NL9301134A

NL9301134A - Werkwijze voor het detekteren en eventueel kwantificeren van aktiviteit van ten minste één protease-inhibitor in een te analyseren mengsel, alsmede toepassing van de werkwijze voor het bepalen van de (rest)aktiviteit van één (of meer) afzonderlijke (iso)type(s) protease-inhibitor(en) en toepassing van de werkwijze voor het bepalen van de totale (rest)aktiviteit van een mengsel eventueel na een verwerkingsproces zoals een proces ter verwijdering of inaktivatie van protease-inhibitor(en).

Info

Publication number: NL9301134A
Application number: NL9301134A
Authority: NL
Original assignee: Inst Voor Agrotech Onderzoek
Priority date: 1993-06-29
Filing date: 1993-06-29
Publication date: 1995-01-16

Description

Titel: Werkwijze voor het detekteren en eventueel kwantificeren van akti-viteit van ten minste één protease-inhibitor in een te analyseren mengsel, alsmede toepassing van de werkwijze voor het bepalen van de (rest)-aktiviteit van één (of meer) afzonderlijke (iso)type(s) protease-inhibi-tor(en) en toepassing van de werkwijze voor het bepalen van de totale (rest)aktiviteit van een mengsel eventueel na een verwerkingsproces zoals een proces ter verwijdering of inaktivatie van protease-inhibitor(en).

Inleiding:

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het detekteren en eventueel kwantificeren van aktiviteit van ten minste één protease-inhibitor in een te analyseren mengsel, alsmede toepassing van de werkwijze voor het bepalen van de (rest)aktiviteit van één (of meer) afzonderlijke (iso)type(s) protease-inhibitor(en) en toepassing van de werkwijze voor het bepalen van de totale (rest)aktiviteit van protease-inhibitoren van een mengsel eventueel na een verwerkingsproces zoals een proces ter verwijdering of inaktivatie van protease-inhibitor(en). De werkwijze kan in het bijzonder worden toegepast voor het specifiek bepalen van de aktiviteit van protease-inhibitoren die voorkomen in plantaardige produkten waaronder sojabonen. Het te analyseren mengsel kan plantaardig, dierlijk, microbieel of humaan zijn.

Achtergrondinformatie

Planten, micro-organismen en dieren, waaronder ook mensen, bevatten eiwitten die de specifieke eigenschap hebben dat zij met proteolytische enzymen een stoïchiometrisch eiwit-eiwit-komplex vormen, hetgeen resulteert in kompetitieve remming van de katalytische aktiviteit van deze proteolytische enzymen, die ook proteases worden genoemd (Richardson 1977)· Dergelijke eiwitten, zogenaamde protease-inhibitoren komen onder meer voor in tal van produkten die voor menselijke en dierlijke konsump-tiedoeleinden worden gebruikt (Liener & Kakade, 1980). Er bestaan veel verschillende types protease-inhibitoren. In één produkt kunnen derhalve verschillende types protease-inhibitoren aanwezig zijn. De remmingskapa-citeit van de protease-inhibitor wordt beïnvloed door de herkomst van de protease (Birk, 1989)· Protease-inhibitoren uit verschillende gewassen hebben bijvoorbeeld verschillende eigenschappen wat betreft anti-nutriti-onele werking, chemische eigenschappen en inaktivatiekinetiek (Liener & Kakade, 1980; DiPietro & Liener, 1989a, Boisen, 1989)· De protease-inhi- bitoren verschillen ondermeer in molekuulgrootte, specificiteit, affiniteit en stabiliteit. Sommige protease-inhibitoren zijn zelfs in staat tegelijkertijd twee proteases te remmen. Vele protease-inhibitoren kunnen trypsine en/of chymotrypsine remmen. Sommige kunnen ook andere proteases zoals elastase, kallikreïne, piasmine, subtilisine, trombine, bromelaïne, carboxypeptidase, cathepsine, ficine, papaine en pepsine remmen (Birk, 1987; Liener & Kakade, 1980; Norton, 1991).

Het (protease- (protease-inhibitor) )-komplex is erg stabiel en de pro-teolytische aktiviteit van de protease wordt hierbij volledig geremd. Uit röntgenkristallografie en NMR-onderzoek van protease-inhibitoren uit sojabonen bleek dat in het (protease-(protease-inhibitor) )-komplex ongeveer 10-15 residuen van de protease-inhibitor interakties vertonen met residuen van de protease. Het specifieke karakter betreft ondermeer de sterkte van de interaktie en het type protease waarmee de interaktie wordt aangegaan (Birk 1989).

De grootste belangstelling gaat uit naar inhibitoren van serineprote-inases, maar er zijn ook inhibitoren van andere proteases, zoals thiol-, carboxyl- (of zure) en metallo-proteases (Birk 1987). Serineproteases hebben in hun aktieve centrum een zeer reaktieve serine die bij de katalytische aktiviteit betrokken is (Dickerson, 1969)· Op basis van sequen-tie-homologie, aard van de reaktieve protease-inhibitorzijde en interaktie met de protease volgens een standaardmechanisme, worden verschillende families onderscheiden: - Kunitz-type trypsine-inhibitoren (KTI); - Bowman-Birk-type proteinase-inhibitoren (BBI); - Potato I-inhibitoren; - Potato II-inhibitoren; - Squash-inhibitoren; - Barley-trypsine-inhibitoren; - en andere protease-inhibitoren.

Hierbij wordt opgemerkt dat met de reaktieve protease-inhibitorzijde het gedeelte van het protease-inhibitormolekuul wordt bedoeld dat direkt met het aktieve centrum van de protease in kontakt staat bij de vorming van het (protease-(protease-inhibitor)-komplex.

Binnen bovengenoemde families komt ook nog een aantal (iso)types voor (Birk, 1989; Laskowski, 1986). Protease-inhibitoren komen onder andere veelvuldig voor in peulvruchten. Met name in sojabonen is de koncentratie aan protease-inhibitor relatief hoog. In peulvruchten komen voornamelijk KTI en BBI voor. De verhouding waarin deze twee protease-inhibi toren in sojaoonen voorkomen is ongeveer 3:1. κπ m sojabonen beert een molekuul-gewicht van ca. 21.000 dalton en bevat 2 zwavelbruggen. BBI heeft een molekuulgewicht van ca. 8.000 dalton en bevat 7 zwavelbruggen. KTI remt voornamelijk trypsine, terwijl BBI ook chymotrypsine en andere enzymen remt (Birk, 1989; Liener & Kakade, 1980). Onderzoek bij sojabonen heeft uitgewezen dat BBI twee reaktieve protease-inhibitor-zijden heeft (de zgn. "double headed protease-inhibitor”). De protease-inhibitor vormt een 1:1 komplex met zowel trypsine als chymotrypsine en een drievoudig kom-plex met beide enzymen. In waterige oplossing ondergaat BBI een koncen-tratie afhankelijke zelf-associatie. Mogelijk kan dit ook optreden in het maagdarm-kanaal in het dier of bij enzymatische afbraak in-vitro, waardoor de aktiviteit en/of inaktivatie verandert.

