CN103842825A - 用于诊断阿耳茨海默氏病(ad)的方法 - Google Patents

用于诊断阿耳茨海默氏病(ad)的方法 Download PDF

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Abstract

公开了一种用于诊断阿耳茨海默氏病(AD)的方法，其中检测怀疑具有AD的人的生物学样品中的Aβ特异性抗体，其包括下列步骤：-使所述样品与Aβ聚集体或与具有Aβ聚集体样表面的颗粒接触，并且容许所述Aβ特异性抗体结合所述Aβ聚集体，并-通过单一颗粒检测技术(single particle detection technique)，优选通过荧光活化细胞分选(FACS)检测与所述Aβ聚集体结合的所述Aβ特异性抗体；且其中与已知AD状态的样品中的量比较检出的Aβ特异性抗体的量。

Description

用于诊断阿耳茨海默氏病(AD)的方法
本发明涉及用于检测生物学样品中的Aβ特异性抗体及的方法，尤其与阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)有关及用于诊断阿耳茨海默氏病。
AD是一种复杂的进行性病症，其牵涉使病理学级联，包括脑中的淀粉状蛋白-β聚集和斑形成，tau蛋白的超磷酸化(hyperphosphorylation)与神经元内缠结的形成相互作用。伴随这些脑蛋白质的聚集和超磷酸化，炎性过程促成突触完整性的丧失和进行性神经变性。
淀粉状蛋白β肽(Aβ或A-beta)从具有主要为alpha-螺旋或无规卷曲二级结构的可溶性形式转化成具有beta-片层二级结构的聚集形式(其最终在脑中形成淀粉状蛋白斑)代表AD病理学的第一标志之一。Aβ的几种形式，即C及N端截短的或经修饰的肽促成脑中的Aβ斑形成。Aβ的三种主要C端变体包括肽Aβ1-40(由40个氨基酸(aa)组成，Val-40为最后一个aa)，Aβ1-42，和Aβ1-43。除了C端截短肽的这些主要形式外，还存在不太频繁出现的其它截短形式，即Aβ1-37，Aβ1-38，和Aβ1-39。Aβ的N端变体由Aβ3-40/42/43和Aβ11-40/42/43组成。在所有这些N端截短形式中，谷氨酸占据第一个位置。此aa不是稳定的，而是经历变化以建立焦谷氨酸(pE)，导致形成Aβp(E)3-40/42和Aβp(E)11-40/42。pE残基自发形成或者通过称为谷氨酰基环化酶的酶酶促形成。
直到最近，AD的诊断是完全临床诊断，其基于至少两个领域(例如认识，功能)的认知缺陷的逐渐发生，这在没有另一种可辨别原因(例如血管)的情况中负面影响患者的日常生活。AD的临床诊断的限制是误诊的高比率(专家为80%诊断特异性)和如下的实情，即仅可以在疾病已经停止导致功能性缺陷的实质性神经元丧失的晚期时间点时做出诊断。
基于经过过去20年搜集的知识，诊断AD的方式在快速变化。一组由B.Dubois（巴黎）领导的研究人员第一次整合数据，其已经从调查出现AD根本的病理学，出现诊断性算法(Dubois等,Lancet Neurol.9(2010):1118-1127)。依照作者，AD的诊断基于特定的认知缺陷(情景记忆的变化)，其必须与疾病特异性生物标志物的变化(如通过结构MRI评估的海马萎缩；AD典型的脑脊液标签(signature)(低A42，高总tau，高磷酸Tau)；阳性淀粉状蛋白成像；限定的遗传风险)组合发生。最近，NIH-NINCDS工作组已经很大程度上采用此病理生理学驱动的诊断算法(McKhann等,Alzheimer’s&Dementia7(2011):263-269)。主要出于实际目的，NIH NINCDS工作组保留AD型的MCI(轻度认知损伤)为AD的早期阶段的诊断。
由国立老龄化研究所(National Institute of Aging)(NIA,NIH,USA)和阿尔茨海默协会(Alzheimer Association)任命的工作组已经采用如下的观念，即依靠反映疾病病理学的生物标志物增强AD的临床诊断。通过这样做，AD不再是通过排除进行的诊断，而是开始为正面诊断。NIA和AA没有完全遵循由Dubois及同事提出的生物标志物驱动的算法的实情反映目前可用的生物标志物的限制。AD脑脊液(CSF)标签可以作为一个例子讨论。AD患者的CSF显示典型的样式，即Aβ1-42的降低和总Tau(tTau)和磷酸Tau(pTau)的升高。标签存在于AD患者中，但是没有随时间检出变化。实际上，在有AD风险的患者(即MCI患者)群体中，其鉴定出继续形成临床症状的人。已经处于所述阶段，CSF显示与在充分发展的AD患者中相同的表达样式和变化量。如此，虽然不可能限定Aβ1-42、tTau和pTau的正常范围，但是没有定义转折点，即给定患者中例如Aβ生理学从正常转化成病理学的时刻。任何目前遵循但尚未确认的生物标志物也就是如此。这点的主要原因是仅有几项评估此问题的纵向研究，因为由于它们对患者造成的风险和/或与其关联的成本而不可能容易地重复CSF、MRI、淀粉状蛋白成像检查。
如此，仍然缺乏可以以低风险和成本重复应用的可靠生物标志物。由于至今开发基于血液的生物标志物耗费的全部努力失败，情况尤其如此(Hampel等,Nat.Rev.Drug Discov.9(2010):560-574)。此类生物标志物的利用度对于疾病缓解疗法的开发会是最重要的。此类疗法施用得越早，成功的机会越大。而且，可以将此类努力限于借助于特定生物标志物鉴定的真正AD病例。
至今，已经在AD和MCI(AD的痴呆前阶段)中评估了Aβ(测试的各种Aβ种类和聚集体状态)。最近的发现显示了存在有AD患者和健康对照的血浆和脑脊液中含有的IgG和IgM的抗促淀粉状变(amyloidogenic)活性(O’Nuallain等,J.Clin.Immunol.30(2010)Suppl.1:S37-S42;Marcello等,J Neural.Transm.116(2009):913-920)。通过评估对各种Aβ形式/聚集状态特异性的IgG和/或IgM的ELISA或免疫沉淀测定法获得的结果显示了AD和MCI患者比健康对照展现出更低水平的血清Aβ自身抗体。虽然这些研究显示了自身抗体浓度的差异，使用的方法缺乏灵敏性和特异性，其对于使用它们作为以高选择性和特异性鉴定AD或MCI患者的预测性诊断工具会是必需的。至今使用的大多数方法基于ELISA技术。为了提高这些测定法的灵敏性，一些方法使用Aβ1-42肽的放射性标记。用经氯胺T标记的Aβ1-42使用免疫沉淀测定法来测量健康对照和AD患者之间的差异，Brettschneider等,(Brettschneider等,Biol.Psychiatry57(2005):813-817)的ROC(接收器工作特性)分析在灵敏性设置为81.3%时达到46.7%的特异性。比较而言，Bayer等(WO2010/128139A1;Marcello等,JNeural.Transm.116(2009):913-920)使用基于ELISA的方法，其中将焦谷氨酸-Aβ片段在板上包被。在此情况中，用抗IgM-HRP抗体检测健康对照和AD患者中的抗Aβ特异性IgM-自身抗体显示了在灵敏性设置为80%时特异性是60%。至今，这些方法无一满足会使它们符合作为AD的预测性生物标志物(>80%特异性)的标准。
不知道这两组患者中降低的Aβ特异性抗体血清浓度的原因。有两种一般且非互相排斥的解释：降低的生成(疾病特异性对一般免疫衰老)和再分布(抗体在例如脑中存在的淀粉状蛋白沉积物中包载)。关于这些Aβ同源性(自身)抗体的潜在功能的支持来自最近的研究，其证明了商品化血液产品，即从源自健康供体的血浆提取的合并IgG级分已经显示为含有对Aβ肽特异性的抗体。两家不同公司的两种此类产品，即静脉内免疫球蛋白(IVIG)制剂目前在进行临床测试以评估其干扰或预防AD病理学的潜力。
另一个未答复的问题是Aβ特异性抗体的水平在疾病实体中是否降低，所述疾病实体在其病理生理学，即帕金森氏痴呆(PDD)、痴呆伴路易体(DLB)、脑淀粉样血管病(CAA)、慢性头部创伤(例如拳击)中具有Aβ组分。这些疾病中Aβ聚集体特异性抗体水平的调查可以添加至对导致AD中Aβ聚集体特异性抗体的血清浓度降低的过程的目前了解。具有这些疾病的患者的血清的调查可以澄清如下的问题，该问题关于AD是否源自特定的免疫缺陷(在Aβ特异性抗体滴度仅在AD中而不在以Aβ病理学为特征的其它疾病中降低的情况中)或者降低的Aβ特异性抗体水平是否源自由于广泛的Aβ病理学所致的再分布。在前一种情况中，测试会是高度疾病特异性的生物标志物，并且因此应当有助于区别AD与前述疾病实体。假设第二种情况，测试可以适合于鉴定疾病由Aβ病理学驱动的患者。
