220+ B 세포 집단을 FACS 분류하고 나서, 현탁 완충제로서 10mM NaCl 및 0.5㎎/㎖ BSA와 함께 300mM 베타인을 이용하여 세포 및 바코드 어댑터 주형 비드 현탁액을 제조하였다. 세포를 4,500개 세포/㎕의 농도로 포함시키고, 비드를 60,000 비드/㎕의 농도에서 사용한다.
RT 혼합물을 다음과 같이 제조한다:
ddH2O 32.7㎕
10X 써모폴 DF 36㎕
1 M DTT 3.6㎕
1 M MgCl2 4.3㎕
50μM 올리고(dT) 7.2㎕
dNTP (NEB) 36㎕
10% 트윈-20 1.2㎕
리보락(써모 사이언티픽) 14.4㎕
이콜라이 무기 파이로포스파타제 (NEB) 28.8㎕
Nt.BbvCI (NEB) 14.4㎕
클레노브 엑소- (NEB) 14.4㎕
T4gp32 (NEB) 8.6㎕
맥시마 H-RTase(써모 사이언티픽) 43.2㎕
총 용적 244.8㎕
세포 및 바코딩된 비드 현탁액을 현탁액을 하나의 샘플 루프에 장입하고 나서, RT/바코딩/용해 혼합물을 주사기를 이용하여 다른 샘플 루프에 장입한다. 4-원 밸브를 전환하고, 따라서 샘플 루프는 펌프와 연결되고, 모두 3개의 펌프가 활성화된다. 2개의 수성 주입물을 그들이 1:2(세포 현탁액: RT/바코딩/용해 혼합물) 비로 혼합되는 속도로 유동시킨다. 수성 및 오일 주입물을 직경이 대략 50㎛인 점적이 형성되는 속도로, 그리고 세포 및 비드가 장치를 통해 유동되기에 충분히 높은 속도로 유동시킨다. 에멀전을 소렌슨 바이오사이언스(Sorenson Bioscience) 0.2㎖ PCR 관에서 수집한다. 샘플이 생성된 후에, 사전 가열 단계(55℃에서 3분)가 처음에 제공되었고, 이어서, 42℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켜 RT/바코딩 반응이 진행되게 한다. 바코딩 반응 후에, 실시예 7에 기재하는 "비-비드 에멀전 파괴" 과정을 이용하여 에멀전을 파괴한다. 후속 PCR 반응을 실시예 7에서와 같이 수행한다.
이렇게 증폭시킨 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 정제하고, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 454 서열분석과 같은 차세대 서열 분석을 위해 제조한다. 이 실시예는 반응 용기마다 대략 1개의 비드로 바코드 어댑터 주형 비드를 사용하기 때문에, 짝지어진 면역글로불린 중쇄 및 경쇄는 고유 바코드 서열의 그들의 공유된 용도에 의해 짝지어진다.
J. 실시예 10: 다중-웰 반응 용기 내에서 바코드 어댑터 주형을 이용하는 세포로부터의 핵산의 바코딩 .
이 실시예는 실제로 달성한 결과보다는 예측한 결과에 기반하여 본 발명의 실시형태를 기재한다. 도 1에서와 같은 조성물을 이용하여 바코드 어댑터 주형을 IDT와 같은 판매사로부터의 이중가닥 올리고로서 합성하였다. 각각의 고유 바코드 어댑터 주형을 바코드 서열의 혼합 또는 교차 오염이 없도록 상이한 저장 용기에서 유지한다. 활성화된 B 세포(형질아세포)를 96-웰 플레이트의 모든 웰 내로 FACS 아리아 II(벡톤 딕켄슨)을 이용하여 10㎕의 용해 완충제 내에 단일 세포 분류한다. 각각의 웰에서 완충제의 조성은 하기와 같다:
10mM 트리스 pH 8.0 10㎕까지
10x MMLV 완충제 1㎕
100mM MgCl2 0.3㎕
1M DTT 0.015㎕
100x BSA (NEB) 0.075㎕
dNTP 0.5㎕
10μM 올리고(dT)25(서열번호 40) 0.5㎕
20% IGEPAL-630(시그마) 0.15㎕
1μM 바코드 어댑터 주형 0.25㎕
리보락(써모 사이언티픽) 0.4㎕
맥시마 H-RTase(써모 사이언티픽) 0.25㎕
이어서, 플레이트를 55℃에서 3분 동안 인큐베이션시키고, 이어서, RT/바코딩 반응이 일어나도록 42℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 96-웰 플레이트의 모든 웰 내의 반응을 함께 풀링하였고, 변형된 전통 페놀/클로로폼 방법을 이용하여 세정을 수행한다:
1. 400㎕의 페놀/클로로폼/아이소아밀 알코올(시그마)을 첨가하고, 사전 교반시킨 겔상 락 튜브(5프라임)에서 격렬하게 진탕시킨다
2. 겔상 락 튜브를 14,000g에서 3분 동안 원심분리하고 나서, 상부 수성 분획을 아미콘 100kDa 칼럼(밀리포어) 내로 피펫팅하고 나서, 14,000g에서 3분 동안 교반시킨다
3. 아미콘 칼럼을 통해 교반시킨 전체 수성 용적을 얻는는데 필요하다면 단계 2를 반복한다
4. 이어서, 450㎕ TE(10mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA)를 아미콘 칼럼 내로 피펫팅하고 나서, 14,000g에서 3분 동안 교반시킨다
5. 이어서, 450㎕의 10mM 트리스(pH8.0)를 아미콘 칼럼 내로 피펫팅하고 나서, 14,000g에서 5분 동안 교반시킨다
6. 아미콘 칼럼을 새로운 수집관 내로 뒤집어 넣고, 1000g에서 2분 동안 교반시켜 용리액을 수집하고, 이는 정제된 mRNA/제1 가닥 cDNA 이중가닥을 함유한다
다음의 PCR1 퓨전(써모 사이언티픽) 반응 혼합물을 하기와 같이 설정하였다:
H2O 11.28㎕
5x GC 완충제 5㎕
MgCl2 0.15㎕
DMSO 1㎕
dNTP 0.5㎕
10μM FW1-쇼트 1㎕
10μM FW-장 1㎕
10μM K-GSP1 0.56㎕
10μM L-GSP1 1.25㎕
10μM G-GSP1 0.56㎕
ET-SSB (NEB) 0.25㎕
BSA 0.25㎕
퓨전 0.2㎕
cDNA 주형 2㎕
Figure pct00023
이어서, PCR1로부터의 반응물을 50x 희석시키고 나서, 3개의 별도의 PCR2 반응(카파 경쇄에 대해 하나, 람다 경쇄에 대해 하나 및 감마 중쇄에 대해 하나)에서 주형으로서 사용한다.
다음의 PCR2 퓨전(써모 사이언티픽) 반응 혼합물을 하기와 같이 설정한다:
H2O 17.82㎕
5x GC 완충제 6㎕
MgCl2 0.18㎕
DMSO 1㎕
dNTP 0.6㎕
10μM 2FW 1.2㎕
10μM K 또는 L 또는 G-GSP2 0.6㎕
BSA 0.3㎕
퓨전 0.3㎕
희석. PCR1 주형 2㎕
Figure pct00024
이렇게 증폭시킨 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 정제하고, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 454 서열분석과 같은 차세대 서열 분석을 위해 제조한다. 이 실시예는 각각의 반응 용기 내로(이 경우에 96-웰 플레이트의 웰) 개별적으로 피펫팅한 고유 바코드 어댑터 주형을 사용하기 때문에, 짝지어진 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 고유 바코드 서열의 그들의 공유된 사용에 의해 생물정보학적으로 짝지었다.
K. 실시예 11: 미세유체 점적 장치를 이용하여 만든 점적에서 바코드 어댑터 주형 비드를 이용하는 세포로부터의 핵산의 바코딩 .
에멀전 PCR을 이용하여 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리를 생성하기 위해 이하에 기재하는 방법을 사용하였고, 여기서 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하여 고유 바코드 어댑터 주형을 각각의 비드에 부착하였다(도 15 참조).
단일 반응에서 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리를 제조하기 위해 사용한 올리고
프라이머 명칭 서열(서열번호)
emB-T7브릿지IsceI 이중-바이오틴-C18스페이서-C18스페이서- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAT AGG GAT AAC AGG GTA ATA GGA (7)
emB-BC브릿지IsceI2 mCmCC CCA GTT TAA ACT CCTH HHT HHH HTH HHH THH HTH HHH TCC TAT TAC CCT GTT ATC CC (8) (HH HTH HHH THH HHT HHH THH HH (3)의 무작위 조합은 318 또는 387 x106가지의 가능성을 가져서, 3억 8천 7백만개의 고유 바코드를 제공한다)
emB-T7무 브릿지IsceI_2 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAT AGG GAT AAC AGG GTA ATA GGA (9)
emB_IsceI_RV 알렉사플루오르647-C18스페이서-mCmCC CCA GTT TAA ACT CCT (10)
스트렙타비딘-코팅된 M-270 다이나비즈(등록상표)(라이프 테크놀로지즈)를 바이오티닐화된 올리고뉴클레오타이드("emB_T7브릿지IsceI")와 결합하였다:
1. 비드를 부드럽게 교반시킴으로써 재현탁시켰다
2. 1㎖의 M270 비드(대략 2 x 109　비드)를 총 3㎖에 대해 각각 3개의 1.5㎖ 마이크로원심분리관에 넣었다
3. 3분 동안 자기에 두었다.
4. 각각의 관으로부터 상청액을 제거하고 나서, 1㎖(1x 용적) 결합/세척 완충제(BWB; 1M NaCl, 5mM 트리스, 0.5mM EDTA) 중에서 재현탁시켰다
5. 단계 4를 2회 이상 반복한 다음에, 540㎕ 용적 BWB 중에서 최종 재현탁시켰다
6. 60㎕의 100μM emB_T7브릿지2를 비드에 첨가하고 나서, 부드럽게 교반시키면서 15분 동안 인큐베이션시켰다
7. 인큐베이션 후에, 비드를 1㎖ BWB 완충제로 3x 세척하였고, 단일관에 합하였다
8. 비드를 4℃에서 0.01% 아자이드나트륨과 함께 저장하였다
9. 비드를 사용 전에 10mM 트리스로 3회 세척하였다
바코드 올리고뉴클레오타이드 및 정방향 및 역방향 프라이머를 에멀전-기반 PCR에서 상기로부터의 결합된 비드에 첨가한다:
1. 다음의 PCR 혼합물(3㎖ 총 용적)을 3개의 1.5㎖ 마이크로원심분리관(VWR 카탈로그 번호 20170-650)에서 제조하였다:
ddH2O 572.7㎕
10X HiFi PCR 완충제 80㎕
50mM MgSO4 40㎕
10mM dNTP 혼합물 16㎕
emB_T7브릿지IsceI-표지된 다이나비즈 (2x105개 비드/㎕) 40㎕
emB_T7무 브릿지IsceI_2 (10μM) 3.2㎕
emB_BC브릿지IsceI_2 (1 pM) 13.3㎕
emB_IsceI_RV (100μM) 24㎕
열안정성 무기 파이로포스파타제 (NEB 2,000 단위/㎖) 1.2㎕
백금 태그 Hifi(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 5 단위/㎕) 9.6㎕
총 용적 800㎕
2. 오일-계면활성제 혼합물을 준비하였다(20㎖ 총 용적):
a. 광유(시그마(Sigma)) 18.4㎕
b. EM90(에보닉) 1.6㎖
3. 800㎕의 오일-계면활성제 혼합물 및 200㎕의 PCR 혼합물을 각각의 12 악시겐(Axygen) 2.0㎖ 맥시뭄 리커버리 코니칼형(Maxymum Recovery conical-bottom) 원심분리관(MCT-200 내지 L-C) 내로 합하였다. 관을 밀봉하고, 3초 동안 진탕시켰다
4. 관을 퀴아젠 조직용해기 II(Qiagen TissueLyzer II)에 넣고, 5분 동안 14㎐에서 진탕시켰다
5. 에멀전을 VWR 96-웰 PCR 플레이트(83007-374)의 웰 중에서 나누고, 160㎕의 에멀전을 웰마다 첨가하였다
6. 다음의 프로그램을 이용하여 관을 열순환시켰다:
Figure pct00025
에멀전을 파괴하고, 비드를 회수하였다:
1. PCR 플레이트의 내용물을 관마다 0.5㎖ 이하의 에멀전 용적을 지니는 1.5㎖ 마이크로원심분리관(VWR 20170-650) 내로 옮겼다
2. 100㎕의 1μM emB_T7무 브릿지IsceI_2 프라이머를 각각의 관에 첨가하였다
3. 관을 아이소부탄올로 가득채우고, 밀봉하고 나서, 진탕시켜 철저하게 혼합하였다
4. 관을 1분 동안 14,000rpm에서 원심분리시켰다
5. 관을 자기 스트립 상에 두어서 관의 측면에 대해 비드를 끌어당기고, 이어서, 가능한 많은 상청액을 흡입하는 한편, 펠렛화된 비드를 뒤에 남겨두었다
6. 1㎖의 아이소부탄올을 첨가하고, 남아있는 오일/에멀전 용적이 아이소부탄올 내로 분산될 때까지 위아래로 피펫팅함으로써 혼합하였다
7. 관을 자기 스트립 상에 두어서 관의 측면에 비드를 끌어당기고, 이어서, 아이소부탄올을 흡입하였다. 비드가 조합되는 관으로부터의 상청액을 처음에 흡입함으로써 모든 관으로부터의 비드를 단일관 내로 합하였고, 이어서, 다른 관으로부터의 전체 용적을 옮겨서, 비드가 자기에서 수집되는 시간을 허용하고, 이어서, 상청액을 흡입한 다음 반복한다
8. 1㎖의 새로운 아이소부탄올을 첨가하고 나서, 잘 혼합하고, 60초 동안 둔다
9. 아이소부탄올을 흡입하였다
10. 1㎖의 100% 에탄올을 첨가하고 나서, 잘 혼합하고, 60초 동안 둔다
11. 에탄올을 흡입하였다
12. 단계 10 및 11을 반복하였다
13. 1㎖의 70% 에탄올을 첨가하고 나서, 잘 혼합하고, 60초 동안 둔다
14. 에탄올을 흡입하였다
15. 단계 13 및 14를 반복하였다
16. 1㎖ PBS를 첨가하고 나서, 잘 혼합하고, 60초 동안 둔다.