Er is veel onderzoek gedaan naar protease-inhibitoren vanwege de mogelijke effekten die zij kunnen hebben op de nutritionele waarde van produkten en vanwege de metabolische en toxische effekten ervan op mens en dier. Maar ook is er, vanwege de unieke eigenschappen die de protease-inhibitoren hebben, belangstelling voor het therapeutisch gebruik van protease-inhibitoren. Verschillende mogelijkheden worden hierbij onderzocht, waaronder het gebruik als anticarcinogeen en de toepassing ervan bij behandeling tegen pancreatitis, emfyseem, shock, allergische reakties en verschillende ontstekingsverschijnselen (Richardson, 1977; Birk, 1989; Friedman, 1986). Pancreaskallikreïne-trypsineinhibitor bijvoorbeeld is al in de handel verkrijgbaar onder de namen Trasylol, Iniprol en Contrykol (Richardson, 1977)»

Eiwit van peulvruchten vormt, indien het voldoende met hitte is behandeld, een uitstekende, relatief goedkope eiwitbron voor mens en dier. Sojabonen worden bijvoorbeeld veel gebruikt, in een groot aantal humane produkten (babyvoeding, sojabloem, sojasaus, tofu, enz.) en in veevoe-derprodukten (kalvermelk, baby-biggenvoer, mengvoeder voor varkens, kippen enz.). In de eiwitfraktie komen echter ook protease-inhibitoren voor. Deze protease-inhibitoren kunnen metabolisme van mens of dier negatief beïnvloeden doordat ze komplexeren met verteringsenzymen (proteases zoals trypsine, chymotrypsine etc.). De effekten die hierdoor kunnen optreden zijn: 1. Remming van de eiwitvertering, hetgeen tot een niet-efficiënte voed-selopname en een hogere stikstofuitscheiding leidt; 2. Verhoging van de uitscheiding van endogene eiwitten onder invloed van een feed-back mechanisme; 3- Verhoging van de behoefte aan zwavelhoudende aminozuren vanwege het verlies aan endogene eiwitten zoals trypsine en chymotrypsine; 4. Remming van groei; 5· Vergroting van de pancreas; 6. Verhoging van de synthese van eiwitten, fosfolipiden en nucleinezuren door de pancreas; 6. Stimulatie van galuitscheiding en 7. Verlaging van de metaboliseerbare energie (Rackis en Gumbmann, 1981). Vanwege deze effekten is het belangrijk dat het gehalte aan aktieve pro-tease-inhibitoren in voedingsprodukten wordt verlaagd. Neutralisatie van protease-inhibitoraktiviteit kan worden bereikt door een (bio-) technologische behandeling of door veredeling van variëteiten.

Gewoonlijk worden protease-inhibitoren die in soja voorkomen geïnakti-veerd door een konventionele behandeling met hitte (Liener & Kakade, 1980; Birk, 1989) · Ondanks deze behandeling resteert 5"20 % van de protease-inhibitoraktiviteit. Hierbij wordt geen onderscheid gemaakt tussen de twee protease-inhibitoren KTI en BBI, terwijl de fysiologische effekten van beide inhibitoren verschillen. En ook blijkt de mate van inakti-vatie van KTI en BBI verschillend te zijn (DiPietro & Liener, 1989b; Rackis & Gumbmann, 1981).

Rest-aktiviteiten van protease-inhibitoren kunnen nog steeds signifi-kante effekten veroorzaken op vertering en metabolisme. Zeker wanneer de konsumptie van bijvoorbeeld sojaboonprodukten over lange termijn in ogenschouw wordt genomen. Risikogroepen zijn hierbij 1. Kinderen die allergisch zijn voor koemelk. Deze kinderen krijgen namelijk gedurende een lange periode sojamelkprodukten toegediend.

2. Mensen die om filosofische of religieuze redenen vegetarisch eten. Deze personen vervangen namelijk dierlijk eiwit door eiwit van plantaardige oorsprong. Hierbij worden hoofdzakelijk peulvruchten zoals soja 1 gebruikt.

3. Patiënten die aan hyperlipidemie lijden. Ter verlaging van hun cholesterolgehalte vervangen zij namelijk dierlijk eiwit in hun dieet door plantaardig eiwit waaronder eiwit uit peulvruchten zoals soja.

4. Mensen uit landen met een slechte voedsel-voorziening. Deze mensen 1 eten namelijk vaak eenzijdig en dan met name peulvruchten en granen.

5. Landbouwhuisdieren voor produktiedoeleinden. Het voer van deze dieren bestaat vrijwel geheel uit mengvoeder (brokken, meel), melkpoeder of ander voer voor jonge dieren. Dit voer bestaat voor een groot gedeelte uit produkten van plantaardige oorsprong. Hierbij wordt veel gebruik gemaakt van peulvruchten zoals sojabonen. (Liener, 1986; Tan-Wilson & Wilson 1986).

Onderzoek naar het reduceren van het gehalte aan protease-inhibitor middels veredeling vindt eveneens plaats. Protease-inhibitoren hebben echter mogelijk een fysiologische rol in de natuurlijke afweer van de plant en de aanwezigheid van sommige protease-inhibitoren kan daardoor belangrijk zijn bij de teelt. Veredeling op cultivars met een lage algemene protease-inhibitoraktiviteit kan daarom een negatief effekt hebben op de opbrengst van het gewas (Birk, 1989; Boisen, 1983; Broadway et al., 1986; Richardson, 1977; Ryan, 1978; Ryan, 1983).

Daarnaast zijn plantaardige eiwitbronnen vaak deficiënt aan zwavelhoudende aminozuren, methionine en cysteine. Protease-inhibitoren die voorkomen in peulvruchten daarentegen zijn juist vaak behoorlijk rijk aan cysteine en kunnen daardoor ongeveer 40 % van het totaal aan cysteine bevatten. Eliminatie van protease-inhibitoren door middel van bijvoorbeeld veredeling zou derhalve een negatief effekt kunnen hebben op de voedingswaarde met name t.a.v. het gehalte aan cysteine van peulvruchten (Rackis & Gumbmann, 1981).

Het beschikbaar zijn van een analysemethode waarmee lage rest-aktivi-teiten van de afzonderlijke protease-inhibitoren in plantaardig materiaal, in het bijzonder in peulvruchten zoals sojabonen en in van dergelijk plantaardig materiaal afgeleide produkten, kunnen worden gemeten na technologische behandeling of veredeling, is vanwege de fysiologische effek-ten die protease-inhibitoren kunnen hebben op mens en dier van groot belang. Tevens is het beschikbaar zijn van een goede analysemethode waarmee lage rest-aktiviteiten van protease-inhibitoren (totaal of afzonderlijk) bepaald kunnen worden van groot belang bij het optimaliseren van een hittebehandeling. In verband met de hoge kosten van een dergelijke technologische behandeling alsmede in verband met gerelateerde milieu-effekten, is het belangrijk om te weten onder welke omstandigheden protease-inhibitoren voldoende geïnaktiveerd zijn. Voor sojabonen bijvoorbeeld is het belangrijk om zowel van BBI als van KTI op de hoogte te zijn van de mate van inaktivatie. Wanneer een goede en snelle analysemethode beschikbaar is, kan de rest-aktiviteit snel en direkt worden gemeten, waardoor het proces zo rendabel mogelijk kan worden uitgevoerd. Verder is het ook voor de veredeling, belangrijk om lage aktiviteiten van de verschillende protease-inhibitoren afzonderlijk te kunnen meten.

