CN113219172A - 一种检测肿瘤抗原ova12血清抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测肿瘤抗原OVA12血清抗体的方法，包括如下步骤：一：收集大量不同类型的肿瘤患者血清样本，并通过体外原核表达方法，纯化获得大量OVA12完整蛋白抗原；二：通过OVA12抗体阳性肿瘤患者血清及两株OVA12单克隆抗体，利用生物信息学方法分析获得的表位肽段，分析筛选OVA12抗原B细胞表位肽段序列；三：应用步骤二候选OVA12的B细胞表位肽段，结合OVA12完整蛋白抗原，采用ELISA技术大样本检测肿瘤患者血清OVA12抗体和OVA12单克隆抗体与上述肽段及完整抗原的免疫反应强度，筛选出OVA12的优势B细胞表位肽段；四：建立基于优势B细胞表位肽段的OVA12血清抗体标准化定量ELISA检测方法。本检测方法可对恶性肿瘤进行早期筛查。
Description
技术领域
本发明涉及医疗检测技术领域，具体涉及一种检测肿瘤抗原OVA12血清抗体的方法。
背景技术
肿瘤抗原OVA12是通过重组cDNA表达文库血清学分析技术(SEREX)构建卵巢癌cDNA文库筛选得到的一个新的基因；由于该基因发现于卵巢癌，其分子量为12KD，故将其命名为肿瘤抗原OVA12。该基因定位于人染色体9q34.3，mRNA全长939bp，含有345bp的开放读码框，编码114个氨基酸，等电点为8.95。该抗原主要定位于细胞浆；在多种肿瘤细胞中高表达，而在正常细胞株中不表达或低表达。收集临床不同来源肿瘤组织和相应癌旁组织，应用免疫组化技术检测OVA12抗原表达水平，结果显示，与癌旁组织相比，OVA12在肿瘤组织中呈特征性高表达，而且与肿瘤的分期呈正相关。收集23例正常人和121例肿瘤患者血清，采用ELISA技术检测上述血清中OVA12抗体水平，结果显示肿瘤患者血清OVA12抗体水平明显高于正常人，具有显著的统计学意义。
近年来我国恶性肿瘤发病率与死亡率持续上升。由于早期多无特异性症状，多数患者出现有症状并就诊时已是中晚期，预后较差。肿瘤早期诊断及并早期治疗是改善肿瘤预后的根本出路。因此，发现新的肿瘤标志物，不仅能挽救一个患者的生命，也能减轻国家在中晚期肿瘤领域的沉重的医疗负担。肿瘤抗原血清抗体的检测可用于肿瘤的早期诊断和预后评价。以往，研究人员通过克隆、表达和纯化完整蛋白抗原，利用完整的抗原检测血清中对应抗体。此法过程复杂，表达效率不高且纯化难度大，不适合临床检测应用。随着免疫学技术的发展，人工合成肿瘤抗原完整蛋白的抗原表位肽段来代替完整蛋白进行检测已成为目前研究的发展趋势。
发明内容
为解决上述问题，本发明一种检测肿瘤抗原OVA12血清抗体的方法，通过生物信息学分析，获取OVA12抗原的优势表位肽段，建立新型人OVA12血清抗体的标准化ELISA检测方法，可用于恶性肿瘤的早期筛查和辅助诊断。
本发明技术方案如下：
一种检测肿瘤抗原OVA12血清抗体的方法，包括如下步骤：
步骤一：收集大量不同类型的肿瘤患者血清样本，并通过体外原核表达方法，纯化获得大量OVA12完整蛋白抗原。
步骤二：通过OVA12抗体阳性肿瘤患者血清及两株OVA12单克隆抗体，利用生物信息学方法分析获得的表位肽段，分析筛选OVA12抗原B细胞表位肽段序列。
步骤三：应用步骤二候选OVA12的B细胞表位肽段，结合OVA12完整蛋白抗原，采用ELISA技术大样本检测肿瘤患者血清OVA12抗体和OVA12单克隆抗体与上述肽段及完整抗原的免疫反应强度，筛选出OVA12的优势B细胞表位肽段。
步骤四：根据步骤三实验结果，建立基于优势B细胞表位肽段的OVA12血清抗体标准化定量ELISA检测方法，通过完善相关实验操作，不断提高该方法的特异性、敏感性和准确性。
如上所述的一种检测肿瘤抗原OVA12血清抗体的方法，其具体步骤为：