17. PBS를 흡입하였다
18. 단계 16 및 17을 반복하였다.
이어서, 바코드 어댑터 주형이 혼입된 비드를 emB_IsceI_RV 역방향 프라이머 내로 혼입된 알렉사 플루오르 647 염료로부터의 형광을 이용하여 벡톤 디켄슨 FACS 아리아 III(Becton Dickenson FACS Aria III)을 사용하여 비-바코딩 비드로부터 분류하였다.
비드를 4℃에서 저장을 위해 0.01% 아자이드나트륨에서 저장하였다. 도 17 내지 도 19에서 나타내고 실시예 7에 기재한 미세유체 장치를 사용하여 바코딩된 비드 및 바코딩 분석에 필수적인 다른 시약과 함께 단일 세포를 캡슐화하였다. CD19+IgG+ 기억 B 세포 집단을 FACS 분류하고 나서, 완전 IMDM 배지(IMDM + 10% FBS + 100U/㎖ IL-2, 50ng/㎖ IL-21, 50ng/㎖ CD40L, 5μg/㎖ 항-CD40L mAb 및 1x 노르모신(Normocin))에서 6일 동안 배양시킨 후, 현탁 완충제로서 10mM NaCl 및 0.5㎎/㎖ BSA와 함께 300mM 베타인을 이용하여 세포 현탁액을 제조하였다. 2,500개 세포/㎕의 농도에서 세포를 사용하고, 100,000개 비드/㎕의 농도에서 비드를 바코딩하였다.
RT/수성 바코드 혼합물을 다음과 같이 제조하였다:
10X 써모폴 DF 24㎕
H2O 10.6㎕
200X BSA 4㎕
1 M DTT 2.4㎕
1 M MgCl2 2.9㎕
50μM 올리고(dT) 4.8㎕
NTP 혼합물(라이프 테크놀로지즈 메가스크립트 T7 키트) 25.4㎕
dNTP(NEB) 11.9㎕
10% 트윈-20 0.8㎕
리보락(써모 사이언티픽) 9.5㎕
이콜라이 무기 파이로포스파타제 (NEB) 19.1㎕
T7 RNAP(NEB) 9.5㎕
T4gp32(NEB) 5.7㎕
맥시마 H-RTase(써모 사이언티픽) 28.6㎕
총 용적 159.1㎕
세포 및 비드 현탁액을 하나의 샘플 루프에 장입하고 나서, RT/바코딩/용해 혼합물을 주사기를 이용하여 다른 샘플 루프에 장입하였다. 단일 점적에서 다중 세포 또는 바코드의 발생을 최소화하는 방법으로 세포 및 바코드 농도를 선택하는 한편, 희석을 효과적으로 야기하도록 세포 및 비드가 현탁액 유체와 동일한 속도로 관을 통해 이동하지 않는다는 것을 유념해두고 해당 농도를 충분히 높게 유지해서 다수의 충분한 수의 세포를 비드와 함께 캡슐화하였다. 4-원 밸브를 전환하였고, 따라서 샘플 루프는 펌프와 연결되고, 모두 3개의 펌프가 활성화되었다. 2개의 수성 주입물을 그들이 1:2(세포 현탁액: RT/바코딩/용해 혼합물) 비로 혼합되는 속도로 유동시켰다. 수성 및 오일 주입물을 직경이 대략 150㎛인 점적이 형성되는 속도로, 구체적으로 1㎕/분(세포/비드 현탁액 선), 2㎕/분(RT 혼합물 선), 3㎕/분(오일 선)으로 유동시켰다. 에멀전을 소렌슨 바이오사이언스(Sorenson Bioscience) 0.2㎖ PCR 관에서 수집하였다. 샘플이 생성된 후에, 사전 가열 단계(50℃에서 3분)가 처음에 제공되었고, 이어서, 42℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켜 반응이 진행되게 하였다. 반응 후에, 이하에 기재하는 프로토콜을 이용하여 에멀전을 파괴하였다. 이는 후속적 PCR 증폭 및 서열분석에 대해 cDNA의 정제된 샘플을 생성하였다.
다음의 절차를 사용하여 에멀전을 파괴하고 산물을 회수하였다:
1. 상 잠금 관(5프라임)을 교반시켜 겔을 바닥으로 밀어내었다.
2. 샘플 및 200㎕ TE 완충제, 400㎕ 페놀 클로로폼 혼합물, 800㎕ 클로로폼을 각각의 상 잠금 관에 첨가하였다.
3. 관을 3분 동안 14,000g에서 교반시켰다
4. 수층을 제2 사전교반상 잠금관에 옮기고 나서, 동일 용적의 페놀 클로로폼을 첨가하였다
5. 관을 14,000g에서 3분 동안 교반시켰다
6. 450㎕의 TE를 아미콘 필터에 첨가하였다
7. 단계 5 및 6을 반복하였다.
8. 450㎕의 10mM 트리스를 아미콘 필터에 첨가하였다
9. 단계 5를 반복하였다
10. 이어서, 각각의 필터 단위를 새로운 수집관 내에 뒤집어서 두었다
11. 관을 1000g에서 2분 동안 교반시키고, 세정한 샘플을 수집관 내로 교반시켰다
이어서, 표 13에서 열거한 일부 프라이머 서열에 추가로 다음의 프라이머를 이용하여 2 라운드의 PCR(PCR1 및 PCR2)을 수행하였다.
Figure pct00026
다음의 PCR1 Q5(NEB)(써모 사이언티픽) 반응 혼합물을 바코드 어댑터 주형을 사용한 RT 반응마다 설정하였다:
H2O 11㎕
5x Q5 완충제 5㎕
50mM MgCl2 0.15㎕
DMSO 1㎕
dNTP 0.5㎕
10μM FW1-쇼트 1㎕
2.5μM BCFW_롱 IsceI 1㎕
10μM K-GSP1 0.56㎕
10μM L-GSP1 0.5㎕
10μM G-GSP1 0.56㎕
ET-SSB (NEB) 0.25㎕
100X BSA 0.25㎕
Q5 효소 0.2㎕
cDNA 주형 2㎕
Figure pct00027
이어서, PCR1로부터의 반응물을 10mM 트리스-HCl(pH 8.0) 중에서 25x 희석시키고 나서, 2개의 별도의 PCR2 반응(카파 및 람다 경쇄에 대해 하나 그리고 감마 중쇄에 대해 하나)에서 주형으로서 사용하였다.
다음의 PCR2 Q5(NEB) 반응 혼합물을 PCR1 반응 당 설정하였다:
H2O 20㎕까지
5x Q5 완충제 4㎕
50mM MgCl2 0.12㎕
DMSO 0.67㎕
dNTP 0.4㎕
10μM 2FW 0.8㎕
10μM K- 및 L- 또는 G-GSP2 0.4㎕
BSA 0.2㎕
퓨전 0.2㎕
희석. PCR1 주형 1.33㎕
Figure pct00028
10㎕의 PCR 산물을 겔 상에서 실행하였다(도 24). 카파 및 람다 경쇄에, 그리고 감마 중쇄에 대응하는 밴드가 명확하게 보였다.
2회의 4-주기 PCR 반응을 중쇄 및 경쇄 앰플리콘에 대해 별도로 수행하여 454 LibA 서열분석 어댑터를 첨가하였다. LibPCR1에서, "A" 어댑터를 앰플리콘의 5' 말단에 첨가하고, "B" 어댑터를 3' 말단에 첨가하였고; LibPCR2에서 반대로 하였다. LibPCR 설명은 다음과 같으며, Lib1-FR 프라이머 혼합물을 LibPCR1에서 사용하고 Lib2-FR 혼합물을 LibPCR2에서 사용하며, 프라이머를 표 14에서 열거한다.
H2O 20㎕까지
5x Q5 완충제 6㎕
50mM MgCl2 0.18㎕
DMSO 1.2㎕
dNTP 0.6㎕
10μM Lib1-FR 또는 Lib2-FR 혼합물 1.2㎕
BSA 0.3㎕
Q5 0.3㎕
주형 2㎕
Figure pct00029
Figure pct00030
이어서, 비드:DNA 비 0.68:1을 이용하는 제조업자의 설명서에 따라 앰퓨어(Ampure)(Beckman Coulter) 비드 세정과 제조업자의 설명서에 따라 플래시겔 리커버리 겔(론자)를 이용하는 겔 정제를 둘 다 이용하여 앰플리콘을 정제하였다.
제조업자의 설명서에 따라 카파 qPCR 라이브러리 정량화(KAPA)를 이용하여 앰플리콘을 정량화하고, 454 에멀전 PCR에서 적절한 양의 중쇄 및 경쇄 앰플리콘 라이브러리를 이용하고 나서, 에멀전을 파괴하고, 제조업자의 설명서에 따라 서열분석을 위해 454 시퀀서 상에 클론 증폭시킨 454 비드를 장입하였다. A와 B 어댑터를 둘 다 앰플리콘의 5'과 3' 말단 둘 다에 첨가하기 때문에, 본 발명자들은 양방향으로부터 서열분석할 수 있고, 정??향과 역방향 판독을 둘 다 얻었다.
다른 차세대 서열분석 플랫폼도 사용할 수 있었지만, 서열을 표준 454실행으로부터 생성하고, 얻어진 서열을 분석하였다.
컴퓨터 프로그램을 작성함으로써 서열을 분석하였다. 컴퓨터 프로그램은 454 피코 타이터 플레이트의 영역으로부터 서열 판독에 대해 다음의 단계들을 수행하였다. 영역 1 서열은 상기 기재한 바와 같은 중쇄 라이브러리로부터 유래되었다. 영역 2 서열은 상기 기재한 바와 같이 생성한 경쇄 라이브러리로부터 유래되었다. 각각의 판독을 위해, 2개의 전역-국부 정렬을 컴퓨터 계산하여 표 15로부터의 서열 T2' 및 T1에 매칭되는 하위 서열을 갖는 가닥을 결정하였다. 전역-국부 정렬을 매치는 0으로서, 미스매치는 -1로서 스코어링하고, 갭 오픈 페널티 및 갭 익스텐션 페널티 -1을 사용하였다. 스코어는 -4 초과로 되는 것이 필요하고 또는 판독을 폐기하였다. 중쇄 영역에 대해, 841x103개 판독 중에서 611x103개 판독은 정렬 스코어 구속을 충족하였다. 경쇄 영역에 대해, 856x103개 판독 중에서 617x103개 판독은 정렬 스코어 구속을 충족하였다. 전역-국부 정렬에 기반하여, DNA 바코드의 서열을 판독으로부터 추출하였다. 정렬 스코어 구속을 충족하는 중쇄 영역 판독에 대해, 397x103개의 판독은 예상한 패턴과 일치되는 바코드 서열을 가지며, 관찰된 바코드를 갖도록 부여하였다. 정렬 스코어 구속을 충족하는 경쇄 영역 판독에 대해, 437x103개의 판독은 예상한 패턴과 일치되는 바코드 서열을 가지며, 관찰된 바코드를 갖도록 부여하였다.
동일한 DNA 바코드 서열을 이용하는 판독을 어셈블리를 위해 함께 그룹화하였다. 동일한 바코드를 지니는 판독의 그룹을 뉴블러(newbler), 즉, 454개의 어셈블리를 이용하여 어셈블하였다. 영역 2 서열과 동일한 바코드 서열을 갖는 영역 1 서열에 대한 어셈블리 공통 서열을 중쇄 및 경쇄쌍 세트로 그룹화하였다.
