CN1935837A - β－胞衬蛋白抗原表位多肽及其筛选方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫学领域，涉及β－胞衬蛋白抗原表位多肽的筛选，得到具有诊断意义的最佳β－胞衬蛋白多肽对应的氨基酸序列。本发明所述的β－胞衬蛋白抗原表位多肽，包括如下(a)或(b)的多肽：(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抗原表位功能的由(a)衍生的多肽。所述的β－胞衬蛋白表位多肽可以特异性地检测干燥综合征患者血清中的抗β－胞衬蛋白多肽IgG抗体，完全符合临床诊断的需要。本发明还提供了检测患者血清中β－胞衬蛋白多肽IgG抗体的免疫学方法，以及将其作为抗原在制备诊断干燥综合征的药物中的应用。

Description

β-胞衬蛋白抗原表位多肽及其筛选方法与应用

技术领域

本发明属于免疫学领域，涉及抗原表位多肽的筛选、免疫学方法的建立以及临床诊断试剂的应用，尤其是涉及β-胞衬蛋白抗原表位多肽的筛选，得到具有诊断意义的最佳β-胞衬蛋白表位多肽对应的氨基酸序列，以及建立检测患者血清中β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体的免疫学方法，以及将其作为抗原在制备诊断干燥综合征的药物中的应用。

技术背景

干燥综合征(Sjgren Syndrome，SS)是一种以口、眼干燥为主，并累及全身多个系统和器官的全身性自身免疫病，分为原发性和继发性干燥综合征。本病主要表现为唾液腺、泪腺及消化道等外分泌腺的炎性细胞浸润及破坏，导致进行性口干、眼干及内脏受累。由于唾液、泪腺分泌减少或停止，出现口、眼干燥难忍、口唇破裂、龋齿猖獗或反复角膜炎、结膜炎、腮腺肿大及血管炎等(Fox RI，Stern M，Michelson P，Update insjgren’s syndrome.Curr Opin Rheumatol，2002，Sep：12(5)：319-8.)。

流行病学调查发现，我国干燥综合征的患病率为0.77％，而在50岁以上人群中的患病率达5％，甚至明显高于糖尿病(0.67％)、风湿性心脏病(0.19％)及肺源性心脏病(0.47％)的患病率。总患病人数逾800万，然而，在临床上，绝大部份(97％)的干燥综合征患者未得到及时的诊断和治疗，52％的患者被误诊为肺间质纤维化、免疫性肝炎及肾炎等，而未能得到正规的治疗或误治，甚至出现因误治出现的器官损害。本病为慢性全身性自身免疫病，未经正确治疗的患者多逐渐出现器官功能异常、衰竭，甚至死亡。淋巴瘤、骨髓瘤等恶性肿瘤在干燥综合征的发生率可高达正常人的40倍(Fox RI，Stern M，Michelson P，Update in Sjgren’s syndrome.Curr Opin Rheumatol，2002，Sep：12(5)：319-8.)。

目前，本病的早期诊断是困扰临床医师多年的最大问题。临床诊断上主要靠症状、体征、唇腺活检及非特异的抗核抗体等指标。其中唇腺活检属创伤性检查，且敏感性差，大多数患者不能接受。而抗核抗体、SSA抗、SSB抗体则特异性较差，敏感性也不理想(Reichlin M.Antibodies to Ro and La.Ann Med Interne(Paris)，1998，149：34-41.)。大部分患者在确诊时已属于中、晚期，往往病情严重，并有多个脏器受损或并发症，治疗上已十分困难。

胞衬蛋白(Fodrin)属于谱蛋白超家族，和红细胞谱蛋白具有同源性，均为重要的细胞膜骨架蛋白。胞衬蛋白广泛分布于神经元、淋巴细胞、肾上腺细胞、肝细胞、上皮细胞等非红细胞细浆膜下，与浆膜平行呈板状分布。胞衬蛋白由α和β两个亚单位组成，分子量分别为240kD和235kD。α和β亚单位以边对边的形式反向平行分布，形成松散的异二聚体，这两个异二聚体进一步以头对头的形式形成圆柱状的四聚体，与肌动蛋白相交连形成肌动蛋白胶体，参与构成细胞膜骨架，维持细胞的形态(Glenney JR Jr，Glenney P，Fodrin is the general spectrin-like protein found in most cells whereas spectrin andthe TW protein have a restricted distribution.Cell，1983，34(2)：503-12.Bennett V，Gilligan DM，et al，The spectrin-based membrane skeleton and micron-scale organization of theplasma-membrane.Annu Rev Cell Biol，1993，9：27-66.)。研究表明，胞衬蛋白可参与细胞的运动及维持细胞的连接和形态，可能与周围神经，脑，肾脏，肝脏及全身性自身免疫病的发生有关。

近几年来，国外及本发明发明人的前期研究发现干燥综合征相关的α-胞衬蛋白抗体在本病的发病机制及诊断中有一定意义。本发明人运用重叠蛋白片段表达筛选得到了一条干燥综合征相关的α-胞衬蛋白抗原表位多肽，虽然其敏感性、特异性相比抗核抗体、SSA抗、SSB抗体有所提高，但最终因筛选方法中运用原核表达重叠重组蛋白结合免疫检测分析，局限了抗原表位多肽的独立检测价值，加上国外许多研究中病例样本小等，该抗体在干燥综合征诊断中的特异性、敏感性仍不尽如人意(Rieko A.，Naozumi I.，IchiroS.，Yoshio H.et al，Development of Autoimmune Exocrinopathy Resembling sjogren’ssyndrome in Adoptively Transferred Mice With autoreactive CD4+ T cells.Arthiritis ＆Rheum，2003，DEC 48(12)：3603-3609.何菁，李晶，栗占国，陈巧林.抗α-胞衬蛋白表位多肽抗体在干燥综合征诊断中的意义，中华风湿病学杂志，2003，7(10)：600-603.He Jing，Chen Qiaolin，Li Zhanguo，Antibodies to α-fodrin-derived peptide in sjogren’s Syndrome.Annals of Rheumatic Diseases，2006，65(4)：549-550.陈巧林，朴海燕，何菁，李晶，栗占国.干燥综合征抗原α-胞衬蛋白抗原表位的筛选与鉴定，中国免疫学杂志，2005，11(21)：864-872.Fox RI，Konttinen Yi.，Fisher A，Use of Muscarinic Agonists in the Treatment ofsjogren’s syndrome.Clin Immunol.2001，101(3)：249-263.)。

