JP2003262616A - キャピラリーアレイ電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 キャピラリーアレイ電気泳動装置において、
複数キャピラリーにレーザ光を同時照射し、試料成分か
らの蛍光を検出するオンカラム蛍光計測を行なう。 【解決手段】 キャピラリーゲル１の泳動開始点より所
定の位置で、所定の長さで各キャピラリーのポリイミド
被覆を除去してレーザ照射部とする。キャピラリーゲル
をキャピラリー軸を平行に保ちガラス平面板３の上に平
面状に固定配列する。蛍光像は第１カメラレンズ３で平
行光束にし、像を垂直方向に分割する像分割プリズム及
び像を結ぶ光束に対応させた４種の組み合わせフィルタ
ー５を透過させ、第２カメラレンズ６で２次元ＣＣＤカ
メラ７に結像させる。キャピラリーの外半径、内半径、
キャピラリー外部の媒質の屈折率、キャピラリーの材料
の屈折率、ゲルの屈折率の間に所定の関係を満足させ
て、レーザのキャピラリーによる屈折を小さくし全ての
キャピラリーに十分な強度のレーザ光を照射する。 【効果】 高感度、高速、高スループットが簡便に実現
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、
又は蛋白質等の分離分析装置に係る技術分野に属し、特
にＤＮＡ、ＲＮＡの塩基配列決定、あるいは個体の塩基
配列の多様性に基づく制限酵素断片の多型性の計測を行
なうキャピラリーアレイ電気泳動装置に係る技術分野に
属する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡ、ＲＮＡ等の分析技術は、遺伝子
解析や遺伝子診断を含む医学、生物学の分野でますます
重要になってきている。特に最近、特にゲノム解析計画
に関連して、高速、高スループットのＤＮＡ解析装置の
開発が進んでいる。ＤＮＡ解析では、蛍光標識された試
料をゲル電気泳動によって分子量分離し、試料にレーザ
を照射して蛍光標識から発する蛍光を検出し、検出され
る一連の信号を解析する。ゲル電気泳動では、０．３ｍ
ｍ程度の間隔に保持された２枚のガラス板の間で、アク
リルアミドを重合させた平板ゲルが広く使用されている
（スラブゲル電気泳動）。平板ゲルの上端（一端）の泳
動開始点に注入された試料は、平板ゲルの両端に印加さ
れた電界により分子量分離されながら下端（他端）方向
に泳動される。泳動開始点から一定距離の位置におい
て、平板ゲルの側面からレーザを照射して、全ての泳動
路を一度に照射し、レーザ照射部を通過する蛍光標識さ
れた試料の泳動分離された成分を励起する。レーザ照射
により発する蛍光の検出は、一定時間間隔で連続して周
期的に検出する。この検出結果を解析することによりＤ
ＮＡ塩基配列を決定している。

【０００３】最近では平板ゲルに替わり、溶融石英製の
毛細管内にゲルを重合させたキャピラリーゲルが使用さ
れるようになった。キャピラリーゲル電気泳動は、上記
のスラブゲル電気泳動に比較して、大きな電界を加える
ことができ、高速、高分離が可能な方法として注目を集
めている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
６２、９００（１９９０））。通常、キャピラリーゲ
ル電気泳動装置では、１本のキャピラリー管を用い、そ
の下端近傍のキャピラリー中をレーザ照射し、蛍光標識
された試料から発する蛍光を検出するオンカラム計測を
行なっている。キャピラリーの外表面全体はポリイミド
コーティングされているので、蛍光を検出する位置のコ
ーティングを除去してガラスを露出させておく（米国特
許５３１２５３５（Ｍａｙ １７、１９９４））。この
ガラスが露出した位置に照射されるレーザにより、電気
泳動によってキャピラリー内部を泳動する蛍光標識され
た試料の泳動分離された成分が励起され蛍光を発する。
この蛍光を一定時間間隔で連続して周期的に検出し、解
析することによりＤＮＡ塩基配列を決定している。しか
し、上記のオンカラム計測装置では、レーザビームのキ
ャピラリー表面での屈折が大きいために、１度に１本の
キャピラリーしか使用できず、スループットが上がらな
いという難点があった。そこで最近、複数本のキャピラ
リーをアレイ化して、多くの試料を同時に高速分析する
高スループットなキャピラリーアレイゲル電気泳動装置
がいくつか報告されている。

【０００４】第１の報告例は、キャピラリーアレイスキ
ャン方式（Ｎａｔｕｒｅ、３５９、１６７（１９９
２））であり、複数本のキャピラリーを１本づつ順番に
レーザ照射し、オンカラム蛍光計測するものである。こ
の装置では、レーザビームがキャピラリー中で最も絞ら
れる位置と、蛍光受光光学系に入射する光源位置とが一
致する共焦点構造が採用されており、１本づつのキャピ
ラリーを独立に計測できる。レーザ照射及び蛍光受光光
学系は固定し、キャピラリーアレイを保持したステージ
を１次元方向に移動させて、各キャピラリーを順番にレ
ーザ照射している。第２の報告例は、キャピラリーアレ
イシースフロー方式（Ｎａｔｕｒｅ、３６１、５６５−
５６６（１９９３）、特開平０６−１３８０３７号公
報）である。この装置では、キャピラリーアレイの下端
を緩衝液中に浸し、ゲル電気泳動によって分子量分離さ
れた試料の成分をそのまま緩衝液中に溶出させ、キャピ
ラリーの存在しない空間部分で、試料の成分から発する
蛍光を検出する、オフカラム計測（キャピラリーにレー
ザ照射して試料の成分を検出するオンカラム計測に対比
して、本願明細書では、キャピラリーの存在しない空間
にレーザ照射して試料の成分を検出する方式を、簡単の
ためオフカラム計測と呼ぶことにする。）を行なってい
る。

【０００５】また、緩衝液を泳動方向にゆっくり流すこ
とによって、異なるキャピラリーゲルから溶出された分
離成分の緩衝液中での混合、あるいは１本のキャピラリ
ーゲル中で分離されていた異なる２つの成分の緩衝液中
での混合を防止している。キャピラリーアレイの出口近
傍で、キャピラリーが存在せず緩衝液が存在する空間部
分を、レーザ照射してキャピラリーの表面でのレーザビ
ームの散乱の問題を回避し、複数のキャピラリーから溶
出された成分を、実質的に一括して励起し、実質的に同
時に蛍光検出することが可能になっている。

【０００６】第３の報告例では、複数のキャピラリーを
機械的にスキャンすることなく、複数のキャピラリーを
同時にオンカラム計測するために、単一のレーザ光源か
らのレーザ光をビームスプリッター等により分割して、
複数のキャピラリーのそれぞれに同時照射している（Ａ
ｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６５、９５
６（１９９３））。

【０００７】第４の報告例では、レーザ光をシリンドリ
カルレンズでキャピラリー配列方向に拡げて、複数のキ
ャピラリーに一括して照射している（Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ ６６、１４２４（１９９
４））。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上記第１の報告例のキ
ャピラリーアレイスキャン方式では、蛍光計測をキャピ
ラリー１本づつ順番に行なうため、１本当たりの蛍光検
出に要する時間が、１本のキャピラリーを使用する通常
のオンカラム計測と比較して減少してしまう。ｎ本のキ
ャピラリーアレイを使用する場合、通常のオンカラム計
測と比較して、１本当たりの蛍光検出に要する時間は最
大で１／ｎ、実際には試料の分離成分が通過しないキャ
ピラリーのガラス部分もスキャンされるので１／ｎ以下
になってしまう。この結果、蛍光検出感度が低下する問
題が生じる。即ち、ｎ本のキャピラリーアレイを使用す
る場合に、１本のキャピラリーを使用する通常のオンカ
ラム計測と同等の蛍光検出感度を得るためには、通常の
オンカラム計測における蛍光を検出時間のｎ倍以上の時
間を要することになってしまう。

【０００９】また、１本のキャピラリー中で分離される
成分の電気泳動パターンの隣り合うピークの時間間隔
は、高速分析になるほど小さくなるが、この隣り合うピ
ークの時間間隔に対して、ｎ本のキャピラリーアレイの
１回のスキャンに要する時間が無視できないほど大きく
なると、分離された成分の電気泳動パターンの分離能が
低下する問題が生じる。更に、本装置では、スキャンを
機械的に行なうためのステージ可動部を有しており、故
障が多発する構造となっている。