Voorwaarden waar een protease-inhibitor-analysemethode aan zou moeten voldoen zi.in: 1. Er moet onderscheid kunnen worden gemaakt tussen aktieve protease-inhibitoren en inaktieve protease-inhibitoren (na toasting of veredeling) 2. De aktiviteit van de protease-inhibitoren moet gemeten kunnen worden.

3. Er moet onderscheid kunnen worden gemaakt tussen verschillende (iso) types protease-inhibitoren.

4. De methode moet voldoende gevoelig en nauwkeurig zijn om lage aktivi-teiten van protease-inhibitoren te kunnen bepalen (bijvoorbeeld om de restaktiviteit te bepalen na toasting of veredeling).

Analysemethoden die momenteel worden gebruikt voor het direkt of indi-rekt aantonen van protease-inhibitoraktiviteit zijn: 1. de enzymatische trypsine-inhibitorbepaling; 2. de ureasebepaling en 3. immunochemische bepalingsmethoden.

1. Enzymatische trypsine-inhibitorbepaling (volgens Kakade et al., 1969). Met deze methode wordt de totale trypsine-inhibitoraktiviteit bepaald, dat wil zeggen de aktiviteit van zowel KTI als BBI en tevens de tryp-sine remmende aktiviteit van andere komponenten uit het monster, zoals tanninen. De trypsine-inhibitoraktiviteit wordt gemeten aan de hand van de remming van trypsine-aktiviteit. De trypsine-aktiviteit wordt gerelateerd aan de omzetting, bij een bepaalde temperatuur en gedurende een bepaalde tijd, van een synthetisch substraat, ΒΑΡΑ (Να-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanalide-waterstofchloride), door trypsine. Het omzettingsprodukt, PA (p-nitroanaline), wordt spektrofotometrisch gemeten na het beëindigen van de reaktie. Door toevoeging van de pro-tease-inhibitor wordt de aktiviteit van trypsine geremd en wordt er 'minder PA gevormd. Voor het verkrijgen van een goede meting van de trypsine-inhibitoraktiviteit moet de remming tussen de 40 en 60% van de maximale aktiviteit (zonder protease-inhibitor) liggen. Wanneer het precieze gehalte van de protease-inhibitor niet bekend is, zal via trial en error de goede verdunning moeten worden gezocht. Dit kost veel tijd, omdat één aktiviteitsbepaling al ongeveer 60 min. kost. Daar deze test een dubbele aktiviteitsmeting betreft (remming van enzym en omzetting van ΒΑΡΑ) worden er extra fouten geïntroduceerd, waardoor relatief grote spreidingen worden verkregen. De test wordt verder o.a. gekenmerkt door invloeden van de toevoeging (eerst synthetisch substraat en dan monster, of eerst monster en vervolgens synthetisch substraat). Bovendien kunnen andere komponenten uit het extrakt, bijvoorbeeld tanninen fytaat, vet en vezel, storend werken. Verder geeft de methode onnauwkeurige resultaten bij behandelde produkten met een lage rest-aktiviteit. Veel onderzoekers hebben daarom gezocht naar verbetering van de methode, (Kakade et al., 1974; Lehnhardt and Dills, 1984; Liu & Markakis, 1989; Hamerstrand et al., 1981; Stauffer, 1990; Van Oort et al., 1989; Van Oort en Westerop 1993; Smith et al., 1980) maar tot dusver is er nog steeds geen gestandaardiseerde methode ontwikkeld. De test wordt binnen de verschillende laboratoria naar eigen inzicht geoptimaliseerd, waardoor de resultaten onderling niet vergelijkbaar zijn. Een ander nadeel van de methode is, dat het onmogelijk is de protease-inhibitorsamenstelling van een monster te bepalen. Er wordt geen onderscheid gemaakt tussen KTI en BBI of andere protease remmende komponenten (Liener, 1986; Brandon, 1988; DiPietro en Liener, 1989a en 1989b).

2. Ureasebenaling. De ureasebepaling is een indirekte methode om protease -inhibi toren aan te tonen. Omdat het omslachtig is tijdens technologische behandeling van plantaardig materiaal zoals sojabonen met de enzymatische trypsineremmingstest de trypsine-inhibitoraktiviteit te meten, wordt in de praktijk volstaan met de bepaling van een marker-enzym, urease. De rest-aktiviteit van dit enzym wordt gezien als (indirekte) maat voor de efficiëntie van de inaktivatiebehandeling met hitte (Publikatieblad EEG, 1971)· Het is, echter zoals hiervoor reeds is uiteengezet, van groot fysiologisch en economisch belang om een goed inzicht te hebben in het verloop van de hitte-stap, in het bijzonder voor peulvruchten zoals de sojaboon, om inzicht te krijgen in de inaktivatie van zowel KTI als BBI. Verder geeft de ureasebepaling geen goede korrelatie met belangrijke parameters zoals restaktiviteit van protease-inhibitoren en nutritionele waarde (Waldroup et al.

1985)· 3. Immunochemische bepalingsmethode.

Al sinds 1969 kunnen protease-inhibitoren met behulp van antilichamen worden aangetoond (Catsimpoolas en Leuthner, 1969a; Catsimpoolas et al., 1969b; Brandon et al., 1985, 1987, 1988, 1989; Sessa en Bietz, 1986; DiPietro en Liener, 1985, 1989a en 1989b). Een groot voordeel van het gebruik van antilichamen is dat een bepaalde struktuur van het oppervlak van het eiwitmolekuul wordt herkend en gebonden. Op deze manier wordt heel specifiek de aanwezigheid van een bepaald (iso)type protease-inhibitor vastgesteld. Het aantonen van de aanwezigheid van een bepaalde protease-inhibitor geeft echter geen uitsluitsel over de aktiviteit van deze protease-inhibitor of over aanwezigheid of aktivi-teit van andere eventueel in het monster aanwezige protease-inhibito-ren. Terwijl juist deze protease-inhibitor-(rest)aktiviteit (afzonderlijk of totaal) belangrijk is.

Uit het voorafgaande blijkt dat de huidige analysemethoden voor bepaling van (rest)aktiviteit van protease-inhibitoren niet voldoen aan de hiervoor genoemde specifieke voorwaarden voor een goede analysemethode. Een protease-inhibitor-bepalingsmethode waarbij de zojuist geschetste problemen worden overkomen is nu gevonden.

Beschrijving van de uitvinding

Het algemene principe van de onderhavige uitvinding berust op herkenning en aan toning van aktieve protease-inhibitoren, waarbij enzymatische aktiviteit niet van belang is. Uitgaande van dit principe zijn verschillende toets-opzetten mogelijk, waarmee dezelfde of vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen. Sommige toets-opzetten meten specifiek de aktiviteit van één (of meer) afzonderlijke (iso)type(s) protease-inhibi-tor, terwijl andere een totale maat voor protease-inhibitoraktiviteit geven.

Het principe van de toetsmethoden om protease-inhibitoraktiviteit te bepalen volgens de onderhavige uitvinding is gebaseerd op de kombinatie van: specifieke herkenning tussen protease en protease-inhibitor, gevoelig en nauwkeurig aantonen van (ten minste één van) de reaktan-ten of het komplex als zodanig door bijvoorbeeld: a. specifieke antilichamen en/of b. een, van een detekteerbaar of detekteerbaar te maken merkmiddel voorziene protease, protease-inhibitor of het (protease-(protease-inhibitor) ) -komplex.