国外学者Masataka等人通过对胞衬蛋白(Fodrin)的β-亚单位β-胞衬蛋白进行研究，选取β-fodrin全长cDNA 7561bp中的298-2158bp对应的共计616aa为对象，用得到的重组表达的616aa蛋白为检测抗原，结果显示抗β-胞衬蛋白抗体在原发性干燥综合征、继发性干燥综合征患者血清中的阳性率为51％和84％，而在红斑狼疮患者、系统性硬化病及正常人血清中的阳性率仅为6％、19％和4％。但由于研究中选择的不是在人体内表达的β-胞衬蛋白全长蛋白序列为对象，而且血清标本的例数不充分，加上检测抗原为重组表达蛋白，每批来源不稳定，使得该抗体的阳性率没有得到真正的提高，在临床上一直没有得到应用(Masataka K，Tetsuroh O，Yoko O，Junichi K，and Yutaka K，Autoantibodiesto the Amino-Terminal Fragment of β-Fodrin Expressed in Glandular Epithelial Cells inPatients with sjogren’s Syndrome.The Joumal of Immunology，2001，167：5449-5456.)。

综上所述，在该领域进行的多是很初步的探索，仍有多个方面的问题尚待澄清。目前已知的干燥综合征诊断抗原(蛋白或多肽)中，尚缺乏一种针对人干燥综合征特异性强，阳性率高的标志物；缺乏稳定的抗原来源及特异性的诊断方法也是问题的核心。因此，筛选及鉴定新的干燥综合征相关抗原(蛋白或多肽等)，寻找一种敏感性高、特异性强而临床又易于检测的抗体，对干燥综合征的临床诊断具有重要而迫切的意义。

发明内容

针对前述研究现状及干燥综合征临床诊断需求，本发明的目的在于提供一种新的β-胞衬蛋白表位多肽，以及其对应的氨基酸序列。所述的β-胞衬蛋白表位多肽可以特异性地检测干燥综合征患者血清中的抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体，该抗体检测结果显示在干燥综合征患者(原发、继发)血清中的阳性率高，而其他对照疾病(类风湿关节炎、系统性红斑狼疮)及正常人群血清中阳性率很低，完全符合临床诊断的需要。因而所述的β-胞衬蛋白表位多肽可以被提供作为人干燥综合征临床诊断用抗原。

本发明的第二个目的在于提供所述的β-胞衬蛋白表位多肽的筛选方法。本发明采用新的生物信息学方法结合免疫检测分析方法，筛选获得的可作为人干燥综合征抗原的β-胞衬蛋白的表位多肽。

本发明的第三个目的在于提供一种将含有所述β-胞衬蛋白表位多肽或其衍生物作为抗原用于检测干燥综合征患者血清抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体的方法，即单特异性ELISA法。本发明对所述的免疫学检测方法的各种条件均进行了优化，并得到实验验证。

本发明的第四个目的在于提供所述的β-胞衬蛋白表位多肽在制备用于诊断干燥综合征的药物的应用。该应用是基于所述的β-胞衬蛋白表位多肽测定抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体在干燥综合征诊断中的价值评定。具体地，本发明所述的β-胞衬蛋白表位多肽可以用于制备干燥综合征的临床诊断试剂盒。

根据本发明的第一个目的，本发明提供了一种β-胞衬蛋白抗原表位多肽及其对应的氨基酸序列，所述多肽的特征在于含有以下(a)或(b)氨基酸序列：

(a)、由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的多肽，该氨基酸序列如下：

NH3-Ser-Val-Glu-Thr-Glu-Asp-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys-Ser-Ala-Lys-COOH

(b)、在(a)中的氨基酸序列经过添加一个或几个氨基酸且具有抗原表位功能的由(a)衍生的多肽。

SEQ ID NO.1所示多肽为β-胞衬蛋白序列中的部分氨基酸残基。

根据本发明的第二个目的，本发明人选取人全长7561ntβ-胞衬蛋白基因序列ORF(311-7405nt)核酸序列对应的氨基酸序列为对象，通过采用Standard，Karplus，Emini，Amphiphi，Pellequer等5种国际上关于抗原表位预测的方法(Odorico M，Pellequer JL，BEPITOPE：predicting the location of continuous epitopes and patterns in proteins.J MolRecognit.2003，Jan-Feb；16(1)：20-22.)，分析了上述2365aa长度的β-胞衬蛋白的抗原决定簇，进一步通过合成多肽及免疫检测，得到了一条敏感性和特异性均很高的抗原多肽，同时，经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抗原表位功能的由(a)序列衍生的多肽，也显示很好的抗原抗体反应，该多肽及其对应的衍生物即为本发明所述的β-胞衬蛋白表位多肽，均可以很好检测抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG型抗体。迄今为止，国内外尚无关于该多肽(包括筛选到的抗原表位多肽及衍生多肽)序列的抗原性、该多肽检测血清中对应抗体的方法及其作为抗原在干燥综合征诊断中意义的研究。

