JP2003247981A - 蛍光検出型キャピラリーアレー電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 多色蛍光体を用いたキャピラリーアレー電気
泳動装置において、キャピラリーアレーを構成する各キ
ャピラリー端の平面性向上、及び励起用レーザ光を重畳
することによる光量半減や背景光重畳による感度低下を
防止する。 【解決手段】 ゲル充填キャピラリーアレー１の溶出端
を光学セル６の内壁で挟むことによって、あるいはゲル
充填キャピラリーアレー１の溶出端付近を平板１８上に
保持することによって、十分な精度で同一平面内に保持
する。波長特性の異なる複数の励起光を照射する場合に
は、各励起光４０，４１の照射位置をゲル充填キャピラ
リー１の溶出端から異なる距離とすることで、レーザ光
を重畳した場合のレーザ光の減衰、背景光の上昇、ノイ
ズの増大を回避する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、レーザ誘起蛍光法
を用いたＤＮＡ等生体物質分析用キャピラリーアレー電
気泳動装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ゲノム計画の進展に伴い、大量のＤＮＡ
塩基配列決定が課題となっている。ＤＮＡの塩基配列決
定にはラジオアイソトープ標識を用いたオートラジオグ
ラフィーが用いられていた。最近、これに代わって蛍光
標識を用いた自動ＤＮＡ塩基配列決定装置、すなわちＤ
ＮＡシーケンサが開発され用いられている。

【０００３】ＤＮＡシーケンサは、ＤＮＡを構成する４
つの塩基Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔの配列を決定する装置である。
その原理は、ＤＮＡ試料の末端の４つの塩基各々に対応
させた蛍光体でＤＮＡを標識し、標識されたＤＮＡ試料
をゲル中で電気泳動して分離し、分離したＤＮＡ試料を
レーザ光で照射し、レーザ光によって試料中の蛍光標識
を励起し、この励起による発光を計測し、その発光波長
から末端塩基種を短いＤＮＡから順次判別し、その順番
から配列を決定する、という手順を踏むものである。こ
のＤＮＡシーケンサで一度に配列決定できる試料数は２
４〜３６サンプルで、４００〜５００塩基の決定に８〜
１０時間を必要としている。そこでより大容量の処理能
力を持ったＤＮＡシーケンサの開発が望まれている。

【０００４】ＤＮＡ試料を大量に処理するには、電気泳
動の速度を速くすること、電気泳動のレーンを多くする
こと、同一レーンに複数のＤＮＡ試料を電気泳動するこ
と等が有効である。電気泳動の速度を速くするには印加
電圧を高くすれば良い。しかし、電圧が高くなるとジュ
ール熱の発生も大きくなるので、放熱効率を上げなけれ
ばならない。板ゲルではゲルを薄くすることで放熱効率
を上げているが限界がある。一方、毛細管にゲルを充填
して用いるキャピラリーゲルは径が０.０５〜０.１ｍｍ
と細く、その形状から放熱効率が高いためジュール熱に
よる温度上昇を招くことなく高電界をかけることができ
るので、電気泳動の速度を速くするのに向いている（An
al. Chem. 62, 900-903, 1990）。そこで高スループッ
トを実現するためにキャピラリーを多数本並べた装置が
考案されている（Nature 359,167, 1992; Nature 361,
565, 1993）。

【０００５】キャピラリーを多数本並べたキャピラリー
アレーを用いて計測を行うためには、多数のキャピラリ
ーを同時に光照射し、発する蛍光を受光検出する必要が
あるが、有力な方法にシースフローを用いる方式があ
る。すなわち多数のゲル充填キャピラリーを分析部とし
て用いるが、その端部をバッファー液中に入れ、溶出し
てくるＤＮＡ断片に光を照射して蛍光を検出する。ゲル
から溶出するＤＮＡ断片が拡散で広がり分離能等を低下
させないように、ゲル端部近傍にはバッファー液による
シースフローが形成されている。この方式を用いると一
度に１００サンプルも解析でき、計測に要する時間も２
時間程度であり、大きなスループットが得られる。

【０００６】ＤＮＡ断片に光照射する励起光源には通常
Ａｒ⁺ レーザ光（４８８ｎｍ）が多く用いられるが、蛍
光極大波長が互いに異なる（従って最適励起波長も異な
る）４種類の蛍光体を１種類のレーザ光で励起すると、
最適励起波長がレーザ波長から離れた蛍光体は励起効率
が低くなり高い感度が得られない。そこで２種類のレー
ザ光を用いて、各レーザ光に対応する比較的励起効率の
高い２組の蛍光体をそれぞれ励起することが有利であ
る。例えば、Ａｒ⁺ レーザ光でＦＩＴＣ（fluoresceine
-5-isothiocyonate 発光極大波長５１５ｎｍ）及びＦＩ
ＴＣ−Ｃｌ２（dichloro-ＦＩＴＣ 発光極大波長５２
９ｎｍ）等を励起し、Ｈｅ−Ｎｅレーザ光（５９４ｎ
ｍ）でＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）（Sulforhodami
ne 101 発光極大波長６０７ｎｍ）あるいはＣｙ−５
（登録商標）（発光波長６６７ｎｍ）等を励起する。も
ちろん１つのレーザ光で３種類の蛍光体を効率良く励起
できる場合もあり、この限りではない。１つのレーザ光
で３種類の蛍光体を励起する例としては、Ａｒ⁺ レーザ
光でＦＩＴＣを励起し、ＹＡＧレーザ光（５３２ｎｍ）
で３種類の蛍光体ＪＯＥ（登録商標）（発光極大波長５
５５ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（登録商標）（Tetra Methil R
hodamine 発光波長５８５ｎｍ）、ＲＯＸ（登録商標）
（Rhodamine X 発光極大波長６１５ｎｍ）を励起する場
合がある。