Door gebruik te maken van de specifieke herkenning tussen protease en protease-inhibitor kan een onderscheid worden gemaakt tussen de aktieve en inaktieve vormen van protease-inhibitoren.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het detekteren en eventueel kwantificeren van aktiviteit van ten minste één protease-inhibitor in een te analyseren mengsel, waarbij men a) het te analyseren mengsel of een monster daarvan in kontakt brengt met ten minste één protease voor de te detekteren protease-inhibitor, met welke protease de aktieve vorm van de protease-inhibitor komplexvorming ondergaat tot (protease- (protease-inhibitor) )-komplex en met welke protease noch inaktieve protease-inhibitor noch reeds gekomplexeerde protease-inhibitor bindt, b) de in stap a gevormde hoeveelheid (protease-(protease-inhibitor))-komplex bepaalt.

In de werkwijze volgens de uitvinding kan men in stap a) het te analyseren mengsel of een monster daarvan tevens in kontakt brengen met een geïmmobiliseerde komponent die specifiek aan ten minste één van de bestanddelen van het (protease-(protease-inhibitor) )-komplex bindt of aan het komplex als zodanig bindt, welke komponent de komplexvorming van de protease met de protease-inhibitor niet verstoort. Een uitvoeringsvorm omvat het gebruik van een geïmmobiliseerde komponent die specifiek (protease- (protease-inhibitor)) -komplex als zodanig en niet de afzonderlijke bestanddelen van het (protease- (protease-inhibitor)) -komplex kan binden. Een andere uitvoeringsvorm omvat het gebruik van een geïmmobiliseerde komponent die specifiek de protease bindt, waarbij noch de komplexvorming van (protease- (protease-inhibitor)) -komplex noch het (protease- (protease-inhibitor))-komplex worden verstoord. De geïmmobiliseerde komponent bindt aan een deel van de protease dat niet bij komplexvorming met de te bepalen protease-inhibitor betrokken is. De geïmmobiliseerde komponent kan, in weer een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding, specifiek de te detekteren protease-inhibitor binden. Hierbij bindt de geïmmobiliseerde komponent aan een deel van de protease-inhibitor dat niet bij komplexvorming met de protease betrokken is.

In de vier zojuist genoemde uitvoeringsvormen kan de geïmmobiliseerde komponent bijvoorbeeld een antilichaam zijn. Er zijn antilichamen bekend dië specifiek zijn voor een bepaalde protease-inhibitor of voor een bepaalde protease. Afhankelijk van de uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding kan men specifiek de aktiviteit van één (of meer) afzonderlijke (iso)type(s) protease-inhibitor of de totale protease-inhi-bitoraktiviteit van een mengsel bepalen. Het is duidelijk dat de keuze van een bepaalde geïmmobiliseerde komponent afhankelijk is van hetgeen men beoogt te bepalen.

In een andere uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding kan de geïmmobiliseerde komponent die specifiek de te detekteren protease-inhibitor bindt ten minste één protease voor de te detekteren protea-se-inhibitor zijn, welke geïmmobiliseerde protease met de aktieve vorm van de protease-inhibitor komplexvorming ondergaat en welke protease niet Λ M rn All* 4«. m J A J Ik a l*. M «3 4» «A S <k ik JX A 1 I A ---* Μ ______ andere proteases aan eventueel andere aanwezige reactieve protease-inhibitor zijden dan waaraan de geïmmobiliseerde protease zelf bindt beïnvloedt. Wanneer de te detekteren protease-inhibitor ten minste twee voor proteaseremming reaktieve inhibitorzijden heeft is het mogelijk de akti-viteit van een dergelijke protease-inhibitor t.a.v. een bepaalde protease in een uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding te bepalen, waarbij men de protease-inhibitor zowel aan de geïmmobiliseerde protease als aan de vrije protease bindt zodat een drievoudig geïmmobiliseerd komplex wordt gevormd.

Hen kan in een andere uitvoeringsvorm in stap a) het te analyseren mengsel of monster daarvan in kontakt brengen met een geïmmobiliseerd bestanddeel van het (protease-(protease-inhibitor))-komplex. Het geïmmobiliseerde bestanddeel kan hetzij protease, hetzij protease-inhibitor zijn.

Het bepalen van de in stap a gevormde hoeveelheid (protease- (protease-inhibitor) )-komplex in stap b van de onderhavige werkwijze kan direkt of indirekt plaatsvinden. Bij de direkte bepaling wordt in stap b) het te analyseren mengsel of monster daarvan tevens in kontakt gebracht met een hoeveelheid detekteerbaar of detekteerbaar te maken merkmiddel dat specifiek aan ten minste één van de bestanddelen van het (protease- (protease-inhibitor) ) -komplex of aan het komplex als zodanig bindt of aan een geïmmobiliseerde komponent genoemd in conclusies 4-9, welke komponent niet gebonden is aan (protease-(protease-inhibitor))-komplex, bindt en welk merkmiddel noch het komplex noch de komplexvorming verstoort. i Bij de indirekte werkwijze volgens de uitvinding brengt men het te analyseren mengsel of een monster daarvan tevens in kontakt met een bekende hoeveelheid van ten minste één van merkmiddel voorzien bestanddeel van het (protease-(protease-inhibitor))-komplex, welk merkmiddel detekteerbaar of detekteerbaar te maken is en welk merkmiddel noch het (prote-I ase-(protease-inhibitor))-komplex noch de vorming van het komplex verstoort.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding kunnen gebruikelijke werkwijzen voor het immobiliseren van hetzij protease hetzij protease-inhibitor aan een vaste drager zoals het kunststofoppervlak van een microtiterplaat ί of reageerbuis van bijvoorbeeld polystyreen, polypropyleen of polyvinylchloride, op glas of kunststofkralen, op filtreerpapier of dextraan, op een membraan van bijvoorbeeld cellulose-acetaat of nitrocellulose-acetaat worden toegepast. Men kan bij imraobilisatie het gewenste bestanddeel kovalent of niet kovalent koppelen, bijvoorbeeld door eenvoudige adsorp- tie of eventueel na aktivering van de drager. Hetzelfde geldt ten aanzien van de immobilisatie van de komponent die specifiek ten minste één van de bestanddelen van het (protease-(protease-inhibitor) )-komplex of het kom-plex als zodanig bindt.

Bij de onderhavige werkwijze kunnen de gebruikelijke merkmiddelen en detektiewijzen van dergelijke merkmiddelen worden toegepast voor de de-tektie en eventuele kwantifikatie van de aktiviteit van de protease-inhibitor (en). Voorbeelden van gebruikelijke merkmiddelen zijn met radioakti-viteit gemerkte deeltjes, fluorescentiemerkmiddelen, enzymen, met kleurstof gemerkte deeltjes of kolloïdale deeltjes. Het merkmiddel kan bij direkte of indirekte bepaling een antilichaam zijn.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het specifiek bepalen van de aktiviteit van protease-inhibitoren. Met deze werkwijze is het mogelijk om het aktieve gedeelte van de protease-inhibi-torpopulatie te bepalen zonder daarbij gebruik te maken van de enzymatische aktiviteit van de geremde protease. De test kombineert de specifieke herkenning tussen protease en protease-inhibitor met gevoelige en nauwkeurige aantoning van één van de reaktanten door bijvoorbeeld specifieke antilichamen of met behulp van een merkmiddel.