本发明所述的β-胞衬蛋白表位多肽可以用本领域人员所熟知的方法得到，例如：固相合成法等。

上述所选取的人全长7561ntβ-胞衬蛋白基因序列来源于NCBI(＞gi|4507195|ref|NP_003119.1|spectrin，beta，non-erythrocytic 1 isoform 1 [Homosapiens])。

根据发明的第三个目的，本发明建立了含有所述β-胞衬蛋白表位多肽SEQ ID NO.1作为抗原用于检测干燥综合征患者血清抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体的方法(单特异性ELISA)。酶联免疫吸附法(ELISA)的原理是：将纯化的、已鉴定生化特性的抗原包被在固相的聚苯乙烯微孔板上；若为抗体阳性，已稀释的血清中的特异性抗体将与包被在固相上的抗原结合；第二步，过氧化物酶标记的抗人抗体与已结合的抗体反应；第三步，结合的标记抗体与色原底物溶液作用后而呈现颜色。颜色的深浅与血清标本中抗体的浓度成正比。

ELISA检测产品大致可以分为三种：“单特异性ELISA”试剂盒(包被有单特异性抗原)可提供对一种抗体的定量体外检测；“抗体谱ELISA”试剂盒可在一条微孔板上对多种不同抗体分别进行半定量体外检测；“混合ELISA”试剂盒的固相包被有混合抗原，可半定量检测多种抗体，而其单特异性需进一步检测。

ELISA检测中，由于抗原抗体反应需要必须的结合条件(pH值、离子浓度和等电点等)，本发明中发明人在实验初始阶段，发现抗原抗体反应较弱，后期经过一系列pH值及反应离子浓度(包括：pH6.01×PBS、pH6.51×PBS、pH7.01×PBS、pH7.51×PBS、pH8.01×PBS、pH8.51×PBS、pH9.01×PBS、pH9.51×PBS等)的调整后，确定了稳定的最佳包被缓冲液(pH9.01×PBS)；另外包被抗原的浓度过高和过低都会影响ELISA检测的特异性和敏感性，尤其在临床患者血清抗体滴度不平衡的情况下，选择抗原多肽的最佳包被浓度是ELISA检测的关键要素。对此本发明发明人进行了相应的实验，将所述β-胞衬蛋白表位多肽经多次不同范围的梯度稀释后进行反应，具体经过3次梯度稀释，包被量分别为：1ng、10ng、100ng、1000ng；10ng、40ng、60ng、80ng、100ng；40ng、45ng、50ng、55ng、60ng。最终确定了检测多肽的最佳包被量(50ng)，以此包被量进行血清抗体检测，效果最好；再有，关于对血清中抗原抗体非特异性反应的阻止问题，也是临床ELISA检测试剂能很好应用的另一关键因素。本发明发明人通过所在研究小组以往的经验，分别采用1％OVA/PBS、1％BCA/PBS、1％脱脂奶粉/PBS及封闭用正常用兔血清等，最终通过临床血清样本检测反应背景比对，确定运用业内统一的封闭用正常兔血清经特定处理后作为封闭液(具体程序为：将封闭用正常兔血清先62℃灭活20分钟，然后在25ml灭活过的封闭用正常兔血清中加入0.3275g Tris、0.21915g NaCl，再用HCl调至pH8.0)，这样可以使得抗β-胞衬蛋白表位多肽抗体检测的特异性能达到最佳。

通过以上条件优化，本发明中发明人将含有所述β-胞衬蛋白表位多肽(SEQ IDNO.1)按一定浓度，包被在固相的聚苯乙烯微孔板上，然后加入阳性干燥综合征患者血清，最终加入过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，除以上优化条件外，其他环节与常规单特异性ELISA相同。本发明经过优化建立的单特异性ELISA方法可以很好的检测临床干燥综合征患者血清的抗IgG抗体，实验结果显示，该方法得到的干燥综合征患者血清抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体的阳性率高、特异性强，完全符合临床诊断疾病的要求。

与现有技术相比，本发明所述的β-胞衬蛋白表位多肽测定抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体在干燥综合征诊断中的价值评定有明显的优势，详述如下：

国外学者Masataka等人利用系统性硬化病继发干燥综合征的患者血清，从HepG2细胞cDNA文库中，筛选分离出编码β-胞衬蛋白氨基端部分的cDNA片段，发现该片段与β-fodrin全长cDNA 7561nt中的298-2158nt同源。选取该片段核酸对应的共计616aa为对象，重组表达代表该段β-胞衬蛋白的不同大小片段：FOD_1-60，FOD_1-103，FOD_1-272，FOD_1-463，FOD_1-616，FOD_273-616，western blots鉴定结果显示，32份抗β-胞衬蛋白抗体阳性的干燥病人血清均能与含有1-272氨基酸部分的片段蛋白反应，均不与而不与FOD_1-60及FOD_273-616反应，其中1份与FOD_1-103重组蛋白反应。以FOD_1-616为检测抗原来检测干燥综合征患者的血清抗β-胞衬蛋白抗体。结果显示抗β-胞衬蛋白抗体在原发性干燥综合征、继发性干燥综合征患者血清中的阳性率为51％和84％，在红斑狼疮患者、系统性硬化病及正常人血清中的阳性率仅为6％、19％和4％，该抗体检测对干燥综合征具有一定的价值。但由于研究中选择的不是在人体内表达的β-胞衬蛋白全长蛋白序列为对象，而且血清标本的例数不充分，加上检测抗原为重组表达蛋白，每批来源不稳定，使得该抗体真正的价值没有得到体现，患者抗体检测阳性率没有得到真正的提高，在临床上一直没有得到应用(Masataka K，Tetsuroh O，Yoko O，Junichi K，and Yutaka K，Autoantibodiesto the Amino-Terminal Fragment of β-Fodrin Expressed in Glandular Epithelial Cells inPatients with Sjogren’s Syndrome.The Journal of Immunology，2001，167：5449-5456.)。