在WO2010/128139A1中，公开了用于诊断AD的生物标志物和方法，尤其是针对pGlu Aβ的抗体。Funke等(Curr.Alz.Res.,6(3)(2009):285-289)讨论了体液中Aβ聚集体的检测是否是适合于AD早期诊断的方法。Maetzler等(J.Alz.Dis.26(1)(2011):171-179)报告了针对淀粉状蛋白和神经胶质衍生的抗原的自身抗体在路易体关联痴呆的血清和脑脊液中升高。Funke等(Rejuv.Res.13(2-3)(2010):206-209)公开了用于Aβ聚集体的单一颗粒检测系统。Fukumoto等(Faseb J.,1(24)(2010):2716-2726)公开了高分子量β-淀粉状蛋白寡聚体在AD患者的脑脊液中升高。
本发明的目的是提供用于改善AD的诊断，尤其是用于追踪疾病的早期阶段及用于观察用于治疗AD的药物的临床试验发展的方法。别的目的是提供用于检测生物学样品中，尤其是人AD患者或怀疑具有AD或有风险形成AD的人个体中的抗Aβ抗体的可靠工具。本发明的目的是提供用于检测生物学样品中，尤其是人AD患者或怀疑具有或者有风险形成AD的人个体的样品中的抗Aβ抗体的手段。
因此，本发明提供了用于诊断阿耳茨海默氏病(AD)的方法，其中检测怀疑具有AD的人的生物学样品中的Aβ特异性抗体，其包括下列步骤：
-使所述样品与Aβ聚集体或与具有Aβ聚集体样表面的颗粒接触，并且容许Aβ特异性抗体结合Aβ聚集体，并
-通过单一颗粒检测技术，优选通过荧光活化细胞分选(FACS)检测与Aβ聚集体结合的Aβ特异性抗体；
且其中与已知AD状态的样品中的量比较检出的Aβ特异性抗体的量。
本发明，公开了检测Aβ特异性自身抗体的新方法，用作对诊断AD并监测AD的形成非常有用的诊断工具。本方法基于如下的发明，不仅使用单一Aβ肽作为Aβ特异性抗体的捕捉工具，而是取而代之，使用Aβ聚集体，且由此使用单一颗粒检测技术检测生成的抗体-Aβ聚集体复合物，且此类抗体的量与AD的形成相关联。通过本方法检出的量越低，就AD而言的疾病状态越晚期。简言之，例如通过过夜温育生成Aβ聚集体(源自不同Aβ截短的和经修饰的型式)。随后，将Aβ聚集体与源自健康供体(HD)或AD患者的血清样品一起温育以容许本抗体(IgG和IgM两者)的结合。可以通过本领域技术人员可用的任何合适的方法，例如通过使用识别与Aβ聚集体结合的Aβ特异性抗体的经标记的二抗检测与Aβ聚集体结合的抗体。例如，可以使用经藻红蛋白(PE)标记的二抗。此后，使用单一颗粒检测技术，诸如FACS(荧光活化细胞分选)分析(又称为流式细胞术)测量包含与Aβ聚集体结合的Aβ特异性抗体(和任选一种或多种检测剂，诸如二抗)的免疫复合物。使用依照本发明的方法，可以显示与健康受试者相比，AD患者含有较少的Aβ特异性免疫球蛋白，其对依照本发明提供的Aβ聚集体(游离的Aβ特异性免疫球蛋白)有反应性。此外，使用依照本发明的方法，可以显示源自AD患者的Aβ特异性免疫球蛋白(针对依照本发明提供的Aβ聚集体)的反应性可以通过称为解蔽(从自身抗体除去潜在结合的Aβ抗原)的方法提高。这与来自健康受试者(其中在以特殊方式处理这些血清后不能检出针对Aβ聚集体的反应性的此类升高)的Aβ特异性免疫球蛋白的反应性形成对比。另一方面，解蔽(=血清中已经结合的Aβ解离)后IgM抗体的反应性揭示了AD患者中升高的IgM水平。另外，还测定具有和没有解蔽情况下IgG水平之间的差(delta(Δ)值)。与健康对照相比，此参数在AD患者中也是升高的，显示在疾病的病理学状态中Aβ对抗体的较高抗体占据。此外，凭借本发明，提供了数据，其显示了与至今公开的方法相比，本方法具有高得多的检测Aβ特异性抗体的能力，如此具有高得多的诊断AD的能力。鉴于这些实情，依照本发明的方法满足预测性诊断工具鉴定AD及追踪给定患者对治疗的临床响应的理论前提。
本发明开发用于分析人样品中的Aβ特异性抗体。因此，优选的实施方案是检测人Aβ特异性抗体，优选人IgG或IgM抗体，尤其是人IgG抗体。如已经提及的，人中Aβ特异性抗体的检测原则上是本领域中已知的；然而，不能证实作为可能的生物标志物的作用。如用本发明显示的，这也是由于本领域中可用的检测方法的分析不足所致。由于依照本发明的方法的优越性，实现人样品中的这些抗体作为生物标志物的利用度。因此，本发明特别适合于检测生物学样品中的自身抗体。因而，在本方法的一个优选的实施方案中，要检测和量化的Aβ特异性抗体是自身抗体。
与现有技术方法形成对比，本方法使用Aβ聚集体作为探针用于结合来自样品的Aβ特异性抗体。虽然此类聚集体原则上是本领域中已知的，但是没有认识到在分析Aβ特异性抗体(尤其在人样品中)中使用此类聚集体可以显著改善还与单一颗粒检测技术，诸如FACS组合的此类方法。由于使用此类聚集体，用单一颗粒检测技术(其是多个不同领域中且用于不同问题的建立技术)的检测对于分析人样品(诸如血液)中的Aβ特异性抗体是可能的，所述人样品通常是非常复杂且难以处理的。
优选地，要依照本发明使用的聚集体的尺寸经标准化以进行分析使用。这可以通过在生成聚集体期间建立某些参数完成。根据生成聚集体期间应用的条件，可以调节聚集体的大小。依照本发明的Aβ聚集体的优选大小是50nm至15μm，优选100nm至10μm，尤其是200nm至5μm(以聚集体的长度(即最常的延伸)限定)。
提供适合于本发明的聚集体的优选方法包括如下的步骤，即于2至9的pH将Aβ-1-42肽，Aβ-1-43肽，Aβ-3-42或Aβ-p(E)3-42肽或不太优选C端截短的Aβ肽，诸如Aβ-1-40肽温育至少20分钟，优选至少1小时，尤其是至少4小时。温育的持续时间是调节聚集体大小的参数之一：温育越长，聚集体越大。典型的温育时间是10分钟至24小时。较短的温育时间通常导致仅非常短的聚集体和少量的聚集体；在显著长于48小时的温育时间的情况中生成的聚集体通常不是本方法中优选的。当然，也可以将聚集体分选并“筛选”以达到期望的大小(若想要的话)，例如通过分级离心和类似的技术进行。
依照本方法，使其中要检测Aβ特异性抗体的样品与Aβ聚集体接触以实现样品中可能存在的Aβ特异性抗体(和反应性相对Aβ聚集体)结合。因此，必须调节Aβ聚集体的浓度以提供对于抗体足够的结合位置。因而，优选地，用于结合样品中的抗体的Aβ聚集体的浓度在0.001至1μM，优选0.01至0.1μM的范围中。最佳浓度还依赖于要结合的抗体的性质，样品的性质，计划的接触时间和聚集体的大小。
本方法主要用于对人样品应用。因此，优选的是，生物学样品是人血液或源自人血液的样品，优选人血清或人血浆；人脑脊液或人淋巴。凭借此类样品来源，还可以建立连续且常规的测试(尤其对于源自血液的样品)。
容许样品中的抗体与聚集体适当结合的优选接触时间是至少10分钟(例如10分钟至48小时)，优选15分钟至24小时，尤其是30分钟至2小时。
若生物学样品没有特别预处理，则具有对Aβ聚集体的结合能力的Aβ特异性抗体会在与Aβ聚集体接触期间被结合。依照本发明的方法不会检出样品中遮蔽的Aβ特异性抗体(即那些已经与结合配偶(例如包含Aβ的结构，或内源Aβ肽)结合的抗体)(缺乏此类特定样品预处理)。虽然仅反应性抗体的鉴定和量化在许多情况中会是足够且期望的，但是可以有如下的情况或诊断问题，其中应当检测样品中Aβ特异性抗体的总量(反应性和非反应性)或全部的、反应性Aβ特异性抗体，非反应性(“遮蔽”)的数目和Aβ特异性抗体的总数。