步骤一：收集大量乳腺癌、宫颈癌、肠癌、胃癌及肝癌组织不同类型和分期患者和正常人血清标本。收集的各种肿瘤类型血清和正常人血清分布在500例以上。
步骤二：将pET32a-OVA12质粒转化至感受态细胞BL21中制备重组菌，在含氨苄青霉素的LB培养基中37℃孵育过夜；随即接种菌液至新鲜的LB培养基中，37℃摇床培养至A600为0.6-0.8时加入IPTG在30℃诱导5h；然后收集菌体，超声裂解，并按照原核表达蛋白纯化试剂盒技术步骤进行纯化。纯化后的血清样本，采用SDS-PAGE鉴定其纯度，并用BCA法测定蛋白浓度。
步骤三：利用噬菌体展示技术，通过OVA12阳性肿瘤病人血清和已制备OVA12单克隆抗体，经过三轮淘选、克隆测序，获取几段候选OVA12抗原B细胞表位肽序列。
步骤四：取OVA12抗体阳性的大样本肿瘤患者血清和已制备的OVA12单抗，采用标准ELISA法对人工合成获得的候选OVA12抗原B细胞表位肽和OVA12完整蛋白抗原进行检测，观察抗原抗体反应强度，筛选出OVA12的优势线性B细胞表位。
进一步的，ELISA法详细步骤为：
S1：将OVA12抗原多肽片段和完整蛋白抗原用ELISA包被稀释至100μg/ml，每孔100μl包被96孔板，4℃包被过夜；
S2：洗涤后经5％脱脂牛奶-PBS于37℃封闭1h；
S3：随后分别加入1:500稀释度的健康人血清和不同类型的肿瘤患者血清作为一抗，每一例血清均设3个复孔，37℃孵育1h；
S4：洗板三次；
S5：加入100μlHRP标记的羊抗鼠IgG在37℃孵育1h；
S6：然后加入TMB显色；
S7：显色结束后用2N H2SO4终止显色，在波长450nm处测量OD值。
步骤五：根据步骤四的实验结果，建立基于优势线性B细胞表位的OVA12血清抗体标准化定量ELISA检测方法，不断提高定量ELISA检测方法的特异性、敏感性和准确性。
本发明的有益效果在于：本发明通过生物信息学分析，获取OVA12抗原的优势表位肽段，建立新型人OVA12血清抗体的标准化ELISA检测方法，可用于恶性肿瘤的早期筛查和辅助诊断。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，本申请的方案和优点对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。
在附图中：
图1为肿瘤抗原OVA12抗原表位鉴定图；
图2为肿瘤患者血清抗OVA12抗体表达水平(OVA12全抗原)结果图；
图3为肿瘤患者血清抗OVA12抗体表达水平(抗原多肽3)结果图。
具体实施方式
下面将结合附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。需要说明，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员，可以以各种形式实现本公开，而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例
一种检测肿瘤抗原OVA12血清抗体的方法，其具体步骤为：
步骤一：收集大量乳腺癌、宫颈癌、肠癌、胃癌及肝癌组织不同类型和分期患者和正常人血清标本。收集的各种肿瘤类型血清和正常人血清分布在500例以上。
步骤二：将pET32a-OVA12质粒转化至感受态细胞BL21中制备重组菌，在含氨苄青霉素的LB培养基中37℃孵育过夜；随即接种菌液至新鲜的LB培养基中，37℃摇床培养至A600为0.6-0.8时加入IPTG在30℃诱导5h；然后收集菌体，超声裂解，并按照原核表达蛋白纯化试剂盒技术步骤进行纯化。纯化后的血清样本，采用SDS-PAGE鉴定其纯度，并用BCA法测定蛋白浓度。
步骤三：利用噬菌体展示技术，通过OVA12阳性肿瘤病人血清和已制备OVA12单克隆抗体，经过三轮淘选、克隆测序，获取几段候选OVA12抗原B细胞表位肽序列。肿瘤抗原OVA12抗原表位分析具体采用如下步骤：