基于以上研究，本发明人采用Standard，Karplus，Emini，Amphiphi，Pellequer等5种国际关于抗原表位预测的方法，分析了2365aa长度的β-胞衬蛋白的抗原决定簇，进一步通过合成多肽及免疫检测，得到了一条敏感性和特异性均很高的抗原多肽，该多肽可以很好检测抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体。本发明人将该多肽作为检测抗原，用上述建立好的单特异性ELISA的方法检测干燥综合征、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及正常人血清中的抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体。本发明研究共检测干燥综合征患者182例，系统性红斑狼疮患者113例，类风湿关节炎患者136例，正常人212例。结果发现该多肽对干燥综合征的抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体测定具有较高的敏感性和特异性，可以达到通过血清学的方法诊断干燥综合征的目的，为干燥综合征的临床诊断提供客观的实验室依据。

根据本发明的第四个目的，本发明还提供了所述的β-胞衬蛋白表位多肽在制备用于诊断干燥综合征的药物的应用。

根据上述关于β-胞衬蛋白表位多肽测定抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体在干燥综合征诊断中的价值评定结果、β-胞衬蛋白表位多肽测定抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体初步免疫学方法以及临床诊断试剂盒的要求，本发明人制备了β-胞衬蛋白表位多肽IgG临床诊断用试剂盒。具体采用的是夹心法固相酶联免疫吸附分析法(ELISA)，用于定量检测抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体；所述的β-胞衬蛋白表位多肽抗原被包被于微孔板上，可拆分的微孔板(1×8)共12板条，可以完成96人份的检测。

本试剂盒经过3个不同的反应阶段自身抗体结合并形成夹心复合物，最后产生酶联颜色反应，颜色的深浅与样品中抗体的浓度成一定的比例关系。步骤1：样品，标准品和质控血清加入微孔板的反应孔内，任何存在的抗体结合在微孔内表面，30分钟孵育后洗涤除去非反应成分。步骤2：加入HRP过氧化物酶标记山羊抗人IgG，结合抗原抗体复合物，15分钟孵育后洗涤除去未结合的多余的酶标。步骤3：加入TMB底物，15分钟孵育后试剂颜色变成蓝色，加入终止液(含1M HCl)终止反应；试剂颜色变成黄色。

颜色的深浅与样品中IgG抗体的浓度成一定的比例关系。样品的IgG抗体含量可根据其O.D.值由标准曲线推断出来。在酶标仪或分光光度计中读取结果。450nm作为初始波长，600至650nm(优选为620nm)作为参考波长。

附图说明

图1为2365aa长度的全长β-胞衬蛋白二级结构的分析结果图；分别用Gamier-Robson和Chou-Fasman法推测二维结构，Kyte-Doolittle标准分析亲水性(Hydrophilicity)，Karplus-Schulz标准推测柔韧性(Flexible)，Janeson-Wolf方法预测抗原性指数(Antigenic index)，Plot-Emini方法分析表面可及性(Surface probability)。

图2为2365aa长度的全长β-胞衬蛋白抗原表位预测结果图；横坐标表示的是序列的位置，纵坐标表示的是预测方法的多少，1是指有1种方法预测那个位点是个epitope(抗原决定簇)，依次类推。该方法准确性大于75％。

图3为单特异性酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体原理示意图。图中，用抗原(β-胞衬蛋白抗原表位多肽)包被微量板孔，制成固相载体。加患者(干燥综合征及疾病对照组等)血清到板孔中，其所含的抗体(抗β-胞衬蛋白表位多肽抗体)特异性地与固相载体中存在的抗原结合，形成免疫复合物。除去多余物质后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG抗体，使之与上述免疫复合物反应。洗板，除去多余的结合物，加入底物(TMB)。该反应产生有颜色产物，颜色强度与特异性抗体含量成正比。

图4为本发明所述的β-胞衬蛋白表位多肽建立的单特异性ELISA法的检测程序示意图；

图5显示β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体在不同疾病的阳性率；由图可见，抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体在原发性和继发性干燥综合征中的阳性率明显高于SLE、RA及正常对照(P均＜0.01)。

图6显示自身抗体在干燥综合征患者血清样本中检测的敏感性和特异性。在干燥综合征患者中，抗β-胞衬蛋白表位多肽抗体的敏感性及特异性明显高于SSA、SSB及抗核抗体(P均＜0.01)。因此，抗β-胞衬蛋白表位多肽抗体在干燥综合征血清学诊断中具重要价值。

具体实施方式

下面将参照附图结合多种实施例来说明本发明所涉及的发明主题以及应用本发明中的β-胞衬蛋白表位多肽及其相应的抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体来实施干燥综合征临床诊断等具体实施方式。

本发明所用术语“β-胞衬蛋白表位多肽”指具有共同序列SVETEDNKEKKSAK(即NH3-Ser-Val-Glu-Thr-Glu-Asp-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys-Ser-Ala-Lys-COOH)的多肽或将上述氨基酸序列经过添加一个或几个氨基酸且具有抗原表位功能的由此衍生的多肽。

实施例1β-胞衬蛋白表位多肽的筛选及鉴定

前述的研究工作已经证明，利用基因工程的方法纯化出的β-胞衬蛋白融合蛋白能够特异性的结合干燥综合征患者血清中的抗β-胞衬蛋白抗体，然后通过特定的方法可以将其检出(Masataka K，Tetsuroh O，Yoko O，Junichi K，and Yutaka K，Autoantibodies to theAmino-Terminal Fragment of β-Fodrin Expressed in Glandular Epithelial Cells in Patientswith sjogren’s Syndrome.The Journal of Immunology，2001，167：5449-5456.)。本发明的实验中，发明人选取全长β-胞衬蛋白基因ORF核酸序列对应的氨基酸序列为对象，采用Standard，Karplus，Emini，Amphiphi，Pellequer等5种国际关于抗原表位预测的标准方法，全面分析了上述2365aa长度的β-胞衬蛋白二级结构(亲水疏水性等)，具体见图1。

