CN116970039A - 一种抗环瓜氨酸肽抗体的抗原及其应用 - Google Patents

一种抗环瓜氨酸肽抗体的抗原及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗环瓜氨酸肽抗体的抗原及其应用，包括：一种CCP肽段、包含其的抗原，试剂盒。所述抗原包括至少一个抗原表位肽，所述抗原表位肽为环瓜氨酸，每一个所述环瓜氨酸肽通过半胱氨酸桥接成环，并形成转角。将该抗原结合载体，可应用于免疫比浊法等抗体检测方法中，操作简单，敏感性、特异性和稳定性较高。

Description

一种抗环瓜氨酸肽抗体的抗原及其应用
技术领域
本发明涉及免疫诊断技术领域，特别涉及一种CCP肽段、包含其抗原、试剂盒及其应用。
背景技术
类风湿关节炎(rheumatoid arthtitis，RA)是一种慢性自身免疫性疾病，导致多个关节发炎和畸形。诊断RA的重要指标是抗瓜氨酸化多肽抗体(anti-citrullinatedprotein antibody，ACPA)，它们能识别环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)这种特异性抗原。检测ACPA的方法有多种，如酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)、胶体金免疫层析法(gold immunochromatographic assay，GICA)、免疫比浊法(immunoturbidimetry，IT)等。
然而，这些方法都存在一定的局限性，主要是由于抗原表位的敏感性和特异性不足。抗原表位是抗原分子上与ACPA结合的部位，它们决定了检测方法的灵敏度和特异度。如果抗原表位的数量少或结构简单，那么ACPA就难以与之结合，导致检测结果假阴性或低阳性；如果抗原表位的结构与其他类似的抗原有交叉反应，那么ACPA就容易与之混淆，导致检测结果假阳性或高阳性。目前主要的CCP使用线性瓜氨酸肽或瓜氨酸化丝聚合蛋白作为抗原底物，但敏感性较低。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于CCP的特异性和敏感性不足，针对现有技术的不足，提供一种CCP肽段，包含其抗原及抗环瓜氨酸肽抗体的检测试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种CCP肽段，所述肽段包括至少一个抗原表位肽，所述抗原表位肽为环瓜氨酸，每一个所述环瓜氨酸肽通过半胱氨酸桥接成环，并形成转角。
进一步地，所述CCP肽段，其中，所述抗原表位肽的序列为ARGGSRCRARGRGRG-Cit-GCKR，其中，第7位半胱氨酸残基与第18位半胱氨酸残基通过二硫键形成环状结构。
进一步地，所述CCP肽段，其中，所述抗原表位肽的序列为GGSKCLYNLR-Cit-GCLAIPQ，其中，第5半胱氨酸残基与第13半胱氨酸残基通过二硫键形成环状结构。
一种CCP抗原，包含如上所述的任意一个或多个的CCP肽段。
进一步地，所述的CCP抗原包括含瓜氨酸、甘氨酸、半胱氨酸基序的CCP肽段的组合。
一种如上所述的CCP抗原在抗体检测中的应用，将环瓜氨酸肽抗原与载体连接，用于抗环瓜氨酸抗体的检测。
所述抗环瓜氨酸肽抗体的抗原在抗体检测中的应用，所述载体包括载体蛋白、生物素、异硫氰荧光素。
一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括：样本稀释液、缓冲液、抗原偶联试剂。
进一步地，所述的样本稀释液包含包括盐高盐溶液和去垢剂。优选地，所述的高盐溶液为氯化钠盐、碳酸钠盐、硫酸铜盐中的一种或多种；所述的去垢剂为十二烷基硫酸钠、胆酸盐、辛基葡萄糖苷中的一种或多种。