중쇄 및 경쇄쌍 세트는 B세포로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 서열 또는 에멀전 RT 거품에 존재하는 B 세포를 함유하였다.
중쇄 및 경쇄 판독쌍 세트 중에서, 2,551개는 중쇄 영역으로부터 적어도 10개의 판독을 가지고, 경쇄 영역으로부터 적어도 10개의 판독을 가진다. 2,551개의 이러한 쌍 중에서, 1,820개는 정확히 하나의 중쇄 및 정확히 하나의 경쇄에 어셈블되었다. 해당 쌍 중 61개는 생성된 서열의 전체 데이터 세트에 걸쳐 고유한 중쇄 및 경쇄를 갖는 것을 발견하였다.
공유된 바코드 "GCCGACCACGGCACAAGCGCCGAAAAT"(서열번호 124)를 갖는 바코딩된 중쇄 및 경쇄 판독으로부터 생성된 짝지어진 중쇄 및 경쇄 서열의 예는 "MEFGLSWLFLVAILKGVQCGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAGSQFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSGISGDGYRIQYADSVEGRFSISRDNSNNMVYLQMTSLRAEDTAVYFCAKDLFPRTIGYFDYWGQGTRVTVSS"(서열번호 125) (중쇄 아미노산 서열) 및 "MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGKIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISINLAWYQHKPGQAPRLLIYGASTRATAIPARFSGSVSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDDWPRTFGQGTKVEI"(서열번호 126)(경쇄 아미노산 서열)이다.
상기 분석은 B 세포로부터의 중쇄 서열이 B 세포로부터 대응하는 경쇄 서열과 결합하는 능력을 입증한다.
Figure pct00031
L. 실시예 12: 미세유체 점적 장치를 이용하여 만든 점적에서 바코드 어댑터 주형 비드를 이용하는 세포로부터의 핵산의 바코딩 .
이 실시예는 실제로 달성한 결과보다는 예측한 결과에 기반하여 본 발명의 실시형태를 기재한다. emB_BC브릿지ISceI_2가 emB_BC브릿지ISceI_N으로 대체되고 emB_IsceI_RV가 emB_ISceI_RV_n으로 대체되는 것을 제외하고 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리를 실시예 11에서와 같이 제조하였다. emB_ISceI_RV_n은, 제조할 때, 상이한 UMI를 지니는 개개 mRNA 분자를 바코딩하기 위해 바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리가 고유 샘플 바코드 및 무작위 H(A,C,T 뉴클레오타이드) 옥타머 UMI를 지니는 각각의 비드를 포함하도록 고유 분자 식별자(UMI)를 함유할 것이다.
Figure pct00032
비드와 함께 세포를 실시예 11에 기재한 바와 같은 바코딩 반응을 위해 점적에서 캡슐화하며, 이는 활성화된 기억 B 세포보다는 PBMC를 사용하고, 사용한 올리고(dT)는 올리고T_n이며, 서열은 CAC GAC CGG TGC TCG ATT TAG TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT T(서열번호 50)이라는 것만 차이가 있다. 이어서, 에멀전을 실시예 11에서 기재한 바와 같이 파괴한다.
이어서, 다음의 프라이머를 이용하여 1라운드의 PCR을 수행한다:
Figure pct00033
다음의 PCR Q5(NEB) 반응 혼합물을 반응마다 사용하고, 다회 반응을 셋업하고 나서, 각각의 반응을 15 내지 26 주기의 상이한 주기에 대해 순환시켜 사용하는 최적의 주기 수를 찾는다:
H2O 9.65㎕
5x Q5 완충제 5㎕
50mM MgCl2 0.15㎕
DMSO 1㎕
dNTP 0.5㎕
10μM FW1-쇼트 1㎕
2.5μM BCFW_롱 IsceI 1㎕
10μM RV_1 1㎕
ET-SSB(NEB) 0.25㎕
100X BSA 0.25㎕
Q5 효소 0.2㎕
cDNA 주형 5㎕
Figure pct00034
5㎕의 PCR 산물을 겔 상에서 실행하고, 양호한 양의 산물을 제공하지만 과순환되지 않는 주기 수를 후속적 하류 단계에서 사용한다.
이어서, 다른 서열분석 플랫폼이 마찬가지로 사용될 수 있지만, 일루미나 쌍 말단 서열분석 키트 및 일루미나 고속대량 시퀀서 상에서 서열분석한 정방향 말단에 따라 산물을 제조한다. 서열을 생성하고 분석한다. 이어서, 샘플 바코드를 사용하여 개개 세포에 대한 판독을 부여한 다음, UMI를 사용하여 당업계에 잘 확립된 방법을 이용하여 단일-세포 RNA 서열분석을 수행한다(Nat Methods. 2014 Feb;11(2):163-6. doi: 10.1038/nmeth.2772. Epub 2013 Dec 22).
M. 실시예 13: 조합적으로 생성된 바코드를 이용하는 바코드 어댑터 주형 합성
바코드 어댑터 주형 비드 라이브러리를 이 실시예에서 합성하였다.
바코드-함유 올리고(도 15에서와 같음)를 2개의 올리고, 즉 BC_부분1_센스 및 BC_부분2_유형(1, 2 또는 3)_안티센스로부터 조합적으로 생성하였다. 각각의 BC_부분1_센스 및 BC_부분2_유형(1, 2 또는 3)_안티센스 올리고는 고유 서열인 "바코드 부분1" 및 "바코드 부분2"를 각각 함유한다. 조합된 이들 서열은 고유 바코드 서열을 생성한다. "바코드 부분1" 및 "바코드 부분2"는 문헌[Generalized DNA barcode design based on Hamming codes, Bystrykh 2012 PLoS One. 2012 7: e36852.]의 방법에 따라 각각 (16,11) 및 (12,7) 해밍 코드이다. 따라서, 이렇게 설계한 바코드는 오류-정정이다.
BC_부분2 올리고는 또한 3가지 유형, 즉, BC_부분2_유형1_안티센스, BC_부분2_유형2_안티센스 및 BC_부분2_유형3_안티센스로 나뉘어진다. 이는 3개의 상이한 미스프라이밍되지 않은 역방향 프라이머(Rv_유형1, Rv_유형2 및 Rv_유형3)를 지니는 바코드 어댑터 주형을 생성하기 위한 증폭을 허용한다. 각각의 해당 역방향 프라이머가 상이한 형광단에 공유 결합될 때, 생성된 바코드 어댑터 주형 비드는 상이한 색으로 형광을 통해 동정될 수 있다. 추가로, 바코드 유형 중 하나 이상의 유형을 갖는 바코드 어댑터 주형 비드는 하나 이상의 색으로 형광을 낼 것이다. 점적에서 필요한 프라이머를 지니는 하나의 바코드-함유 올리고를 지니는 비드를 넣기 위해 바코드 어댑터 주형으로서 이 실시예에서 비드를 제한 희석을 이용하는 emPCR에서 생성한다. 푸아송 통계는 적은 백분율의 점적이 비-단일코드 바코드 어댑터 주형 비드를 생성하는 효과에서 하나 이상의 바코드-함유 올리고를 함유한다는 것을 나타낸다. 상이한 색으로 형광을 내는 상이한 유형의 바코드 어댑터 주형 비드를 가짐으로써, 다음에 단색 비드의 FACS 분류는 바코드 어댑터 주형 비드의 emPCR 생성을 통해 얻은 단일코드 비드의 백분율을 크게 증가시킬 것이다.
Figure pct00035
바코드-함유 올리고를 표 19에서의 조건 및 다음의 열순환 조건을 이용하여 PCR 생성하였다: 2분 동안 94℃, 다음에 2시간 동안 53℃, 15초 동안 7주기의 94℃, 30초 동안 53℃ 및20초 동안 68℃, 이어서, 1분 동안 68℃ 및 10℃에서 유지한다. 자이모 DNA 세정 및 농축 키트를 이용하여 반응물을 세정하고, 농도를 쿠비트(Qubit)(라이프 테크놀로지즈)를 이용하여 정량화한다.
Figure pct00036
바코드-함유 올리고에 대한 82bp 크기를 겔 상에서 확인하였다(도 25, 상부 좌측).
9.8㎛ 슈퍼아비딘(SuperAvidin) 마이크로스피어 비드(방스 랩(Bang's Lab))를 바이오티닐화된 SAV-비드-링커 올리고와 결합하였다. 1천 5백만개의 비드를 60㎕의 10μM 올리고와 함께 1시간 동안 인큐베이션시키고, 이어서, BWB 완충제(TE 중의 1M NaCl)로 3x 세척한 다음에 10mM 트리스 중에서 3회 세척하여 결합된 SAV_ 비드_ 링커 비드를 생성하였다.
바코드 어댑터 주형 비드를 생성하기 위한 emPCR을 다음과 같이 진행하였다:
Figure pct00037
표 20의 마스터믹스와 함께 에멀전 오일을 진탕시킴으로써 에멀전을 생성하였다. 에멀전 오일 제형은 10㎖ AR20 실리콘 오일(시그마), 7.5㎖ 7225C 제형 보조제(다우 코닝), 7.5㎖ 0749 수지(다우 코닝) 및 0.1% 트리톤 X-100(시그마)였다. 12㎖의 에멀전 오일을 조직용해기(퀴아젠) 내에서 4㎖의 모의 혼합물(표 20의 마스터믹스의 올리고, 프라이머 및 효소 없음)과 함께 30Hz에서 5분 동안 진탕시켰고, 이어서 4㎖의 마스터믹스를 첨가한 후에 5분 동안 12Hz에서 진탕시켰다. 이는 직경이 30 내지 80㎛인 대다수의 더 큰 점적을 제공한다. 열순환 조건은 하기와 같다:
Figure pct00038
에멀전을 브레이킹 믹스 1, 다음에 브레이킹 믹스 2로 세척함으로써 파괴한 다음에 70% 에탄올 세척하고, TE 세척한다. 비드를 0.001% 트윈 20과 함께 TE 중에서 재현탁시켰다.
Figure pct00039
BD FACS 재즈 앤 브라이트 상에서 비드를 실행하고, 단색 비드를 분류하였다(도 25, 우측). PCR 관 내 다중 비드와 함께 그리고 정제된 PBMC RNA와 함께 반응을 개방 PCR에서 행한 것을 제외하고, 실시예 14에서와 같이 수행한 바코딩 반응을 행하여서 비드를 RNA를 바코딩하기 위한 바코드 어댑터로서 사용할 수 있는지를 입증한다. 도 25, 하부 좌측에서와 같이, 비드가 바코딩 RNA에 대해 바코드 어댑터 주형으로서 정말로 사용가능한지를 나타내는 밴드를 얻었다.
N. 실시예 14: 다양한 용적의 점적에서 바코드 어댑터 주형 비드를 이용하는 세포로부터의 핵산의 바코딩
동결보존한 PBMC를 해동하고 나서, 3백만개의 세포/㎖로 밤새 AIM V 배지(라이프 테크놀로지)에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 제조업자의 설명서에 따라 CD3 마이크로비즈(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))을 이용하는 자기-활성화된 세포 분류(MACS)를 이용하여 T 세포를 단리시켰다. 간략하게, T 세포를 300g에서 10분 동안 원심분리시키고, 4℃에서 15분 동안 20% CD3 마이크로비드를 함유하는 MACS 완충제(1X PBS 중에서 2% 소 태아 혈청 및 2mM EDTA) 중에서 현탁시켰다. 이어서, 자기 표지된 T 세포를 자기 분리 칼럼을 이용하여 분리시킨 후에, 1X 이노마이신, 및 1X 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)와 함께 3시간 동안 공자극시켰다. 자극을 둘 다 함유하는 배지를 제거한 후에, 세포를 15분 동안 항-응괴제로서 1x의 DNAse(시그마)와 함께 인큐베이션시켰다.
DNAse를 함유하는 상청액을 제거하기 위해 세포를 원심분리시키고, 5%의 1M NaCl, 1.5%의 500mM EDTA, 33.8%의 4M 베타인 및 7.5%의 20 ㎎/㎖ 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 세포 현탁 완충제(CSB)로 3회 세척하였다. 세포를 40㎛ 세포 스트레이너(BD 팔콘(BD Falcon))를 이용하여 여과시켜 1㎖ CSB 중에서 재현탁시킨 후에 세포 클럼프를 제거하였다. 이어서, 세포 현탁액을 실시예 8에서와 같은 점적 생성기 상에서 실행하여 세포 및 바코드 어댑터 주형 비드를 점적 내로 캡슐화하였고, 여기서 비드는 실시예 13에서와 같이 생성하였다. 이 실시예에서, 세포 및 비드를 상이한 크기의 점적으로 캡슐화하였다: 1.4, 3.1 및 5.6nℓ.