进一步分析上述2365aa长度的β-胞衬蛋白抗原决定簇，结果见图2，按抗原趋势指数排列，得到并合成了共计32条多肽。32条计算分析得到的较好的抗原表位序列(均为从NH3端到COOH端排序)如下：

VDDWDNENSSARLFE       SVETEDNKEKKSAK         DISVDHPDEKSIITY

EKYESLASDLLEWIE       WERLEKAEHERELAL         NELIRQEKLEQLAR

RLWEYLLELLRAR    FCYQELCQL    GKDLTSVMRLL   IVSSSDVGHDEYSTQS

HRFESLEP   EIKAQQDKLNTRWS   LQQFLRDLDDFQS    EIDNYEEDYQKMRDM

QEKVDSIDDRHRKN        MRLKDNRDLQKFLQDC        ESTTQTKAQRLFDA

SQEGKSTDEVDSKRLT      KEIQGHQPRIDDIFER     NIVTDSSSLSAEAIRQ

MMSEEKAKDEQSAVS         EERRGKLDERHRLF      INSGHSDAATIAEWKD

FGRIQDKHKKLPEEL         ADDIQKRENEVLEA     EIDARNDSFTTCIELG

REIGQSVDEVEKLIKR       EVRRQQEEEERKRRP      PSPTSDRKAKTALPA

EYLFQAKDDEEMNTW   SSAISSDKHEVSASTQ   KREKDKEKDKEKRFS

将上述32条合成的β-胞衬蛋白表位多肽采用单特异性ELISA方法分别检测临床10例β-胞衬蛋白IgG抗体检测阳性的干燥综合征确诊患者血清抗体。

具体步骤是：32条合成的β-胞衬蛋白表位多肽分别用包被缓冲液(上述自制的PBS缓冲液，pH 9.6)稀释至0.5μg/ml，包被酶标板(100μl/孔)，4℃孵育过夜。以0.1％PBS-Tween洗板5次，每孔加入封闭用正常兔血清缓冲液(BNRS)(用前经过处理，见上述)150μl，37℃孵育3h，洗板5次。抗β-胞衬蛋白阳性SS患者血清标本(IgG阳性10例)各以PBS稀释50倍后加入(100μl/孔)，37℃孵育1h。洗板5次后对应加入PBS 1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG二抗(Santa Cruz产品)，37℃孵育1h。洗板后加入TMB显色液显色10min，加入1mol/L的浓HCL终止后测定标本在450nm处的A值。每板同时设空白对照、阳性对照及阴性对照(均来自β-fodrin蛋白大规模筛选检测过样本)。采用反应OD值的平均值，比较32条合成多肽与SS患者血清IgG的反应强弱，得到的最强反应活性的多肽认定为SS(干燥综合征)相关抗体最佳检测抗原β-胞衬蛋白表位多肽。

通过分析及免疫检测，得到了一条反应最强的抗原多肽：第2条，其序列为SVETEDNKEKKSAK(即NH3-Ser-Val-Glu-Thr-Glu-Asp-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys-Ser-Ala-Lys-COOH)，可以很好检测抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体，在32条多肽中与干燥综合征阳性血清IgG抗体反应最强，OD平均值为：1.02，结果见表1。

表1 32条β-胞衬蛋白合成多肽的序列及其对应的单特异性ELISA检测结果

No	起点*	氨基酸序列	终点	IgG反应OD平均值
					1	27	VDDWDNENSSARLFE	41	0.11

2	163	SVETEDNKEKKSAK	176	1.02
					3	255	DISVDHPDEKSIITY	269	0.34
4	305	EKYESLASDLLEWIE	319	0.15
					5	396	WERLEKAEHERELAL	410	0.10
6	412	NELIRQEKLEQLAR	425	0.18
					7	508	RLWEYLLELLRAR	520	0.24
8	618	FCYQELCQL	626	0.15
					9	667	GKDLTSVMRLL	677	0.31
10	766	IVSSSDVGHDEYSTQS	781	0.57
					11	889	HRFESLEP	896	0.13
12	925	EIKAQQDKLNTRWS	938	0.21
					13	1064	LQQFLRDLDDFQS	1076	0.41
14	1110	EIDNYEEDYQKMRDM	1124	0.72
					15	1247	QEKVDSIDDRHRKN	1260	0.76
16	1269	MRLKDNRDLQKFLQDC	1284	0.32
					17	1366	ESTTQTKAQRLFDA	1379	0.48
18	1447	SQEGKSTDEVDSKRLT	1462	0.35
					19	1532	KEIQGHQPRIDDIFER	1547	0.16
20	1550	NIVTDSSSLSAEAIRQ	1565	0.22
					21	1615	MMSEEKAKDEQSAVS	1629	0.55
22	1688	EERRGKLDERHRLF	1701	0.12
					23	1766	INSGHSDAATIAEWKD	1781	0.22
24	1818	FGRIQDKHKKLPEEL	1832	0.52
					25	1879	ADDIQKRENEVLEA	1892	0.13
26	1959	EIDARNDSFTTCIELG	1974	0.25
					27	2043	REIGQSVDEVEKLIKR	2058	0.14
28	2086	EVRRQQEEEERKRRP	2100	0.11
					29	2168	PSPTSDRKAKTALPA	2182	0.42
30	2284	EYLFQAKDDEEMNTW	2298	0.52
					31	2303	SSAISSDKHEVSASTQ	2318	0.10