进一步地，所述的缓冲液包含磷酸盐、Tris、PEG-6000、ProClin300、消泡剂，优选地消泡剂包含但不限于有机硅类消泡剂、表面活性剂类消泡剂、矿物油消泡剂中的一种或多种。
进一步地，所述的抗原偶联试剂包含上述的CCP肽段一个或多个的抗原与载体蛋白、生物素、异硫氰荧光素三者中任何一个偶联的方式存在；优选地所述的载体蛋白可以是牛血清白蛋白、阳离子牛血清白蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、牛γ球蛋白及人γ球蛋白中任意一种。
本发明提供了一种CCP肽段及包含CCP肽段的抗原及其应用，抗原包括至少一个抗原表位肽，而抗原表位肽的环瓜氨酸通过半胱氨酸成环，形成转角，从而将环瓜氨酸暴露出来，提高检测的特异性和敏感性。同时，该抗原可应用于免疫比浊法等多种检测方法中，从而提高检测方法的精确度。
具体实施方式
本发明提供一种抗环瓜氨酸肽抗体的抗原及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，当我们称元件被“连接”或“耦接”到另一元件时，它可以直接连接或耦接到其他元件，或者也可以存在中间元件。此外，这里使用的“连接”或“耦接”可以包括无线连接或无线耦接。这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的全部或任一单元和全部组合。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学及相关领域的常规技术。
实施例1
1、CCP肽段的合成
通过类风湿性关节炎患者血清筛选出针对类风湿性关节炎的特异性识别的优势抗原表位，并在这些抗原表位的基础上增加转角结构和病毒瓜氨酸肽抗原位点，形成特异性的CCP肽段结构。本实施里列出两条应用于后续检测的序列：
(1)SEQ NO.1:ARGGSRCRARGRGRG-Cit-GCKR
其中，第7位半胱氨酸残基与第18位半胱氨酸残基通过二硫键形成环状结构。
(2)SEQ NO.2:GGSKCLYNLR-Cit-GCLAIPQ
其中，第5位半胱氨酸残基与第13位半胱氨酸残基通过二硫键形成环状结构。
相较于直链结构而言，环状结构的瓜氨酸肽具有更高的敏感性和特异性。在瓜氨酸之后连接的甘氨酸体型小，而瓜氨酸之前存在精氨酸、天冬氨酸等体型大且具有较高极性的氨基酸，能够更好得将瓜氨酸暴露且提高溶解性，从而增加结合的效率。
该实施例的CCP肽段通过增加病毒瓜氨酸肽抗原位点，加大了转角氨基酸的修饰，本实施里实现对序列的合理优化和修饰，增强其作为抗原时的灵活性，进一步提高抗原检出效率，为提高抗环瓜氨酸肽的检测提供更为可靠的检测结果。
2、制备抗原
本发明还申请了一种CCP抗原，包含上述CCP肽段的一个或多个上述任一种CCP肽段。由于本申请上述改进的CCP肽段，不仅具有现有CCP抗原较高的临床检测敏感性，而且具有较低的被非CCP抗体识别的概率，因而采用其中的一种或几种的组合形成的CCP抗原，在用于检测RA患者血清时，不仅具有较高的检测敏感性，而且具有较高的检测特异性。上述CCP肽段还可与其他瓜氨酸、甘氨酸、半胱氨酸基序的CCP肽段组合，形成其他成分的CCP抗原。
3、制备抗环瓜氨酸肽抗体的检测试剂
样本稀释液的配置：(以配制1L为例)
(1)用1000mL量筒准确量取定量的纯化水加入到试剂1配制容器中，备用；
(2)在搅拌下依次加入高盐溶液、去垢剂，加入物料后，200r/min搅拌30分钟至完全溶解；
(3)以上完全溶解后测pH值，边搅拌边用盐酸或氢氧化钠调节pH值至7.50±0.30；
(4)定容：加纯化水至规定配制量后，200r/min搅拌30分钟，搅拌时避免产生泡沫；
(5)过滤：用孔径0.22μm的滤膜过滤至另一清洁可密封加盖的贮存容器。