【０００７】これら多数の蛍光体を２種類のレーザ光で
励起するために、２つのレーザ光を重畳して平面状に並
んだキャピラリー端部近傍をキャピラリーアレー面に沿
って泳動路照射を行う。このようにして同時に照射され
た多数のＤＮＡ断片から発する蛍光を分光受光して、Ｄ
ＮＡ断片の末端塩基種を判別し、その順序から塩基配列
決定を行なう。この種の装置は、ＤＮＡシーケンサーと
しての用途以外に、蛍光標識された生体関連物質の分析
に幅広く活用できるものである。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】キャピラリーアレーの
光照射方法には、レーザ光をスキャンして１本１本のキ
ャピラリーを順次照射する方法と、並べたキャピラリー
を横から同時に照射する方法がある。後者の方がレーザ
光を有効に使える利点があるが、照射される部位近傍に
おかれるキャピラリーアレーを構成する各キャピラリー
端を同一平面に保つことが必要である。しかし、キャピ
ラリーが柔らかいため、先端をフリーの状態にして平面
に保つのは難しかった。この結果、レーザ光照射部から
はずれたところをＤＮＡ断片が通過し、計測ミスをする
ことがしばしば起こった。

【０００９】また、複数のレーザ光を用いる場合レーザ
光を重畳させて用いるが、これは異なるレーザ光で励起
される蛍光体で標識されたＤＮＡのフェログラムを比較
して厳密な解析をする場合に必要である。この場合、励
起用レーザ光はハーフミラーを用いて重畳するが、光量
がこれにより半減してしまう上、両励起光に起因する背
景光がやはり重畳されて大きくなり、高い検出感度が得
にくい難点があった。

【００１０】本発明は、これら従来技術の問題点に鑑み
てなされたものであり、光学系に対してキャピラリーア
レーが高精度に位置決めされたキャピラリーアレー電気
泳動装置を提供することを目的とする。本発明はまた、
背景光信号強度が小さく高感度な電気泳動装置を提供す
ることを目的とする。本発明はまた、均一なシースフロ
ーを流すことのできるキャピラリーアレー電気泳動装置
を提供することを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明においては、ゲル
充填キャピラリーアレーの溶出端を２枚の平板で挟むこ
とによって十分な精度で同一平面内に保持する。２枚の
平板は光学セルの内壁とすることができ、ゲル充填キャ
ピラリーアレーの溶出端を光学セルの内壁で挟む操作
は、ゲル充填キャピラリーの外径にほぼ等しい寸法を有
する光学セルの内壁間隙にゲル充填キャピラリーアレー
の溶出端を挿入することによって行うことができる。あ
るいは光学セル内に可動平板を設け、光学セルの内壁と
この可動平板によってゲル充填キャピラリーアレーの溶
出端を挟んでもよい。また、ゲル充填キャピラリーアレ
ーの溶出端付近を平板上に固定して保持することによっ
ても、十分な精度で同一平面内に保持することができ
る。

【００１２】ゲル充填キャピラリーアレーの溶出端を同
一平面内に保持することにより、ゲル充填キャピラリー
アレーが並ぶ方向と同一平面方向からレーザ光を照射す
る測定法での測定精度を向上することができる。蛍光を
励起するための光照射位置はゲル充填キャピラリーの溶
出端より下流側に設定し、ゲル充填キャピラリーから溶
出したＤＮＡ断片は緩衝液等からなるシース液の流れ、
すなわちシースフローで光照射位置まで運搬することが
できる。このとき、ゲル充填キャピラリーとシース液の
流れる通路を交互に並べて配置すると、均一で安定した
シースフローを形成することができる。シース液通路
は、ゲル充填キャピラリーに接して交互に並べた中空キ
ャピラリーによって実現してもよい。