因此，依照本发明的另一个优选的实施方案，将样品解蔽，即在与依照本发明的Aβ聚集体接触前将Aβ特异性抗体从对样品中存在的结合配偶的任何结合“释放”。这容许检测样品中的所有Aβ特异性抗体而不仅仅检测那些没有与样品中的结合配偶结合的抗体(“游离的”或“反应性”抗体)。在本发明的过程中，在本发明的过程中，确定了反应性Aβ特异性抗体，尤其是反应性Aβ特异性IgG的量是用于AD诊断和形成的关键标志物。如上文所述，本方法还适合于测定样品中的Aβ特异性抗体总体量，即游离的(或“反应性”)抗体及那些在样品中已经(例如与Aβ结构)结合的抗体。这可以有助于建立样品中反应性对非反应性抗体的差(Δ)，即对于AD诊断也有重大意义的参数。虽然此类差在具有就AD而言的“健康状态”的人中不存在(或较低)，此差对于AD中的标志物功能(关于Aβ特异性IgG和Aβ特异性IgM)是至关重要的。为了使用Aβ特异性IgM作为用于AD诊断的参数，实施本方法前的解蔽步骤是特别优选的，如此样品中反应性对非反应性抗体的差(Δ)会限定并用作相关参数。
依照本发明的方法应用单一颗粒检测技术。此类技术容许鉴定并量化(“计算”)Aβ特异性抗体对Aβ聚集体的“阳性”结合结果的数目和计数。此技术的一个优选的实施方案是FACS，其是一种在本领域中建立的技术。要用于检测与Aβ聚集体结合的抗体的其它检测方法是例如Luminex或质谱术。
依照Luminex技术，可以如材料和方法中描述的那样实施样品制备。在样品制备后，可以通过与荧光染色的微球偶联的二抗检测由特异性Aβ特异性抗体识别的Aβ聚集体，所述荧光染色的微球可以在多重检测系统，例如Luminex阅读器中检测(Binder等,Lupus15(2005):412-421)。
若使用质谱术作为单一颗粒检测技术，则也可以如在下文实施例部分的材料和方法中描述的那样实施样品制备。如描述的那样完成样品制备。在样品制备后，可以通过与过渡元素的稳定同位素偶联的二抗检测由特异性抗体识别的Aβ聚集体，所述过渡元素的稳定同位素可以通过原子质谱术检测。然后，可以将样品喷雾到加热至温度>5,500K的充满氩等离子体的感应线圈。将样品蒸发并离子化成其原子组成，并且通过飞行时间质谱术量化有同位素标签的抗体的数目(Janes等,Nat.Biotechnol.29(2011):602-604)。
或者，也有可能应用单一颗粒检测技术，其中一个结合配偶(Aβ聚集体或抗体/血清)是固定化的，但是在流动条件下测量结合。例子是Hybcell技术和表面等离振子共振技术。在本发明中使用Hybcell技术，可以将血清样品定位于Hybcell(旋转圆筒)表面上，并且可以与直接荧光标记的预温育的Aβ聚集体或备选与经荧光标记的单克隆Aβ特异性二抗一起实施温育。用激光检测与Aβ聚集体结合的抗体(Ronacher,Anagnostics Technical Note ANA-TN-005(2010))。若在依照本发明的方法中使用表面等离振子共振，可以应用相反设置：可以在芯片表面上固定化预温育的Aβ聚集体。可以通过芯片表面上质量增加检测来自血清的Aβ特异性抗体对芯片上Aβ聚集体的结合，因此结合配偶的无标记是必需的。为了提高灵敏性或者测定IgG亚型，抗IgG-AB的连续注射是有可能的(Cannon等,Anal.Biochem.328(2004):67-75)。代替对芯片表面直接固定化Aβ聚集体，可以使用捕捉抗体。对于此设置，将Aβ特异性抗体在芯片表面上固定化，接着注射预温育的Aβ聚集体。在捕获聚集体后，将血清注射，并通过质量增加测量反应性。
可以通过已知的任何合适的方法，例如荧光分光术实施检测Aβ特异性抗体对依照本发明的Aβ聚集体的结合(Missailidis等,Methods in MolecularBiology248(2003):431–441)，所述荧光分光术用于通过二抗(例如经标记的抗IgG或抗IgM二抗)检测与Aβ聚集体结合的Aβ特异性抗体。
还可以使用特异性结合抗体的底物，诸如蛋白A或蛋白G实施与聚集体结合的自身抗体的检测。另一种可能性是使用Aβ聚集体沉淀Aβ聚集体特异性自身抗体，清洗复合物，并将抗体生物素化。随后，然后可以使用链霉抗生物素蛋白作为第二步试剂。
依照本发明的一个优选的实施方案，具有Aβ聚集体样表面的颗粒是具有在其表面上固定化的Aβ聚集体的珠，尤其是磁珠。
已知AD状态的样品可以是任何样品值，其容许分类通过依照本发明的方法评估的样品。它可以是具有已知AD状态(例如没有AD的健康人，或AD患者，尤其是具有已知疾病状态的AD患者(例如通过简短精神状态检查(MMSE)测定))的人的真实的物理样品或比较数值，诸如校正曲线。优选的校正曲线包括AD状态校正曲线，尤其是MMSE曲线中同一类型的样品(例如血液样品)中Aβ特异性抗体的比较量。在标准化的测定系统中，依照本发明检测的Aβ特异性抗体的绝对量可以与AD状态相关联。在不同时间点时给定患者的Aβ特异性抗体的降低量指示疾病的进展。
还有可能为限定疾病状态(例如“健康”，轻度AD，晚期AD，或依照MMSE量表)限定样品中Aβ特异性抗体的某些阈值数值。阈值数值当然取决于样品和精确的检测系统，但是可以开发用于实施本发明的任何标准化方式。健康人的血清中的Aβ特异性IgG浓度通常介于1000和5000ng/ml之间，而AD患者的IgG浓度通常低得多，例如范围为250至1500ng/ml。大多数AD患者具有小于1000ng/ml。因此，依照本发明的一个优选的实施方案，样品中低于阈值水平的Aβ特异性抗体量的检出指示AD，其中阈值水平是1500ng/ml或更低，优选1000ng/ml或更低，尤其是750ng/ml或更低。另一方面，在AD治疗(尤其是通过免疫疗法的AD治疗)过程中此IgG浓度的上升指示成功的免疫疗法。例如，若水平从在750ng/ml下上升至超过1000ng/ml或甚至超过1500ng/ml，则这会指示成功的免疫疗法。
优选地，Aβ特异性抗体的检出量与从人取得样品同时同一人的MMSE结果相关联。
依照本发明的方法特别适合于在疾病形成方面监测给定的AD患者，尤其是用于将依照本发明的诊断结果与用于测定AD状态和/或用于监测治疗性干预的效率的其它诊断工具联系起来。因而，在本发明的一个优选的实施方案中，对在不同时间取得的同一患者的样品实施所述方法至少两次。优选地，将Aβ特异性抗体的检出量与从患者取得样品同时同一患者的MMSE结果联系起来。为了监测给定患者中AD的形成，优选的是以定期时间间隔实施依照本发明的方法，例如每6个月至少一次，优选每3个月至少一次，尤其是每个月至少一次。
因此，本方法特别适合于随时间以监测方式与AD诊断结合使用。凭借本发明，提供人患者中的Aβ特异性自身抗体作为AD状态的标志物。在其血液中具有“正常”Aβ特异性抗体水平的人就AD而言是“健康的”。若此水平在具有AD的患者或有风险形成AD或怀疑具有AD的受试者中是修饰的，则此类修饰水平与AD相关联。“修饰的”水平可以是Aβ特异性抗体的绝对数目修饰或Aβ特异性抗体(例如给定类别的Aβ特异性抗体(IgG，IgM，等))的总数的反应性的修饰。例如，降低的反应性Aβ特异性IgG与AD相关联，并且是AD的标志物。另一方面，在IgM的情况中，(非反应性；即结合的或遮蔽的)Aβ特异性IgM的水平改变为其他方向就AD而言具有标志功能。凭借本方法，在反应性Aβ特异性IgG的“健康”水平设置为100%时，反应性Aβ特异性IgG的显著降低，例如降低至70%和更低，至50%或更低或至30%和更低，指示AD形成。另一方面，在反应性Aβ特异性IgM的“健康”水平设置为100%时，血液样品中总IgM(反应性+非反应性)增加至少30%，例如至少50%或至少100%指示AD的形成。
因而，本发明的用途的一个优选领域是诊断阿耳茨海默氏病(AD)。然而，本发明可用于与Aβ联系或相关的所有病理学(“Aβ病理学”)，特别是疾病过程中出现Aβ沉积物的病理学而言，本发明还可用于免疫疗法。关于此类Aβ病理学的例子是帕金森氏痴呆(PDD)，痴呆伴路易体(DLB)，脑淀粉样血管病(CAA)，包含体肌炎(IBM；尤其是散发性IBM(sIBM))，或慢性头部创伤(例如拳击)。
由于本发明提供了用于AD及甚至用于AD形成的标志物，有可能使用此方法以观察疾病的形成和可能的治疗方法的性能，尤其是治疗方法是否使得能够建立Aβ特异性抗体，尤其是IgG或IgM的“健康”或“健康者”水平。
因此，优选地，使用本方法来监测AD患者，尤其是用治愈或改善AD的药物治疗的AD患者。可以成功应用本方法以在AD疫苗(例如用依照WO2004/062556A,WO2006/005707A,WO2009/149486A和WO2009/149485A的AD模拟位；或用依照WO99/27944A的Aβ衍生的疫苗)或Aβ靶向性疾病缓解药物的临床试验中观察患者。