32

2344

KREKDKEKDKEKRFS

2358

0.73

同时，为了分析上述筛选得到的SEQ ID NO.1多肽抗原性的普遍稳定性，通过对SEQ ID NO.1多肽经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抗原表位功能的由此衍生的多肽，重新合成一系列多肽，通过以上免疫检测步骤，发现均可以很好检测抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体，均显示与干燥综合征阳性血清IgG抗体很好的反应，OD平均值结果见表2。

       表29条β-胞衬蛋白SEQ ID NO.1多肽衍生物的序列及其

             对应的单特异性ELISA检测结果

No	氨基酸序列	IgG反应OD平均值
			1	ISVETEDNKEKKSAK	0.92
2	SVETEDNKEKKSAK D	0.87
			3	FQIQDISVETEDNKEKKSAK	0.82
4	SVETEDNKEKKSAK DALL	0.85
			5	FQIQDISVETEDNKEKKSAK DALL	0.79
6	SVETED PKEKKSAK	0.74
			7	SVETED PKEKKS PK	0.65
8	SVETEDNKEKKSA	0.87
			9	VETEDNKEKKSAK	0.81

上表中，序号为1-5的序列是在SEQ ID NO.1序列的首末端添加不同数量氨基酸(用下划线标出)的序列：序号为6和7的序列是在SEQ ID NO.1序列插入1个或多个氨基酸(用下划线标出)的序列；序号为8和9的序列是在SEQ ID NO.1序列首末端缺失1个或多个氨基酸的序列。

本发明的试验中发明人利用的是Flechsler等报道的固相合成法(Anderson EC，et al，Proc，Natl.Acad.USA 1998，95：7574-79.)合成了该条共14个氨基酸的β-胞衬蛋白表位多肽(SEQ ID NO.1)及其对应的衍生物。迄今为止，国内外尚无关于该多肽序列的抗原性、该多肽检测血清中对应抗体的方法及其作为抗原在干燥综合征诊断中意义的研究。

实施例2  β-胞衬蛋白表位多肽对患者血清中抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体的检测及其价值评定

本发明实验中针对合成多肽的氨基酸特性及其与抗体反应的情况，经过一系列pH值及反应离子浓度的调整后，我们确定了以pH9.6的自配PBS为包被缓冲液；同时也针对包被抗原浓度进行了相应的实验，将该β-胞衬蛋白表位多肽SEQ ID NO.1进行梯度稀释后进行反应，结果显示，用以上pH9.6的自配PBS包被缓冲液将肽稀释为0.5μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育4小时后，进行血清抗体检测，效果最好；另外，关于对非特异性反应的阻止问题，通过发明人以往的实验经验，首次运用业内统一的封闭用正常兔血清经特定处理后作为封闭液，使得抗β-胞衬蛋白表位多肽抗体检测的特异性能达到最佳。具体操作如下：

封闭：每孔加经处理的封闭用正常兔血清缓冲液(BNRS)150μl，4℃温育过夜。

BNRS的配制：正常兔血清25ml  (先62℃灭活20分钟)

            Tris      0.3275g

            NaCl      0.21915g

            用HCl调pH至8.0

本研究利用上述的SEQ ID NO.1多肽采用上述经过优化而建立好的酶联免疫吸附法(单特异性ELISA法)对干燥综合征(SS)、类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)患者及正常人血清中的抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体进行检测，以评价该多肽抗体在各种疾病中的分布。

具体步骤是：首先选择上述筛选到的β-胞衬蛋白表位多肽(SEQ ID NO.1)，用包被缓冲液(上述PBS缓冲液，pH9.6)稀释至0.5μg/ml，包被酶标板(100μl/孔)，4℃孵育过夜。以0.1％PBS-Tween洗板5次，每孔加入经过处理的封闭用兔血清缓冲液(BNRS)(用前经过处理，见上述)150μl，37℃孵育3h，洗板5次。患者血清标本(包括干燥综合征患者、系统性红斑狼疮患者、类风湿关节炎患者及正常人)以pH7.2 PBS稀释50倍后分别加入包被孔中(100μl/孔)，37℃孵育1h。洗板5次后分组加入pH7.2 PBS 1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG二抗(Santa Cruz产品)，37℃孵育1h。洗板后加入TMB显色液显色10min，加入1mol/L的浓HCL终止后测定标本在450nm处的A值。每板同时设空白对照、阳性对照及阴性对照((均来自β-fodrin蛋白大规模筛选检测过样本)。采用待测标本A值＞正常标本均数+2×标准差为阳性域值，分析SEQ IDNO.1多肽与SS患者及对照组血清IgG的反应情况。

检测原理示意图见图3。

本发明研究中共检测干燥综合征患者182例，系统性红斑狼疮患者113例，类风湿关节炎患者136例，正常人212例。

1.检测程序概要：如图4所示，多肽进行包被，50ng/孔，4℃过夜，洗涤，加入封闭用正常兔血清缓冲液(BNRS)150微升，湿盒中37℃过夜，洗涤。样品稀释液1∶50稀释临床病人血清，将稀释的样本，和立即可用的对照血清，分别加到微量孔内(100微升)，在湿盒中孵育60分钟/37℃。再洗涤，加入已稀释的酶标记IgG溶液100微升，在湿盒中再孵育60分钟/37℃，洗涤，加入底物溶液100微升，在湿盒中再孵育10分钟/37℃，加入终止液(100微升)，在450纳米处读数

2.检测过程

2.1将检测所需数目的微孔条放到微孔板(已包被好多肽SEQ ID NO.1并已经封闭完成)框上并准备好一张草签。

2.2在微量孔内分别加入100微升的已稀释样本或立即可用的对照血清。留一个孔为底物空白使用，例如：

IgG检测微量孔
		孔A1孔B1孔C1	底物空白阴性对照标本1......