【００１３】波長特性の異なる複数の励起光を使用する
場合には、各励起光の照射位置をゲル充填キャピラリー
の溶出端から異なる距離とする。このことにより、レー
ザ光を重畳した場合のレーザ光の減衰、背景光の上昇、
ノイズの増大を回避することができる。そのため計測に
使用できるダイナミックレンジを広く取ることができ、
Ｓ／Ｎの低下がない。なお、シースフロー中でのＤＮＡ
試料の移動速度は電界ではなくシースフローの速度で決
まり、ＤＮＡ試料は塩基長によらず常に一定時間で複数
の光照射位置の間を移動する。このため励起光の照射位
置の相違による蛍光発生タイミングのずれを補正して、
シーケンスパターンの比較を行うのは容易である。

【００１４】また、光学セル内をキャピラリー材料やキ
ャピラリー内物質と同程度の屈折率を有する物質で満た
すことにより、シースフローを使わずにキャピラリーに
光照射して計測を行う場合にも光散乱や屈折を抑制して
高精度な測定を行うことができる。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、図面を用いて本発明の実施
の形態を詳細に説明する。 〔実施の形態１〕図１は、本発明によるマルチキャピラ
リーＤＮＡシーケンサの全体構成の一例を示す図であ
る。マルチキャピラリーＤＮＡシーケンサは、ゲル充填
キャピラリー１、緩衝液槽２、上部電極槽３、下部電極
槽４、電源５、光学セル６、中空キャピラリー７、ミラ
ー８，９、レーザ光源１０，１１、レンズ１２，１３、
蛍光用フィルタ１４、像分割プリズム１５、蛍光検出器
１６、コンピュータ１７からなり、計測部にシースフロ
ーを形成し、２本のレーザ光４０，４１でシースフロー
部の異なる位置を照射する。

【００１６】各ゲル充填キャピラリー１は、試料注入端
を図示しない試料容器中の試料に浸漬して電圧を印加す
ることでＤＮＡ試料を電界注入し、そののち試料注入端
を上部電極槽３に挿入する。次いで、電源５を動作させ
て上部電極槽３と下部電極槽４の間に電圧を印加するこ
とで、電界注入されたＤＮＡ試料はゲル充填キャピラリ
ー１中を電気泳動して分離される。緩衝液は、緩衝液槽
２から送られて光学セル６中を満たし、下部の中空キャ
ピラリー７へと流入し、下部電極槽４へ排出される。分
離されたＤＮＡ試料がこの光学セル６を通過するとき、
ミラー８及びミラー９により誘導されてきたレーザ光４
０，４１の照射により、試料を標識している蛍光体が励
起され蛍光を発する。この蛍光発光は、集光レンズ１
２、垂直方向に並べられた複数枚の蛍光用フィルター１
４、各蛍光毎に像を分ける像分割プリズム１５及び結像
レンズ１３を通り、蛍光検出器１６に到達し検出され
る。

【００１７】蛍光検出器１６は冷却ＣＣＤカメラ等の２
次元撮像装置からなる。蛍光用フィルター１４は、図の
例では４種類の蛍光体の蛍光波長を各々分離して透過さ
せる４枚のフィルターからなり、蛍光用フィルター１４
によって分離された４種類の蛍光体の像は、像分離プリ
ズム１５及び結像レンズ１３によって２次元撮像装置の
撮像面に上下方向に分離して結像される。蛍光検出器１
６によって検出された信号はコンピュータ１７へ送られ
て解析され、試料の塩基配列が決定される。

【００１８】図２は光学セル６の部分の詳細説明図、図
３はその側断面図である。緩衝液で満たされた光学セル
６の前後の無蛍光透明ガラス板６ａ，６ｂの間隔は０.
２２ｍｍであり、この間隙に上から外径０.２ｍｍのゲ
ル充填キャピラリー１が挿入されている。ゲル充填キャ
ピラリー１は、平板１８上に例えば０.４ｍｍピッチで
アレー状に接着されて保持されており、各ゲル充填キャ
ピラリー１に対向して中空キャピラリー７が下部に配置
されている。平面状に整列したゲル充填キャピラリー１
と中空キャピラリー７との間隔は約５ｍｍであり、この
間隙を平行な２本のレーザ光４０，４１が通過してい
る。このように、ゲル充填キャピラリー１の先端はキャ
ピラリーの外径程度のガラス間隙に保持されているた
め、十分な精度で同一平面内に保持される。なお、光学
セル６は、少なくともレーザ光の入射領域及び蛍光取り
出し領域が透明であればよく、必ずしも全部の壁面を透
明部材で作製する必要はない。

【００１９】図３に示すように、光学セル６の上方には
緩衝液容器５０が設けられ、緩衝液槽２から送られてき
た緩衝液は緩衝液容器５０に入ったのち光学セル中を上
から下へ流れる。なお、緩衝液容器５０の側壁には案内
溝を有するガイド部材５１ａ，５１ｂが取り付けられて
おり、多数本のゲル充填キャピラリー１を保持した平板
１８の端部をガイド部材５１ａ，５１ｂの案内溝に挿入
することによって、平面状に揃えられたゲル充填キャピ
ラリー１の先端が光学セル６中の所定位置に配置され
る。