세포와 바코드를 둘 다 함유하는 점적은 다음의 최종 반응 완충제 조성물 중에서 50℃에서 3분 동안 다음에 42℃에서 3시간 동안 인큐베이션시킴으로써 역전사를 겪었다:
Figure pct00040
이어서, 에멀전을 페놀/클로로폼 혼합물을 이용하여 파괴하고 나서, 실시예 8에서와 같이 아미콘 100kDa 칼럼(밀리포어)에서 농축하였다. cDNA에 18 주기의 PCR1, 다음에 이하에 열거한 RT 반응 당 반응 혼합물 및 표 21에서 열거한 열순환 조건을 이용하는 PCR2를 실시하였다. 사용한 프라이머는 표 22에 있다.
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
도 26으로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험한 3 점적 용적에서, 반응은 성공적으로 완료되었다.
O. 실시예 15: 바코딩된 핵산으로부터의 TCR 알파 및 베타 유전자의 증폭 및 서열분석
바코딩한 T 세포 cDNA를 실시예 14에서와 같이 생성하였다. 간략하게, PBMC을 3시간 동안 AIM V 배지 중에서 1X의 이노마이신 및 PMA와 함께 공동자극하였다. CD3, CD4 또는 CD8-발현 T 세포를 자기 표지하고, MACS 키트(밀테니 바이오텍)를 이용하여 별도로 단리시키고, 점적 장치를 통해 실행하여 바코드 어댑터 주형 비드와 함께 세포를 캡슐화하고, 이를 실시예 13에서와 같이 생성하였다. 세포와 바코드를 둘 다 함유하는 에멀전을 50℃에서 3분 동안 그리고 42℃에서 3시간 동안 역전사시켰다. 이어서, 에멀전을 페놀/클로로폼 혼합물을 이용하여 파괴하고 나서, 아미콘 100 kDa 칼럼(밀리포어)을 이용하여 농축하였다.
역전사 및 PCR1 및 PCR2을 실시예 14에서와 같이 수행하였고, 상이한 인덱스_sID 프라이머(각각 고유 인덱스 ID 바코드를 지님)를 각각의 샘플에 대해 사용하였다. 이는 동일한 차세대 서열분석 실행에서 샘플의 풀링 및 다중복합을 가능하게 하며, 여기서 상이한 샘플은 인덱스 ID 바코드를 통해 서로 구별된다.
이어서, PCR2 산물을 1㎕ PCR 2 산물 대 1.8㎕ 자기 비드의 비에서 제조업자의 설명서에 따라 AMPure 자기 비드(로슈)와 함께 농축시켰다. 이어서 샘플을 추가적인 라이브러리 PCR을 이용하는 일루미나 서열분석을 위해 준비하여 일루미나 서열분석을 위한 어댑터를 첨가하였다. 사용한 프라이머는 표 23에서 열거한다.
H2O 16.22㎕
5X GC 완충제 6.00㎕
MgCl2 0.18㎕
DMSO 1.20㎕
dNTP 0.60㎕
10μM 넥스트 i5 n 0.60㎕
10μM 넥스트 i7 풀 n 0.60㎕
BSA 0.30㎕
퓨전 DNA 중합효소 0.30㎕
주형 4.00㎕
총 30.00㎕
라이브러리 PCR에 대한 열순환 조건
Figure pct00044
Figure pct00045
증폭된 산물을 핍핀 프렙(Pippin Prep) 및 DNA 정제 및 농축기 키트(자이모 리서치)로 세정하여 소분획을 제거하고, 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 분석하고 나서(도 27), 일루미나 서열분석을 이용하여 서열분석하였다.
일루미나 서열분석으로부터의 짝지어진 말단 판독을 분석하여 T 세포 수용체(TCR) 생식계열, TCR CDR3을 결정하고, 전장 서열을 추론하였다. 서열분석은 21,207,225개의 여과되고 짝지어진 말단 판독을 생성하였다. DNA 바코드를 사용하여 정방향 판독 서열에 기반하여 개개 T 세포 내에서 TCR의 전사체에 대해 짝지어진 판독을 부여한다. 정방향 판독 내의 DNA 바코드의 동정을 피톤 스크립트를 이용하여 행하였다. 각각의 정방향 판독에 대해, 고정된 서열 1에 대한 편집 거리를 전역/국소 정렬을 이용하여 컴퓨팅하였다. 2 이하의 편집 거리가 필요하거나 또는 판독쌍을 폐기하였다. 고정된 서열 1의 위치 및 바코드 부분1(BC1) 및 바코드 부분2(BC2)의 공지된 길이로부터, 후보 BC1 및 BC2 서열을 정방향 판독으로부터 추출하였다. BC1 및 BC2를 그들이 각각 해밍(16, 11) 또는 해밍(12, 7) DNA 바코드에 대한 해밍 조건을 충족하였다는 것을 입증하기 위해 확인하였다(서열 및 명명한 서열의 서로에 대한 상대적 위치에 대해 표 18을 참조). BC1 및 BC2에 기반하여, 짝지어진 판독을 특이적 T 세포에 부여하였다. 결과로서 3,712,013 판독쌍을 T 세포에 부여하였다.
이어서, T 세포에 부여된 짝지어진 판독을 e-값 컷오프 10-5를 이용하는 프로그램 blastn을 이용하여 V, J 및 불변 생식계열 TCR 서열의 공지된 변이체와 비교하였다. 쌍의 판독 중 하나가 블라스트에 의해 생식계열에 대해 히트로서 스코어링되었다면, 해당 생식계열 및 관련된 대립유전자의 계수를 (BC1, BC2에 의해 동정한 세포의)대응하는 TCR 알파 또는 베타쇄에 대한 계수에 의해 실행하였다. 각각의 생식계열 대립유전자 조합 및 특이적 세포에 추가로, 그에 대해 히트를 갖는 서열 목록을 분류하였다.
BC1 및 BC2의 고유 조합에 의해 동정된 각각의 세포에 대해, 알파 및 베타쇄에 대한 v, j 및/또는 불변 생식계열 대립유전자 조성물은 상기 표시한 대다수의 계수에 기반하여 부여하였고, 각각의 생식계열에 대해, 그와 관련된 가장 긴 HSP를 갖는 서열은 해당 생식계열에 대한 전사체의 대표적인 부분으로서 선택하였다.
다음에 CDR3 영역의 조성물을 다음의 단계를 다음의 단계를 이용하여 결정하였다. 각각의 j 생식계열에 대해, 패턴 FG*G를 충족시키는 4개의 아미노산(AA)의 서열의 위치를 가능할 때 결정하고, 그의 서열의 마지막 10개에서 CA의 조합을 갖는 v 생식계열의 목록을 동정하였다. 각각의 세포에 대해, j 생식계열 및 CA 조합의 4개의 AA 패턴은 j에 대해 번역된 대표적인 서열의 모두 3개 프레임에서 추구하였다. CDR3은 CA와 4개의 AA 패턴 사이에 AA의 서열인 것으로 결정하였다. TCR의 추정적 AA을 CA까지 v 생식계열의 AA 서열 다음에CDR3 서열, 이어서 4개의 AA 패턴으로 시작하는 j 생식계열의 AA 서열을 합함으로써 얻었다. CDR3의 뉴클레오타이드 서열 및 TCR의 추정 전장 뉴클레오타이드 서열의 유사한 접근을 이용하여 TCR을 결정하였다.
D 생식계열 및 D 대립유전자를 D 생식계열과 CDR3의 뉴클레오타이드 서열 사이의 전역-국부 정렬에 기반하여 편집 거리를 평가함으로써 평가하였다. A D 생식계열/대립유전자를 TCR에 부여하였고, 단, 가장 가까운 생식계열 서열에 대한 편집 거리는 2 이하였다.
표 24는 바코딩된 세포, 부여된 TCR 알파 또는 베타쇄를 지니는 세포, 부여된 TCR 알파와 베타 둘 다를 지니는 세포의 추정된 수, 및 전장 알파 또는 베타쇄의 추론된 수를 포함하는 가공된 샘플에 대한 통계 요약을 나타낸다.
Figure pct00046
P. 실시예 16: 바코딩된 핵산으로부터의 세포 서브타입-특이적 유전자의 증폭 및 서열분석
바코딩한 T 세포 cDNA를 실시예 15에서와 같이 생성하였다. 간략하게, PBMC을 3시간 동안 AIM V 배지 중에서 1X의 이노마이신 및 PMA와 함께 공동자극하였다. CD3, CD4 또는 CD8-발현 T 세포를 자기 표지하고, MACS 키트(밀테니 바이오텍)를 이용하여 별도로 단리시키고, 점적 장치를 통해 실행하였다. 세포와 바코드를 둘 다 함유하는 에멀전을 50℃에서 3분 동안 그리고 42℃에서 3시간 동안 실시예 14에서와 같이 역전사시켰다. 이어서, 에멀전을 페놀/클로로폼 혼합물을 이용하여 파괴하고 나서, 아미콘 100 kDa 칼럼(밀리포어)을 이용하여 농축하였다. 이어서, 상이한 주기에서 PCR1 및 PCR2를 표 25에서 열거한 바와 같은 T 세포 표적화된 서브세트 유전자, 예를 들어 CD4, CD8, 및 인터페론 감마(IFNγ)에 대한 특이적 프라이머와 함께 표 21에서의 열순환 조건을 이용하여 수행하였다. 반응 혼합물을 다음과 같이 제조하였다:
Figure pct00047
Figure pct00048
이어서 PCR2 산물을 실시예 15에서와 같이 일루미나 서열분석에 대해 제조하였고, 일루미나 서열분석 전에 아가로스 겔 전기영동 전에 아가로스 겔 전기영동에 의해 산물을 분석하였다(도 27).
일루미나 서열분석으로부터의 짝지어진 말단 판독을 분석하여 유전자 특이적 마커에 기반하여 T 세포 서브타입을 결정하였다. 서열분석은 19,205,611개의 여과되고 짝지어진 말단 판독을 생성하였다. DNA 바코드를 사용하여 정방향 판독 서열에 기반하여 개개 T 세포 내에서 전사체에 대해 짝지어진 판독을 부여한다. 정방향 판독 내의 DNA 바코드의 동정을 피톤 스크립트를 이용하여 행하였다. 각각의 정방향 판독에 대해, 고정된 서열 1에 대한 편집 거리를 전역/국소 정렬을 이용하여 컴퓨팅하였다. 2 이하의 편집 거리가 필요하거나 또는 판독쌍을 폐기하였다. 고정된 서열 1의 위치 및 바코드 부분1(BC1) 및 바코드 부분2(BC2)의 공지된 길이로부터, 후보 BC1 및 BC2 서열을 정방향 판독으로부터 추출하였다. BC1 및 BC2를 그들이 각각 해밍(16, 11) 또는 해밍(12, 7) DNA 바코드에 대한 해밍 조건을 충족하였다는 것을 입증하기 위해 확인하였다. 해밍 조건을 충족시키는 정방향 판독을 위해, 후보 분자 바코드를 X, 고정된 서열 2 및 분자 바코드의 공지된 길이에 기반하여 추출하였다(서열 및 명명한 서열의 서로에 대한 상대적 위치에 대해 표 18 참조). 분자 바코드 서열이 "C" 뉴클레오타이드가 없다면, 짝지어진 판독을 T 세포(BC1 및 BC2에 기반) 및 T 세포 내의 특이적 전사체(분자 바코드에 기반)에 부여하였다. 3,902,569 판독쌍을 개개 T 세포 내에서 전사체에 부여하였다.
이어서, T 세포 전사체에 부여된 짝지어진 판독을 e-값 컷오프 10-6 및 셋팅백분율_동일성 98로 프로그램 blastn을 이용하여 마커 유전자의 공지된 스플라이스 변이체와 비교하였다. 쌍의 판독 중 하나를 블라스트에 의해 히트로서 스코어링한다면, T 세포로부터의 대응하는 전사체(BC1, BC2 및 분자 바코드에 의해 동정)는 마커 유전자와 관련되었다.
BC1 및 BC2의 고유 조합에 의해 동정한 각각의 세포에 대해, 주어진 마커 유전자와 관련된 판독쌍으로부터 관찰한 별도의 분자 바코드의 수를 계수화함으로써 주어진 마커 유전자로부터의 전사체를 본 별도의 횟수를 결정하였다.
검출한 T 세포의 각각의 유형을 마커 유전자에 기반하여 결정하였다. 적어도 하나의 CD4 전사체 및 하나의 IFNγ전사체가 부여된 것을 결정한 T 세포를 Th1 세포로서 계수화하였다. 적어도 하나의 CD4 전사체가 부여되고 IFNγ전사체가 부여되지 않은 것을 결정한 T 세포를 비-Th1 CD4 샘플로서 계수화하였다. 적어도 하나의 CD8 전사체 및 하나의 IFNγ전사체를 동정한 것을 결정한 T 세포를 IFNγ+ 세포독성 T 세포로서 계수화하였다. 적어도 하나의 CD8 전사체(IFNγ전사체 없음)를 부여한 것을 결정한 T 세포를 IFNγ- 세포독성 T 세포로서 계수화하였다.