【００１０】上記第２の報告例のキャピラリーアレイシ
ースフロー方式では、分子量分離された成分から得られ
る蛍光強度が、オンカラム蛍光計測の場合と比較して、
分子量が多きくなるほど小さくなってしまうという問題
がある。この問題は、次の理由により生じる。キャピラ
リーゲルの下端より緩衝液中に溶出さた分離成分が、緩
衝液中で拡散等によって混合しないようにするために
は、緩衝液を泳動方向に一定の速度以上で定常的に流す
必要がある。一方、キャピラリーゲル中を分子量分離さ
れながら泳動する試料成分の泳動速度は、その分子量が
多きいほど小さくなる。緩衝液のフロー速度に対して、
キャピラリーゲル中での試料成分の泳動速度が小さいほ
ど、その試料成分はキャピラリーゲルから緩衝液中に溶
出される際に、泳動方向に大きく引き伸ばされることに
なる。その結果、蛍光強度が小さくなり、計測感度が低
下する原因となる。

【００１１】上記第３、第４の報告例では、キャピラリ
ー１本当たりに照射されるレーザ光強度が低下するた
め、電気泳動により分離される試料成分を感度よく検出
できないという問題がある。

【００１２】本発明の目的は上記した各種の問題を解決
するために、オンカラム蛍光計測を行ないながら、複数
のキャピラリーを機械的にスキャンせず、あるいはレー
ザをスキャンすることなく、複数のキャピラリーを実質
的に同時にレーザ照射して、複数のキャピラリー中の試
料成分から発する蛍光を、実質的に同時に一括して計測
できるキャピラリーアレイ電気泳動装置を提供すること
にある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明のキャピラリーア
レイ電気泳動装置は、泳動する試料の成分を検出するた
めの複数のキャピラリーの少なくとも一部が平面状に配
列され、複数のキャピラリーにレーザ光を照射するキャ
ピラリーアレイ電気泳動装置において、（１）レーザ光
を、上記少なくとも一部が配列する平面に平行な方向か
ら、複数のキャピラリーに照射すること、（２）レーザ
光を、上記少なくとも一部が配列する平面の１つ又は２
つの側方より、上記平面に平行な方向から複数のキャピ
ラリーに照射すること、（３）キャピラリーの外半径、
内半径、キャピラリー外部の媒質の屈折率、キャピラリ
ーの材料の屈折率、キャピラリー内部の媒質の屈折率の
間に所定の関係を満足させて、上記レーザ光のキャピラ
リーによる屈折を十分小さくし、全てのキャピラリーに
十分な強度を有するレーザ光を照射すること、（４）キ
ャピラリーアレイ又はレーザ光のスキャンを行なうこと
なく、複数のキャピラリーにレーザ光を実質的に同時に
照射して、上記の各キャピラリー中を泳動する試料の成
分から発する蛍光を実質的に同時に検出するために、上
記レーザ光を、上記少なくとも一部が配列する平面の１
つ又は２つの側方より、前上平面に平行な方向から複数
のキャピラリーに照射すること、（５）キャピラリーア
レイ又は前記レーザ光のスキャンを行なうことなく、複
数のキャピラリーにレーザ光を実質的に同時に照射し
て、上記の各キャピラリー中を泳動する試料の成分から
発する蛍光を実質的に同時に検出するために、キャピラ
リーの外半径、内半径、前記キャピラリー外部の媒質の
屈折率、キャピラリーの材料の屈折率、キャピラリー内
部の媒質の屈折率の間に所定の関係を満足させて、レー
ザ光のキャピラリーによる屈折を十分小さくし、全ての
キャピラリーに十分な強度を有するレーザ光を照射する
こと、に特徴を有するキャピラリーアレイ電気泳動装置
である。

【００１４】さらに、本発明のキャピラリーアレイ電気
泳動装置は、上記特徴（１）から（５）に加えて、
（ａ）上記各キャピラリーのレーザ光が照射される部分
が透明であること、上記レーザ光が、少なくとも３つの
異なる屈折率をもつ媒質を透過すること、（ｂ）上記レ
ーザ光が通過する各キャピラリーの外半径をＲ、内半径
をｒ、屈折率をｎ₂とし、レーザ光が通過する各キャピ
ラリーの外部の媒質の屈折率をｎ₁とし、レーザ光が通
過する各キャピラリーの内部の媒質の屈折率をｎ₃とす
るとき、 （３６０／π）│ｓｉｎ^-1｛ｒ／（２Ｒ）｝−ｓｉｎ^-1
｛ｒｎ₁／（２Ｒｎ₂）｝｝＋ｓｉｎ^-1｛ｎ₁／（２
ｎ₂）｝｝−ｓｉｎ^-1｛ｎ₁／（２ｎ₃）｝│≦６．２° なる関係を満たすこと、あるいは、 （ｃ）（３６０／π）│ｓｉｎ^-1｛ｒ／（２Ｒ）｝−ｓ
ｉｎ^-1｛ｒｎ₁／（２Ｒｎ₂））｝＋ｓｉｎ^-1｛ｎ₁／
（２ｎ₂）｝｝−ｓｉｎ^-1｛ｎ₁／（２ｎ₃）｝│≦１．
２°なる関係を満たすこと、（ｄ）レーザ光の通過する
各キャピラリーの外部の媒質が、屈折率ｎ₁＝１．３３
からｎ₁＝１．３７の範囲にある水又は緩衝液であり、
上記外半径と上記内半径の比Ｒ／ｒがＲ／ｒ＝２±０．
２であり、レーザ光の通過する各キャピラリーが、屈折
率ｎ₂＝１．４６±０．０２である石英ガラスからな
り、レーザ光が通過する各キャピラリーの内部の媒質の
屈折率がｎ₃＝１．３７±０．０４であり、この媒質が
アクリルアミドゲルからなること、（ｅ）レーザ光の通
過する各キャピラリーの外部の媒質が、屈折率ｎ₁＝
１．３３からｎ₁＝１．３７の範囲にある水又は緩衝液
であり、上記外半径と内半径の比Ｒ／ｒがＲ／ｒ＝２±
０．２であり、レーザ光の通過する各キャピラリーが、
屈折率ｎ₂＝１．４６±０．０２である石英ガラスから
なり、レーザ光が通過する各キャピラリーの内部の媒質
の屈折率がｎ₃＝１．４０±０．０４であり、この媒質
がホルムアミドを混入させたアクリルアミドゲルからな
ること、（ｆ）レーザ光の通過する各キャピラリーの外
部の媒質が、屈折率ｎ₁＝１．００の空気であり、上記
外半径と内半径の比Ｒ／ｒがＲ／ｒ＝５±０．５であ
り、レーザ光の通過する各キャピラリーが、屈折率ｎ₂
＝１．４６±０．０２である石英ガラスからなり、レー
ザ光が通過する各キャピラリーの内部の媒質の屈折率が
ｎ₃＝１．３７±０．０４であり、この媒質がアクリル
アミドゲルからなること、（ｇ）レーザ光の通過する各
キャピラリーの外部の媒質が、屈折率ｎ₁＝１．００の
空気であり、上記外半径と内半径の比Ｒ／ｒがＲ／ｒ＝
３±０．３であり、レーザ光の通過する各キャピラリー
が、屈折率ｎ₂＝１．６０±０．０２であるガラスから
なり、レーザ光が通過する各キャピラリーの内部の媒質
の屈折率がｎ₃＝１．３７±０．０４であり、この媒質
がアクリルアミドゲルからなること、等にも特徴を有す
る。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を図を
参照して詳細に説明する。図１は、複数のキャピラリー
１（図１では、６本の例を示す）を同一平面上に配列
し、この平面と平行であり、試料成分の泳動方向とほぼ
直交する方向からレーザ２を照射して、複数のキャピラ
リーを実質的に同時に励起して、各キャピラリー中で分
離される試料成分をオンカラム計測して検出するキャピ
ラリーアレイ電気泳動装置の主要部分を示す。図１
（ａ）は、複数のキャピラリーアレイの平面図、図１
（ｂ）は、その断面図である。レーザ２が照射される複
数のキャピラリーは、試料成分を分離するための分離用
キャピラリー、もしくは分離用キャピラリーに接続され
泳動分離された試料成分を検出するための計測用キャピ
ラリーのいずれかである。レーザ２が照射される複数の
キャピラリーが分離用キャピラリーである場合には、試
料の泳動開始点から所定の距離でレーザ２を照射する。
これらの各キャピラリーには、ゲルが充填されている。
本発明のキャピラリーアレイ電気泳動装置で泳動分析、
又は解析される試料は、蛍光標識されている複数の成分
を含んでいる。また、試料に含まれる成分自身が、レー
ザの照射により蛍光を発する性質をもっている場合に
は、蛍光標識は不要である。なお、図１を含め以下で参
照する各図では、泳動のための電界を印加するための、
電源、電極、電極及び電解液を収納する電極層等の各手
段、更に、キャピラリーゲル１の中を泳動する試料成分
からの蛍光を検出した後、これら検出信号を処理する演
算処理装置、演算処理結果の表示を行なう表示器、キャ
ピラリーアレイ電気泳動装置の各部を制御する制御装
置、レーザ光源等は省略してある。