【００２０】ゲル充填キャピラリー１で分離されたＤＮ
Ａ断片３８は、ゲル充填キャピラリー１から緩衝液中へ
溶出してくると拡散で広がろうとするが、重力による自
然落下で層流状態を保ちながら下方へと移動するシース
フロー（緩衝液流）３９によって搬送され、拡散する前
にレーザ光４０，４１の光路を横切り、光照射されて蛍
光を発する。各ゲル充填キャピラリー１で分離されたＤ
ＮＡ断片３８は、互いに平面性を保ったまま混ざり合う
ことなくシースフロー３９により搬送されるので、レー
ザ光４０，４１により一斉に照射できる。ＤＮＡ断片３
８と緩衝液は中空キャピラリー７を通って下部電極槽４
へ排出される。

【００２１】ＤＮＡ断片３８のシースフロー３９中での
移動速度は約０.１ｍｍ／ｓである。この時ゲル充填キ
ャピラリー１の溶出端から０.５ｍｍ及び１ｍｍの位置
をレーザ１０，１１からのレーザ光４０，４１で照射
し、蛍光信号を求める。この２本のレーザ光間の距離
０.５ｍｍをＤＮＡ断片３８が移動する時間は約５秒で
あり、この時間は塩基長に依らず一定である。図４は、
シースフロー中でのＤＮＡ断片の移動速度の比を、２０
塩基長のＤＮＡ断片の速度を１として１５０塩基長、３
００塩基長、４００塩基長のＤＮＡ断片について測定し
た結果を示したものである。図４から、シースフロー中
でのＤＮＡ断片の移動速度が塩基長に依らず一定である
ことが良くわかる。このため、種々の蛍光体を励起する
レーザ光４０，４１の照射位置が異なっていても、単に
計測時間をシースフロー速度で決まる時間分ずらすだけ
で励起光照射位置のずれを相互に補正することができ、
各ＤＮＡ断片の相対泳動速度を比較し、塩基配列決定等
を行うことができる。

【００２２】次に、２本のレーザ光４０，４１の光路を
ずらした理由について説明する。レーザ光で水溶液を照
射すると、水のラマン散乱に基づく強い信号がレーザ光
の波長から約１００ｎｍ長波長側に観測される。１つの
レーザ光で１つの蛍光体を励起する場合には、発する蛍
光の極大は通常最適励起波長の２０〜３０ｎｍ長波長側
に現われるので、この波長部分を透過させラマン線の部
分を遮断するフィルターを介して受光することで、ラマ
ン散乱の影響を受けずに蛍光検出を行うことができる。

【００２３】しかし、複数のレーザ光を重畳して用いた
場合、短波長側のレーザ光のラマン線が長波長側レーザ
光で励起する蛍光体の蛍光極大波長に近い位置に来て背
景光強度が増大し、高いＳ／Ｎが得られないことがあ
る。実際４８８ｎｍで励起すると、５８５ｎｍ近傍にラ
マン線が現われる。この波長は５３２ｎｍで励起するＴ
ＡＭＲＡの蛍光極大波長に近いので、ＴＡＭＲＡ用の透
過フィルターを通り抜けてしまい、ＴＡＭＲＡに関して
は高い感度が得られない。また、励起光５３２ｎｍの散
乱はＦＡＭ（5-carboxyfluorescein）やＦＩＴＣ用のフ
ィルターで完全には遮断できず、背景光の増大すなわち
感度の低下をもたらす。

【００２４】そこで、本発明のように２本のレーザ光４
０，４１の照射位置を空間的にずらし、位置分解能力の
ある検出器で受光することにより、これらの障害を除去
することができる。実際、２本のレーザ光の照射位置を
ずらすと、２本のレーザ光を重畳した場合に比べ、ＦＡ
Ｍ用フィルターで観測した背景光の信号強度は１／２、
ＴＡＭＲＡ用フィルターで観測した背景光の信号強度は
１／４とすることができ、高感度化を達成することがで
きた。

【００２５】ゲル充填キャピラリーアレーを平面状に整
列させる方法の一例として、ゲル充填キャピラリーアレ
ーの溶出端をゲル充填キャピラリーの外径にほぼ等しい
寸法を有する光学セル６のガラス板６ａ，６ｂの間隙に
挿入する方法を説明した。この場合、光学セルのガラス
板によって形成される間隙に、図５の断面に示すように
テーパ６ｃを設けると、ゲル充填キャピラリーアレーの
挿入を容易に行うことができる。

【００２６】また、ここでは予め組み立てられた光学セ
ルの間隙にゲル充填キャピラリーの溶出端を挿入した
が、内部に可動平板を備える光学セルを用い、可動平板
と光学セル壁面の間隙を広げた状態でゲル充填キャピラ
リーアレーの先端をその間隙に挿入し、次いで可動平板
をセル壁面の方向に移動することでゲル充填キャピラリ
ーの溶出端を光学セル内に挟み込むようにすることもで
きる。図６は、この変形例を説明するための光学セル部
分の断面図である。