本实施例采用含有高盐去垢剂组分的稀释液，高浓度的盐和去垢剂可以限制低亲和力的抗体结合，避免干扰物质，高抗原与抗体的亲和力、提高试剂抗干扰力，提高线性范围，进而提高试剂的灵敏度、特异性。本实施例采用的高盐溶液是相对于常见的稀释液中生理盐水的浓度而言。
缓冲液的配置:(以配制1L为例)
(1)用1000mL量筒准确量定量的纯化水加入到试剂1配制容器中，备用；
(2)在搅拌下依次加入磷酸盐(有助于张力，相对于细胞等渗或高渗取决于磷酸盐浓度)、Tris、PEG-6000、ProClin300，消泡剂加入物料后，400r/min搅拌30分钟至完全溶解；
(3)以上完全溶解后测pH值，边搅拌边用盐酸或氢氧化钠调节pH值至7.50±0.30；
(4)定容：加纯化水至规定配制量后，400r/min搅拌30分钟，搅拌时避免产生泡沫；
(5)过滤：用孔径0.22μm的滤膜过滤至另一清洁可密封加盖的贮存容器。
缓冲液的基本成分包括MES、Tris、磷酸盐等，其pH值维持在7.0～8.0之间。本实施例中，在此基础上增加了消泡剂，消泡剂可采用有机硅类消泡剂、表面活性剂类消泡剂、矿物油消泡剂中的一种或多种。通过增加消泡剂组分，降低试剂测值不稳定风险，提高试剂稳定性。
抗原偶联物的配置：(以配制1L为例)
抗原偶联物是通过各种方式将抗原与载体进行连接。在免疫比色法中，与抗原偶联的载体可包括载体蛋白、生物素或异硫氰荧光素等。
以偶联物为载体蛋白为例，制备抗原偶联物的过程如下：
(1)选择合适的载体蛋白，以及与之匹配的偶联试剂。本实施例中，载体蛋白优选动物源性载体蛋白或人源性载体蛋白，如牛血清白蛋白、阳离子牛血清白蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、牛γ球蛋白及人γ球蛋白。
(2)将抗原肽溶解在适当的缓冲液中，如PBS或MES，调节pH值为6-7.5。
(3)将载体蛋白溶解在相同的缓冲液中，调节pH值为8-9。
(4)按照一定的比例(如10:1或20:1)将偶联试剂加入抗原肽溶液中，轻轻混匀，室温孵育30分钟。
(5)将偶联后的抗原肽溶液与载体蛋白溶液按照一定的比例(如1:10或1:20)混合，300-500r/min搅拌2-3h，搅拌结束后得到的溶液于37℃环境下封闭24-48h。
(6)将反应后得到的偶联物通过透析或凝胶过滤等方法除去未反应的试剂和小分子杂质，收集偶联的抗原偶联物，并测定其浓度和纯度。
(7)将抗原偶联物保存在含有适当浓度的防腐剂(如NaN3或甘油)的缓冲液中，2-8℃或-20℃保存备用。
通过特定蛋白分析仪，对结合溶液进行检测，本实施例中使用的特定蛋白分析仪为锦瑞公司生产的全自动特定蛋白分析仪。
在检测前为了提高检测结果，可先进行校准，准备本发明试剂盒中包含CCP校准品和质控品，通过对校准品的检测，调整特定蛋白分析仪的校准曲线。
本实施例以免疫比浊法作为检测方法进行后续的检测步骤，故需制备抗原偶联物。但除了免疫比浊法，本实施例中的抗原还可应用酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法等，其原理都是基于抗原与抗体的特异性结合，抗原所连接的载体还可包括固相载体，例如硝酸纤维素膜，也可为胶体金等，在此不再赘述。
实施例2
基于上述三组抗原组合，本实施例提供三组实验组和一个对照组。具体如下：
试验组 序列
实验组1 SEQ ID NO:1
实验组2 SEQ ID NO:2
实验组3 SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2
对照组 常规抗原序列
为验证抗原和方法的特异性和敏感性，设置了特异性和敏感性的定义和计算公式，如下：
(1)特异性针对的是健康体检样本、非RA样本(如：系统性红斑狼疮患者、干燥综合征患者、原发性胆汁性硬化患者或I型自身免疫性肝炎患者的血清)。计算公式为：
特异性＝真阴性/(真阴性+假阳性)；