【００１６】（第１の実施形態）本実施形態は、５本の
キャピラリーゲル電気泳動によるＤＮＡ塩基配列決定の
ための装置であり、その装置の基本構成を図２に示し
た。但し、図２には、５本のキャピラリーゲル１の中を
泳動する試料成分を検出する蛍光計測部分近傍のみを示
す。キャピラリーゲル１は、長さ５０ｃｍ、外径０．２
ｍｍ（外半径、Ｒ＝０．１ｍｍ）、内径０．１ｍｍ（内
半径、ｒ＝０．０５ｍｍ）の溶融石英管（屈折率＝１．
４６）に、変性剤として７Ｍのウレアを含んだ４％Ｔ
（Ｔｏｔａｌｍｏｎｏｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉ
ｏｎ）、５％Ｃ（Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｍａｔｅ
ｒｉａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）の濃度のアク
リルアミドを注入した後ゲル化させて調製した（屈折率
＝１．３７）。試料注入側のキャピラリー末端より３０
ｃｍの位置で、長さ１０ｍｍにわたり、各キャピラリー
のポリイミド被覆を除去してレーザ照射部とした。図２
のように、このキャピラリーゲル５本をそれぞれキャピ
ラリー軸を平行に保ち、０．２ｍｍピッチに揃えてガラ
ス平面板３の上に固定して平面状に配列させた。図３に
示すように、キャピラリーゲルを取り巻く媒質は、空気
９である（屈折率＝１．００）。

【００１７】図３は、蛍光計測部分のキャピラリー軸に
垂直な断面図であり、ＹＡＧレーザ（５３２ｎｍ、２０
ｍＷ）、及びＨｅ−Ｎｅレーザ（５９４ｎｍ、１０ｍ
Ｗ）を同軸にした後、ビーム２の径を０．１ｍｍに絞
り、キャピラリーが配列する平面に平行であり、キャピ
ラリー軸にほぼ垂直な方向から入射させた（即ち、キャ
ピラリーアレイの側方からビーム２を入射させる）。蛍
光の計測は、キャピラリーゲルが配列する平面に対して
垂直方向からガラス平面板３を通して行なった。図３に
示すように、蛍光の計測は、ガラス平面板３の反対の側
から行なうこともできる水平方向に幅０．８ｍｍに、
０．２ｍｍ間隔で１列に並ぶ５個の蛍光発光点群を、図
２に示す構成により、第１カメラレンズ３でほぼ平行光
束にし、像を垂直方向に４つに分割する像分割プリズム
及び４つの像を結ぶ光束に対応させた４種の組み合わせ
フィルター５を透過させ、第２カメラレンズ６で、２次
元ＣＣＤカメラ７に結像させた。なお、この蛍光選別法
は特開平０２−２６９９３６号公報に詳しく記されてい
る。５×４＝２０個からなる２次元状に展開された蛍光
発光点群を、冷却型の２次元ＣＣＤカメラ７に一度に露
光させ計測した。この計測は、露光時間１．０秒、デー
タ取得間隔１．５秒で連続的に行なった。

【００１８】５種のＤＮＡ試料の塩基配列決定はサンガ
ー法に従って行なった。試料は５種ともに標準試料のＭ
１３ｍｐ１８である。調製されたＤＮＡ試料成分には、
末端塩基種Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔに対応して４種の蛍光体Ｃｙ
３（極大発光波長５６５ｎｍ）、ＴＲＩＴＣ（極大発光
波長５８０ｎｍ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（極大発光波長
６１５ｎｍ）、Ｃｙ５（極大発光波長６６５ｎｍ）を標
識した。ここで、蛍光体Ｃｙ３、Ｃｙ５は、バイオロジ
カル・ディテクション・システム社（米国）より販売さ
れている蛍光体、ＴＲＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄはモ
レキュラー・プローブ社より販売されている蛍光体であ
る。これら４種の蛍光体から発する蛍光が、波長選別さ
れて２次元ＣＣＤカメラ７に結像されるように、４種の
組み合わせフィルター５を用いた。末端塩基種に対応し
た４種の反応物を試料種毎に混合した後、エタノール沈
殿によって１０倍に濃縮して試料溶媒をホルムアミドに
置換した。５本のキャピラリーゲルのそれぞれの試料注
入端を、５種のＤＮＡ試料液中に対応させて浸し、キャ
ピラリーゲルの両端に１００Ｖ／ｃｍ（３ｋＶ）の一定
電界強度を２秒間印加して試料注入を行なった。この結
果、５本のキャピラリーゲルのそれぞれの泳動開始点
に、異なるＤＮＡ試料が添加される。

【００１９】電気泳動は一定電界強度１００Ｖ／ｃｍ
（３ｋＶ）で約３時間行なった。２次元ＣＣＤカメラ７
で得られた４種の蛍光に対応する４種の信号の時間変化
をコンピュータで解析し、塩基配列決定を行なうことが
できたが、レーザ２が出射する側の２本のキャピラリー
からの蛍光強度は、レーザの入射する側のキャピラリー
より一桁近く低かった。

【００２０】（第２の実施形態）複数のキャピラリーに
対して、より効率の良い同時レーザ照射を実現するため
に、レーザ光の収束条件を検討し、最適条件下で計測を
行なった例を、以下に説明する。キャピラリーが円筒形
状であるため、各キャピラリーそのものがレンズ作用を
もち、照射されたレーザビームは１本目のキャピラリー
を透過する際に大きく屈折を受ける。屈折は全てのキャ
ピラリーで起こるので、各キャピラリーに到達し入射す
るレーザ光の強度は、ほぼ指数関数的に減少してしまう
ので、従って各キャピラリー中の試料成分から発する蛍
光の強度も、使用するキャピラリーの本数に応じて、ほ
ぼ指数関数的に減少してしまうことになる。

【００２１】図４は、外半径Ｒ（２３）、内半径ｒ（２
４）をもつキャピラリー断面図であり、キャピラリーの
軸から、距離ｘ（１０）だけ離れた位置に入射した無限
小幅のレーザビーム２の１本のキャピラリーによる屈折
の様子を示している。図４では、複数のキャピラリーの
各軸が配列するキャピラリー配列軸１９上の、キャピラ
リーの軸Ｏをもつ１本のキャピラリーの断面を示し、他
の複数のキャピラリーは省略している。

【００２２】キャピラリー外部の媒質２０の屈折率はｎ
₁、キャピラリーの材料２１の屈折率はｎ₂、キャピラリ
ー内部の媒質２２の屈折率はｎ₃である。キャピラリー
に入射する前のレーザビームと、キャピラリーを透過後
のレーザビームとがなす角を屈折角Δθとすると、Δθ
は図４から、（数１）で与えられる。なお、θ₁はキャ
ピラリー外部の媒質からキャピラリーへの入射角１１、
θ₂はキャピラリー外部の媒質からキャピラリーへの屈
折角１２、θ₃はキャピラリー材料からキャピラリー内
部の媒質への入射角１３、θ₄はキャピラリー材料から
キャピラリー内部の媒質への屈折角１４、θ₅はキャピ
ラリー内部の媒質からキャピラリー材料への入射角１
５、θ₆はキャピラリー内部の媒質からキャピラリー材
料への屈折角１６、θ₇はキャピラリー材料からキャピ
ラリー外部の媒質への入射角１７、θ₈はキャピラリー
材料からキャピラリー外部の媒質への屈折角１８であ
る。