【００２７】図６に断面模式図を示した光学セル６は、
蛍光取り出し側の壁面６ｂが無蛍光透明ガラスで作ら
れ、その反対側の壁面６ａがステンレス鋼で作られてい
る。壁面６ａには水平方向に延びる溝状の凹部が設けら
れ、その凹部に無蛍光透明ガラス製の平板６１が挿入さ
れている。平板６１には裏側の３箇所に押圧部材６２が
取り付けられており、押圧部材６２は壁面６ａを貫通し
て光学セル外に延び、その端部に配置された圧縮バネ６
３によって矢印方向に付勢されている。従って、圧縮バ
ネ６３に抗して押圧部材６２を図の左方向に移動させ、
平板６１と壁面６ｂの間隔を広げた状態でゲル充填キャ
ピラリーアレーの先端を挿入し、そののち押圧部材６２
を離すことにより、ゲル充填キャピラリー１は壁面６ｂ
と平板６１に挟まれて同一平面上に整列する。

【００２８】また、光学セルのガラス板６ａ，６ｂの間
隔がゲル充填キャピラリーの外径より大きい場合であっ
ても、ゲル充填キャピラリーアレーを固定した平板１８
から突出させるキャピラリー１の自由端の長さを十分短
くすると、平板１８への固定のみでゲル充填キャピラリ
ーアレーの溶出端を十分な精度をもって一直線上に揃え
ることができる。例えば、外径０.２ｍｍ、内径０.１ｍ
ｍのゲル充填キャピラリーの場合、固定平板１８から突
出するキャピラリーの長さを５ｍｍ以下とすると、光学
セルのガラス板６ａ，６ｂで挟んで位置を規制せずとも
ゲル充填キャピラリーアレーの溶出端を実用上十分な精
度で一直線上に揃えることができる。

【００２９】なお、平板１８によって、キャピラリーア
レーを同一平面内に保持する場合の固定方法は接着法だ
けに限られない。例えば、図７に断面模式図を示すよう
に、ゴムシート５５を敷いたステンレス板等からなる第
１の平板５６上に複数のゲル充填キャピラリー１を所定
の間隔で並べて保持し、その上に第２の平板５７を載
せ、その状態で第１の平板５６と第２の平板５７の両端
部をクリップ等で挟んで固定する方法によることもでき
る。

【００３０】上の例では２本のレーザ光４０，４１を、
光学セル６の側面からゲル充填キャピラリーアレーの配
列方向に照射した。励起用レーザ光は、ゲル充填キャピ
ラリーアレーの作る平面と交差する方向から照射するこ
ともできる。図８及び図９は、レーザ光照射方法の他の
例を示す略図である。図８及び図９において、ゲル充填
キャピラリーに泳動電圧を印加するための上下電極槽、
緩衝液槽、蛍光検出系などレーザ光照射光学系以外の部
分は図１と同一であるので図示を省略してある。

【００３１】図８は、光学セルの蛍光検出面と同じ側か
ら２本のレーザ光を走査して照射する例を示す。２つの
レーザ光源１０，１１から射出したレーザ光４０，４１
は、回転するポリゴンミラー７１で反射され、光学セル
６を一端から他端に向けて走査される。光学セル６の透
明窓を通ってセル内に入射したレーザ光は、各ゲル充填
キャピラリー１の溶出端と中空キャピラリー７の入口端
の間の間隙を順番に走査し、ゲル充填キャピラリーから
溶出したＤＮＡ断片を照射する。ＤＮＡ断片の蛍光標識
から発せられた蛍光は、前記した位置分解能を有する蛍
光検出器で検出される。

【００３２】図９は、光学セルの蛍光検出面と同じ側か
ら２本のシート状レーザ光４０，４１を照射する例を示
す。鉛直方向に配置された２つのレーザ光源１０，１１
から発せられたレーザ光４０，４１は、わずかに異なる
鉛直方向入射角をもってミラー７２に入射し、ミラー７
２で反射されたのちＦθレンズ７３によってシート状の
ビームとされ、光学セル６内のゲル充填キャピラリー１
の溶出端と中空キャピラリー７の入口端の間に集光され
る。２本のビーム４０，４１はシースフローの流れる方
向に０.５ｍｍ程度離れた位置で各ゲル充填キャピラリ
ー１から溶出したＤＮＡ断片を照射する。この場合にお
いても、ＤＮＡ断片の蛍光標識から発せられた蛍光は、
前記した位置分解能を有する蛍光検出器で検出される。

【００３３】〔実施の形態２〕図１０は、ゲル充填キャ
ピラリーと中空キャピラリーとを交互に配置したキャピ
ラリーアレーシートを用いた他の例の全体構成図であ
る。この例では、溶出端付近でゲル充填キャピラリーと
中空キャピラリーとを交互に隣接させて配置すること
で、ゲル充填キャピラリーのピッチ精度を向上すると共
に、中空キャピラリーからシースフローを形成するため
緩衝液を供給することにより、ガラス間隙内で安定なシ
ースフローを生成する。