也可以使用依照本发明的方法来评估形成AD的风险或检测早期阶段AD。凭借本发明，原则上有可能就Aβ特异性自身抗体而言在比认知损伤显著更早时间点检测患者的免疫学设置变化。若在常规测试形式中建立，则这就大得多的群体部分而言可以容许AD早期诊断的显著改善。这使患者适合AD的早期阶段治疗方案和/或预防(或延迟)策略，尤其是疫苗接种。
依照另一个方面，本发明涉及用于实施依照本发明的方法的试剂盒，其包含：
-Aβ聚集体，和
-样品容器，尤其是用于人样品(例如血液，血清，血浆)。
优选地，依照本发明的试剂盒可以进一步含有用于检测与Aβ特异性抗体结合的Aβ聚集体的手段，优选二抗，尤其是经标记的二抗，例如抗IgG或抗IgM抗体)。其它组分可以是标准品样品，阳性和/或阴性对照，使用说明书和合适的包装手段(例如稳固的盒，有色的管形瓶，等等)。
附图简述
本发明通过以下实施例和附图进一步例示，但是不限于此。
图1显示了使用FACS分析进行的Aβ聚集体大小测定。可以使用流式细胞术检测硫磺素(Thioflavin)T阳性Aβ1-42聚集体，并且其描绘为斑点印迹中FL1-FITC A(对数分度(log-scale))和FSC-A(对数分度)通道中的同质群体。使用商品化经校正的大小珠(1、2、4、6、10、和15μm)测定Aβ聚集体的大小分布(以FCS-A信号限定)，如FSC-A直方图(B)中显示的。
图2显示了使用基于FACS的测定法检测对Aβ聚集体的单克隆抗体反应性。Aβ1-42单克隆抗体3A5特异性结合Aβ1-42聚集体(A)，但是不与Aβp(E)3-42聚集体(C)相互作用。比较而言，Aβp(E)3-42特异性抗体D129结合Aβp(E)3-42而非Aβ1-42聚集体(B+D)。在FL2-PE通道中使用抗免疫球蛋白-经PE标记的二抗测定反应性。如B和C中显示的荧光强度代表背景染色，如在将聚集体与单独的经PE标记的二抗一起温育时看到的。
图3显示了三种不同方法的测定灵敏性的比较。(A)将Aβ1-42聚集体与IVIG稀释系列一起温育，并且使用流式细胞术在FL-2通道中测定反应性。(B)于pH9.2用Aβ1-42包被过夜的Maxisorp ELISA板上的IVIG滴定。(C)使用表面等离振子共振(BiaCore)对与SA-芯片上固定化的主要生物素化的Aβ1-42相互作用的不同浓度IVIG的无标记物检测。请注意为了比较，所有结果以倍数背景信号给出。
图4显示了测定指定血清样品中Aβ特异性IgG自身抗体反应性。将来自健康供体(年龄为30至50岁)的对照血清，或源自AD患者的血清进行描述的FACS测定法。在FL2-PE通道中评估Aβ聚集体的荧光强度，并且以中值荧光强度(MFI)表示。图5B显示了ROC曲线分析。比较来自源自AD患者的血清与源自健康供体的血清的IgM特异性抗Aβ1-42反应性。
图5显示了ROC曲线分析。比较源自AD患者的血清与源自健康供体的血清的IgG特异性抗Aβ1-42反应性。
图6显示了IgG反应性与简短精神状态检查(MMSE)得分的关联。对24名AD患者检查MMSE状态，并且将那些患者的血清进行描述的FACS测定法，并且测定中值FI。在结果和前图中显示了收集数据的关联。
图7显示了ROC曲线分析。比较源自AD患者的血清与源自健康供体的血清的IgG特异性抗Aβ3-42反应性。
图8显示了ROC曲线分析。比较源自AD患者的血清与源自健康供体的血清的IgG特异性抗Aβp(E)3-42反应性。
图9A显示了测定指定血清样品中Aβ特异性IgM自身抗体反应性。将来自健康供体的对照血清，或源自AD患者的血清进行描述的FACS测定法。在FL2-PE通道中评估Aβ聚集体的荧光强度，并且以中值荧光强度(MFI)表示。图9B显示了ROC曲线分析。比较来自源自AD患者的血清与源自健康供体的血清的IgM特异性抗Aβ1-42反应性。
图10显示了抗体解蔽后指定血清样品中Aβ特异性IgM自身抗体反应性的测定。将来自健康供体(HI)的对照血清，或源自AD患者的血清进行描述的解蔽方法和随后的FACS测定法。在FL2-PE通道中评估Aβ聚集体的荧光强度，并且以中值荧光强度(MFI)表示。
图11显示了ROC曲线分析。在自身抗体解蔽后比较来自源自AD患者的血清与源自健康供体的血清的IgM特异性抗Aβ1-42反应性。
图12显示了ROC曲线分析。在抗原解离之前和之后分析源自AD患者的血清和源自健康个体的血清的IgG特异性抗Aβ1-42反应性。使用Delta值，计算ROC曲线。
图13显示了代表用AFFITOPE疫苗处理的患者中在疫苗接种之前，期间和之后Aβ聚集体特异性IgG抗体的绝对MFI值。显示了源自在具有(患者A)和没有明矾(患者B)的情况中免疫的患者的血清的Aβ1-42反应性。在FL2-PE通道中评估Aβ聚集体的荧光强度，并且以MFI表示。
图14显示了在具有和没有明矾的情况中用AFFITOPE疫苗免疫的患者的以中值MFI数值表示的针对Aβ1-42聚集体的免疫反应性的统计学分析。由于有佐剂组中的一个极值，实施Mann-Whitney检验(非正态分布)(A)在除去极值后，给出正态分布，并且实施Student t检验(B)。这两种检验都是统计学显著的(p<0,05)。
实施例
材料和方法
使用表面等离振子共振(SPR-BIAcore)检测Aβ特异性抗体
Biacore系统提供可以用于固定化的多种芯片。对于此实验，使用经链霉抗生物素蛋白(SA)包被的芯片。为了避免配体经由侧链对芯片表面的非特异性结合，使用C端生物素化的Aβ肽(购自Anaspec)。由于生物素-链霉抗生物素蛋白复合物是非常稳定的，它最适合于延长的连续实验。为了优化芯片的稳健性及因此可再现性，将最大的响应单位(约1500RU)固定化至流动池上，而流动池1保持为空，并用作参照。为了避免芯片表面上的非特异性结合，使用游离的生物素来饱和所有4个流动池上的游离的SA结合位点。测量人样品(已经在HBS pH7.4中以1:10至1:100稀释)和范围为1mg/ml至10μg/ml的IVIG稀释系列(也在HBS pH7.4中稀释)。在每次样品注射后用10mM甘氨酸-HCl(pH1.8)再生芯片表面。将所有实验于25℃实施。使用标准化方案进行注射，以结合相200秒开始，接着是解离相600秒。Rmax值定义为样品注射结束时的响应水平(以RU测量)。对于信号评估，使用集成的BIA评估软件测定Rmax值。
使用ELISA检测Aβ特异性抗体
将不同Aβ肽(购自rPeptide)在100mM NaHCO3(pH9.2)中以浓度5μg/ml稀释，并在Maxisorp96孔板上包被过夜。为了防止非特异性结合，使用1%BSA/PBS于37℃将板封闭1小时。将ELISA用人血清样品的连续稀释(以1:10稀释开始)或通过添加结合缓冲液(PBS/0.1%BSA/0.1%Tween20)中稀释的范围为1mg/ml下至10μg/ml的浓度的IVIG于37℃实施1小时。在用PBS/0.1%Tween20重复清洗步骤(3次)后，于37℃添加抗人Ig HRP(0.5μg/ml)检测二抗1小时。将样品再清洗3次，并添加ABTS(在0.1M柠檬酸pH4.3中的0.68mM)30分钟以推进测定法，之后以波长405nm在读板仪(Biotek-Gen5Program)上测量OD。
使用FACS分析检测Aβ特异性抗体
在分析前，将冻干的β-淀粉状蛋白肽进行解聚方法。出于此目的，将冻干的Aβ种类在1%NH4OH(pH11)中溶解。随后，将溶解的Aβ肽等分取样，并于-20℃贮存。为了诱导聚集体的形成，将不同Aβ种类以浓度20μM在水溶液(pH5)中于37℃在摇动器(350rpm)上在Eppendorf管中温育过夜。可以通过FACS(FSC/FL1)中的硫磺素T(ThT)染色确认Aβ聚集体的形成。将聚集的Aβ种类在无菌过滤的0.5%BSA中稀释至0.15μM，并且在终体积95μl中在96孔板中预温育30分钟。将5μl预稀释的人血浆或抗体(在0.5%BSA/PBS中)添加至95μl Aβ聚集体溶液。血浆的最终稀释范围为1:1000上至1:10.000。对于单克隆抗体，使用低于0.5μg/ml的浓度。于室温(RT)在摇动器(350rpm)上45或60分钟温育后，将200μl0.5%BSA/PBS在每个孔中添加，并且以3000rpm(96孔板离心机)离心5分钟。将上清液除去，并且用200μl0.5%BSA/PBS将清洗步骤再次重复。在第二次清洗后，弃去SN，并且将团粒在含有1:1000稀释的经标记的抗IgG(H+L)-PE或1:500稀释的抗IgM,Fc5μ二抗(都是JacksonImmuno Research)的100μl0.5%BSA/PBS中重悬。将样品于RT在摇动器(350rpm)上再温育45或60分钟，并在装备有高通量取样器(HTS)的FACS Canto上测量。将聚集体在FSC/SSC中门控，并且分别意味着使用FACS Diva软件，在FL2-PE通道中测量并评估中值荧光强度(MFI)，及在FL1-FITC通道中测量并评估ThT对Aβ聚集体的反应性。