【００２３】

【数１】 Δθ＝（θ₁−θ₂）＋（θ₃−θ₄）−（θ₅−θ₆）−（θ₇−θ₈） ＝２（θ₁−θ₂＋θ₃−θ₄） …（数１） ここでθ₁＝θ₈、θ₂＝θ₇、θ₃＝θ₆、θ₄＝θ₅の関係
を用いた。図４に示すレーザビーム２のたどる光路の幾
何学的関係、及び異なる媒質の界面におけるＳｎｅｌｌ
の法則を用いると、（数１）から（数５）が成立し、
（数６）を得る。

【００２４】

【数２】 ｓｉｎθ₁＝ｘ／Ｒ …（数２）

【００２５】

【数３】 ｓｉｎθ₁／ｓｉｎθ₂＝ｎ₂／ｎ₁ …（数３）

【００２６】

【数４】 ｓｉｎθ₂／ｓｉｎθ₃＝ｒ／Ｒ …（数４）

【００２７】

【数５】 ｓｉｎθ₃／ｓｉｎθ₄＝ｎ₃／ｎ₂ …（数５）

【００２８】

【数６】 Δθ＝２｛ｓｉｎ^-1（ｘ／Ｒ）−ｓｉｎ^-1（ｘｎ₁／（Ｒｎ₂）） ＋ｓｉｎ^-1（ｘｎ₁／（ｒｎ₂））−ｓｉｎ^-1（ｘｎ₁／（ｒｎ₃））｝ …（数６） （数６）で与えられるΔθの大きさが十分に小さけれ
ば、レーザ光強度の減衰をより少なくして、図１から図
３に示す構成により、複数のキャピラリーに対して、よ
り効率の良い同時レーザ照射を実現し、各キャピラリー
を泳動する試料成分を実質的に同時に励起することがで
きる。

【００２９】通常、キャピラリーへのレーザ照射は、レ
ーザをキャピラリーの内径程度に絞って行なう。通常の
場合、レーザ強度は、レーザビームの中心軸を対称軸と
したガウス分布になっている。即ち、レーザビームの中
心軸がキャピラリーの中心軸に入射した場合、複数のキ
ャピラリーの中心軸が配列する配列軸から垂直な方向
に、キャピラリーの内半径のほぼ半分の距離の位置で、
レーザ強度はほぼ、上記ガウス分布の半価幅を与える強
度となる。そこで、簡単のためキャピラリーの配列軸１
９より内半径ｒの１／２の距離だけ離れた位置に入射し
たレーザビーム（即ち、ｘ＝ｒ／２）のみに着目すると
（数６）は、

【００３０】

【数７】 │Δθ│＝（３６０／π）│ｓｉｎ^-1｛ｘ／（２Ｒ）｝ −ｓｉｎ^-1｛ｒｎ₁／（２Ｒｎ₂）｝＋ｓｉｎ^-1｛ｎ₁／（２ｎ₂）｝ −ｓｉｎ^-1｛ｎ₁／（２ｎ₃）｝│ …（数７） と表わせる。

【００３１】複数のキャピラリーの中を泳動する試料を
同時に励起するために、レーザビームが空間的にどの程
度広がるかを考える。はじめにレーザビームが入射する
１本目のキャピラリーから、Ｎ本先のキャピラリーの位
置で、キャピラリーの中心軸が配列する配列軸の方向と
垂直な方向への、レーザビームの変位は、近似的に、│
ＮＲΔθ│により、与えられる。Ｎ本目のキャピラリー
でのレーザ強度が、１本目のキャピラリーでのレーザ強
度の（１／１０）以上であることが、Ｎ本目のキャピラ
リーの中を泳動する試料を同時に励起するための、同時
励起条件であるとすると、この条件は上記の変位が、ｒ
／２の｛√（１０）−１｝倍以下であればよいと言い換
えることができる。即ち、（数８）が成立し、

【００３２】

【数８】 │ＮＲΔθ│≦｛√（１０）−１｝ｒ／２ …（数８） （数８）が、Ｎ本のキャピラリーの上記同時励起条件と
なる。

【００３３】ここで、同時に励起すべきキャピラリーの
本数を５本以上（Ｎ≧５）とする。キャピラリーの外形
と内径の比Ｒ／ｒは、通常Ｒ／ｒ≧２であることを考え
ると、（数８）は│Δθ│≦６．２°となり、（数７）
から上記同時励起条件は（数９）と表わすことができ
る。

【００３４】

【数９】 （３６０／π）│ｓｉｎ^-1｛ｒ／（２Ｒ）｝−ｓｉｎ^-1｛ｒｎ₁／（２Ｒｎ₂）｝ ｝ ＋ｓｉｎ^-1｛ｎ₁／（２ｎ₂）｝｝−ｓｉｎ^-1｛ｎ₁／（２ｎ₃）｝│≦６．２ ° …（数９） Ｎ本目のキャピラリーでのレザー強度が、１本目のキャ
ピラリーでのレザー強度の（１／２）以上であること
が、Ｎ本目のキャピラリーでの上記同時励起条件である
とすると、この条件は、（数８）と同様にして、（数１
０）となる。

【００３５】

【数１０】 │ＮＲΔθ│≦｛√（２）−１｝ｒ／２ …（数１０） Ｎ≧５、及びＲ／ｒ≧２を考慮して、│Δθ│≦１．２
°となり（数７）から、上記同時励起条件は（数１１）
と表わすことができる。

【００３６】

【数１１】 （３６０／π）│ｓｉｎ^-1｛ｒ／（２Ｒ）｝−ｓｉｎ^-1｛ｒｎ₁／（２Ｒｎ₂）｝ ｝ ＋ｓｉｎ^-1｛ｎ₁／（２ｎ₂）｝｝−ｓｉｎ^-1｛ｎ₁／（２ｎ₃）｝│≦１．２ ° …（数１１） 図５は、｜Δθ｜の変化を（数７）を用いて計算した結
果であり、キャピラリーの外半径Ｒ＝０．１ｍｍ、内半
径ｒ＝０．０５ｍｍ、キャピラリーの材料を石英（ｎ₂
＝１．４６）と仮定し、キャピラリーの外部の媒質を空
気（ｎ₁＝１．００）、水（ｎ₁＝１．３３）、及び石英
（ｎ₁＝１．４６）と仮定した場合の、キャピラリーの
外部の媒質の屈折率（ｎ₃）の変化に対する｜Δθ｜の
変化を、キャピラリーの外部の各媒質に関して示してい
る。アクリルアミドゲルの屈折率は１．３７程度である
と見積もられる。

【００３７】（第１の実施形態）の場合、ｎ₁＝１．０
０（空気）、ｎ₃＝１．３７（アクリルアミドゲル）で
あるから、（数７）から｜Δθ｜＝６．４８°と計算さ
る。図５の結果から、キャピラリー外部の媒質を水で満
たせば（ｎ₁＝１．３３）、｜Δθ｜＝１．２６°とな
り、キャピラリーに入射する前のレーザビームと、キャ
ピラリーを透過後のレーザビームとがなす屈折角Δθが
小さくなり、より多くのキャピラリーの中を泳動する試
料成分からの蛍光を同時計測できる。キャピラリー外部
の媒質をキャピラリーと同じ材料、即ち石英ガラス（ｎ
₁＝１．４６）で満たした場合を想定すると、｜Δθ｜
＝４．４０°となるので、キャピラリー外部の媒質を水
とするほうがより有利である。

【００３８】（数７）による解析から、屈折率が空気と
水の間の値をもつ媒質、具体的にはｎ₁＝１．２８なる
媒質でキャピラリー外部を満たすことができれば、最も
｜Δθ｜を小さくすることができるが、実際にはそのよ
うな媒質は通常存在し得ないので、上記の条件では、キ
ャピラリー外部を水で満たすのが最も良い。ここで更に
｜Δθ｜を小さくするためには、図５から、アクリルア
ミドゲルの屈折率をｎ₃＝１．３７からｎ₃＝１．４０に
上昇させてやれば良いことがわかる。（数７）でｎ₃＝
１．４０とすれば｜Δθ｜＝０．１０°となり、かなり
屈折が小さくなる。アクリルアミドゲルの屈折率を上昇
させる方法としては、例えばホルムアミド（屈折率１．
４５）を適当濃度混入させてやれば良い。ホルムアミド
はウレア同様変成剤であり、１０％程度の混入は電気泳
動の分解能を上昇させる効果があり、２０％以上の混入
は泳動速度を低下させてしまう欠点がある（Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１３、４８４−４８６（１９９
２））。もっともアクリルアミドゲルの屈折率を１．３
７から１．４０に上昇させるには、１０％程度のホルム
アミドの混入で十分である。