표 26은 검출한 CD4 T 세포의 총 수, Th1 CD4 T 세포의 수, 총 세포독성 T 세포 및 본 명세서에 기재한 절차를 이용하여 3개의 상이한 샘플을 처리하는 것으로부터 초래된 IFNγ+ 세포독성 T 세포를 나타낸다.
Figure pct00049
Q. 실시예 17: 단일 세포 전사체학의 수행
바코딩한 T 세포 cDNA를 실시예 15에서와 같이 생성하였다. 간략하게, PBMC을 3시간 동안 AIM V 배지 중에서 1X의 이노마이신 및 PMA와 함께 공동자극하였다. CD3, CD4 또는 CD8-발현 T 세포를 자기 표지하고, MACS 키트(밀테니 바이오텍)를 이용하여 별도로 단리시키고, 점적 장치를 통해 실행하였다. 세포와 바코드를 둘 다 함유하는 에멀전을 50℃에서 3분 동안 그리고 42℃에서 3시간 동안 실시예 14에서와 같이 역전사시켰다. 이어서, 에멀전을 페놀/클로로폼 혼합물을 이용하여 파괴하고 나서, 아미콘 100 kDa 칼럼(밀리포어)을 이용하여 농축하였다. 단일 라운드의 PCR을 수행하여 전체 전사체를 증폭시키고, 조건을 이하에 나타낸다:
Figure pct00050
Figure pct00051
어댑터를 상기와 동일한 PCR 조건 및 열순환 조건이지만, 대신에 정방향 프라이머로서 FW2-n-V2를 이용하는 PCR 5주기를 이용하여 라이브러리에 첨가하였다. 이어서, 샘플을 풀링하고, 앰퓨어 비드를 이용하여 세정하고 나서, 5ng의 DNA 주형을 사용하고, 관습적 내부 프라이머를 증폭 단계 동안 대신 사용한 것을 제외하고 제조업자의 설명서를 이용하여 DNA를 더 작은 단편으로 태그화한 넥스테라 XT DNA 제조 키트(일루미나)를 이용하여 일루미나 서열분석을 준비하였다. 사용한 내부 프라이머, 즉, 넥스트_i5_n_v2 및 넥스트_i7_n은 바코드를 함유하는 태그화된 단편만이 증폭된다는 것을 보장하였다. 겔을 실행하고, 도 29에서 나타낸다.
전체 전사체 증폭 및 라이브러리 제조를 위해 사용한 추가적인 프라이머
명칭 서열 (서열번호)
v2_PCR1_RV_n ATTAGGAGACACAATAGGGAGGCA (103)
넥스트_i5_n_v2 CTATGCGCCTTGCCAG AATGATAC (104)
넥스트_i7_n CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT TCGCCTTA GTCTCGTGGGCTCGG (105)
일루미나 NextSeq 기기를 이용하여 바코딩된 앰플리콘 라이브러리를 서열분석하였다. 짝지어진 판독을 개개 세포와 관련짓기 위해 그리고 해당 세포에서 발현된 유전자를 동정하기 위해 짝지어진 말단 판독을 분석하였다. 서열분석은 371,918,220개의 여과되고 짝지어진 말단 판독을 생성하였다. DNA 바코드를 사용하여 정방향 판독 서열에 기반하여 개개 T 세포 내에서 전사체에 대해 짝지어진 판독을 부여한다. 정방향 판독 내의 DNA 바코드의 동정을 피톤 스크립트를 이용하여 행하였다. 각각의 정방향 판독에 대해, 고정된 서열 1에 대한 편집 거리를 전역/국소 정렬을 이용하여 컴퓨팅하였다. 2 이하의 편집 거리가 필요하거나 또는 판독쌍을 폐기하였다. 고정된 서열 1의 위치 및 BC1 및 BC2의 공지된 길이로부터, 후보 BC1 및 BC2 서열을 정방향 판독으로부터 추출하였다. BC1 및 BC2를 그들이 각각 해밍(16, 11) 또는 해밍(12, 7) DNA 바코드에 대한 해밍 조건을 충족하였다는 것을 입증하기 위해 확인하였다. 해밍 조건을 충족시키는 정방향 판독을 위해, 후보 분자 바코드를 X, 고정된 서열 2 및 분자 바코드의 공지된 길이에 기반하여 추출하였다. 분자 바코드 서열이 "C" 뉴클레오타이드가 없다면, 짝지어진 판독을 세포(BC1 및 BC2에 기반) 및 세포 내의 특이적 전사체(분자 바코드에 기반)에 부여하였다. 37,110.172 판독쌍을 개개 세포 내에서 전사체에 부여하였다.
이어서, 세포 전사체에 부여된 짝지어진 판독을 e-값 컷오프 10-6 및 셋팅백분율_동일성 98로 프로그램 blastn을 이용하여 엠셈블(Ensembl)(www.ensembl.org)의 릴리즈 78에서 보고한 바와 같은 유전자의 공지된 스플라이스 변이체와 비교하였다. 쌍의 판독 중 하나를 블라스트에 의해 히트로서 스코어링한다면, 세포로부터의 대응하는 전사체(BC1, BC2 및 분자 바코드에 의해 동정)는 유전자와 관련되었다. 하나 이상의 블라스트 히트가 있다면, 정방향 및 역방향 판독에 대해 HSP 길이의 가장 큰 합을 갖는 유전자를 발견함으로써 최상의 매칭을 선택하였다. 두 상이한 유전자 사이를 묶는 경우에, 유전자에 대한 판독쌍의 부여는 애매한 것으로 고려하였고, 추가로 고려하지 않았다.
BC1 및 BC2의 고유 조합에 의해 동정한 각각의 세포에 대해, 주어진 유전자와 관련된 판독쌍으로부터 관찰한 별도의 분자 바코드의 수를 계수화함으로써 주어진 유전자로부터의 전사체를 본 별도의 횟수를 결정하였다.
표 33은 이 절차를 이용하여 4개의 샘플을 가공한 후에 가장 빈번하게 검출된 유전자를 나타낸다. 상기 표는 엠셈블 유전자 ID, 유전자의 엠셈플 설명, 세포의 수 검출된 유전자를 나타낸다.
R. 실시예 18: 제1 가닥 cDNA의 5' 말단 내로의 바코드 어댑터의 혼입
이 실시예는 실제로 달성한 결과보다는 예측한 결과에 기반하여 본 발명의 실시형태를 기재한다. 세포 및 바코드 어댑터 주형을 반응 용기에 함께 넣음으로써, 대다수의 반응 용기는 단지 하나의 세포 및 하나의 주형분자를 갖거나 또는, 예를 들어, 점적 발생 장치 및 반응 용기에 의해 하나의 세포 및 하나의 바코드 어댑터 주형 비드는 실시예 14에서와 같은 유중수 점적이다. 바코드 어댑터 서열은 고정된 서열, 바코드 서열, 선택적으로 UMI, 및 올리고(dT) 또는 무작위 또는 반-무작위 서열(표 28에서 각각 바코드_어댑터_5c_올리고dT 및 바코드_어댑터_5c_랜도머) 중 하나, 또는 조합을 포함한다. 주형 전환 올리고(TSO)는 고정된 서열, 선택적으로 UMI, 및 제1 가닥 cDNA 상보적 서열(표 28에서 5' 어댑터)을 포함한다.
역전사 반응을 다음의 반응 조건으로 50℃에서 3분 동안, 다음에 42℃에서 3시간 동안 수행한다:
RT 반응 혼합물
Figure pct00052
바코딩은 반응을 프라이밍하며, 제1 가닥 cDNA의 5' 말단으로 혼입된다. 역전사가 프라이머로서 DNA와 RNA를 둘 다 이용할 수 있기 때문에 바코드 어댑터는 RNAP 또는 DNAP 중 하나(바코드 어댑터 주형 상의 적절한 RNA 프로모터 또는 가닥-치환 DNAP 인식 부위, 예컨대 틈내기 효소에 의해 생성된 틈를 지님)를 생성한다(도 8 및 도 9).
실시예 14에서와 같이 파괴하고, 이어서 얻어진 바코딩된 핵산 라이브러리를 풀링하고 나서, 실시예 17에서와 같이 바코딩 반응에서 각각 5'어댑터 및 바코드_어댑터_5c_올리고dT 또는 바코드_어댑터_5c_랜도머에 이해 첨가된 고정된 서열에 상보성인 서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. 반응 조건을 이하에 나타낸다:
Figure pct00053
Figure pct00054
유전자-특이적 서열을 포함하는 정방향 프라이머를 이용하고, 바코딩 반응에서, 예컨대 실시예 14 및 16에서 바코드_어댑터_5c_올리고dT 또는 바코드_어댑터_5c_랜도머에 의해 첨가된 고정된 서열에 상보성인 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 이용하는 증폭을 수행함으로써 관심 대상의 표적 유전자를 또한 증폭시킬 수 있다. 2회의 연속적 PCR 반응에서 TCR 알파 및 베타쇄를 증폭시키기 위한 반응 조건을 이하에 나타내며, 여기서 PCR1의 산물을 PCR2에서 사용하기 전에 50x 희석시켰다:
PCR1에 대한 반응 혼합물 PCR2에 대한 반응 혼합물
H2O 15.64㎕ H2O 17.82㎕
5X Q5 완충제 6.00㎕ 5X Q5 완충제 6.00㎕
MgCl2 0.19㎕ MgCl2 0.18㎕
DMSO 1.20㎕ DMSO 1.00㎕
dNTP 0.63㎕ dNTP 0.60㎕
PCR1_i5_뉴 0.63㎕ FW2-N-V2 0.60㎕
PCR1_쇼트_n_v2 0.63㎕ RV2-n 0.60㎕
TRAC 53-78 / TRBC 37-60 0.63㎕ TRAC GSP2 / TRBC GSP2 0.60㎕
ET-SSB 0.31㎕ BSA 0.30㎕
BSA 0.31㎕ Q5 효소 0.30㎕
Tipp 0.60㎕ 주형 2.00㎕
Q5 효소 0.25㎕ 총 30.00㎕
주형 3.00㎕
총 30.00㎕
PCR1 및 PCR2의 열순환 조건
Figure pct00055
이어서, 라이브러리를 차세대 서열분석을 위해, 예컨대 일루미나 또는 이온 토렌트(Ion Torrent) 플랫폼 상에서 준비한다.
프라이머 서열
프라이머 서열(서열번호)
5' 어댑터 GGAAGATAGGGATAACAGGGTAATG [UMI] GCGGG (106)
바코드_어댑터_5c_올리고dT ATTAGGAGACACAATAGGGAGGCA [바코드 부분1] GCTGAGACATGTGAAGAGG [바코드 부분2] [X] GAGGGA [UMI] TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT,
여기서 [X] = GCTCTTCG (107), TCGTCTCG (108) 또는 ACCTCAGC이고, (109) 바코드는 [바코드 부분1] 및 [바코드 부분2]를 포함함
바코드_어댑터_5c_랜도머 ATTAGGAGACACAATAGGGAGGCA [바코드 부분1] GCTGAGACATGTGAAGAGG [바코드 부분2] [X] GAGGGA [UMI] Nx,
x가 6 내지 15의 범위인 경우, [X] = GCTCTTCG (110), TCGTCTCG (111) 또는 ACCTCAGC, (112)이고, 바코드는 [바코드 부분1] 및 [바코드 부분2]를 포함한다
S. 실시예 19: PCR 동안 5' 말단 내로 바코드 어댑터의 혼입
이 실시예는 실제로 달성한 결과보다는 예측한 결과에 기반하여 본 발명의 실시형태를 기재한다. 세포 및 바코드 어댑터 주형을 반응 용기에 함께 넣음으로써, 대다수의 반응 용기는 단지 하나의 세포 및 하나의 주형분자를 갖거나 또는, 예를 들어, 점적 발생 장치 및 반응 용기에 의해 하나의 세포 및 하나의 바코드 어댑터 주형 비드는 실시예 14에서와 같은 유중수 점적이다. 주형 전환 올리고(TSO)는 고정된 서열, 선택적으로 UMI, 및 제1 가닥 cDNA 상보적 서열(표 29에서 5' 어댑터)을 포함한다. 3' 어댑터 서열은 고정된 서열, 선택적으로 UMI, 및 올리고(dT) 또는 무작위 또는 반-무작위 서열 중 하나(표 29에서 각각 3'_어댑터_올리고dT 및 3'_어댑터_랜도머), 또는 조합을 포함한다.