2.3将样品于湿盒内37℃(±1℃)孵育60分钟(±5分钟)。

2.4孵育后以洗液缓冲液洗涤板孔(使用自动洗板机或手工洗板)：

-吸去或甩去洗液

-每孔内加入300微升洗液

-吸去或甩去洗液

-重复洗涤过程4次(共5次！)

-将微孔板翻转过来在纸巾上拍打，使微孔中不再含有液体

2.5加入酶标记抗体。

于适当孔内(底物空白除外)加入100微升IgG酶标记抗体混合物

2.6湿盒内37℃(±1℃)孵育60分钟(±1分钟)。

2.7孵育后，以洗液清洗板孔(洗涤见上)

2.8 加入底物

于每孔内加入100微升底物溶液(包括底物空白孔)

2.9湿盒内37℃(±1℃)孵育10分钟(±1分钟)。

2.10终止反应

每孔内加入100微升终止液，轻微振荡微孔板以混合溶液。

2.11读取消光度

以底物空白为空白对照液，60分钟内读取450纳米的OD值，参考波长范围为620纳米-690纳米(例如650纳米)。

本实施例主要通过以下几个方面阐明本发明β-胞衬蛋白表位多肽(SEQ ID NO.1)在干燥综合征患者诊断中的意义：

1、β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体阳性率在干燥综合征、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及正常人血清之间的比较。

本发明的研究实验中，发明人用单特异性ELISA方法检测了β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体在干燥综合征、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及正常人血清检测中的阳性率(表3，图5)。应用统计学比较各组数据，结果显示，β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体在原发和继发性干燥综合征患者血清检测中的阳性率显著高于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和正常人，p值均＜0.01。原发和继发性干燥综合征的β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体的阳性率相近，无统计学差异。

表3.β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体在不同疾病的阳性率

抗β-胞衬蛋白表位多肽
					诊断	例数	IgG抗体		p值
阳性例数	阳性率(％)
		干燥综合征原发性*继发性系统性红斑狼疮类风湿关节炎正常人	18214636113136212	146116304144			80.279.583.33.510.31.9	＜0.01＜0.01＜0.01

^*包括SLE继发SS患者13例，RA继发SS者19例，皮肌炎继发SS、未分化结缔组织病继发SS患者各2例。

2、抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体在干燥综合征、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎及正常人血清中滴度的比较。

由表4可见β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体在干燥综合征的平均滴度明显高于RA、SLE患者及正常人。

表4.SS、SLE、RA及正常人抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体滴度的比较

血清样本	OD值(M±SD)	P值
			原发ss继发SSSLERA正常人	0.93±0.080.98±0.090.18±0.090.23±0.090.13±0.04	＜0.01＜0.01＜0.01

3、抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体与其它自身抗体在干燥综合征的敏感性和特异性的比较。

表5，图6显示了抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体、SSA抗体、SSB抗体及ANA在干燥综合征中的敏感性和特异性。其中ELISA法检测抗α-胞衬蛋白抗体：相应检测试剂盒及方法由德国IMETEC生物试剂公司提供；欧蒙斑点法检测抗SSA、SSB抗体：相应检测试剂盒及方法由德国欧蒙医学实验诊断有限公司提供；间接免疫荧光法检测抗核抗体(ANA)：相应检测试剂盒及方法由德国欧蒙医学实验诊断有限公司提供。本发明实验结果显示抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体特异性和敏感性均明显高于抗α-胞衬蛋白抗体、SSB抗体、SSA抗体和ANA。因此，结合敏感性和特异性，抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体在诊断中的意义可能优于其他自身抗体。

表5.自身抗体在干燥综合征的敏感性和特异性

抗体类别	阳性例数	敏感性(％)	特异性(％)
				β-胞衬蛋白表位多肽抗体	146	80.2	95.2
α-胞衬蛋白抗体SSA抗体SSB抗体ANA	1197535109	65.441.219.259.9	71.663.388.152.7

实施例3 β-胞衬蛋白表位多肽作为抗原在制备临床干燥综合征诊断试剂盒中的应用

本发明人采用夹心法固相酶联免疫吸附分析法(ELISA)，将所述的β-胞衬蛋白表位多肽抗原包被于微孔板上，制备了β-胞衬蛋白表位多肽IgG临床诊断用试剂盒，用于定量检测抗β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体，共可以完成96人份的检测。具体内容如下：

1.试剂盒组成材料

包被了高度纯化β-胞衬蛋白表位多肽可拆分的微孔板(1×8)12板条1块；

β-胞衬蛋白表位多肽IgG标准品：0/6.3/12.5/25/50/100U/ml各1瓶，每瓶1.5ml；

质控血清(含IgG和阴性质控)各1瓶，1.5ml；

浓缩的样品缓冲液1瓶，20ml；

HRP过氧化物酶标记山羊抗人IgG1瓶，15ml；

TMB底物1瓶，15ml；

终止液(含1M HCl)1瓶，15ml；

浓缩洗涤缓冲液1瓶，20ml

2.技术参数

(1)样本：血清或血浆

(2)样本量：每次实验100ul未稀释样本

(3)总孵育：室温下(18-28℃)60分钟

(4)质控范围：0-100U/ml

(5)灵敏度：1U/ml

(6)储存：2-8℃

(7)有效期：生产后9个月或标明有效期

(8)包装规格：96人份

3.试剂盒性能

(1)特异性  高度纯化的β-胞衬蛋白表位多肽抗原被包被于微孔板上，制备的β-胞衬蛋白表位多肽试剂盒仅用于特异性检测的抗体。

(2)校正  β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体定量检测系统无国际标准校正。

4.免疫分析程序

(1)自备材料

   仪器      酶标仪，450nm波长

             漩涡振荡器

             加样器：10ul，100ul，1000ul

   试剂准备  蒸馏水

             量筒：100ml，1000ml

             装洗涤液的饲料容器

   可选择    多通道加样器

             可重复的加样器：100ul

             数据分析软件

(2)样品收集，处理和保存

使用血清或血浆样本检测β-胞衬蛋白表位多肽IgG抗体，血清或血浆用样品稀释缓冲液以1∶50的比例稀释(20ul样本+1ml缓冲液)，病人无须禁食，也不用特别的准备，静脉穿刺，取血采样，形成凝结后离心去除颗粒。