【００３９】図６は、図５の結果を得る際に仮定した条
件のうち、キャピラリーの外半径をＲ＝０．１ｍｍから
Ｒ＝０．２５ｍｍに変更した場合の、キャピラリーの外
部の媒質の屈折率（ｎ₃）の変化に対する｜Δθ｜の変
化を（数７）を用いて計算し、キャピラリーの外部の各
媒質に関して示している。図６と図５とを比較すると、
キャピラリーの内半径ｒはそのままにして外半径Ｒを
２．５倍に増大することで、ｎ₁＝１．００、ｎ₁＝１．
３３の場合の曲線が、右側にシフトしているのがわか
る。その結果、アクリルアミドゲルの屈折率ｎ₃＝１．
３７に対して、キャピラリー外部を空気（ｎ₁＝１．０
０）で満たしたとき、｜Δθ｜＝０．８７°と屈折が小
さくなり、より多数のキャピラリーの中を泳動する試料
成分からの蛍光を同時計測するに適当な条件であると判
断できる。

【００４０】図７は、キャピラリーの材料が屈折率ｎ₂
＝１．４６で、キャピラリー内部の媒質が屈折率ｎ₃＝
１．３７からなるアクリルアミドゲルであるとき、キャ
ピラリー外部の媒質を、空気（屈折率ｎ₁＝１．０
０）、仮想媒質（屈折率ｎ₁＝１．２８）、水（屈折率
ｎ₁＝１．３３）とした場合に、キャピラリーの外径２
Ｒと内径２ｒの比Ｒ／ｒに対する│Δθ│の変化を、
（数７）を使用して計算した結果を示す。キャピラリー
外部の媒質が空気（屈折率ｎ₁＝１．００）であると
き、Ｒ／ｒが約６．６のとき、│Δθ│は最小となり、
Ｒ／ｒの低下とともに│Δθ│は増大する。図５、図６
に示す結果と同様に、Ｒ／ｒ＝５では│Δθ│＝０．８
７°、Ｒ／ｒ＝２では│Δθ│＝６．４８°となり、Ｒ
／ｒ＝５の場合の方が、より多くのキャピラリーを同時
に照射するに適した条件である。

【００４１】キャピラリー外部の媒質が水（屈折率ｎ₁
＝１．３３）であるとき、Ｒ／ｒが約１．４のとき、│
Δθ│は最小となり、Ｒ／ｒの増加とともに│Δθ│は
増大する。通常利用できるキャピラリーでは、２≦Ｒ／
ｒ≦８であり、Ｒ／ｒ＝１．４を有するキャピラリーは
実際には使用できない。図５、図６に示す結果と同様
に、Ｒ／ｒ＝２では│Δθ│＝１．２６°、Ｒ／ｒ＝５
では│Δθ│＝２．８６°となり、Ｒ／ｒ＝２の場合の
方が、より多くのキャピラリーを同時に照射するに適し
た条件である。キャピラリー外部の媒質が仮想媒質（屈
折率ｎ₁＝１．２８）であるとき、Ｒ／ｒ＝２のとき、
│Δθ│は最小となるが、屈折率ｎ₁＝１．２８を有す
る媒質は、通常存在し得ないので、実際にはこのような
仮想媒質を使用ことはできない。

【００４２】図８は、図５の結果を得る際に仮定した条
件のうち、キャピラリーの外半径をＲ＝０．１ｍｍから
Ｒ＝０．１５ｍｍに、キャピラリーの材料の屈折率をｎ
₂＝１．４６からｎ₂＝１．６０に変更した場合の、キャ
ピラリーの外部の媒質の屈折率（ｎ₃）の変化に対する
｜Δθ｜の変化を（数７）を用いて計算し、キャピラリ
ーの外部の各媒質に関して示している。屈折率＝１．６
０をもつ材料には、（株）オハラより発売されているＰ
ＨＭ５３（ガラス品番）がある。図８の結果は図６の場
合と同様、アクリルアミドゲルの屈折率ｎ₃＝１．３７
に対して、キャピラリー外部を空気（ｎ₁＝１．００）
で満たしたとき、｜Δθ｜＝０．８４°と屈折が小さく
なり、より多数のキャピラリーの中を泳動する試料成分
からの蛍光を同時計測するに適当な条件であると判断で
きる。

【００４３】本実施形態では、５本のキャピラリーゲル
電気泳動によるＤＮＡ塩基配列決定を実施した。使用し
た装置は図２に示す装置の基本構成のうち、ガラス平面
板３の代わりに、蛍光計測用セル２５を使用する（図
９）。キャピラリーゲルは、長さ５０ｃｍ、外径０．２
ｍｍ（外半径、Ｒ＝０．１ｍｍ）、内径０．１ｍｍ（内
半径、ｒ＝０．０５ｍｍ）の溶融石英管（ｎ₂＝１．４
６）に、変性剤として７Ｍのウレアを含んだ４％Ｔ（Ｔ
ｏｔａｌ ｍｏｎｏｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏ
ｎ）、５％Ｃ（Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｍａｔｅｒ
ｉａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）の濃度のアクリ
ルアミドを注入した後、ゲル化させて調製した（ｎ₃＝
１．３７）。上記のＲ、ｒ、ｎ₁、ｎ₂、ｎ₃の値を（数
７）に代入すると、｜Δθ｜＝１．２６°となる。本実
施形態ではキャピラリーゲルによる屈折が十分小さく、
５本以上のキャピラリー中を泳動する試料成分から発す
る蛍光の同時計測に適した条件となっている。試料注入
側のキャピラリー末端から３０ｃｍの位置で、長さ１０
ｍｍにわたり、各キャピラリーのポリイミド被覆を除去
してレーザ照射部とした。図９のように、このキャピラ
リーゲル５本を、０．２ｍｍピッチに揃えて配列し、水
（ｎ₁＝１．３３）を満たした蛍光計測セル２５内に固
定した。但し、図９はキャピラリーゲルの蛍光計測セル
２５が配置される近傍のみを示した。

【００４４】図１０は、蛍光計測セル２５の部分のキャ
ピラリー軸に垂直な断面図を示す。この断面図におい
て、少なくとも、レーザビームが入射、出射する側の面
（全面、又は入射、出射する部分のみでも良い）、及び
キャピラリー中を泳動する試料成分から発する蛍光を検
出する側の面（全面、又は各キャピラリー中から蛍光を
検出する複数の部分のみでも良い）は透明な材料から構
成される。蛍光計測セル２５内には、各キャピラリーの
軸が平行に配置され、各キャピラリーの軸がほぼ同一面
となるように固定され、各キャピラリーの外部は水（ｎ
₁＝１．３３）で満たされている。（第１の実施形態）
で使用したと同様の２種のレーザを同軸にした後、ビー
ム径０．１ｍｍに絞り、蛍光計測セル２５の透明壁を介
して、各キャピラリーゲルの軸が配列する平面の側方よ
り入射させた。（第１の実施形態）では、蛍光の計測
は、キャピラリーゲルが配列する平面に対して垂直方向
からガラス平面板３を通して行なうのに対して、本実施
形態では、蛍光計測セル２５の透明な材料から構成され
る部分から蛍光の計測を行なう。この点を除けば、蛍光
の計測のための構成、条件、蛍光の計測の方法は、（第
１の実施形態）と全く同一である。さらに、使用した５
種のＤＮＡ試料、標識蛍光体、泳動開始点への試料の添
加を含む電気泳動条件等も、（第１の実施形態）と全く
同一である。このようにして、電気泳動を約３時間行な
い、２次元ＣＣＤカメラで得られた４種の蛍光に対応す
る４種の信号の時間変化をコンピュータで解析し、５種
の試料のＤＮＡ塩基配列を決定した。