【００３４】この例のキャピラリーアレーＤＮＡシーケ
ンサは、ゲル充填キャピラリー１、緩衝液槽２０、上部
電極槽２１、下部電極槽２２、電源５、光学セル２４、
光学セルと下部電極槽とを接続する中空キャピラリー
７、一端側を緩衝液槽に浸漬し他端側はゲル充填キャピ
ラリーと交互に配置した中空キャピラリー２６、レーザ
光源１０、レーザ光源１０からのレーザ光を光学セルに
導くミラー２７、レーザ光源１１、レーザ光源１１から
のレーザ光を光学セルに導くミラー２８，２９、蛍光集
光レンズ１２、蛍光用フィルタ１４、像分割プリズム１
５、結像レンズ１３、蛍光検出器１６、コンピュータ１
７からなる。

【００３５】各ゲル充填キャピラリー１は、試料注入端
を図示しない試料容器中の試料に浸漬して電圧を印加す
ることでＤＮＡ試料を電界注入され、そののち試料注入
端は上部電極槽２１に挿入される。次いで、電源５を動
作させて上部電極槽２１と下部電極槽２２の間に電圧を
印加することで、電界注入されたＤＮＡ試料はゲル充填
キャピラリー１中を電気泳動して分離される。緩衝液は
緩衝液槽２０から中空キャピラリー２６に送られて光学
セル２４中を満たし、下部の中空キャピラリー７へと流
入し、下部電極槽２２へ排出される。

【００３６】分離されたＤＮＡ試料がこの光学セル２４
を通過するとき、ミラー２８，２９より導かれたレーザ
光４１、及びミラー２７により導かれたレーザ光４０の
照射を受け、試料を標識している蛍光体が励起され蛍光
を発する。この蛍光発光は、集光レンズ１２、垂直方向
に並べられた複数枚の蛍光用フィルター１４、各蛍光毎
に像を分ける像分割プリズム１５及び結像レンズ１３を
通り、蛍光検出器１６に到達し検出される。集光レンズ
１２、蛍光用フィルタ１４、像分割プリズム１５、結像
レンズ１３、蛍光検出器からなる蛍光検出系は図１で説
明したのと同じものである。検出された信号はコンピュ
ータ１７へ送られて解析され、試料の塩基配列が決定さ
れる。

【００３７】図１１は光学セルの部分の詳細説明図、図
１２はその側断面図である。光学セル２４は、ゲル充填
キャピラリー１と中空キャピラリー２６のアレーを同一
平面上に保ち、キャピラリー端部から長い距離にわたっ
て安定なシースフロー３９を形成して、すべてのＤＮＡ
試料を安定に照射するためにキャピラリーアレーを２枚
の無蛍光石英ガラス板２４ａ，２４ｂでサンドイッチし
た形になっている。この光学セル２４の内部間隔、すな
わち石英ガラス板２４ａと２４ｂの間隔は約０.２１ｍ
ｍで、キャピラリー管の外径と一致させた。ゲル充填キ
ャピラリー１及び中空キャピラリー２６は、平板１８に
固定されている。平板１８は、図示省略した装置の枠体
に固定されたガイド部材５１ａ，５１ｂの案内溝に挿入
することによって装置に固定される。なお、図には平板
１８が光学セル２４に接して固定されているように描い
てあるが、平板１８の固定位置は光学セル２４から離れ
た位置であっても構わない。

【００３８】安定なシースフロー３９をつくるため、ゲ
ル充填キャピラリー１と中空キャピラリー２６を交互に
並べたものと、中空キャピラリー７を並べたものを互い
に約５ｍｍ離し、光学セル２４の無蛍光石英ガラス板２
４ａ，２４ｂで挟まれた平面上に対向させた。ゲル充填
キャピラリー１の上端は上部電極槽２１に、上側中空キ
ャピラリー２６の上端は緩衝液槽２０に、下側中空キャ
ピラリー７の下端は下部電極槽２２にそれぞれ挿入され
ている。

【００３９】緩衝液は、落差によって緩衝液槽２０から
上側中空キャピラリー２６を通り抜け、光学セル２４の
内部で各々のゲル充填キャピラリー１からでてくるＤＮ
Ａ試料に対してシースフロー３９を形成し、下側中空キ
ャピラリー７を通り抜け、下部電極槽２２へと排出され
る。ゲル充填キャピラリー１には電源５から電圧が印加
されており、分離されたＤＮＡ断片３８はゲル充填キャ
ピラリー１の中を電界により移動しシースフロー３９中
へと泳動する。シースフロー３９中に出てきたＤＮＡ断
片３８は、シースフロー３９によって互いに混ざり合う
ことなく、下側中空キャピラリー７へと移動する。この
シースフロー３９部分にはレーザ光４０，４１が互いに
重なることなく照射されている。