解蔽
为了破坏Aβ特异性自身抗体对患者血清中可能存在的Aβ的结合且因此防止通过基于抗原的方法(如ELISA或FACS)检出与自身抗体结合的这些Aβ，将血清在10mM甘氨酸pH2.6中以稀释1:16.7预稀释5分钟。
为了破坏Aβ抗原对自身抗体的潜在结合，将血清在10mM甘氨酸pH2.6中以稀释1:16.7预稀释5分钟。然后，将5μl酸化的血清与3μl Aβ1-42(100μg/ml)再温育5分钟。然后，通过添加92μl0.5%BSA/PBS中和混合物，并温育20至60分钟。如上文对非解蔽的血清描述的，实施清洗步骤和与二抗一起温育。
结果
Aβ聚集体：寡聚化和原纤(fibril)形成
最近几年中已经在多种条件下广泛调查了从单体Aβ形成Aβ聚集体(包括Aβ寡聚物，原纤和原纤聚集体)。已经发现了Aβ肽的聚集非常多地依赖于不同条件，包括pH、温度、缓冲剂组成和蛋白质浓度。聚集开始于从单体形成β-发夹，生成可溶性寡聚物。对平行β-片层的构象转变导致然后导致形成原纤和原纤聚集体，其可以通过离心沉淀。最近的发现已经显示了于pH7.4生成的Aβ40和Aβ42聚集体包含具有5nm宽细丝的原纤，该细丝具有侧向结合成束(15至25nm宽的细丝)的微小趋势。此类单一原纤的长度位于亚微米(50-100nm)上至10-15μm的范围中，如通过透射电子显微术测定的。这些Aβ原纤的一个特征在于它们与荧光染料硫磺素T(ThT)一起特异性插入。
依照本发明，生成不同Aβ肽变体(Aβ1-42、Aβ3-40、和Aβp(E)3-40)(其与ThT一起插入)的Aβ聚集体。可以使用FACS分析检测这些Aβ聚集体。出于此目的，如MM中描述的，将无核(seedless)可溶性Aβ肽以浓度20μM于37℃温育20小时。如图1A(上部小图)中显示的，清楚的ThT阳性同质群体(测量为FL1(FITC)阳性信号)，依照本发明开发的FACS测定法容许分析体外生成的Aβ聚集体。使用范围为1至15μm的校正大小珠(Molecular probes的流式细胞术大小校正试剂盒(产品目录编号F-13838))(图1底部小图)分析Aβ聚集体的大小分布(通过前向散射FSC-A限定)。使用此分析，显示了预期的，生成的Aβ聚集体的大小范围为亚微米范围上至10μm，其中大多数生成的聚集体范围为约200nm上至3μm。
单抗与Aβ聚集体的反应性
为了限定Aβ聚集体是否容许Aβ特异性抗体结合并且测定此类相互作用是否可以使用本文描述的基于FACS的测定法监测，进行另一组实验。出于此目的，生成Aβ1-42及Aβp(E)3-42聚集体，并将其与对Aβ1-42(3A5)特异性或对Aβp(E)3-42(D129)特异性的单克隆抗体一起温育。如图2中的FACS直方图中显示的，单克隆抗体3A5仅仅结合Aβ1-42聚集体，而单抗D129仅与N端截短的焦谷氨酸化的Aβ种类相互作用。这显示了描述的基于FACS的测定法容许以特定方式检测Aβ特异性抗体。
限定使用IVIG进行的人自身抗体的Aβ结合的不同检测方法的灵敏性
IVIG(静脉内免疫球蛋白)是一种商品化血液产品。它含有自源自健康供体的血浆(来自至少1000名供体的人血浆)提取的合并的IgG级分。已经显示了IVIG制剂含有对Aβ肽特异性的天然存在的抗体(自身抗体)。
此实验的目的是限定并比较用于IVIG(IVIG-Subcuvia，购自Baxter,Austria)的Aβ反应性的三种独立检测方法(Biacore、ELISA和基于FACS的测定法)的检测限。因此，将Aβ1-42固定化至芯片表面上或Maxisorp微量滴定板上，分别用于SPR或ELISA测定。或者，生成Aβ1-42聚集体以进行FACS分析。随后，将不同IVIG稀释液应用于各个系统，并且限定Rmax值(在SPR的情况中)，OD值(在ELISA的情况中)或荧光强度(MFI值)(在FACS测定法的情况中)。出于比较原因，对所有IVIG浓度评估信噪比，并且信号以倍数背景信号(xBG)表示(图3)。在SPR测量的情况中，IVIG浓度无一给出高于背景的信号(图3C)。与此形成对比，对照抗体3A5给出强信号，指示Aβ1-42成功固定化至芯片表面，且Aβ肽原则上可以在芯片表面上被抗体识别。使用ELISA作为检测方法，1000μg/ml IVIG给出高于背景的清楚信号(BG的7倍)，而由100μg/ml IVIG诱导的信号仅是背景的2倍。10μg/ml IVIG没有产生大于背景的信号(图3B)。如图3A中描绘的，基于FACS的测定法提供了比由其它两种检测方法投递的信号高得多的信号。不仅1000μg/ml(BG的24倍)，或100μg/ml(BG的11倍)，而且还有10μg/ml(BG的5倍)，和1μg/ml(BG的几何2倍)IVIG稀释液产生明显高于背景的信号。这指示检测Aβ特异性自身抗体的新开发的基于FACS的测定法比常规测定法诸如ELISA或Biacore灵敏至少100倍。
限定源自健康供体和AD患者的人血液中的抗beta淀粉状蛋白抗体
a.IgG对Aβ1-42的反应性
如上文描述的，使用Aβ聚集体和FACS分析对源自健康个体(n=13，约30至50岁龄)或AD患者(n=48，约70岁龄)的血清样品分析天然存在的Aβ特异性抗体内容物。如图4中显示的，在测试的所有样品中检测对Aβ聚集体特异性的天然存在的抗体。然而，在与源自健康受试者的血清样品相比时，此类抗体的浓度在源自AD患者的血液样品中显著较低。
为了限定本FACS测定法鉴定患有AD的人的灵敏性和特异性，将图4中指示的IgG对血清的Aβ1-42聚集体的反应性重复两次，并且已经在ROC曲线中汇总结果(图5)。此ROC曲线分析显示了在灵敏性是81%时，特异性是100%，且在特异性是77%时灵敏性是100%，曲线下面积(AUC)为0,9679。
试图限定认知和免疫学数据之间的关联，将测量的IgG对AD患者血清(n=24)的Aβ聚集体的反应性与血清取样时患者的简短精神状态检查(MMSE)的得分联系起来。此关联揭示了具有弱测试表现的患者显示降低的IgG反应性的趋势，如图4中描绘的。因此，Aβ特异性IgG反应性的此降低反映AD进展。
试图限定认知和免疫学数据之间的关联，将AD患者血清(n=24)的测量的IgG反应性与来自简短精神状态检查(MMSE)的结果联系起来。此测试通常用于筛选认知损伤和痴呆，并且评估在给定时间点时个体中认知损伤的严重性。MFI与MMSE得分的关联揭示了具有弱测试表现的患者显示降低的IgG反应性的趋势，如图4中描绘的。
b.IgG对Aβ3-42和Aβp(E)3-42的反应性
在限定AD患者和健康受试者的血清中天然存在的免疫球蛋白对Aβ1-42聚集体的反应性外，还针对Aβ3-42以及针对Aβp(E)3-42限定这些血清的反应性。图7和图8中描绘了源自这些分析的ROC曲线。在Aβ3-42的情况中(图7)，ROC曲线分析显示了在灵敏性是77%时特异性是92%，曲线下面积(AUC)为0.859。
在Aβp(E)3-42的情况中(图8)，ROC曲线分析显示了在灵敏性是93%时特异性是85%，曲线下面积(AUC)为0,928。
c.IgM对不同Aβ聚集体的反应性
在下一组实验中，使用与上文的描述相同的血清，在源自健康个体或AD患者的血清样品中限定Aβ聚集体特异性IgM反应性。如图9A中可以看到的，在测试的所有样品中检出对Aβ聚集体特异性的IgM同种型的天然存在的抗体。但是与IgG反应性形成对比，源自健康对照的血清样品没有表现为比源自AD患者的血清样品具有更高的IgM对Aβ聚集体的反应性。因此，ROC曲线分析没有产生描绘灵敏性或特异性的曲线(图9B)。
d.解蔽后IgG和IgM对Aβ聚集体的反应性