样品如果不直接使用，2-8℃下可保存5天或-20℃下可保存6个月，将其分为小部分避免反复冷冻。

胆红素和溶血素对结果无影响。

(3)试剂的准备/储存

除样品缓冲液和洗涤缓冲液外，全部试剂均为即用型液体；开盖后试剂2-8℃下可至少保存30天或标签上的有效期。

实验中不用的板条立即放回带干燥剂的包装中，2-8℃下密封保存，以免变质。

洗涤缓冲液的准备：蒸馏水50倍稀释后装到1000ml容器。稀释后的缓冲液可在2-8℃下至少保存30天或标签上的有效期。

稀释缓冲液的准备：蒸馏水5倍稀释后装到100ml容器。稀释后的缓冲液可在2-8℃下至少保存30天或标签上的有效期。

(4)技术要点

质控血清或样本必须每次作为未知分析，以检测实验的可靠性。

加样和样本处理：使用带一次性吸头的微量加样器取样；直接加入微孔底部。为避免交叉污染，每次更换吸头取样。对怀疑高浓度的病人样本应进一步稀释，并在结果计算时调整。

(5)试验过程

不同批号不要混用

全部试剂和样本使用前恢复到室温。

所有病人样本用样品稀释缓冲液以1∶50的比例稀释(20ul样本+1ml缓冲液)，混合均匀。标准品和质控血清为即用型，不必稀释。

根据样品数量加上标准品和质控决定所需的板条，每个样品，标准品和质控都应做双份。

建议使用的试验方案

	1	2	3	4	5	6
							A	标1	标1	样1	样1
B	标2	标2	样2	样2
							C	标3	标3	样3	样3
D	标4	标4	样4	样4
							E	标5	标5	样5	样5

F	标6	标6	…	…
							G	阳	阳
H	阴	阴

每孔加入100ul血清稀释液、标准品和质控血清，室温下孵育1小时(18-28℃)；倒空微孔板，每孔用300ul洗涤缓冲液冲洗3次；每孔加入100ul酶标液，室温下孵育60分钟；倒空微孔板，每孔用300ul洗涤缓冲液冲洗3次；每孔加入100ul底物TMB，室温下黑暗中孵育10分钟；每孔加入100ul的终止液，静止5分钟；停止反应后30分钟内，测定结果，450nm作为初始波长，620nm(可以用600至690nm)作为参考波长。

(6)结果分析

以吸光度和标准品浓度作标准曲线(直线、半对数或对数坐标纸)。

由标准曲线可直接确定血清的抗体浓度。

(7)实验参数

精度：

批内
			样品	平均值(U/ml )	CV％
1	15.9	4.0
			2	59	4.0
3	137	2.2
			批间
样品	平均值(U/ml)	CV％
			1	15.7	2.9
2	58.1	1.1
			3	144	3.4

灵敏度：1U/ml

对应：在稀释实验中，高抗体浓度的样本用样本缓冲液稀释并检测。结果在全部测试范围内成线性关系。

                            SEQUENCE LISTING(序列表)

<110>中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120>β-胞衬蛋白抗原表位多肽及其筛选方法与应用

<140>

<141>2006-08-30

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Ser Val Glu Thr Glu Asp Asn Lys Glu Lys Lys Ser Ala Lys。

1                  5                     10

Claims (8)

1、β-胞衬蛋白抗原表位多肽，其特征在于，包括如下(a)或(b)的多肽：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抗原表位功能的由(a)衍生的多肽。

2、如权利要求1所述的β-胞衬蛋白抗原表位多肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)选取人全长7561 ntβ-胞衬蛋白基因序列ORF核酸序列对应的2365 aa长度的氨基酸序列为对象，采用Standard、Karplus、Emini、Amphiphi、Pellequer五种关于抗原表位预测的标准方法，全面分析上述2365 aa长度的β-胞衬蛋白二级结构，确定其抗原决定簇；

B)按抗原趋势指数排列，计算分析得出较好的抗原表位序列，合成候选的若干条多肽，通过免疫检测，得到了一条敏感性和特异性均很高的抗原多肽；

C)通过添加不同数量的氨基酸重新合成含有该序列的多肽，经免疫检测也显示很好的抗原抗体反应，得到具有抗原表位活性的多肽及其对应的衍生物。

3、一种用于检测干燥综合征患者的免疫学方法，其特征在于：将如权利要求1所述的β-胞衬蛋白表位多肽作为抗原，采用单特异性ELISA法检测干燥综合征患者血清抗β-胞衬蛋白多肽IgG抗体。

4、根据权利要求3所述的免疫学方法，其特征在于：所述的ELISA法中，包被缓冲液的pH值为9.0，反应离子浓度为1×PBS。

5、根据权利要求3所述的免疫学方法，其特征在于：所述的ELISA法中，抗原多肽即所述β-胞衬蛋白表位多肽的包被量为50ng。

6、根据权利要求3所述的免疫学方法，其特征在于：所述的ELISA法中，将业内统一的封闭用正常兔血清经特定处理后作为封闭液，所述的特定处理的具体程序为：将封闭用正常兔血清先62℃灭活20分钟，然后在25ml灭活过的封闭用正常兔血清中加入0.3275g Tris、0.21915g NaCl，再用HCl调至pH8.0。

7、如权利要求1所述的β-胞衬蛋白抗原表位多肽在制备诊断干燥综合征的药物中的应用。

8、含有如权利要求1所述的β-胞衬蛋白抗原表位多肽的诊断干燥综合征的试剂盒。

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