Door gebruik te maken van de specifieke herkenning tussen protease en protease-inhibitor kan een onderscheid worden gemaakt tussen aktieve protease-inhibitoren en inaktieve protease-inhibitoren.

Door bij de aantoning, gebruik te maken van specifieke antilichamen gericht tegen de te detekteren protease-inhibitor of het (protease-(protease-inhibitor) )-komplex kunnen de aktieve (iso)type(s) protease-inhibitoren afzonderlijk worden gedetecteerd en eventueel gekwantificeerd. Door gebruik te maken van antilichamen is de analyse zeer gevoelig, waardoor lage koncentraties van de protease-inhibitor bepaald kunnen worden.

Door bij de aantoning, gebruik te maken van specifieke antilichamen gericht tegen meerdere protease-inhibitortypes of komplexen of de andere reaktanten (bijvoorbeeld protease) of van andere merkmiddelen is het mogelijk om het totaal aan aktieve protease-inhibitoren via indirekte of direkte bepaling te detecteren en eventueel te kwantificeren. Met deze methode kunnen eveneens lage koncentraties van het totaal aan aktieve protease-inhibitoren worden bepaald.

De onderhavige uitvinding is gericht op toepassing van de beschreven werkwijze voor detekteren en eventueel kwantificeren van de aktieve (iso) types protease-inhibitor (en) zoals Kil en BBI. Afhankelijk van de uitvoeringsvorm kan de totale protease-inhibitoraktiviteit of specifiek de aktiviteit van één (of meer) afzonderlijke protease-inhibitor(en) worden bepaald. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen aktieve en inaktieve vormen van de protease-inhibitor.

De bepaling is simpel en snel en er kunnen veel monsters tegelijkertijd worden geanalyseerd. De bepalingsmethode die hier wordt beschreven, is geschikt om de kwaliteit (die gekoppeld is aan protease-inhibitorakti-viteit) van plantaardige produkten, in het bijzonder van peulvruchten, maar ook van aardappelen, granen, etc. en van dergelijk plantaardig materiaal afgeleide produkten, te bepalen. Onder andere kan het gehalte aan aktieve protease-inhibitoren KTI en BBI in sojabonen en in daarvan afgeleide produkten worden bepaald. Ook aktiviteiten van dierlijke, micro-biële en synthetische protease-inhibitoren kunnen met de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding worden bepaald.

De werkwijze kan ook worden toegepast voor het bepalen van zeer lage koncentraties protease-inhibitor in voor voedsel of voeder bestemde produkten na bepaalde verwerkingsstappen. De onderhavige werkwijze kan ook worden toegepast om nieuwe plantvariëteiten die bijvoorbeeld door veredeling zijn ontstaan, te screenen. Ook kan de onderhavige werkwijze worden toegepast om (nieuwe) plantvariëteiten, plantweefselkweken en microörga-nismen, etc. te screenen op expressie van een gen dat voor protease-inhibitor codeert.

Uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding kan ondermeer plaatsvinden in microtiterplaten, maar een "dipstick”-achtige testopzet behoort ook tot de mogelijkheden. Bij een dergelijke testopzet kan worden geïmmobiliseerd op een membraan.

De onderhavige uitvinding heeft eveneens betrekking op een kit die bestemd is voor het uitvoeren van de werkwijze volgens de uitvinding. De exakte uitvoeringsvorm van een dergelijke kit zal afhangen van de toepassing die men beoogt voor de onderhavige werkwijze. i In de onderstaande tabel staan een aantal verschillende denkbare protokollen, waarmee men de werkwijze volgens de uitvinding kan toepassen schematisch weergegeven. Het zal voor een deskundige zondermeer duidelijk zijn welke kitvormen voor dergelijke protokollen mogelijk zijn en onder de onderhavige uitvinding vallen, i Is stelt de te detekteren protease-inhibitor voor.

E stelt de protease die aan protease-inhibitor kan komplexeren voor.

I stelt een tweede protease-inhibitor voor, welke tweede protease-inhibitor niet dezelfde is als de te detekteren protease-inhibitor. De tweede protease-inhibitor kan wel van hetzelfde (iso)type zijn als de te detek-teren protease-inhibitor

Ce stelt een komponent voor dat specifiek protease bindt Ci stelt een komponent voor dat specifiek de te detekteren protease-inhibitor bindt

Cei stelt een komponent voor dat specifiek (protease-(protease-inhibitor) )-komplex bindt.

# stelt immobilisatie voor van het type bestanddeel dat het daarna gegeven symbool voorstelt.

Uit deze tabel kunnen de volgende hoofdkategoriën worden afgeleid: 1) Men inkubeert protease (E) en te detekteren protease-inhibitor (Is).

2) Men immobiliseert protease (#E) en brengt dit in kontakt met te detekteren protease-inhibitor (Is).

3) Men immobiliseert een tweede protease-inhibitor (die specifiek voor de protease is) (#1) en brengt dit in kontakt met protease (E) en te detekteren protease-inhibitor (Is).

4) Men immobiliseert een komponent die specifiek protease bindt (#Ce) en brengt dit in kontakt met protease (E) en te detekteren protease-inhibitor (Is).

5) Men immobiliseert een komponent die specifiek protease-inhibitor bindt (#Ci) en brengt dit in kontakt met protease (E) en te detekteren protea-se-inhibitor (Is).

6) Men immobiliseert een komponent die specifiek (protease-(protease-inhibitor) )-komplex bindt (#Cei) en brengt dit in kontakt met protease (E) en te detekteren protease-inhibitor (Is).

Indien men een protease-inhibitor met ten minste twee reaktieve pro-te&se-inhibitorzijden wil detekteren kan men gebruikmaken van de eigenschap dat ten minste twee proteases aan de protease-inhibitor kunnen binden. Door de te detekteren protease-inhibitor (Is) volgens een methode van één van de zes hiervoor genoemde hoofdkategoriën tevens in contact te brengen met een tweede protease (E2), kan de protease-inhibitor zowel aan de eerste protease (El) als aan de tweede protease binden, zodat een drievoudig geïmmobiliseerd komplex wordt gevormd. Het tweede protease kan eenzelfde type protease zijn als de eerste protease of een ander type protease. Eén van de mogelijke en in het volgende voorbeeld uitgewerkte uitvoeringsvormen is:

Inkubatie Mogeliike produkten #E1 + Is + E2 #ElIsE2, #ElIs, #E1, IsE2, E2, Is.