在先前的研究中，已经显示了Aβ特异性自身抗体(主要是IgM同种型的)可以用Aβ抗原占据以建立免疫复合物，其是稳定的并且在人血液中循环(WO2010/128139A1;Marcello等,2009;Lindhagen-Persson等,PLoS ONE5(2010):e13928)。为了限定与自身抗体潜在结合的Aβ抗原是否可以阻断这些抗体对体外生成的Aβ聚集体的反应性，将个体血清进行解蔽方法，如材料和方法中描述的。使用低pH，潜在的免疫复合物被破坏，导致从抗体结合域除去Aβ抗原(抗原解离)。如此，若免疫复合物存在于血清样品中，则解蔽方法可以在基于FACS的测定法中产生较高的自身抗体信号。令人感兴趣地，如图10中描绘的，与未处理的血清相比，AD患者血清的IgM反应性在解蔽后显著升高，而健康对照血清的反应性没有变化(比较图9A)。这与在IgG对Aβ聚集体的反应性的情况中测量的情况形成对比。如图4中显示的，源自健康个体的血清比源自AD患者的血清(在此情况中尚未用低pH处理血清)显示了更高的IgG对Aβ聚集体的反应性。
在图11中，已经在ROC曲线中汇总了图10中描绘的结果。此ROC曲线分析显示了在灵敏性是78%时，特异性是84%，曲线下面积(AUC)为0.822。
为了完成此组实验，还实施解蔽实验以检测IgG亚型的自身抗体是否也可以被Aβ抗原占据。出于此目的，再次用低pH处理所有血清以破坏潜在的免疫复合物，随后分析针对Aβ聚集体的血清的IgG反应性。如先前在IgM解蔽实验中显示的，在此实验中针对源自健康受试者的血清的Aβ聚集体的IgG反应性在未处理的和解蔽的血清之间也没有差异。与此形成对比，源自AD患者的血清再次显示了解蔽方法后Aβ反应性的显著升高。比较抗原解离之前和之后源自血清IgG自身抗体对Aβ聚集体(在此情况中为Aβ1-42)的结合的信号。源自不同测量(未处理对解蔽)的MFI值间的差定义为解离delta(Δ)。在图11中，在ROC曲线中汇总了源自健康对照的血清的Δ数值和源自AD患者的血清的Δ数值。如可以看出的，源自IgG反应性的Δ数值也可以用作参数以鉴定AD患者。此ROC曲线分析显示了在灵敏性是79%时特异性是85%，曲线下面积(AUC)为0.862。
结论
基于这些结果，可以说明依照本发明的FACS-聚集测定法的较高灵敏性与Aβ1-42的不同聚集状态直接相关联。对于BIAcore分析，使用新鲜溶解且生物素化的Aβ1-40以在链霉抗生物素蛋白芯片上固定化。此方法有利于在芯片表面上单体Aβ1-42的结合，因为肽在没有预温育的情况中立即固定化，并且生物素-标签还减速聚集体的形成。Maxisorp板上于pH9的Aβ1-42包被似乎也有利于Aβ的单体形式，尽管不能排除一些聚集体的包被。在这些测定法中，抗体和Aβ1-42肽之间的亲和力造成检测限。
与这两种用于依照本发明的基于FACS的测定法的方法形成对比，将Aβ-1-42聚集体特异性诱导，并且用于检测IVIG中存在的对Aβ特异性的抗体。这些较大的分子提供多个抗体结合位点。所得的亲合力效应(多种协同低亲和抗体-抗原相互作用的总和)可以造成此测定法的较高灵敏性，且通过导致IVIG级分内低亲和抗体的检出进行。IVIG对Aβ聚集体的反应性也可以通过仅存在于Aβ聚集形式上的表位的存在解释。
实施例清楚显示了本发明比本领域中目前可用的方法的优越性，尤其就分析特性，诸如特异性和选择性而言。
用依照EP1583774B1和EP1679319B1的模拟物疫苗的临床研究。
在含有两个分支的临床研究中测试如EP 1 583 774 B1和EP 1 679 319 B1中要求保护的AFFITOPE-疫苗，其能够诱导特异性靶向Aβ肽的抗体。将分组1的患者用含有佐剂的AFFITOPE疫苗免疫，且将分组2中的患者用缺乏作为免疫应答增强剂的佐剂的AFFITOPE疫苗免疫。与无佐剂的疫苗(其中不能预期Aβ特异性IgG抗体的增加)形成对比，有佐剂的疫苗应当具有诱导靶向Aβ的抗体的能力。
为了评估依照本发明的基于FACS的测定法在临床研究的过程里监测诱导的IgG抗体的能力，将源自疫苗接收者的血清进行此测定法。分析源自每位单一患者的1份免疫前血清(在开始免疫方法前收集)和3份免疫后血清。对血清样品的不同等分试样完成每个时间点和患者两次单独的测量。各位患者中Aβ聚集体特异性IgG抗体随时间的增加会指示FACS测定法可以适用于随时间监测免疫治疗性干预的效力，且此外，此类结果会也会指示成功的疫苗接种。
应用依照本发明的基于FACS的测定法，发现所有研究参与者的免疫前血清已经含有Aβ聚集体特异性IgG，如预期的。这与最近的出版物一致，其显示了体液诸如血液(血浆/血清)和CSF含有Aβ聚集体特异性IgM和IgG抗体。
图13中显示的数值描绘了随时间的两次测量的均值数值。在此图中，例示性地，描绘了源自分组1的患者(患者A)和用缺乏佐剂的疫苗免疫的患者(分组2-患者B)中的Aβ特异性IgG抗体应答的形成。如图13中可以看出的，来自患者A的免疫血清2和3的MFI信号显著高于源自前血清的荧光信号，指示增加的Aβ特异性IgG。与此形成对比，源自患者B的免疫血清没有产生升高的荧光信号。这些结果对于各自组是代表性的。
为了限定个体患者中Aβ1-42反应性的升高，已经计算最后一次免疫血清与相应的前血清的两次独立测量的均值MFI值的差。在图14中，可以看出使用FACS测定法分析免疫血清导致这两组间的明显差异。来自用有佐剂的疫苗免疫的患者的免疫血清一致显示Aβ特异性IgG的增加。
为了评估接受有佐剂的或无佐剂的疫苗接种的患者的中值FI值间的统计学差异，实施两项不同检验。在包括所有患者数据时，由于有佐剂的组中的一个极值，在两组间没有给出正态分布。在此前置条件(precondition)下，实施Mann-Whitney检验，这产生0.0473的p值(图14)。为了还在正态分布条件下进行统计学分析，从数据集除去外层(out-layer)，并计算student t检验。此分析还产生0.0089的统计学显著性p值(图14)。

Claims (20)

1.一种用于诊断阿耳茨海默氏病(AD)的方法，其中检测怀疑具有AD的人的生物学样品中的Aβ特异性抗体，其包括下列步骤：
-使所述样品与Aβ聚集体或与具有Aβ聚集体样表面的颗粒接触，并且容许所述Aβ特异性抗体结合所述Aβ聚集体，并
-通过单一颗粒检测技术(single particle detection technique)，优选通过荧光活化细胞分选(FACS)检测与所述Aβ聚集体结合的所述Aβ特异性抗体；
且其中将检出的Aβ特异性抗体的量与已知AD状态的样品中的量比较。
2.依照权利要求1的方法，其特征在于所述Aβ特异性抗体是人抗体，优选人IgG或IgM抗体，特别是人IgG抗体。
3.依照权利要求1或2的方法，其特征在于所述Aβ特异性抗体是自身抗体。
4.依照权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于所述Aβ聚集体具有50nm至15μm，优选100nm至10μm，尤其是200nm至5μm的大小。
5.依照权利要求1至4中任一项的方法，其特征在于所述Aβ聚集体已经通过于2至9的pH将Aβ-1-42肽，Aβ-1-43肽，Aβ-3-42，或Aβ-p(E)3-42肽温育至少20分钟，优选至少1小时，尤其是至少4小时制备。
6.依照权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于所述Aβ聚集体以0.001至1μM，优选0.01至0.1μM的量存在，用于使所述样品与Aβ聚集体接触。
7.依照权利要求1至6中任一项的方法，其特征在于所述生物学样品是人血液或自人血液衍生的样品，优选人血清或人血浆；人脑脊液或人淋巴。
8.依照权利要求1至7中任一项的方法，其特征在于使所述Aβ聚集体与所述样品接触至少10分钟，优选10分钟至24小时，尤其是20分钟至2小时。
9.依照权利要求1至8中任一项的方法，其特征在于在使所述样品与Aβ聚集体接触前对所述样品中的所述Aβ特异性抗体实施解蔽步骤，尤其在检测IgM抗体时。
10.依照权利要求1至9中任一项的方法，其特征在于所述具有Aβ聚集体样表面的颗粒是具有在其表面上固定化的Aβ聚集体的珠，尤其是磁珠。
11.依照权利要求1至10中任一项的方法，其中所述已知AD状态的样品是具有AD的患者的样品或健康人的样品。