【００４５】図１１は、本実施形態で得られたＤＮＡシ
ーケンス結果のうち、ＴｅｘａｓＲｅｄで標識されたＡ
成分の電気泳動パターンを示す。図１１は、泳動時間３
０分から６０分の範囲の電気泳動パターンを示し、プラ
イマーから約１３０塩基長までのＡ成分のパターンを示
している（分析した試料は５種ともに標準試料のＭ１３
ｍｐ１８である）。図１１の右欄に示す数字はキャピラ
リー番号を示し、番号１、２、３、４、５のキャピラリ
ー順にレーザビームが入射する。即ち、最上段のキャピ
ラリー１に、最初にレーザビームが入射し、次に次段の
キャピラリー２に、キャピラリー１を通過したレーザビ
ームが入射し、最後に、キャピラリー５に、キャピラリ
ー１から４を通過したレーザビームが入射する。図１１
は、レーザビームが最初に入射するキャピラリー１から
遠ざかるキャピラリーの順に、電気泳動パターンを示し
ている。ピーク強度は、キャピラリー１から遠ざかるに
従い減少しているが、これはキャピラリーによるレーザ
の屈折が完全にゼロではないために生じている。キャピ
ラリー５のピーク強度は、キャピラリー１の１／３以下
になっているが、それでも十分に高いＳ／Ｎ（塩基長９
１に相当する位置で、Ｓ／Ｎ＝７３４である）で泳動ピ
ーク検出が可能である。なお、キャピラリー１のピーク
におけるＳ／Ｎは、塩基長９１に相当する位置で、Ｓ／
Ｎ＝３３００である。

【００４６】他の蛍光体で標識された試料成分の電気泳
動パターンも同様に得られており、５本のキャピラリー
ゲルを使用する電気泳動により、断片を高感度に検出し
てＤＮＡ塩基配列決定を実現できた。なお、図１１で
は、縦軸はそれぞれ、キャピラリー１の所定の塩基長の
ピークを１として規格化した相対蛍光強度を表してお
り、各キャピラリーから得る泳動パターンが、厳密に相
似形を示していない理由は、各キャピラリーの長さが厳
密に同一でないこと、各キャピラリーに充填されるゲル
の濃度が厳密に同一でないことによる（後で説明する図
１３、図１４においても同様である）。

【００４７】（第３の実施形態）本実施形態は、（第２
の実施形態）において、キャピラリーの本数を１０本に
増やし、キャピラリーゲルを変性剤として７Ｍのウレア
を含んだ４％Ｔ（Ｔｏｔａｌ ｍｏｎｏｍｅｒ ｃｏｎ
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、５％Ｃ（Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ
ｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏ
ｎ）の濃度のアクリルアミドに１０％のホルムアミドを
添加して重合させて調製した実施形態である。キャピラ
リーゲルの組成を（第２の実施形態）と異ならせた結
果、アクリルアミドゲルの屈折率はｎ₃＝１．４０まで
上昇した。これら以外の実験条件は（第２の実施形態）
と全く同一とした。（数７）から、｜Δθ｜＝０．１０
°と計算され、以下に説明する（第４の実施形態）と同
様に、キャピラリーによる屈折がより小さくなり、泳動
する試料成分から発する蛍光を高感度に計測でき、１０
種の試料を１０本のキャピラリーゲルを使用する電気泳
動により、ＤＮＡ塩基配列決定を実現できた。

【００４８】（第４の実施形態）本実施形態は、空気中
にキャピラリーを配置した実施形態である。図１２は、
空気９中に配置される、ゲル８が充填される１０本のキ
ャピラリー１に、レーザビーム２を照射して蛍光を計測
する部分のキャピラリー軸に垂直な断面図を示す。使用
するキャピラリーは、外径を０．５ｍｍ（外半径、Ｒ＝
０．２５ｍｍ）、内径を０．１ｍｍ（内半径、ｒ＝０．
０５ｍｍ）とする溶融石英管（ｎ₂＝１．４６）とし、
１０本のキャピラリー１の配列は、図１２のようにガラ
ス平面板３上に０．５ｍｍピッチで、図３と同様にし
て、各キャピラリー軸を平行に配置し各キャピラリー軸
がほぼ同一面を成すように固定した。本実施形態では、
蛍光計測セルは使用せず、キャピラリー外部の媒質は空
気（ｎ₁＝１．００）とした。これら以外の実験条件は
（第２の実施形態）と全く同一とした。（数７）から、
｜Δθ｜＝０．８７°と計算され、キャピラリーによる
屈折が十分小さくなるので、この実験条件は、各キャピ
ラリーに照射されるレーザ光強度を大きく減衰させるこ
となしに、１０本以上のキャピラリー中を泳動する試料
成分から発する蛍光を、同時に励起できる条件である。
図１２に示すように、蛍光の検出は、ガラス平面板３の
側、あるいはガラス平面板３の反対側から行なう。

【００４９】図１３、図１４は本実施形態で得られたＤ
ＮＡシーケンス結果のうち、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄで標識
されたＡ成分の電気泳動パターンである。これは泳動時
間３０分から６０分の電気泳動パターンであり、プライ
マーから約１２０塩基長までのＡ成分のパターンを示し
ている（分析した試料は１０種ともに標準試料のＭ１３
ｍｐ１８である）。図１３、図１４の右欄の数字は、図
１１と同様にキャピラリー番号を示し、レーザビーム
は、各キャピラリーを、キャピラリー１、キャピラリー
２、…、キャピラリー１０の順に照射する。縦軸の相対
蛍光強度の意味は図１１と同じである。レーザビーム
は、最初にキャピラリー１に照射され、次いでキャピラ
リー１を通過したレーザビームがキャピラリー２に照射
され、…、キャピラリー１からキャピラリー９を通過し
たレーザビームがキャピラリー１０に照射される。図１
３、図１４は、レーザビームが最初に照射されるキャピ
ラリー１から遠ざかるキャピラリー２、３、…、１０か
ら得られる電気泳動パターンを示しており、１０本のキ
ャピラリーとも十分なＳ／Ｎ（塩基長９１を与えるピー
クにおいてＳ／Ｎは、キャピラリー１で２３７、キャピ
ラリー４で２３７、キャピラリー７で１１０、キャピラ
リー１０で１４２でありる（キャピラリー１０でのＳ／
Ｎがキャピラリー７でのＳ／Ｎより大きいのは、測定の
ばらつきと考えられる））で蛍光を計測できた。他の蛍
光体で標識された試料成分の電気泳動パターンも図１
３、図１４同様に得られており、１０本のキャピラリー
ゲルを使用する電気泳動により、泳動する試料成分から
発する蛍光を高感度に計測でき、ＤＮＡ塩基配列決定を
実現できた。

【００５０】（第５の実施形態）本実施形態では（第４
の実施形態）において、使用するキャピラリーの外径を
０．３ｍｍ（外半径、Ｒ＝０．１５ｍｍ）、内径を０．
１ｍｍ（内半径、ｒ＝０．０５ｍｍ）とし、キャピラリ
ーの材料の屈折率はｎ₂＝１．６０である。具体的には
キャピラリーの材料として、（株）オハラより発売され
ているＰＨＭ５３（ｎ₂＝１．６０）を用いた。これら
以外の実験条件は、（第４の実施形態）と全く同一とし
た。（数７）から、｜Δθ｜＝０．８４°と計算され、
（第４の実施形態）における｜Δθ｜＝０．８７°より
もキャピラリーによる屈折がより小さくなる。従って、
レーザビームにより１０本のキャピラリー中を泳動する
試料成分を実質的に同時に励起でき、１０種の試料を１
本のキャピラリーゲルを使用する電気泳動により、泳動
する試料成分から発する蛍光を高感度に計測でき、ＤＮ
Ａ塩基配列決定を実現できた。

【００５１】（第６の実施形態）本実施形態では、図１
５に示すように、使用するキャピラリーは２種のキャピ
ラリーから構成され、各キャピラリーは異なる径寸法を
有している。使用するキャピラリー１０本はそれぞれ、
電気泳動分離部分では、外径０．２ｍｍ（外半径、Ｒ＝
０．１ｍｍ）、内径０．１ｍｍ（内半径、ｒ＝０．０５
ｍｍ）の寸法を有するキャピラリー（分離用キャピラリ
ー２７）、レーザビーム２を照射して蛍光を計測する部
分では、外径０．５ｍｍ（外半径、Ｒ＝０．２５ｍ
ｍ）、内径０．１ｍｍ（内半径、ｒ＝０．０５ｍｍ）の
寸法を有するキャピラリー（計測キャピラリー２８）か
ら構成される。図１５に示すように、分離用キャピラリ
ー２７と計測用キャピラリー２８とを接続させて、図
３、図１２と同様にして、ガラス平面上に０．５ｍｍピ
ッチで、計測キャピラリー２８の軸を平行に保ち、各計
測キャピラリー２８の軸が平面を成すように、ガラス平
面板上に配列固定した。この時、１０組の対向する分離
用キャピラリーと計測用キャピラリーの中心軸がそれぞ
れ一致するようにした。両キャピラリーの材料はいずれ
も石英（ｎ₂＝１．４６）であり、接続面は、予め研磨
してフラットにした。