Vervolgens kan men direkt of indirekt één van de (gevormde) produkten detekteren en eventueel kan men de hoeveelheid aktieve te detekteren protease-inhibitor daaruit afleiden. Bij de direkte methode wordt gebruik gemaakt van een hoeveelheid detekteerbaar of detekteerbaar te maken merkmiddel, dat specifiek aan ten minste één van de bestanddelen van het (protease- (protease-inhibitor) )-komplex of aan het komplex als zodanig bindt of aan een geïmmobiliseerde komponent genoemd in conclusies 4-9, welke komponent niet gebonden is aan (protease-(protease-inhibitor))-komplex, bindt en welk merkmiddel noch het gevormde komplex noch de kom-plexvorming verstoort. Bij indirekte bepaling wordt een kompetitie-reak-tie uitgevoerd met hetzij een bekende hoeveelheid van merkmiddel voorziene protease (@E) hetzij een bekende hoeveelheid van merkmiddel voorziene tweede protease-inhibitor (@I), hetzij met een bekende hoeveelheid van merkmiddel voorzien (protease-(protease-inhibitor))-komplex (@IE). (@ stelt hierbij het merkmiddel voor, direkt gekoppeld aan het type bestanddeel dat het daarna gegeven symbool voorstelt). Eén van de mogelijke en in het volgende voorbeeld uitgewerkte uitvoeringsvormen is:

Inkubatie Mogeli.ike produkten #E + Is + ei #EIs, #E@I, #E, Is, §1

De volgorde waarin produkten moeten of kunnen worden toegepast is zonder meer voor een deskundige duidelijk. Welk produkt de deskundige detekteert is geheel vrij aan degene die de reaktie uitvoert. Het zal afhangen van de toepassing die men beoogt, de reaktanten en de daaruit gevormde produkten welk produkt het eenvoudigst en het goedkoopst kan worden gedetek-teerd.

TABEL: Schematische weergave van diverse uitvoeringsvormen

Enkele nadere uitwerkingen van de werkwijze volgens de uitvinding zullen nu worden gegeven.

Ten eerste kan gebruik worden gemaakt van de kombinatie van de specifieke herkenning tussen protease en protease-inhibitor met de gevoelige en nauwkeurige aantoning van ten minste één van de reaktanten door specifieke antilichamen. Wanneer specifieke antilichamen gebruikt worden gericht tegen de te detekteren protease-inhibitor of tegen het (protease-(protease-inhibitor))-komplex als zodanig, kan elke (iso)type protease-inhibitor afzonderlijk worden gedetecteerd. Voor een betere fijnafstemming is deze vorm zeer geschikt. Maar, door gebruik te maken van antilichamen tegen meerdere protease-inhibitortypes of komplexen of tegen andere reaktanten, is het ook mogelijk het totaal aan protease-inhibitor-aktiviteit te meten.

Mogelijke protokollen zijn: 1. Een bestanddeel van het (protease- (protease-inhibitor) )-komplex bijvoorbeeld de protease zoals trypsine wordt geïmmobiliseerd door binding aan een microtiterplaat. Vervolgens wordt geïnkubeerd met protease-inhi-bitorstandaardoplossing voor bepaling van een kalibratiekurve of met te meten soja-monsters. Geïnaktiveerde protease-inhibitoren kunnen niet aan trypsine binden; aktieve protease-inhibitoren wel. De gebonden protease-inhibi torfraktie wordt dan aangetoond met specifieke antilichamen, gevolgd door detektie en eventueel kwantifikatie in een kleuringsstap. Door gebruik te maken van specifieke antilichamen kan de aktiviteit van elke protease-inhibitor in het mengsel of monster afzonderlijk worden aangetoond, iets wat met de huidige analysemethoden niet mogelijk is. Deze testopzet leidt aldus tot een direkte maat voor de aktiviteit van de verschillende protease-inhibitoren die in een te onderzoeken mengsel aanwezig zijn.

2. Een specifieke protease-inhibitor wordt gebonden aan een microtiterplaat. Vervolgens wordt geïnkubeerd met protease-inhibitorstandaardoplos-singen voor bepaling van de kalibratiekurve of er wordt geïnkubeerd met te meten monsters bij aanwezigheid van een bekende hoeveelheid protease zoals trypsine. De aanwezige protease kan komplexeren met protease-inhibitor in oplossing of met de geïmmobiliseerde protease-inhibitor. Als maat voor de aktiviteit in het monster wordt vervolgens protease die aan geïmmobiliseerde protease-inhibitor is gebonden of nog onbezette geïmmobiliseerde protease-inhibitor bepaald door middel van binding van speci- fieke antilichamen tegen de protease resp. tegen de protease-inhibitor, welke bindingsreaktie kan worden gevolgd door een signaalreaktie.

3. Specifieke aantoning van in oplossing gevormde (protease-(protease-inhibitor) )-komplexen kan plaatsvinden, wanneer een antilichaam wordt gebruikt dat het (protease-(protease-inhibitor))-komplex als zodanig herkent en niet één van de reaktanten afzonderlijk herkent. Ook deze toets-opzet kan leiden tot een specifieke waarde voor één (iso)type protease-inhibitor. Men kan bijvoorbeeld het specifieke antilichaam door binding aan een microtiterplaat immobiliseren, waarna men vervolgens met protease-inhibitorstandaardoplossingen voor het bepalen van de kalibra-tiekurve of met te meten monsters bij aanwezigheid van een bekende hoeveelheid protease zoals trypsine inkubeert. Daarna kan men op verschillende wijzen de protease-inhibitoraktiviteit bepalen, bijvoorbeeld met behulp van, van merkmiddel voorzien specifiek antilichaam dat protease-inhibitor of protease of het (protease- (protease-inhibitor) )-komplex als zodanig herkent. Men kan de protease-inhibitoraktiviteit ook bepalen door het toevoegen van een bekende hoeveelheid van merkmiddel voorzien protease, welk merkmiddel detekteerbaar of detekteerbaar te maken is en welk merkmiddel het (protease-(protease-inhibitor))-komplex en de vorming van het komplex niet verstoort.

Als tweede mogelijkheid, kan gebruik worden gemaakt van de kombinatie van de specifieke herkenning tussen protease en protease-inhibitor en van aantoning van één van de reaktanten met behulp van ten minste één van merkmiddel voorzien bestanddeel van het (protease-(protease-inhibitor))-komplex of ten minste één van merkmiddel voorzien komplex als zodanig. Dit toetsprincipe kaneen algemene maat geven voor de totale aktiviteit van aanwezige protease-inhibitoren. Twee protokollen daarvan kunnen zijn: 1. Een vaste hoeveelheid protease zoals trypsine wordt door binding aan een microtiterplaat geïmmobiliseerd. Vervolgens wordt geïnkubeerd met protease-inhibitorstandaardoplossingen voor het bepalen van een kalibra-tiekurve of met te meten monsters bij aanwezigheid van een bekende hoeveelheid, van een merkmiddel voorziene protease-inhibitor. Als maat voor de protease-inhibitoraktiviteit in de oplossing of in het monster wordt vervolgens van een merkmiddel voorziene protease-inhibitor die zich aan de geïmmobiliseerde protease zoals trypsine heeft gehecht bepaald. Hierbij kan bijvoorbeeld een enzym, een fluorescente groep, een kolloidaal label, enz. als merkmiddel dienen.

2. Een specifieke protease-inhibitor kan aan een microtiterplaat worden gebonden. Vervolgens wordt geïnkubeerd met protease-inhibitorstandaardop-lossingen voor bepaling van de kalibratiekurve of met te meten monsters bij aanwezigheid van een bekende hoeveelheid, van merkmiddel voorziene protease zoals trypsine. Als maat voor de protease-inhibitoraktiviteit in de oplossing of in het monster wordt vervolgens van een merkmiddel voorziene protease zoals trypsine, die zich aan geïmmobiliseerde protease-inhibitor heeft gehecht bepaald.