12.依照权利要求1至10中任一项的方法，其中所述已知AD状态的样品是AD状态校正曲线，尤其是简短精神状态检查(MMSE)曲线。
13.依照权利要求1至12中任一项的方法，其中检出低于阈值水平的所述样品中Aβ特异性抗体的量指示AD，其中所述阈值水平是1500ng/ml或更低，优选1000ng/ml或更低，尤其是750ng/ml或更低。
14.依照权利要求1至13中任一项的方法，其中Aβ特异性抗体的检出量与从所述人取得所述样品同时同一人的MMSE结果相关联。
15.依照权利要求1至14中任一项的方法，其中对不同时间时取得的同一人的样品至少两次实施所述方法，且其中优选地，Aβ特异性抗体的检出量与从所述人取得所述样品同时同一人的MMSE结果相关联。
16.依照权利要求15的方法，其中每6个月至少一次，优选每3个月至少一次，尤其是每个月至少一次实施所述方法。
17.依照权利要求1至16中任一项的方法用于监测AD患者，尤其是用治愈或改善AD的药物治疗的AD患者的用途。
18.依照权利要求1至16中任一项的方法用于评估形成AD的风险或用于检测早期阶段AD的用途。
19.依照权利要求1至16中任一项的方法用于诊断帕金森氏痴呆(Parkinson’s dementia,PDD)、痴呆伴路易体(Dementia with Lewy Bodies,DLB)、脑淀粉样血管病(Cerebral Amyloid Angiopathy,CAA)、包含体肌炎(Inclusion body myositis,IBM)、或慢性头部创伤(chronic head trauma)的用途。
20.用于实施依照权利要求1至16中任一项的方法的试剂盒，其包含：
-Aβ聚集体，和
-样品容器。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109073661A (zh) * 2016-05-04 2018-12-21 欧蒙医学诊断技术有限公司 用于神经学疾病的诊断的测定法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2787347A1 (en) * 2013-04-03 2014-10-08 Affiris AG Method for detecting Aß-specific antibodies in a biological sample
EP2787349A1 (en) 2013-04-03 2014-10-08 Affiris AG Method for detecting proteinopathy-specific antibodies in a biological sample
WO2015165961A1 (en) 2014-04-29 2015-11-05 Affiris Ag Treatment and prevention of alzheimer's disease (ad)
KR101658620B1 (ko) * 2014-12-02 2016-09-23 주식회사 피플바이오 응집형-형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출하는 방법
KR20170108203A (ko) 2016-03-16 2017-09-27 주식회사 피플바이오 응집형-형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출하는 방법
KR101871895B1 (ko) * 2016-04-20 2018-06-28 한국과학기술연구원 응집 단백질의 고감도 광 산화 증폭 면역 분석을 통한 체액기반의 퇴행성 신경질환 진단 방법
KR101989383B1 (ko) * 2017-04-04 2019-06-14 조선대학교산학협력단 알츠하이머성 치매의 조기진단을 위한 펩타이드 프로브
KR102108171B1 (ko) * 2018-08-27 2020-05-08 광주과학기술원 알츠하이머성 치매 진단용 펩타이드 바이오마커
WO2020045962A1 (ko) * 2018-08-27 2020-03-05 광주과학기술원 알츠하이머성 치매 진단용 펩타이드 바이오마커
CN113075398A (zh) * 2021-03-23 2021-07-06 中国医学科学院输血研究所 一种血浆中特异性IgG抗体的定量测定方法
CN113063949A (zh) * 2021-03-23 2021-07-02 中国医学科学院输血研究所 一种血浆中特异性IgM抗体的定量测定方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0391714A2 (en) * 1989-04-05 1990-10-10 BRIGHAM &amp; WOMEN'S HOSPITAL Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue
WO1996012544A1 (en) * 1994-10-19 1996-05-02 The General Hospital Corporation A DIAGNOSTIC ASSAY FOR ALZHEIMER'S DISEASE: ASSESSMENT OF Aβ ABNORMALITIES
WO1996015452A1 (en) * 1994-11-14 1996-05-23 Athena Neurosciences, Inc. METHODS FOR AIDING IN THE DIAGNOSIS OF ALZHEIMER'S DISEASE BY MEASURING AMYLOID-β PEPTIDE (X- ≥41) AND TAU
CN1371416A (zh) * 1999-08-24 2002-09-25 梅达里克斯公司 人ctla－4抗体及其应用
CN1377278A (zh) * 1999-06-01 2002-10-30 神经实验室有限公司 淀粉样变性疾病的预防和治疗
WO2004074837A1 (en) * 2003-02-24 2004-09-02 Digitalbiotech Co., Ltd. Method for measuring the level of anti-beta-amyloid antibody in body fluids and diagnostic kit for alzheimer’s disease using same
CN101262863A (zh) * 2005-07-08 2008-09-10 马泰克生物科学公司 用于治疗痴呆和前痴呆相关病症的多不饱和脂肪酸

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
AT413945B (de) 2003-01-14 2006-07-15 Mattner Frank Dr Impfstoff für die alzheimer-krankheit
AT413336B (de) 2003-09-12 2006-02-15 Mattner Frank Dr Apherese-vorrichtung
AT500483B1 (de) 2004-07-13 2006-01-15 Mattner Frank Dr Set zur vorbeugung oder behandlung der alzheimer'schen erkrankung
AT413946B (de) 2004-07-13 2006-07-15 Mattner Frank Dr Impfstoff gegen die alzheimer-krankheit
DE102005006217B4 (de) * 2005-02-07 2007-08-16 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Diagnose von allergischen Erkrankungen und/oder atopischen Erkrankungen durch Nachweis von Autoantikörpern gegen CD28 in humanem Serum