세포 및 바코드 어댑터 주형 비드와의 역전사 반응을 다음의 반응 조건으로 50℃에서 3분 동안, 다음에 42℃에서 3시간 동안, 다음에 표준 PCR 주기 조건에서 수행한다:
RT 반응 혼합물
Figure pct00056
5'_PCR_바코드_어댑터_프라이머는 DNAP(바코드 어댑터 주형 상의 적절한 가닥-치환 DNAP 인식 부위, 예컨대 틈내기 효소에 의해 생성된 틈을 지님) 중 하나를 이용하여 바코드_어댑터_주형을 생성한다. 여기서, 클레노브 단편을 DNAP로서 사용하고, Nt.BbvCI는 틈내기 엔도뉴클레아제로서 사용하며, 제한 부위는 "CCTCAGC"이다. 역전사 후에, 제1 가닥 cDNA에 첨가된 어댑터 서열에 상보적인 3' 말단을 지니는 프라이머를 증폭을 위해 사용하고, 정방향 프라이머는 바코드 어댑터 주형으로부터 생성된 5'_PCR_바코드_어댑터_프라이머이며, 역방향 프라이머는 3'_PCR_프라이머이다.
PCR 반응 동안 바코딩이 일어나는데 바코드 어댑터 (5'_PCR_바코드_어댑터_프라이머)는 정방향 프라이머이며, 바코드 어댑터는 제1 가닥 cDNA의 5' 말단 내로 혼입되기 때문이다(도 11).
관심 대상의 표적 유전자는 또한 정방향 프라이머로서 5'_PCR_바코드_어댑터_프라이머 , 및 유전자-특이적 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 이용하는 증폭을 수행함으로써 증폭시킬 수 있다.
이어서, 라이브러리를 풀링하고, 차세대 서열분석을 위해, 예컨대 일루미나 또는 이온 토렌트(Ion Torrent) 플랫폼 상에서 준비한다.
Figure pct00057
T. 실시예 20: PCR 동안 3' 말단 내로 바코드 어댑터의 혼입
이 실시예는 실제로 달성한 결과보다는 예측한 결과에 기반하여 본 발명의 실시형태를 기재한다. 이 실시예는 바코드 어댑터 주형으로부터 생성된 바코드 어댑터가 PCR에서 역방향 프라이머로서 사용된다는 것을 제외하고 실시예 19와 유사하다. 실시예 19에서와 같이 역방향 전사를 수행하고, PCR에서 5'_PCR_프라이머는 정방향 프라이머이며, 3'_PCR_바코드_어댑터_프라이머는 바코드_어댑터_주형으로부터 생성하고, 역방향 프라이머로서 사용한다(도 12). 세포 및 바코드 어댑터 주형 비드와의 역전사 반응을 다음의 반응 조건으로 50℃에서 3분 동안, 다음에 42℃에서 3시간 동안, 다음에 표준 PCR 주기 조건에서 수행한다:
RT 반응 혼합물
Figure pct00058
관심 대상의 표적 유전자를 또한 유전자-특이적 서열을 포함하는 역방향 정방향 프라이머, 및 역방향 프라이머로서 3'_PCR_바코드_어댑터_프라이머를 이용하여 증폭을 수행함으로써 증폭시킬 수 있다.
이어서, 라이브러리를 풀링하고, 차세대 서열분석을 위해, 예컨대 일루미나 또는 이온 토렌트(Ion Torrent) 플랫폼 상에서 준비한다.
Figure pct00059
U. 실시예 21: 비세포 공급원으로부터의 RNA 바코딩
본 발명의 실시형태에서, 반응 용기에서 모든 RNA를 바코딩하고, 단, 반응에서 사용한 프라이머를 결합하고, 특정 RNA에 대한 역전사를 개시할 수 있다. 따라서,외인성으로 도입한 RNA를 또한 바코딩할 수 있다. 이 실시예에서, 시험관내 전사를 이용하여 생성한 RNA를 바코딩하였다.
스파이크인(SpikeIn) 서열을 IDT로부터 정돈하고, 5' T7 RNAP 프로모터 서열 및 3' 폴리 A 꼬리를 지니는 이중 가닥 물질을 얻기 위한 프라이머로서 스파이크인-FW 및 스파이크인-RV를 이용하여 퓨전 DNA 중합효소로 PCR 증폭시켰다. 이어서, 산물을 퀴아젠 MinElute 키트를 이용하여 세정하고, DNA 산물을 라이프 테크놀로지즈' T7 메가스크립트 키트를 이용하여 시험관내 전사에 대해 사용하였다. 이렇게 얻은 RNA를 세척에 의해 세정하고, 아미콘 30 kDA 칼럼(밀리포어)을 이용하여 10mM 트리스로 농축시켰다.
8개의 96-웰 플레이트의 각각의 웰에서, 0.5ng 효모 tRNA (라이프 테크놀로지즈) 및 0.1pg의 스파이크-인 RNA와 함께 단일 기억 B 세포를 역전사시켰다. 웰 당 10㎕ 반응에서, 반응물은 다음과 같다:
Figure pct00060
반응물을 55℃에서 3분 동안 인큐베이션시키고, 이어서, 42℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 96-웰 플레이트 내 각각의 웰은 웰ID-어댑터에서 상이한 웰 바코드를 가졌다. 이어서, 반응물을 바이오티닐화된 올리고dT에 결합한 스트렙타비딘 상자성 C1 다이나비즈(라이프 테크놀로지즈)와 제1 가닥 cDNA를 결합함으로써, 그리고 이어서, 제1 가닥 cDNA를 풀 다운하기 위한 자기를 이용하고, BWB 완충제(TE 중의 2M NaCl)로 3x 세척한 다음 10mM 트리스로 3x 세척함으로써 세정하고, 15㎕의 10mM 트리스에서재현탁시켰다.
PCR 증폭의 2회 라운드를 행하여서 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자를 증폭하였다. 상이한 플레이트 바코드 서열을 상이한 플레이트 내의 모든 풀링한 바코딩된 cDNA에 첨가하였다.
PCR1에 대한 웰마다:
Figure pct00061
PCR1로부터의 산물을 50x으로 희석시키고, PCR2에서 사용하였다. PCR2에 대한 웰마다의 반응:
Figure pct00062
얻어진 증폭된 물질의 양을 정규화하고, 454 서열분석에 대해 실시예 11에서와 같이 제조하였다. 이 실시예에서 사용한 프라이머를 표 13, 표 14 및 표 32에서 발견할 수 있다.
얻은 454 판독을 플레이트- 및 웰-ID 바코드에 기반하여 보관한다. 따라서, 판독을 특이적 플레이트 내 본래의 웰에 다시 보관할 수 있다. 바코드 서열을 단축시킨 후에 뉴블러로 판독을 어셈블하였다. 각각의 콘틱에 대해, 본 발명자들은 매칭에 대해 2, 미스매치에 대해 -1, 갭 오픈에 대해 -1 및 갭 익스텐션에 대해 -1을 이용하여 스파이크-인 서열을 지니는 콘틱의 스미스-워터만 정렬을 수행하였다. 800 초과의 스코어를 지니는 임의의 콘틱을 매칭으로 고려하였다. 본 발명자들은 매칭을 관찰한 각각의 플레이트에 대한 웰의 수를 계수화하였다. 스파이크-인 서열을 매우 대다수의 웰에서 검출하였다(표 31).
Figure pct00063
Figure pct00064
V. 실시예 22: 세포 집단을 동정하기 위한 비-세포 공급원으로부터의 RNA 바코딩
이 실시예는 실제로 달성한 결과보다는 예측한 결과에 기반하여 본 발명의 실시형태를 기재한다. 실시예 21에서 나타낸 바와 같이,외인성으로 도입한 RNA를 바코딩할 수 있다. 이 실시예에서, 바코딩된 RNA를 사용하여 특이적 세포 집단을 동정한다. 스파이크인-FW가 5' NH2 변형을 갖는 것을 제외하고, 스파이크-인 DNA를 실시예 21에서와 같이 생성한다. 올-인-원 항체-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이션 키트(솔루링크(Solulink))를 이용하여 항-CD4 항체에 컨쥬게이션시킨다. 시험관내 전사를 이용하여 스파이크-인 DNA로부터 생성한 RNA를 또한 항-CD4 항체 대신 컨쥬게이션할 수 있다.
T 세포를 제조하고, 실시예 15와 같이 서열분석하며, 추가 단계는 T 세포를 스파이크-인 컨쥬게이션된 항-CD4 항체와 함께 인큐베이션시킨 후에 점적 생성기 상에서 T 세포를 실행하고 후속적으로 RNA를 바코딩한다. 얻어진 판독을 인덱스-ID 및 바코드 어댑터에 의해 첨가한 바코드에 기반하여 보관한다. 따라서, 판독을 본래의 반응 용기에 다시 보관할 수 있다. 매칭에 대해 2, 미스매치에 대해 -1, 갭 오픈에 대해 -1 및 갭 익스텐션에 대해 -1을 이용하여 스파이크-인 서열을 지니는 콘틱의 스미스-워터만 정렬을 행하였다. 800 초과의 스코어를 지니는 임의의 콘틱을 매칭으로 고려한다. 이어서, 본 발명자들은 매칭을 관찰한 반응 용기를 계수화한다. 스파이크-인 서열을 검출한 반응 용기에 대해, 이어서, T 세포를 CD4 T 세포로서 동정한다(도 14A). 상이한 스파이크-인 서열과 결합한 다수의 항체를 사용할 수 있으며, 최종 결과는 상이한 세포 표면 항원을 지니는 상이한 세포가 동일한 실험 실행에서 동정될 수 있다는 것이다.
W. 실시예 23: 항원-특이적 B 세포를 동정하기 위한 비-세포 공급원으로부터의 RNA 바코딩
이 실시예는 실제로 달성한 결과보다는 예측한 결과에 기반하여 본 발명의 실시형태를 기재한다. 이 실시예에서, 외인성으로 도입한 RNA를 바코딩하고, 항원-특이적 B 세포를 동정하기 위해 사용한다. 스파이크인-FW가 5' NH2 변형을 갖는 것을 제외하고, 스파이크-인 DNA를 실시예 21에서와 같이 생성한다. 올-인-원 항체-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이션 키트(솔르링크(Solulink))를 이용하여 인플루엔자 혈구응집소 항원에 컨쥬게이션시킨다. 시험관내 전사를 이용하여 스파이크-인 DNA로부터 생성한 RNA를 또한 혈구응집소 대신 컨쥬게이션할 수 있다.
인플루엔자-백신 면역화한 마우스로부터의 B 세포를 실시예 8에서와 같이 제조하고, 추가적인 단계는 B 세포를 스파이크-인 컨쥬게이션된 항원과 함께 인큐베이션 한 후에 그들을 바코딩하는 것이다. 얻어진 판독을 인덱스-ID 및 바코드 어댑터에 의해 첨가한 바코드에 기반하여 보관한다. 따라서, 판독을 본래의 반응 용기에 다시 보관할 수 있다. 매칭에 대해 2, 미스매치에 대해 -1, 갭 오픈에 대해 -1 및 갭 익스텐션에 대해 -1을 이용하여 스파이크-인 서열을 지니는 콘틱의 스미스-워터만 정렬을 행하였다. 800 초과의 스코어를 지니는 임의의 콘틱을 매칭으로 고려한다. 이어서, 본 발명자들은 매칭을 관찰한 반응 용기를 계수화한다. 스파이크-인 서열을 검출한 반응 용기에 대해, 이어서, B 세포를 혈구응집소-특이적인 것으로 동정한다(도 14B). 상이한 스파이크-인 서열과 결합한 다중 항원을 사용할 수 있으며, 최종 결과는 상이한 항원에 대해 특이적인 상이한 B 세포가 동일한 실험 실행에서 동정될 수 있다는 것이다.
X. 실시예 24: 항원-특이적 T세포를 동정하기 위한 비-세포 공급원으로부터의 RNA 바코딩
이 실시예는 실제로 달성한 결과보다는 예측한 결과에 기반하여 본 발명의 실시형태를 기재한다. 이 실시예에서, 외인성으로 도입한 RNA를 바코딩하고, 항원-특이적 B 세포를 동정하기 위해 사용한다. 스파이크인-FW가 5' NH2 변형을 갖는 것을 제외하고, 스파이크-인 DNA를 실시예 21에서와 같이 생성한다. 올-인-원 항체-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이션 키트(솔르링크(Solulink))를 이용하여 특정 펩타이드-MHC 항원에 컨쥬게이션시킨다. 시험관내 전사를 이용하여 스파이크-인 DNA로부터 생성한 RNA를 또한 펩타이드-MHC 복합체 대신 컨쥬게이션할 수 있다.
T 세포를 제조하고, 실시예 15와 같이 서열분석하며, 추가 단계는 T 세포를 스파이크-인 컨쥬게이션된 항-CD4 항체와 함께 인큐베이션시킨 후에 점적 생성기 상에서 T 세포를 실행하고 후속적으로 RNA를 바코딩한다. 얻어진 판독을 인덱스-ID 및 바코드 어댑터에 의해 첨가한 바코드에 기반하여 보관한다. 따라서, 판독을 본래의 반응 용기에 다시 보관할 수 있다. 매칭에 대해 2, 미스매치에 대해 -1, 갭 오픈에 대해 -1 및 갭 익스텐션에 대해 -1을 이용하여 스파이크-인 서열을 지니는 콘틱의 스미스-워터만 정렬을 행하였다. 800 초과의 스코어를 지니는 임의의 콘틱을 매칭으로 고려한다. 이어서, 본 발명자들은 매칭을 관찰한 반응 용기를 계수화한다. 스파이크-인 서열을 검출한 반응 용기에 대해, 이어서, T 세포를 항원-특이적인 것으로 동정한다(도 14C). 상이한 스파이크-인 서열과 결합한 다중 상이한 펩타이드-MHC를 사용할 수 있으며, 최종 결과는 상이한 펩타이드-MHC를 인식하는 상이한 T 세포가 동일한 실험 실행에서 동정될 수 있다는 것이다.