In principe is het mogelijk het toetsprincipe volgens de onderhavige uitvinding toe te passen in een snelle, dipstick-achtige assay.

In een uitvoeringsvorm van een dergelijke toets wordt het ene bestanddeel van het te vormen (protease- (protease-inhibitor) )-komplex op een membraan geïmmobiliseerd. Het andere bestanddeel wordt aan kolloïdale deeltjes geadsorbeerd. In een andere uitvoeringsvorm wordt een komponent die specifiek aan ten minste één van de bestanddelen van het (protease-(protease-inhibitor))-komplex bindt of aan het komplex als zodanig bindt op een membraan geïmmobiliseerd en wordt één van de bestanddelen van het te vormen (protease-(protease-inhibitor))-komplex aan kolloïdale deeltjes geadsorbeerd, terwijl het andere bestanddeel vrij wordt toegevoegd.

De deeltjes-eiwitkonjugaten worden vervolgens gebruikt als merkmiddel in een chromatografische toets-opzet. In een protokol van dit principe wordt een antilichaam gericht tegen een protease-inhibitor op een membraan (dipstick) geïmmobiliseerd; kolloïdale deeltjes worden gecoat met de protease, bijvoorbeeld trypsine en een aantal centimeters onder het geïmmobiliseerde antilichaam op het membraan aangebracht; het membraan wordt vervolgens in een bepaald volume van het te analyseren mengsel (bijvoorbeeld soja-extrakt) geplaatst; het mengsel wordt door kapillaire kracht door het membraan getrokken en neemt de aangebrachte kolloïdale konjugaat mee (flow-through assay); protease-inhibitoren in het mengsel binden aan de protease en dus aan de kolloïdale deeltjes; het komplex wordt tenslotte gebonden door de geïmmobiliseerde antilichamen; dit geeft aanleiding tot een gekleurde spot ter plaatse. De intensiteit van de kleur is afhankelijk van de hoeveelheid aktieve protease-inhibitor in het te analyseren mengsel. Door bepaling van de intensiteit kan deze toets worden gekwantificeerd. Dit is mogelijk door gebruik te maken van bijvoorbeeld eenvoudige handdensitometers of door toepassing van komputer-beeld-analyse.

Met de onderhavige werkwijze kan niet alleen de aktiviteit van in de natuur voorkomende protease-inhibitoren worden bepaald maar kunnen van synthetische en ook genetisch gemanipuleerde polypeptiden met soortgelijke type werking als de natuurlijke protease-inhibitoren de aktiviteiten worden bepaald (Hammond et al, 198*1; Jondrier et al, 1987; Spencer en Hodge, I99I; Meader et al, 1992; Leatherbarrow en Salasinski, 1991)· Hiermee kunnen bijvoorbeeld de gevolgen van manipulaties op de aktiviteit van gemuteerde protease-inhibitoren worden vergeleken met wildtype protease-inhibitoren. Hetgeen in het bijzonder bij medicinale toepassingen zeer interessant is.

Vanwege fysiologische effekten die protease-inhibitoren kunnen hebben op mens en dier en vanwege economische en milieukundige aspekten is het van groot belang te kunnen beschikken over een analysemethode waarmee de aktiviteit van protease-inhibitoren, totaal of afzonderlijk, gevoelig en nauwkeurig kan worden bepaald. De huidig gebruikte ureasetest en trypsi-neremmingstest zijn hiervoor ontoereikend. De onderhavige methode voldoet wel aan bovengenoemde eisen en is derhalve superieur aan de huidige bepalingsmethoden. De ureasetest is een indirekte methode die niet goed kor-releert met de restaktiviteit van de protease-inhibitoren en dus ongeschikt is om protease-inhibitor te meten (Waldroup et al, 1985)· De tryp-sineremmingstest geeft onnauwkeurige resultaten bij produkten met een lage (rest)aktiviteit, bijvoorbeeld bij met hitte behandelde van soja afgeleide produkten (Brandon et al, 1988). Verder is de test omslachtig en tijdrovend, terwijl bovendien andere komponenten uit het extrakt storend werken. Het is met beide testen (urease- en trypsineremmingstest) niet mogelijk een onderscheid te maken tussen verschillende protease-inhibitoren.

Met de onderhavige analysemethode kan de protease-inhibitoraktivi-teit, zowel totaal als afzonderlijk, direkt worden bepaald, zonder hierbij gebruik te maken van de katalytische aktiviteit van de protease. De methode is gevoelig en nauwkeurig en matrixeffekten spelen hier niet of nauwelijks een rol.

Eén van de voordelen van de onderhavige analysemethode boven de huidige immunochemische analysemethode is dat in sommige testopzetten, gebruik wordt gemaakt van zowel de herkenning van de protease met de protease-inhibitor alsook van de specifieke aantoning van de protease-inhibitor, zodat de aktiviteit van de protease-inhibitor zelf wordt gemeten. Terwijl bij gebruikmaking van alleen antilichamen die in de huidige immunochemische bepalingsmethoden worden toegepast, alleen de aanwezigheid van een bepaalde protease-inhibitor wordt bepaald en niet de aktiviteit zelf.

Samenvattend kunnen de volgende kenmerken van de onderhavige analysemethode worden geformuleerd: 1. De aktiviteit van de protease-inhibitoren wordt bepaald zonder daarbij gebruik te maken van een enzymatische aktiviteit van de geremde protease.

2. Alleen aktieve protease-inhibitoren worden bepaald. Inaktieve protea-se-inhibitor of andere protease remmende komponenten worden niet mee bepaald.

3. Afhankelijk van het gebruikte testprincipe kan onderscheid worden gemaakt tussen de afzonderlijke (iso)type(s) protease-inhibitor(en) maar ook het bepalen van de totale protease-inhibitoraktiviteit behoort tot de mogelijkheden.

4. Matrixeffekten spelen niet of nauwelijks een rol bij de bepaling van de protease-inhibitoraktiviteit.

5- De bepaling is snel (bijvoorbeeld ELISA-achtige uitvoering) tot eventueel zeer snel (bijvoorbeeld dipstick-achtige uitvoering).

6. Er kunnen veel monsters/verdunningen tegelijkertijd worden gemeten.

7· Tegelijk met de monsters wordt de ijklijn gemeten (geen tijds- en testverschillen zoals bij de enzymatische bepaling).

8. De test is gevoelig.

9. Met de test wordt een grote nauwkeurigheid en specificiteit bereikt.

10. Er zijn slechts kleine volumina nodig voor de bepaling, waardoor ook kleine monsters kunnen worden bepaald (interessant i.v.m. veredeling) .

11. De kosten zijn aanzienlijk lager dan bij bestaande methoden.

Voörbeeld I

- Het bekleden van de microtiterplaat met trypsine.