【００４０】上側中空キャピラリー２６は、緩衝液をゲ
ル充填キャピラリーの間から均一に流して安定なシース
フロー３９を作る役目と、ゲル充填キャピラリー１と交
互に並べることでゲル充填キャピラリー１を等間隔に並
べる役目を持つ。図１１では、下側中空キャピラリー７
は間隔を開けずに並んでいるが、シースフロー３９の流
入はゲル充填キャピラリー１と対向するものにしか生じ
ないようにしてある。しかし、これと異なり全ての中空
キャピラリー７にシースフローが流入するようにしても
構わない。

【００４１】図示した装置はシースフロー３９が上から
下に向かって流れる構造となっているが、装置全体を逆
さにしたり、斜めや横にして、シースフローが下から
上、横方向等に流れるようにしても良い。また必ずしも
上側と下側のキャピラリーの数が同じである必要はな
く、さらにはゲル充填キャピラリーを同じ径で同じピッ
チで並べたり、違う径で同じピッチに並べる等任意であ
る。また電極は、下部電極槽２２の中に限らず光学セル
２４中に配置することも可能である。

【００４２】ここでは、ゲル充填キャピラリー１と緩衝
液を流すための中空キャピラリー２６とを交互に隣接さ
せて配置することで、ゲル充填キャピラリーのピッチ精
度を向上すると共に安定なシースフローを生成した。同
様のことは、中空キャピラリーの代わりにキャピラリー
保持部材を兼ねる構造部材を用いても実現することがで
きる。図１３〜図１５を用いて、この変形例について説
明する。

【００４３】この変形例においては、ゲル充填キャピラ
リーの溶出端付近をキャピラリー保持部材によって固定
して保持する。図１３はキャピラリー保持部材の構成要
素を示す斜視図、図１４はキャピラリー保持部材の全体
図である。キャピラリー保持部材８０は、図１３に示す
ように、平行な溝８３，８４を形成した２つの溝付部材
８１，８２を、その溝が形成された面を対向させて接合
したものである。溝８３はゲル充填キャピラリー１の外
径と同じ寸法を有し、溝付部材８１の一つおきの溝８３
に溶出端を溝８３から少し突出させてゲル充填キャピラ
リー１を配置する。そして、もう一方の溝付部材８２を
接合することにより、溶出端を一直線上に揃えて、定め
られたピッチで配置されたゲル充填キャピラリーアレー
が組み立てられる。溝８４は、保持部材８０の幅方向に
貫通する孔となる。

【００４４】図１５は、キャピラリー保持部材８０を用
いたマルチキャピラリーＤＮＡシーケンサのセル部分の
断面模式図である。キャピラリー保持部材８０の上部に
は緩衝液容器５０が固定されている。キャピラリー保持
部材８０の下部は２枚の無蛍光石英ガラス板２４ａ，２
４ｂで挟まれ、光学セル２４が形成されている。光学セ
ル２４の下端には、複数本の中空キャピラリー７が図１
１と同様に接続されている。キャピラリー保持部材８０
の溝８４によって形成される孔は緩衝液容器５０と光学
セル２４を連通し、光学セル２４内に均一な緩衝液の流
れを発生する。ゲル充填キャピラリー１で分離されたＤ
ＮＡ断片３８は、こうして形成された安定なシースフロ
ーによってレーザ光４０，４１の照射位置まで運ばれ
る。以上述べたいずれの例においても、励起用レーザ光
は、図８又は図９に示すように、ゲル充填キャピラリー
アレーの作る平面と交差する方向から照射することもで
きる。

【００４５】〔実施の形態３〕以上の例は計測部にシー
スフローを用いた測定系についてのものであるが、本発
明は計測部にシースフローを用いない多数キャピラリー
同時照射の測定系にも有効である。これには、ゲル充填
キャピラリーの被覆を剥がし、その被覆のないゲル充填
キャピラリー部分を光照射する場合と、ゲル充填キャピ
ラリー端部を中空キャピラリーにつなげ、中空キャピラ
リーを光照射する場合とがある。ここではゲル充填キャ
ピラリーと中空キャピラリーを縦列に並べた例を示す。

【００４６】図１６は光学セルの部分の模式図、図１７
はその断面図である。平板１８によって平面状に保持さ
れた多数本のゲル充填キャピラリー１は、その溶出端を
２枚の無蛍光透明ガラス板９１ａ，９１ｂで挟まれて一
直線上に並べられている。ゲル充填キャピラリー１に対
向して配置される透明な中空キャピラリー９２は、その
被覆を除去し、グリセリン９４で満たされたガラス間隙
に並べられる。グリセリン９４は仕切板９３で区切られ
た光学セル９０の下方領域に満たされ、ゲル充填キャピ
ラリー１と中空キャピラリー９２の間隙を含む仕切板９
３の上方領域には緩衝液が満たされている。