가장 빈번하게 관찰한 유전자.
유전자ID 설명 세포
ENSG00000062716 액포 막 단백질 1 101
ENSG00000137265 인터페론 조절 인자 4 59
ENSG00000075624 액틴, 베타 47
ENSG00000092820 에즈린 32
ENSG00000026508 CD44 분자(인디안 블러드 그룹(Indian blood group)) 30
ENSG00000111537 인터페론, 감마 30
ENSG00000177954 리보솜 단백질 S27 30
ENSG00000070756 폴리(A) 결합 단백질, 세포질 1 25
ENSG00000132510 라이신 (K)-특이적 데메틸라제 6B 25
ENSG00000164924 타이로신 3-모노옥시게나제/트립토판 5-모노옥시게나제 활성화 단백질, 제타 25
본 명세서에 기재된 실시예 및 실시형태는 단지 예시적 목적을 위한 것이며 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제시될 것이고 본 출원의 정신 및 범위 및 첨부되는 청구범위의 범주 내에 포함된다는 것이 이해된다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 서열 수탁 번호, 특허 및 특허 출원은 그들의 전문이 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참고로 포함된다.

Claims (132)

  1. 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 생성방법으로서,
    하나 이상의 샘플과 관련된 복수의 RNA를 얻는 단계로서, 상기 샘플은 한 명 이상의 대상체로부터 얻고, 상기 샘플과 관련된 RNA는 별도의 반응 용적에 존재하는, 상기 복수의 RNA를 얻는 단계;
    어댑터 분자를 상기 샘플과 관련된 RNA에 첨가하는 단계로서, 상기 어댑터 분자는 효소 반응을 이용하여 생성되고 보편적인 프라이밍 서열, 바코드 서열 및 결합 부위를 포함하는, 상기 첨가하는 단계; 및
    상기 바코드 서열을 상기 샘플과 관련된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 내로 혼입시킴으로써, 상기 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효소 반응을 이용하여 상기 어댑터 분자를 생성하는 단계를 더 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 어댑터 분자는 주형 분자를 하나 이상의 효소와 접촉시킴으로써 생성되는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 주형 분자는 RNA 중합효소(RNAP) 프로모터를 포함하는 DNA 분자이고, 상기 하나 이상의 효소는 RNA 중합효소를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 RNAP 프로모터는 T7, T3 및 SP6으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 주형 분자는 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 DNA 분자이고, 상기 하나 이상의 효소는 틈내기 엔도뉴클레아제 및 가닥-치환 DNA 중합효소를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위는 Nt.BbvCI, Nt.BspQI, Nt.BsmAI, Nt.BstNBI, Nt.AlwI 및 Nt.BsmAI로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 가닥-치환 DNA 중합효소는 클레노브 엑소-(Klenow exo-), Bst 거대 단편, 및 Bst 거대 단편의 공학처리된 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 주형 분자는 고체 지지체에 결합되고,
    상기 고체 지지체는 수용액과 접촉되며,
    상기 어댑터 분자는 생성됨에 따라 상기 수용액 내로 방출되는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 하나의 샘플에 관련된 RNA에 상기 어댑터 분자를 첨가하는 것은 상기 수용액을 상기 RNA가 존재하는 상기 반응 용적과 합하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 수용액은 상기 하나의 샘플에 관련된 RNA와 동일한 반응 용적에 존재하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 주형 분자는 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하고,
    상기 하나 이상의 효소는 제한 엔도뉴클레아제를 포함하며,
    상기 어댑터 분자는 상기 주형 분자의 일부를 포함하고, 상기 일부는 상기 주형 분자를 상기 제한 엔도뉴클레아제와 접촉 시 생성되고 상기 수용액 내로 방출되는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 고체 지지체는 비드 또는 표면인, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 어댑터 분자는 상기 하나의 샘플에 관련된 RNA에 상기 어댑터 분자를 첨가하기 전에 용액 중에서 유리되는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 어댑터 분자는 구획 내에서 생성되고, 상기 하나의 샘플에 관련된 RNA에 어댑터 분자를 첨가하는 것은 상기 구획을 상기 RNA가 존재하는 반응 용적과 합하는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 어댑터 분자는 상기 어댑터 분자가 첨가된 상기 RNA가 존재하는 반응 용적에서 생성되는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 어댑터 분자는 상기 어댑터 분자가 첨가된 상기 RNA가 존재하는 반응 용적에서 생성되지 않는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 효소 반응은 등온 반응인, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 어댑터 분자는 고유 분자 식별자(unique molecular identifier: UMI) 서열을 더 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 어댑터 분자는 RNA 분자인, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 어댑터 분자는 RNAP를 이용하여 생성된, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 어댑터 분자는 DNA 분자인, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 어댑터 분자는 DNAP를 이용하여 생성된, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 것은 상기 샘플과 관련된 RNA를 역전사시킴으로써, 복수의 제1 가닥 cDNA를 합성하는 것을 포함하고,
    상기 샘플과 관련된 RNA의 적어도 일부는 상기 어댑터 분자의 상기 결합 부위에 대해 상보성인 서열 영역을 포함하며,
    상기 어댑터 분자는 상기 바코드 서열이 상기 샘플과 관련된 제1 가닥 cDNA 내로 혼입되도록 역전사를 위한 프라이머로서 사용되는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 결합 부위는 폴리-T 트랙을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 결합 부위는 무작위 트랙을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 결합 부위는 상기 어댑터 분자의 3' 말단에서 생기는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  28. 제24항에 있어서, 상기 어댑터 분자는 구획 내에서 생성되고, 상기 샘플과 관련된 상기 RNA를 역전사시키는 것은 상기 구획을 상기 RNA가 존재하는 반응 용적과 합할 때 일어나는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  29. 제24항에 있어서, 상기 샘플과 관련된 상기 RNA를 역전사시키는 것은 상기 RNA에 첨가된 어댑터 분자가 생성된 경우와 동일한 반응 용적에서 일어나는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 샘플과 관련된 상기 RNA를 역전사시켜 복수의 cDNA를 얻는 단계를 더 포함하되, RNA를 역전사시키는 것은 역전사효소 및 제1 가닥 프라이머를 이용하여 cDNA의 제1 가닥을 합성하는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 역전사효소는 MMLV H-역전사효소인, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 어댑터 분자는 구획 내에서 생성되고, 상기 하나의 샘플에 관련된 RNA에 상기 어댑터 분자를 첨가하는 것은 상기 구획을 RNA가 존재하는 반응 용적과 합하는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  33. 제32항에 있어서, cDNA의 제1 가닥은 상기 구획을 상기 반응 용적과 조합하기 전에 합성되는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  34. 제32항에 있어서, cDNA의 제1 가닥은 상기 구획을 상기 반응 용적과 조합하는 것에 후속적으로 합성되는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  35. 제30항에 있어서, 상기 샘플과 관련된 상기 RNA를 역전사시키는 것은 상기 RNA에 첨가된 상기 어댑터 분자가 생성된 경우와 동일한 반응 용적에서 일어나는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 반응 용적 중의 완충제는 pH 8.0 내지 pH 8.8의 pH 범위에서 트리스(Tris), 칼륨 이온, 염소 이온, 황산 이온, 암모늄 이온, 아세트산 이온 또는 망간 이온 중 적어도 하나를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  37. 제30항에 있어서,
    상기 역전사효소는 주형 전환 활성을 가지며,
    상기 샘플과 관련된 cDNA의 적어도 일부의 제1 가닥은 3' 돌출부를 포함하고,
    상기 어댑터 분자의 상기 결합 부위는 상기 3' 돌출부에 대해 상보성인 3' 부분을 포함하며,
    상기 어댑터 분자는 상기 바코드 서열이 상기 샘플과 관련된 cDNA의 제1 가닥 내로 혼입되도록 상기 역전사효소에 대한 주형으로서 작용하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 3' 돌출부는 하나 이상의 C 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 결합 부위의 상기 3' 부분은 하나 이상의 G 뉴클레오타이드를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  39. 제37항에 있어서, 상기 제1 가닥 프라이머는 폴리-T 트랙을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  40. 제37항에 있어서, 상기 제1 가닥 프라이머는 무작위 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  41. 제30항에 있어서, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 것은 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 이용하여 상기 샘플에 대해 cDNA의 제1 가닥을 증폭시키는 단계를 포함하되, 상기 제2 프라이머는 상기 제1 가닥 프라이머의 적어도 일부와 동일한 서열을 갖고, 상기 제1 프라이머 또는 상기 제2 프라이머는 상기 어댑터 분자인, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 제1 프라이머는 상기 어댑터 분자인, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 제2 프라이머는 상기 어댑터 분자인, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 제1 가닥 프라이머는 폴리-T 트랙을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  45. 제41항에 있어서, 상기 제1 가닥 프라이머는 무작위 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  46. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 세포를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 세포는 혈액 세포, 면역 세포, 조직 세포 또는 종양 세포인, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 세포는 B 세포 또는 T 세포인, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  49. 제46항에 있어서, 상기 샘플과 관련된 상기 RNA는 mRNA를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 샘플과 관련된 상기 RNA는 적어도 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000 또는 1,000,000개의 mRNA를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  51. 제49항에 있어서, 상기 샘플과 관련된 상기 RNA는 세포의 적어도 일부의 전사체를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  52. 제46항에 있어서, 상기 샘플과 관련된 상기 RNA는 세포의 총 RNA를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  53. 제46항에 있어서, 샘플 당 적어도 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000 또는 1,000,000개의 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드가 생성되는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  54. 제46항에 있어서, 상기 하나 이상의 샘플은 적어도 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000 또는 1,000,000개의 세포를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  55. 제46항에 있어서, 상기 하나 이상의 샘플은 동일한 대상체로부터 얻어지는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  56. 제46항에 있어서, 상기 샘플을 용해 완충제와 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  57. 제46항에 있어서,
    상기 샘플을 핵산 마커와 접촉시킴으로서, 상기 핵산 마커를 상기 샘플의 서브세트에 결합시키는 단계; 및
    상기 샘플을 세척함으로써, 상기 핵산 마커가 결합되지 않은 샘플로부터 상기 핵산 마커를 제거하는 단계를 더 포함하되,
    상기 서브세트 내의 샘플에 대해, 상기 샘플과 관련된 상기 RNA에 첨가된 상기 어댑터 분자는 또한 상기 핵산 마커에 첨가되고, 관심 대상의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 상기 핵산 마커를 이용하여 생성된, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 핵산 마커는 분자 표지에 결합된 핵산을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 분자 표지는 항체, 항원 또는 단백질인, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  60. 제58항에 있어서, 상기 분자 표지는 하나 이상의 세포 표면 모이어티에 대해 친화도를 갖는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  61. 제58항에 있어서, 상기 핵산은 RNA인, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  62. 제58항에 있어서, 상기 핵산은 DNA인, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 DNA는 RNAP 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  64. 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플을 제1 핵산 마커 및 제2 핵산 마커와 접촉시키고,
    상기 제1 핵산 마커는 제1 분자 표지에 결합된 제1 핵산을 포함하며,
    상기 제2 핵산 마커는 제2 분자 표지에 결합된 제2 핵산을 포함하고,
    상기 제1 핵산과 제2 핵산은 상이한 서열 영역을 포함하며,
    상기 제1 분자 표지와 제2 분자 표지는 상이한, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  65. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 샘플은 동일한 대상체로부터 얻어지는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  66. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 샘플은 적어도 3, 10, 30 또는 100명의 상이한 대상체로부터 얻어지는, 폴리뉴클레오타이드의 생성방법.
  67. RNAP 프로모터 서열, 보편적인 프라이밍 서열, 바코드 서열 및 결합 부위를 포함하는 어댑터 작제물.
  68. 제67항에 있어서, 상기 RNAP 프로모터는 T7, T3 및 SP6으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 어댑터 작제물.
  69. 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위, 보편적인 프라이밍 서열, 바코드 서열 및 결합 부위를 포함하는 어댑터 작제물.
  70. 제69항에 있어서, 상기 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위는 Nt.BbvCI, Nt.BspQI, Nt.BsmAI, Nt.BstNBI, Nt.AlwI 및 Nt.BsmAI로 이루어진 군으로부터 선택되는, 어댑터 작제물.
  71. 제67항 또는 제69항에 있어서, 고유 분자 식별자(UMI) 서열을 더 포함하는, 어댑터 작제물.