S1：利用ExPASy服务器，依据Hopp&Woods亲水性参数、Janin可及性参数、Zimmerman极性参数及柔韧性参数进行预测。
S2：利用Predicprotein服务器预测肿瘤抗原OVA12二级结构。
S3：利用BcePred服务器预测肿瘤抗原OVA12B细胞表位。
S4：多种预测综合分析获得三段抗原多肽段，序列分别为多肽1：RRLAGIKVQIEASPC；多肽2：PARGHCQDHAS；多肽3：CRKKNRVAVFELPGT，具体参见图1。
步骤四：取OVA12抗体阳性的大样本肿瘤患者血清和已制备的OVA12单抗，采用标准ELISA法对人工合成获得的候选OVA12抗原B细胞表位肽和OVA12完整蛋白抗原进行检测，观察抗原抗体反应强度，筛选出OVA12的优势线性B细胞表位。
进一步的，采用ELISA法检测肿瘤患者OVA12抗体水平的详细步骤为：
S1：从-80℃冰箱中取出纯化的OVA12抗原，冰上融化。
S2：用ELISA包被液将OVA12抗原稀释至1ng/μl，用12孔移液器每孔100μl加至96孔酶标板中，盖上盖膜，4℃包被过夜。
S3：用200μl/孔的0.1％PBST洗板并使板充分干燥，重复3次。
S4：加入每孔100μl的ELISA封闭液，37℃孵育1小时。
S5：用200μl/孔的0.1％PBST洗板并使板干燥，重复3次。
S6：将健康人及肿瘤患者血清用ELISA稀释液以1:500的稀释比进行稀释，每孔分别加入100μl，每个样品设3个复孔，并设置不加血清的阴性对照，盖膜后37℃孵育1小时。
S7：用200μl/孔的0.1％PBST洗板并使板干燥，重复3次。
S8：将带HRP标记的羊抗人二抗用ELISA稀释液按1:1000的比例进行稀释，每孔加入100μl，盖膜后37℃孵育1小时。
S9：用200μl/孔的0.1％PBST洗板并使板干燥，重复3次。
S10：向96孔板中加入每孔100μl的TMB显色液，室温避光显色20分钟后用2M H2SO4终止显色。
S11：用酶标仪检测波长450nm处的吸光值，用Graphpad软件分析数据并作图。
进一步的，采用ELISA法，以抗原多肽3片段作为抗原检测健康人及肿瘤患者血清抗OVA12抗体的表达含量，三段多肽的浓度分别为多肽1：0.063mg/ml、多肽2：0.071mg/ml、多肽3：0.102mg/ml，将三段多肽稀释至1ng/μl，其余包被、封闭、洗板、一抗二抗孵育以及显色方法同OVA12融合蛋白检测肿瘤患者中抗体表达含量的方法相同。终止显色后用酶标仪检测波长450nm处的吸值用Graphpad软件分析数据并作图。
步骤五：根据步骤四的实验结果，建立基于优势线性B细胞表位的OVA12血清抗体标准化定量ELISA检测方法，不断提高定量ELISA检测方法的特异性、敏感性和准确性。
检测例
参见图2，应用纯化OVA12抗原检测时，肿瘤患者血清组OD450值为0.2740±0.0084，高于健康人血清组的OD450值(0.2371±0.0086)，两组间有显著统计学差异(*P<0.05)。肿瘤患者血清包括151例肠癌、53例胃癌、12例肝癌、5例膀胱癌和13例乳腺癌患者的血清。以高于健康人血清的OD450平均+2SD值作为阳性，统计显示肿瘤患者血清中有43例显阳性，阳性率为18.4％。
参见图3，应用抗原多肽3检测时，肿瘤患者血清组的OD450值为0.4408±0.2323，高于健康人血清组的OD450值(0.2856±0.1534)，两组具有显著的统计学差异(***P<0.001)，以高于健康人血清的OD450平均+2SD值作为阳性，单抗B10B9、B11F8均未检测到多肽1和多肽2有反应性，而多肽3与B10B9和B11F8均呈现随稀释度增大而逐渐递减的反应，纯化的OVA12抗原也具有同样趋势，但相同浓度的多肽3的反应性明显高于OVA12纯化抗原，说明B10B9和B11F8识别同一抗原表位，该抗原表位位于OVA12蛋白的第101-114个氨基酸残基序列。抗原多肽3检测相比OVA12全抗原检测，两组显著性增大肿瘤患者血清组的阳性率提高，表明抗原多肽3检测更具有临床应用价值。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或增减替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (5)