【００５２】両キャピラリーには、変性剤として７Ｍの
ウレアを含んだ４％Ｔ（Ｔｏｔａｌｍｏｎｏｍｅｒ ｃ
ｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、５％Ｃ（Ｃｒｏｓｓｌｉ
ｎｋｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔ
ｉｏｎ）の濃度のアクリルアミドを注入した後ゲル化さ
せた。キャピラリーの接続部分は電気的に断線しないよ
うに緩衝液に浸し、分離用キャピラリーを泳動し分離し
た試料成分が、そのまま対向する計測用キャピラリーを
泳動するようにした。

【００５３】分離用キャピラリーは長さ２５ｃｍ、計測
用キャピラリーは長さ１５ｃｍとした。但し、図１５に
は両キャピラリーの接続部分付近のみを記した。分離用
キャピラリーと計測用キャピラリーの接続位置から５ｃ
ｍの位置で、長さ１０ｍｍにわたり計測用キャピラリー
のポリイミド被覆を予め除去して、この位置に図１５に
示したように、レーザビーム２を照射した。この時、泳
動距離は（２５＋５）ｃｍ＝３０ｃｍとなる。これら以
外の実験条件は（第４の実施形態）と全く同一とした。
即ち、本実施形態での装置構成条件は、レーザのキャピ
ラリーによる屈折は十分に小さくして、各キャピラリー
に照射されるレーザ光強度を大きく減衰させることなし
に、１０本のキャピラリーを泳動する試料成分を実質的
に同時に励起できる条件であり、１０種の試料を１０本
のキャピラリーゲルを使用する電気泳動により、泳動す
る試料成分から発する蛍光を高感度に計測でき、ＤＮＡ
塩基配列決定を実現できた。なお、図１５に図示してい
ないが、蛍光の検出は、ガラス平面板の側、もしくはガ
ラス平面板の反対側より行なう。

【００５４】一般にキャピラリーの価格は、外径が大き
く内径が小さいほど、即ち、肉厚になるほどガラスの体
積にほぼ比例して高価になる。即ち、本実施形態で用い
た分離用キャピラリーと計測用キャピラリーの単位長さ
当たりの価格は、後者のほうが８倍も高い。本実施形態
では、分離用キャピラリーと計測用キャピラリーの脱着
が可能なので、１つの試料に関する計測終了後に分離用
キャピラリーのみを交換して、次の試料に関する計測を
でき、コストを低減できる。このことは本実施形態のも
う一つの効果である。

【００５５】本実施形態で使用した、図１５に示す各キ
ャピラリーが異なる径寸法をもつ２種のキャピラリーか
ら構成されるキャピラリーを、図１０で説明した（第２
の実施形態）に適用しても、本実施形態とほぼ同様の結
果が得られることは言うまでもない。

【００５６】（第７の実施形態）以上（第１の実施形
態）から（第６の実施形態）では、平面状に配列された
キャピラリーゲルの成す平面に平行に、１方向から各キ
ャピラリー軸を通るようにレーザビームを照射する構成
について説明したが、（第１の実施形態）から（第６の
実施形態）において、図１６に示すように、２方向から
各キャピラリー軸を通るようにレーザビームを照射する
構成としても良い。図１６（ａ）の構成は、レーザビー
ム２（単一波長のレーザ光、又は複数のレーザ光源から
の複数波長のレーザ光を混合して同軸にしたレーザ光で
も良い）を、半透明鏡２９、及び３０−１、３０−２、
３０−３により、分岐させて２方向から各キャピラリー
軸を通るようにレーザビームを照射する構成である。図
１６（ｂ）の構成は、２つのレーザビーム２−１、２−
２を、対向する２方向から複数のキャピラリーに照射す
るする構成であり、レーザビーム２−１、２−２はそれ
ぞれ単一波長のレーザ光、又は複数のレーザ光源からの
複数波長のレーザ光を混合して同軸にしたレーザ光でも
良い。図１６（ａ）、（ｂ）の構成では、（第１の実施
形態）から（第６の実施形態）において、各キャピラリ
ーに照射されるレーザ光の強度の不均一を、改善してよ
り一様な強度のレーザ光を各キャピラリーに照射するこ
とができる。この結果、より多数の本数を使用するキャ
ピラリーアレイ電気泳動が可能となる。なお、図１６
（ａ）の構成では、分岐させて２方向から各キャピラリ
ー軸を通るようにレーザビームを照射するため、レーザ
光照射強度が減少するので、高出力のレーザ光源の使用
が望ましい。更に、（第１の実施形態）から（第６の実
施形態）に、図１６（ｂ）の構成を適用する際に、レー
ザビーム２−１が含む単数、又複数のレーザ光の波長
と、レーザビーム２−２が含む単数、又複数のレーザ光
の波長とが、同一となるように構成されても、異なるよ
うに構成されてもいずれでも構わない。

【００５７】（第８の実施形態）以上（第１の実施形
態）から（第７の実施形態）では、全てアクリルアミド
ゲルを用いたが、もちろんこれ以外の分離用媒体を用い
ても良い。分離媒体として交換可能なものを用いて、キ
ャピラリーそのものは再利用しても良い。但し、それぞ
れ分離媒体の屈折率に応じて、例えば、（数７）に基づ
いて各媒質の屈折率、キャピラリーの径寸法の最適化を
行なうことが、複数のキャピラリー中を泳動する試料成
分から発する蛍光を高感度に効率的に同時計測する場合
に重要である。また（数７）から、｜Δθ｜はキャピラ
リーの外径２Ｒ、内径２ｒそれぞれ単独で決まるのでは
なく、｜Δθ｜は外径と内径の比Ｒ／ｒで決定される。
従って、以上に示した各実施形態について、異なる外径
２Ｒ、内径２ｒのキャピラリーを用いた場合でも、外径
と内径の比（Ｒ／ｒ）が等しければ、ほぼ同様の効果を
得ることができる。

【００５８】（第９の実施形態）以上（第１の実施形
態）から（第８の実施形態）では、複数のキャピラリー
ゲルを使用したが、単一のキャピラリーゲルを使用して
も良いことは言うまでもない。単一のキャピラリーゲル
を使用する場合にも、（数７）により与えれるキャピラ
リーゲルによる、レーザビームの屈折｜Δθ｜を最小化
して、試料成分が泳動するゲルにレーザビームを照射し
て、効率良く試料成分からの蛍光を検出することができ
る。

【００５９】最後に簡単に本発明を要約すると、キャピ
ラリーアレイ電気泳動装置において、キャピラリーアレ
イ又はレーザ光のスキャンを行なうことなく、複数のキ
ャピラリーにレーザ光を実質的に同時に照射して、各キ
ャピラリー中を泳動する試料成分から発する蛍光を実質
的に同時に検出し、オンカラム蛍光計測を行なう。即
ち、複数のキャピラリーを一平面上に配列させ、配列平
面の１つ又は２つの側方よりレーザを、配列平面に平行
に照射する。キャピラリーの外半径、内半径、キャピラ
リー外部の媒質の屈折率、キャピラリーの材料の屈折
率、キャピラリー内部の媒質の屈折率の間に所定の関係
を満足させて、レーザのキャピラリーによる屈折を十分
に小さくし、全てのキャピラリーに十分な強度のレーザ
光を照射することにより、高感度、高速、高スループッ
トが簡便に実現する。

【００６０】

【発明の効果】本発明によれば、キャピラリーアレイ電
気泳動装置において、キャピラリーアレイ又はレーザ光
のスキャンを行なうことなく、複数のキャピラリーにレ
ーザ光を実質的に同時に照射して、各キャピラリー中を
泳動する試料成分から発する蛍光を実質的に同時に検出
し、高感度、高速、高スループットな分析を簡便に達成
できるオンカラム蛍光計測を実現できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施形態であり、同一平面上に配列
される複数のキャピラリーにこの平面と平行で、試料成
分の泳動方向とほぼ直交する方向からレーザを照射する
キャピラリーアレイ電気泳動装置の主要部分を示す、
（ａ）複数のキャピラリーアレイの平面図、（ｂ）その
断面図。