JP4937143B2 (ja) * 2005-03-05 2012-05-23 アボット ゲーエムベーハー ウント カンパニー カーゲー 非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマー構造エピトープに対して特異性を有する自己抗体を検出する方法
TW200726774A (en) 2005-06-30 2007-07-16 Merck & Co Inc Composition and method for producing stable amyloid beta oligomers
CA2632822C (en) * 2005-12-12 2018-08-28 Ruth Greferath A beta 1-42 specific monoclonal antibodies with therapeutic properties
WO2008084402A2 (en) * 2007-01-11 2008-07-17 Philipps-Universitaet Marburg Diagnosis and treatment of alzheimer's and other neurodementing diseases
US7771957B2 (en) * 2007-10-19 2010-08-10 The Regents Of The University Of California Method for diagnosing alzheimer's disease
WO2009051599A1 (en) * 2007-10-19 2009-04-23 The Regents Of The University Of California Use of biomarkers of alzheimer's disease for diagnostic tests and drug screening
AT506535B1 (de) 2008-02-22 2010-04-15 Affiris Forschungs & Entwicklungs Gmbh Vaccine enthaltend alpha-synuclein-mimotope auf basis von peptiden
AT509611B1 (de) 2008-06-12 2012-04-15 Affiris Forschungs-Und Entwicklungs Gmbh Vakzin
US20110092436A1 (en) 2008-06-12 2011-04-21 Affiris Ag Compounds for treating symptoms associated with parkinson's disease
AT506819B1 (de) 2008-06-12 2011-06-15 Affiris Forschungs Und Entwicklungs Gmbh Vakzin zur behandlung von alzheimer-krankheit
EP2401617A4 (en) 2009-02-24 2012-09-26 Winton G Gibbons DETECTION OF COMPLEXES FORMED BETWEEN THE TAU PROTEIN AND AN AMYLOID
WO2010128139A1 (en) 2009-05-08 2010-11-11 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts, Universitätsmedizin Biomarkers and methods for diagnosing alzheimer's disease and/ or mild cognitive impairment
AT508638B1 (de) 2009-08-21 2011-08-15 Affiris Ag Verwendung von peptiden und polypeptiden zur behandlung und/oder prävention von synukleinopathien
WO2011106732A1 (en) * 2010-02-25 2011-09-01 Wyeth Llc Pet monitoring of ab-directed immunotherapy

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0391714A2 (en) * 1989-04-05 1990-10-10 BRIGHAM &amp; WOMEN'S HOSPITAL Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue
WO1996012544A1 (en) * 1994-10-19 1996-05-02 The General Hospital Corporation A DIAGNOSTIC ASSAY FOR ALZHEIMER'S DISEASE: ASSESSMENT OF Aβ ABNORMALITIES
WO1996015452A1 (en) * 1994-11-14 1996-05-23 Athena Neurosciences, Inc. METHODS FOR AIDING IN THE DIAGNOSIS OF ALZHEIMER'S DISEASE BY MEASURING AMYLOID-β PEPTIDE (X- ≥41) AND TAU
CN1377278A (zh) * 1999-06-01 2002-10-30 神经实验室有限公司 淀粉样变性疾病的预防和治疗
CN1371416A (zh) * 1999-08-24 2002-09-25 梅达里克斯公司 人ctla－4抗体及其应用
WO2004074837A1 (en) * 2003-02-24 2004-09-02 Digitalbiotech Co., Ltd. Method for measuring the level of anti-beta-amyloid antibody in body fluids and diagnostic kit for alzheimer’s disease using same
CN101262863A (zh) * 2005-07-08 2008-09-10 马泰克生物科学公司 用于治疗痴呆和前痴呆相关病症的多不饱和脂肪酸

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIROAKI FUKUMOTO ET AL: "High-molecular-weight β-amyloid oligomers are elevated in cerebrospinal fluid of Alzheimer patients", 《FASEB JOURNAL》 *
HIROAKI FUKUMOTO ET AL: "High-molecular-weight β-amyloid oligomers are elevated in cerebrospinal fluid of Alzheimer patients", 《FASEB JOURNAL》, vol. 204, no. 8, 31 August 2010 (2010-08-31) *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109073661A (zh) * 2016-05-04 2018-12-21 欧蒙医学诊断技术有限公司 用于神经学疾病的诊断的测定法

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CA2850840A1 (en) 2013-04-11
IL231620A0 (en) 2014-05-28
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