  72. 제67항, 제69항 또는 제71항의 어댑터 작제물을 포함하는 고체 지지체.
  73. 제72항에 있어서, 상기 어댑터 작제물은 공유 결합을 통해 상기 고체 지지체에 결합되는, 고체 지지체.
  74. 제72항에 있어서, 상기 어댑터 작제물의 다중 복제물은 상기 고체 지지체에 결합된, 고체 지지체.
  75. 제74항에 있어서, 상기 어댑터 작제물의 적어도 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000 또는 1,000,000개의 복제물은 상기 고체 지지체에 결합된, 고체 지지체.
  76. 제74항에 있어서, 상기 어댑터 작제물의 각각의 복제물은 동일한 바코드 서열을 포함하는, 고체 지지체.
  77. 복수의 제72항의 고체 지지체를 포함하는 어댑터 주형 라이브러리.
  78. 제77항에 있어서, 상기 복수는 적어도 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000 또는 1,000,000개의 고체 지지체를 포함하는, 어댑터 주형 라이브러리.
  79. 분자 표지에 결합된 핵산을 포함하는 핵산 마커로서, 상기 분자 표지는 항체, 항원 또는 단백질인, 핵산 마커.
  80. 제79항에 있어서, 상기 분자 표지는 하나 이상의 세포 표면 모이어티에 대해 친화도를 갖는, 핵산 마커.
  81. 제79항에 있어서, 상기 핵산은 RNA인, 핵산 마커.
  82. 제79항에 있어서, 상기 핵산은 DNA인, 핵산 마커.
  83. 제82항에 있어서, 상기 DNA는 RNAP 프로모터를 포함하는, 핵산 마커.
  84. 제79항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 마커는 제1 분자 표지에 결합된 제1 핵산을 포함하고, 적어도 하나의 핵산 마커는 제2 분자 표지에 결합된 제2 핵산을 포함하되,
    상기 제1 핵산과 제2 핵산은 상이한 서열 영역을 포함하고, 상기 제1 분자 표지와 제2 분자 표지는 상이한, 핵산 마커.
  85. 제67항, 제69항 또는 제71항의 어댑터 작제물, 제72항의 고체 지지체, 제77항의 어댑터 주형 라이브러리 또는 제79항 내지 제83항 중 어느 한 항의 핵산 마커를 포함하는 키트.
  86. 제85항에 있어서, 제67항 또는 제69항의 어댑터 작제물로부터의 보편적인 프라이밍 서열, 바코드 서열 및 결합 부위를 포함하는 어댑터 분자를 생성하기 위한 효소를 더 포함하는, 키트.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, 삼투억제제를 포함하는 세포 현탁 완충제를 더 포함하는, 키트.
  88. 제87항에 있어서, 상기 삼투억제제는 베타인 또는 이의 밀접한 구조적 유사체인, 키트.
  89. 제88항에 있어서, 상기 삼투억제제는 글리신 베타인인, 키트.
  90. 제87항에 있어서, 상기 삼투억제제는 당 또는 폴리올인, 키트.
  91. 제90항에 있어서, 상기 삼투억제제는 트레할로스인, 키트.
  92. 제87항에 있어서, 상기 삼투억제제는 아미노산인, 키트.
  93. 제92항에 있어서, 상기 삼투억제제는 프롤린인, 키트.
  94. 제87항에 있어서, 상기 완충제의 상기 삼투압몰농도는 약 250 내지 350 mOsm/ℓ인, 키트.
  95. 제87항에 있어서, 상기 삼투억제제는 상기 완충제의 상기 삼투압몰농도의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%까지를 구성하는, 키트.
  96. 제87항에 있어서, 상기 완충제는 약 230 내지 330mM 베타인 및 약 10mM NaCl을 포함하는, 키트.
  97. 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법으로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 바코드 서열을 함유하며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함하는, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법:
    a) 역유화(inverse emulsion)의 친수성 구획을 생성하는 단계로서, 상기 친수성 구획은:
    고체 지지체,
    바코드 서열을 포함하는 바코드 올리고뉴클레오타이드, 및
    포획 모이어티를 통해 상기 고체 지지체의 표면에 결합된 올리고뉴클레오타이드를 함유하되, 상기 결합된 올리고뉴클레오타이드는 상기 바코드 올리고뉴클레오타이드의 3' 서열에 대해 상보성인 3' 서열을 포함하는, 상기 친수성 구획을 생성하는 단계; 및
    b) 중합효소 연장 반응을 수행하여 상기 바코드 서열을 상기 고체 지지체 상의 상기 결합된 올리고뉴클레오타이드 내로 혼입하는 단계.
  98. 제97항에 있어서, 상기 바코드 올리고뉴클레오타이드는 PCR 역방향 프라이머 서열에 대해 동일하거나 또는 상보성인 5' 서열을 더 포함하는, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 형광단-표지된 역방향 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하는 단계를 더 포함하는, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  100. 제97항에 있어서, 상기 고체 지지체는 비드 또는 표면인, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  101. 제97항에 있어서, 상기 포획 모이어티는 스트렙타비딘인, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  102. 제97항에 있어서, 상기 포획 모이어티는 카복실기, 에폭시기 또는 하이드록실기를 포함하는, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  103. 제97항에 있어서, 상기 포획 모이어티는 티올화된 올리고뉴클레오타이드를 포획하기 위해 금을 포함하는, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  104. 제97항에 있어서, 상기 바코드 올리고뉴클레오타이드는 보편적인 프라이밍 서열 및 결합 부위를 더 포함하는, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 바코드 올리고뉴클레오타이드는 T7, T3 및 SP6으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNAP 프로모터를 더 포함하는, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  106. 제104항에 있어서, 상기 바코드 올리고뉴클레오타이드는 Nt.BbvCI, Nt.BspQI, Nt.BsmAI, Nt.BstNBI, Nt.AlwI 및 Nt.BsmAI로 이루어진 군으로부터 선택된 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위를 더 포함하는, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  107. 제104항에 있어서, 상기 결합 부위는 하나 이상의 G 뉴클레오타이드인, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  108. 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법으로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 바코드 서열을 함유하고, 상기 방법은 하기 단계들을 포함하는, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법:
    a) 고체 지지체,
    W 서열을 포함하는 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드, 및
    포획 모이어티를 통해 고체 지지체의 표면에 결합된 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 상기 결합된 올리고뉴클레오타이드는 (i) S1x 서열 및 (ii) 상기 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드의 3' 서열에 대해 상보성인 서열을 포함하는, 상기 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계;
    b) 상기 결합된 올리고뉴클레오타이드 내로 W 서열을 혼입하기 위해 중합효소 연장 반응 또는 결찰 반응을 수행하는 단계;
    c) (i) S2y 서열 및 (ii) 단계 b)로부터 초래된 상기 결합된 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 대해 상보성인 3' 서열을 포함하는 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계; 및
    d) 상기 결합된 올리고뉴클레오타이드 내로 S2y 서열을 혼입하기 위해 중합효소 연장 반응 또는 결찰 반응을 수행함으로써, 상기 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 단계로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 바코드 서열을 함유하고, 상기 바코드 서열은 S1x, W 및 S2y 서열을 포함하는, 상기 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 단계.
  109. 제108항에 있어서, 상기 고체 지지체는 비드 또는 표면인, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  110. 제108항에 있어서, 상기 포획 모이어티는 스트렙타비딘인, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  111. 제108항에 있어서, 상기 포획 모이어티는 카복실기, 에폭시기 또는 하이드록실기를 포함하는, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  112. 제108항에 있어서, 상기 포획 모이어티는 티올화된 올리고뉴클레오타이드를 포획하기 위해 금을 포함하는, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  113. 제108항에 있어서, 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드 또는 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드는 보편적인 프라이밍 서열 및 결합 부위를 더 포함하는, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  114. 제113항에 있어서, 상기 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드 또는 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드는 T7, T3 및 SP6으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNAP 프로모터를 더 포함하는, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  115. 제113항에 있어서, 상기 제1 바코드 올리고뉴클레오타이드 또는 제2 바코드 올리고뉴클레오타이드는 Nt.BbvCI, Nt.BspQI, Nt.BsmAI, Nt.BstNBI, Nt.AlwI 및 Nt.BsmAI로 이루어진 군으로부터 선택된 틈내기 엔도뉴클레아제 제한 부위를 더 포함하는, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  116. 제113항에 있어서, 상기 결합 부위는 하나 이상의 G 뉴클레오타이드인, 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 방법.
  117. 제97항 내지 제116항 중 어느 한 항에 의해 제조된 고체 지지체로서, 상기 고체 지지체는 폴리뉴클레오타이드에 부착되고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 바코드 서열을 함유하는, 고체 지지체.
  118. 제117항의 복수의 고체 지지체를 포함하는 바코드 라이브러리.
  119. 세포, 바코드 어댑터 주형, 및 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위한 시약을 캡슐화하기 위한 미세유체 점적 장치로서, 상기 장치는 (a) 3개의 독립적으로 제어된 압력 공급원, (b) 3개의 미세유체 경로, (c) 3개의 유동 센서, (d) 2개의 샘플 루프, (e) 미세유체 점적 칩, 및 (f) 샘플 수집 용기를 포함하되,
    각각의 압력 공급원은 상기 상기 미세유체 경로 중 하나에 결합되고 미세유체 경로 중 하나를 통해 유체를 밀어내며,
    상기 유동 센서 중 하나는 상기 각각의 압력 공급원 하류의 각각의 미세유체 경로를 따라서 배치되며,
    제1 미세유체 경로는 제1 샘플 루프를 통과하고,
    제2 미세유체 경로는 제2 샘플 루프를 통과하며,
    상기 제1 샘플 루프 및 제2 샘플 루프는 열 냉각 유닛과 접촉되고,
    상기 제1 미세유체 경로 및 제2 미세유체 경로는 제1 접합부에서 합쳐져서 조합된 경로를 형성하고,
    상기 조합된 경로와 제3 미세유체 경로는 제2 접합부에서 합쳐져서 샘플 경로를 형성하고, 상기 제2 접합부는 상기 미세유체 점적 칩 내에서 그리고 상기 제1 접합부의 하류에서 생기며,
    (a) 내지 (f)가 유동으로 연결되도록, 상기 샘플 경로는 상기 제2 접합부의 하류의 샘플 수집 용기 내로 통과하는, 미세유체 점적 장치.
  120. 제119항에 있어서, 각각의 압력 공급원은 압력 펌프를 포함하는, 미세유체 점적 장치.
  121. 제119항에 있어서, 각각의 압력 공급원은 주사기 펌프를 포함하는, 미세유체 점적 장치.
  122. 제119항에 있어서, 상기 제1 샘플 루프는 미세유체 점적 칩에 대해 수용액의 유동을 측정하도록 구성되되, 상기 수용액은 세포 및 바코드 어댑터 주형을 포함하는, 미세유체 점적 장치.
  123. 제119항에 있어서, 상기 제2 샘플 루프는 상기 미세유체 점적 칩에 대해 반응 혼합물의 유동을 측정하도록 구성되되, 상기 반응 혼합물은 세포 용해를 위한 시약 및 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위한 시약을 포함하는, 미세유체 점적 장치.
  124. 제119항에 있어서, 상기 제3 미세유체 경로는 오일/계면활성제 혼합물을 미세유체 점적 칩에 전달하도록 구성되는, 미세유체 점적 장치.
  125. 제119항에 있어서, 상기 열 냉각 유닛은 펠티에 소자를 포함하는, 미세유체 점적 장치.
  126. 제119항에 있어서, 상기 열 냉각 유닛은 얼음 보관함을 포함하는, 미세유체 점적 장치.
  127. 제119항에 있어서, 상기 제1 접합부는 상기 점적 칩 내에서 생기는, 미세유체 점적 장치.
  128. 제119항에 있어서, 상기 제3 미세유체 경로는 상기 미세유체 점적 칩의 상류에서 2개의 하위경로로 분할되고, 상기 2개의 하위경로는 상기 제2 접합부에서 조합 경로와 합쳐지며, 상기 제2 접합부는 유동-집속 기하구조를 갖는, 미세유체 점적 장치.
  129. 제119항에 있어서, 상기 제2 접합부는 t-접합부 기하구조를 갖는, 미세유체 점적 장치.
  130. 제119항에 있어서, 상기 제1 미세유체 경로는 세포를 수용하도록 구성되고, 상기 제2 미세유체 경로는 고체 지지체에 결합된 바코드 어댑터 주형을 수용하도록 구성된, 미세유체 점적 장치.
  131. 제77항에 있어서, 상기 고체 지지체 중 적어도 둘은 상이한 바코드 서열 또는 UMI 서열을 지니는 어댑터 작제물을 포함하는, 어댑터 주형 라이브러리.
  132. 제131항에 있어서, 상기 복수의 고체 지지체의 모든 고체 지지체는 상이한 바코드 서열 또는 상이한 UMI 서열을 지니는 어댑터 작제물을 포함하는, 어댑터 주형 라이브러리.
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