【図２】本発明の第１の実施形態であり、５本のキャピ
ラリーゲルを使用する電気泳動によるＤＮＡ塩基配列決
定のための装置の基本構成を示す図。

【図３】本発明の第１の実施形態であり、キャピラリー
ゲルを取り巻く媒質を空気とする蛍光計測部分のキャピ
ラリー軸に垂直な断面図。

【図４】本発明の第２の実施形態であり、外半径Ｒ、内
半径ｒをもつキャピラリー断面図であり、キャピラリー
の軸から、距離ｘだけ離れた位置に入射した無限小幅の
レーザビームの１本のキャピラリーによる屈折の様子を
示す図。

【図５】本発明の第２の実施形態であり、キャピラリー
の外半径、内半径、キャピラリー材料の屈折率、ゲルの
屈折率、及びキャピラリーの外部の媒質の屈折率と、キ
ャピラリーゲルによるレーザ光の屈折の大きさ｜Δθ｜
との関係−１を示す図。

【図６】図５の結果を得る際に仮定した条件のうち、キ
ャピラリーの外半径を変更した場合の、キャピラリーの
外部の媒質の屈折率の変化に対する｜Δθ｜の変化を、
キャピラリーの外部の各媒質に関して示す図。

【図７】キャピラリーの外半径と内半径の比、及びキャ
ピラリーの外部の媒質の屈折率を変更した場合の｜Δθ
｜の変化を示す図。

【図８】図５の結果を得る際に仮定した条件のうち、キ
ャピラリーの外半径、及びキャピラリーの材料の屈折率
を変更した場合の、キャピラリーの外部の媒質の屈折率
の変化に対する｜Δθ｜の変化を、キャピラリーの外部
の各媒質に関して示す図。

【図９】本発明の第２の実施形態であり、図２に示す装
置の基本構成のうち、ガラス平面板の代わりに、蛍光計
測用セルを使用するキャピラリーゲル電気泳動装置の構
成を示す図。

【図１０】図９の蛍光計測セルの部分のキャピラリー軸
に垂直な断面図。

【図１１】本発明の第２の実施形態で得られたＤＮＡシ
ーケンス結果のうち、ＴｅｘａｓＲｅｄで標識されたＡ
成分の電気泳動パターンを示す図。

【図１２】本発明の第４の実施形態であり、空気中に配
置される、ゲルが充填される１０本のキャピラリーに、
レーザビームを照射して蛍光を計測する部分のキャピラ
リー軸に垂直な断面図。

【図１３】本発明の第４の実施形態において、得られた
ＤＮＡシーケンス結果のうち、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄで標
識されたＡ成分の電気泳動パターンを示す図。

【図１４】本発明の第４の実施形態において、得られた
ＤＮＡシーケンス結果のうち、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄで標
識されたＡ成分の電気泳動パターンを示す図。

【図１５】本発明の第６の実施形態であり、各キャピラ
リーが異なる径寸法をもつ２本のキャピラリーから構成
されるキャピラリーを使用するキャピラリー電気泳動装
置のレーザ照射部位を示す図。

【図１６】本発明の第７の実施形態であり、２方向から
各キャピラリー軸を通るようにレーザビームを照射する
構成を示し、（ａ）はレーザビームを半透明鏡によりレ
ーザビームを分岐させて２方向から各キャピラリー軸を
通るように照射する構成、（ｂ）は２つのレーザビーム
を、対向する２方向から複数のキャピラリーに照射する
構成を示す図。

【符号の説明】 １…キャピラリー、２、２−１、２−２…レーザ光、３
…ガラス平面板、４…第１レンズ、５…像分割プリズム
及び組み合わせフィルター、６…第２レンズ、７…２次
元ＣＣＤカメラ、８…アクリルアミドゲル、９…空気、
１０…入射レーザのキャピラリー軸からのずれの距離
（ｘ）、１１…キャピラリー外部の媒質からキャピラリ
ーへの入射角（θ₁）、１２…キャピラリー外部の媒質
からキャピラリーへの屈折角（θ₂）、１３…キャピラ
リー材料からキャピラリー内部の媒質への入射角
（θ₃）、１４…キャピラリー材料からキャピラリー内
部の媒質への屈折角（θ₄）、１５…キャピラリー内部
の媒質からキャピラリー材料への入射角（θ₅）、１６
…キャピラリー内部の媒質からキャピラリー材料への屈
折角（θ₆）、１７…キャピラリー材料からキャピラリ
ー外部の媒質への入射角（θ₇）、１８…キャピラリー
材料からキャピラリー外部の媒質への屈折角（θ₈）、
１９…各キャピラリーの軸が配列するキャピラリー配列
軸、２０…キャピラリー外部の媒質の屈折率（ｎ₁）、
２１…キャピラリー材料の屈折率（ｎ₂）、２２…キャ
ピラリー内部の媒質の屈折率（ｎ₃）、２３…キャピラ
リーの外半径、２４…キャピラリーの内半径、２５…蛍
光計測用セル、２６…水、２７…分離用キャピラリー、
２８…計測用キャピラリー、２９−１、２９−２、２９
−３、２９−４…半透明鏡。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 神原 秀記 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内 Ｆターム(参考） 2G043 BA16 CA03 EA01 EA19 FA06 GA07 GB01 GB02 GB16 HA01 HA08 JA02 KA02 KA05 KA09 LA03 NA01 4B029 AA07 AA23 BB15 BB20 CC01 FA12 FA15

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】少なくとも一部が平面状に配列される複数
   のキャピラリーと、平面状に配列される前記複数のキャ
   ピラリーの各軸のなす平面に平行な方向から前記各キャ
   ピラリーの透明部分にレーザを照射する手段と、前記各
   キャピラリーを泳動する試料の成分から発する蛍光を検
   出する手段とを有し、前記レーザが通過する前記各キャ
   ピラリーの外半径をＲ、内半径をｒ、屈折率をｎ_２と
   し、前記レーザが通過する前記各キャピラリーの外部の
   媒質の屈折率をｎ_１とし、前記レーザが通過する前記各
   キャピラリーの内部の媒質の屈折率をｎ_３とするとき、 （３６０／π）｜ｓｉｎ^−１｛ｒ／（２Ｒ）｝−ｓｉｎ
   ^−１｛ｒｎ_１／（２Ｒｎ _２）｝＋ｓｉｎ^−１｛ｎ_１／
   （２ｎ_２）｝−ｓｉｎ^−１｛ｎ_１／（２ｎ_３）｝｜≦
   ６．２° なる関係を満たすことを特徴とするキャピラリーアレイ
   電気泳動装置。
2. 【請求項２】少なくとも一部が平面状に配列される複数
   のキャピラリーと、平面状に配列される前記複数のキャ
   ピラリーの各軸のなす平面に平行な方向から前記各キャ
   ピラリーの透明部分にレーザを照射する手段と、前記各
   キャピラリーを泳動する試料の成分から発する蛍光を検
   出する手段とを有し、前記レーザが通過する前記各キャ
   ピラリーの外半径をＲ、内半径をｒ、屈折率をｎ_２と
   し、前記レーザが通過する前記各キャピラリーの外部の
   媒質の屈折率をｎ_１とし、前記レーザが通過する前記各
   キャピラリーの内部の媒質の屈折率をｎ_３とするとき、 （３６０／π）｜ｓｉｎ^−１｛ｒ／（２Ｒ）｝−ｓｉｎ
   ^−１｛ｒｎ_１／（２Ｒｎ _２）｝＋ｓｉｎ^−１｛ｎ_１／
   （２ｎ_２）｝−ｓｉｎ^−１｛ｎ_１／（２ｎ_３）｝｜≦
   １．２° なる関係を満たすことを特徴とするキャピラリーアレイ
   電気泳動装置。
3. 【請求項３】前記レーザが通過する前記キャピラリーの
   外部の媒質が、空気であることを特徴とする請求項１ま
   たは２に記載のキャピラリーアレイ電気泳動装置。
4. 【請求項４】前記レーザが通過する前記キャピラリーの
   外部の媒質は、その屈折率が1.00から1.33の範囲にある
   ことを特徴とする請求項１または２に記載のキャピラリ
   ーアレイ電気泳動装置。
5. 【請求項５】前記レーザが通過する前記キャピラリーの
   外部の媒質は、その屈折率が1.28であることを特徴とす
   る請求項１または２に記載のキャピラリーアレイ電気泳
   動装置。