【００４７】ＤＮＡ断片はゲル充填キャピラリー１で分
離された後に中空キャピラリー９２に入り、横からレー
ザ光により照射される。キャピラリー９２表面でのレー
ザ光４０，４１の散乱、屈折はグリセリンのため少なく
なり、中空キャピラリー９２内を移動する全てのＤＮＡ
断片３８を複数のレーザ光で安定に照射することができ
る。中空キャピラリー９２の周囲に充填する物質は、グ
リセリンの代わりに、ガラスの屈折率に近い屈折率１.
２〜１.６の物質としてもよい。

【００４８】この例の場合、レーザ光は屈折率の異なる
領域を通過するので、十分絞られた細いビームであるこ
とと、全てのキャピラリーが平面上に配置されていて光
が直進できることが重要である。全てのキャピラリーを
平面上に配置することは、ガラス板等でキャピラリーを
挟むことにより達成される。レーザ光を照射するキャピ
ラリーの回りをガラスの屈折率に近い物質で満たしてい
る場合は、レーザ光を複数のゲル充填キャピラリーに同
時照射することも可能である。

【００４９】

【発明の効果】以上説明したように本発明によれば、複
数のレーザ光を分離してシースフロー上で照射すること
により、マルチキャピラリーＤＮＡシーケンサの感度と
スループットを上げることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるマルチキャピラリーＤＮＡシーケ
ンサの一例の全体構成を示す図。

【図２】図１の光学セルの部分の詳細説明図。

【図３】光学セルの断面図。

【図４】ＤＮＡ断片の塩基長と移動速度の関係を示した
図。

【図５】光学セルの他の例の模式図。

【図６】光学セルの他の例の断面模式図。

【図７】キャピラリーアレー固定方法を説明する断面
図。

【図８】励起光照射方法の他の例を示す略図。

【図９】励起光照射方法の他の例を示す略図。

【図１０】本発明によるマルチキャピラリーＤＮＡシー
ケンサの他の例の全体構成を示す図。

【図１１】図１０の光学セルの部分の詳細説明図。

【図１２】光学セルの断面模式図。

【図１３】キャピラリー保持部材の構成要素を示す斜視
図。

【図１４】キャピラリー保持部材の全体図。

【図１５】キャピラリー保持部材を用いたマルチキャピ
ラリーＤＮＡシーケンサのセル部分の断面模式図。

【図１６】本発明によるマルチキャピラリーＤＮＡシー
ケンサの他の例の光学セル部分の詳細図。

【図１７】光学セルの断面図。

【符号の説明】

１…ゲル充填キャピラリー、２…緩衝液槽、３…上部電
極槽、４…下部電極槽、５…電源、６…光学セル、７…
中空キャピラリー、１０，１１…レーザ光源、１２…集
光レンズ、１３…結像レンズ、１４…蛍光用フィルタ、
１５…像分割プリズム、１６…蛍光検出器、１７…コン
ピュータ、１８…平板、２０…緩衝液槽、２１…上部電
極槽、２２…下部電極槽、２４…光学セル、２６…中空
キャピラリー、３８…ＤＮＡ断片、３９…シースフロ
ー、４０，４１…レーザ光、５０…緩衝液容器、５１
ａ，５１ｂ…ガイド部材、５５…ゴムシート、５６，５
７…平板、６１…平板、６２…押圧部材、６３…圧縮バ
ネ、７１…ポリゴンミラー、７２…ミラー、７３…Ｆθ
レンズ、８０…キャピラリー保持部材、８１，８２…溝
付部材、８３，８４…溝、９０…光学セル、９２…中空
キャピラリー、９３…仕切板、９４…グリセリン

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 神原 秀記 東京都国分寺市東恋ヶ窪一丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内 Ｆターム(参考） 2G043 BA16 CA03 DA05 EA01 EA19 FA06 GA01 GA07 GB01 HA01 HA02 HA08 JA02 KA02 KA05 KA09 LA03 2G057 AA04 AB01 AB04 AC01 BA05 BB01 CA01 DA11 DC05

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 溶出端が同一の平面内に保持され、試料
   を泳動分離する複数のキャピラリーと、 前記複数のキャピラリーの前記溶出端から溶出した試料
   をシースフローを用いて流す手段と、 前記シースフローを用いて流れた前記試料を前記平面と
   平行な方向から照射する複数のレーザ光と、 前記試料を標識する蛍光体から発する蛍光を検出する手
   段と、を有することを特徴とする蛍光検出型電気泳動装
   置。
2. 【請求項２】 前記複数のレーザ光は２つであることを
   特徴とする請求項１記載の蛍光検出型電気泳動装置。
3. 【請求項３】 溶出端が同一の平面内に保持され、試料
   を横方向に泳動分離する複数のキャピラリーと、 前記複数のキャピラリーの前記溶出端から溶出した試料
   を横方向に流れるシースフローを用いて流す手段と、 前記シースフローを用いて流れた前記試料を照射するレ
   ーザ光と、 前記試料を標識する蛍光体から発する蛍光を検出する手
   段と、を有することを特徴とする蛍光検出型電気泳動装
   置。