(2)敏感性针对的是类风湿性关节炎患者的血清中抗体的含量检测的敏感性，其计算公式为：
敏感性＝真阳性/(真阳性+假阴性)。
本实施例采集了200份RA标准，780份非RA标本和200例健康人士的样本，采用上述方法对其特异性和敏感性进行检测，检测结果如下表：
表1RA患者临床诊断敏感性
表2非RA患者临床诊断特异性
表3健康体检样本临床诊断特异性
从表1～3中，结果看出发明实施例提供的环瓜氨酸肽无论是单独或以组合方式作为抗CCP抗体的抗原，其相较于未有修改的瓜氨酸肽而言，检测抗CCP抗体都具有较高的敏感性和特异性，尤其是以SEQ ID NO：1+2的组合来检测时，其敏感性达到80％，特异性达到了97.97％。而采用现有技术检测，其敏感性58％，特异性为85.71％。可见，相较于现有技术，本发明提供的环瓜氨酸肽显著提高了抗CCP抗体检测的敏感性和特异性。
实例3
本实施例提供一种基于上述方法的试剂盒，该试剂盒包括稀释液(R1)，缓冲液(R2)、乳胶颗粒(R3)、校准品和质控品。其中，乳胶颗粒包含抗原偶联物。校准品包括高浓度的标准品和低浓度的标准品。
为检测该试剂盒测值的稳定性，本实施例需对该试剂盒进行精密度的检测。本实施例采用的检测方式为采用试剂盒对三个水平的质控品进行检测，每天1次，每次进行4个重复，共检测5天，每个水平共测定20次，计算变异系数(变异系数CV＝浓度均值/标准差*100％)，Mean表示平均值，SD表示标准差。
表4试剂盒批内精密度测试结果
从上表4可以看出，结果表明实验组的变异系数在5％以内。实验组对应的试剂盒检测的数值标准偏差和变异系数明显小于对照组对应的试剂盒，具有更高的批内精密度,说明试剂增加高盐缓冲液、消泡剂会提高试剂测值稳定性，进一步优化了反应体系。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种CCP肽段，其特征在于，所述肽段包括至少一个抗原表位肽，所述抗原表位肽为环瓜氨酸，每一个所述环瓜氨酸肽通过半胱氨酸桥接成环，并形成转角。
2.根据权利要求1所述的CCP肽段，其特征在于，所述肽段的序列为ARGGSRCRARGRGRG-Cit-GCKR，其中，第7位半胱氨酸残基与第18位半胱氨酸残基通过二硫键形成环状结构。
3.根据权利要求1所述的CCP肽段，其特征在于，所述肽段的序列为GGSKCLYNLR-Cit-GCLAIPQ，其中，第5半胱氨酸残基与第13半胱氨酸残基通过二硫键形成环状结构。
4.一种CCP抗原，其特征在于所述的CCP抗原包含权利要求1-3中一个或任意个中任意一项描述的CCP肽段。
5.根据权利要求4所述的CCP抗原，其特征在于，所述CCP抗原包括含瓜氨酸、甘氨酸、半胱氨酸基序的CCP肽段的组合。
6.一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂包括：
对待测样品进行处理的样本稀释液；
试剂缓冲液；
包含CCP抗原的试剂，所述CCP抗原为权利要求4或5所述的抗原。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的样本稀释液包括高盐溶液和去垢剂。
8.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的CCP抗原将以CCP抗原偶联物形式存在。
9.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括消泡剂。
10.一个或多个权利要求1至3中任一项所述的CCP肽段、或者权利要求4～5所述的CCP抗原在制备用于抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂或试剂盒中的用途。
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