1.一种检测肿瘤抗原OVA12血清抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：收集大量不同类型的肿瘤患者血清样本，并通过体外原核表达方法，纯化获得大量OVA12完整蛋白抗原；
步骤二：通过OVA12抗体阳性肿瘤患者血清及两株OVA12单克隆抗体，利用生物信息学方法分析获得的表位肽段，分析筛选OVA12抗原B细胞表位肽段序列；
步骤三：应用步骤二候选OVA12的B细胞表位肽段，结合OVA12完整蛋白抗原，采用ELISA技术大样本检测肿瘤患者血清OVA12抗体和OVA12单克隆抗体与上述肽段及完整抗原的免疫反应强度，筛选出OVA12的优势B细胞表位肽段；
步骤四：根据步骤三实验结果，建立基于优势B细胞表位肽段的OVA12血清抗体标准化定量ELISA检测方法，通过完善相关实验操作，不断提高该方法的特异性、敏感性和准确性。
2.根据权利要求1所述的一种检测肿瘤抗原OVA12血清抗体的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
步骤一：收集大量乳腺癌、宫颈癌、肠癌、胃癌及肝癌组织不同类型和分期患者和正常人血清标本；
步骤二：将pET32a-OVA12质粒转化至感受态细胞BL21中制备重组菌，在含氨苄青霉素的LB培养基中37℃孵育过夜；随即接种菌液至新鲜的LB培养基中，37℃摇床培养至A600为0.6-0.8时加入IPTG在30℃诱导5h；然后收集菌体，超声裂解，并按照原核表达蛋白纯化试剂盒技术步骤进行纯化；
步骤三：利用噬菌体展示技术，通过OVA12阳性肿瘤病人血清和已制备OVA12单克隆抗体，经过三轮淘选、克隆测序，获取几段候选OVA12抗原B细胞表位肽序列；
步骤四：取OVA12抗体阳性的大样本肿瘤患者血清和已制备的OVA12单抗，采用标准ELISA法对人工合成获得的候选OVA12抗原B细胞表位肽和OVA12完整蛋白抗原进行检测，观察抗原抗体反应强度，筛选出OVA12的优势线性B细胞表位；
步骤五：根据步骤四的实验结果，建立基于优势线性B细胞表位的OVA12血清抗体标准化定量ELISA检测方法，不断提高定量ELISA检测方法的特异性、敏感性和准确性。
3.根据权利要求2所述的一种检测肿瘤抗原OVA12血清抗体的方法，其特征在于，步骤四中ELISA法详细步骤为：
S1：将OVA12抗原多肽片段和完整蛋白抗原用ELISA包被稀释至100μg/ml，每孔100μl包被96孔板，4℃包被过夜；
S2：洗涤后经5％脱脂牛奶-PBS于37℃封闭1h；
S3：随后分别加入1:500稀释度的健康人血清和不同类型的肿瘤患者血清作为一抗，每一例血清均设3个复孔，37℃孵育1h；
S4：洗板三次；
S5：加入100μlHRP标记的羊抗鼠IgG在37℃孵育1h；
S6：然后加入TMB显色；
S7：显色结束后用2N H2SO4终止显色，在波长450nm处测量OD值。
4.根据权利要求2或3所述的一种检测肿瘤抗原OVA12血清抗体的方法，其特征在于，步骤一中收集的各种肿瘤类型血清和正常人血清分布在500例以上。
5.根据权利要求2或3所述的一种检测肿瘤抗原OVA12血清抗体的方法，其特征在于，步骤二中纯化后的血清样本，采用SDS-PAGE鉴定其纯度，并用BCA法测定蛋白浓度。
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