Trypsine werd opgelost in PBS (0.8% NaCl, 10 mM fosfaat, pH 7*4) in een koncentratie van 10 pg/ml. Aan elk putje van de microtiterplaat werd 100 μΐ van deze oplossing toegevoegd (1 pg / well). Het bekleden vond gedurende de nacht plaats bij 4 eC. Vervolgens werd de plaat één keer met water, drie keer met PBST (0.8% NaCl, 10 mM Fosfaat, 0.1% Tween-20, pH 7.4) en nog één keer met water gewassen.

- De inkubatie met Kunitz trypsine inhibitor (KTI) van de sojaboon.

100 μΐ van een oplossing van KTI (Sigma Chemical Co., gezuiverd m.b.v. FPLC DEAE-mono-Q kolom) in verschillende koncentraties werd geïnkubeerd gedurende 30 minuten bij 37 eC. Als buffer is bij deze inkubatiestap 1% runderserumalbumine, 50 mM Tris en 20 mM CaCl2. pH 8.2 gebruikt. De KTI-koncentraties van de ijklijn waren 1000, 100, 10 en 1 ng/100 μΐ. De ijklijn werd in duplo ingezet. Daarna werd de plaat één keer met water, drie keer met PBST en nog één keer met water gewassen.

- De inkubatie met anti-KTI-serum.

De plaat werd vervolgens geïnkubeerd met 100 μΐ K338-4 (500 x verdund in 1% runderserumalbumine, 100 mM fosfaat, 2 mM EDTA, pH 7.8 )/putje gedurende 1 uur bij 37 *C. Serum K338-4 is serum van een konijn na 4 immuni-saties met KTI (3 x KTI-Sigma en 1 x KTI-Sigma-FPLC gezuiverd). De plaat werd daarna één keer met water, drie keer met PBST en nog één keer met water gewassen.

- De inkubatie met GARAP.

De plaat werd geïnkubeerd met 100 μΐ met alkalische fosfatase gemerkte geit-(anti-konijn)-IgG (1000 x verdund in 1% runderserumalbumine, 100 mM fosfaat, 2 mM EDTA, pH 7*8 )/putje gedurende 1 uur bij 37 °C. Vervolgens werd de plaat één keer met water, drie keer met PBST en nog één keer met water gewassen.

- Toevoeging van substraat.

Aan elk putje werd 200 μΐ substraatoplossing toegevoegd (1 mg p-nitrofe-nylfosfaat/ml 50 mM carbonaat, 0.5 mM MgCl2.6H20, pH 9*6). Inkubatie vond plaats gedurende 30 minuten bij 37 °C. De extinktie werd vervolgens bij 405 nm m.b.v. een microplate reader gemeten.

Li teratuurlijst:

Birk Y, 1987. Protease inhibitors. In: (Eds.) Hydrolytic enzymes. A. Neu-berger & K. Brocklehurst : Elsevier, Amsterdam. 257"305·

Birk, Y., 1989* Protein protease inhibitors of plant origin and their significance in nutrition. In: Becent advances of research in anti-nutritional factors in legume seeds, Eds: J. Huisman, T.F.B. van der Poel, I.E. Liener. Pudoc Wageningen, The Netherlands, 83“95·

Boisen S., 1983· Protease inhibitors in cereals, Acta Agricult. Scandi- navica 33· 369-301..

Boisen, S., 1989· Comparative studies on trypsin inhibitors in legumes and cereals. In: Becent advances of research in antinutritional factors in legume seeds, Ed. J. Huisman, T.F.B. van der Poel, I.E. Liener, Pudoc, Wageningen, The Netherlands. 118-120.

Brandon, D.L., S. Hague and M. Friedman, 1985. Antigenicity of native and modified Kunitz Soybean Trypsin Inhibitor, (Abstract), 7th European Immunology Meeting, Jerusalem, Israel, 8-13·

Brandon, D.L., S. Hague and M. Friedman, 1987· Interaction of monoclonal antibodies with soybean trypsin inhibitors, J. Agric. Food Chem. 35» I95-2OO.

Brandon, D.L., A.H. Bates and M. Friedman, 1988. Enzyme-linked immunoassay of soybean Kunitz Trypsin inhibitor using monoclonal antibodies, J. Food Sci., 53 (1), 102-106.

Brandon, D.L., A.H. Bates and M. Friedman, 1989. Monoclonal antibody-based enzyme immunoassay of the Bowman-Birk Protease Inhibitor of soybeans, J. Agric. Food Chem. 37. 1192-1196.

Broadway R.M., S.S. Duffey, G. Pearce and C.A. Ryan, 1986. Plant proteinase inhibitors: a defense against herbivorous insects? Entomol.

exp. appl. 41: 33-38

Catsimpoolas, N. and E. Leuthner, 1969· Immunological methods for detection and quantitation of Kunitz Soybean Trypsin Inhibitor, Anal.Bio- chem. 31, 437-447.

Catsimpoolas, N., D.A. Rogers and E.W. Meyer, 1969· Immunochemical and disc electrophoresis study of Soybean Trypsin Inhibitor SBTIA-2, Cereal Chem. 46, 136-144.

Dickerson R.E. and I. Geis, 1969· The structure and action of proteins, Harper & Row, Publishers, New York, 120 p, 83·

DiPietro, C.M. and I.E. Liener, 1985· Heat inactivation of soybean trypsin inhibitor is quantified by ELISA, Fed. Proc. 749·

DiPietro, C.M. and I.E. Liener, 1989a. Soybean protease inhibitors in foods, J. Food Science, 54, 606-609, 617.

DiPietro, C.M. and I.E. Liener, 1989b. Heat inactivation of the Kunitz and Bowman-Birk Soybean Protease Inhibitors, J. Agric. Food Chem., 37, 39-44.

Friedman, M. (Ed.), 1986. Nutritional and toxicological significance of enzyme inhibitors in foods. Plenum, NY

Hamerstrand, G.E., L.T. Black and J.D. Glover, 1981. Trypsin inhibitors in soy products: Modification of the standard analytical procedure, Cereal Chem. 58, 42-45.

Hammond, R.W., D.E. Foard, B.A. Larkins, 1984. Molecular cloning and analysis of a gene coding for the Bowman Birk protease inhibitor in soybean, J. of Biol. Chem., 259, 15, 9883-9890.

Jondrier, P.E., D.E. Foard, L.A. Floener and B.A. Larkins, 1987· Isola tion and sequence of cDNA encoding the soybean protease inhibitors pl-IV and C-II, Plant Molecular Biology 10, 35-42.

Kakade, M.L., N. Simons and I.E. Liener, 1969· An evaluation of natural versus synthetic substrates for measuring the antitryptic activity of soybean samples, Cereal Chem., 46: 518-526.

Kakade, M.L., J.J. Rackis, J.E. McGhee and G. Puski, 1974. Determination of trypsin inhibitor activity of soy products: A collaborative analysis of an improved method, Cereal Chem., 51* 376-382.

Laskowski, M. Jr., 1986. Protein inhibitors of serine proteinases - mechanism and classification. In: nutritional and toxicological significance of enzyme inhibitors in foods Ed: M. Friedman, Plenum, New York, 1-17.

Leatherbarrow, R.J. and H.J. Salacinski, 1991· Design of a small peptide based proteinase inhibitor by modeling the active site region of Barley chymotrypsin inhibitor 2, Biochem. 30, 10717“10721.

Lehnhardt, W.L. and H.G. Dills, 1984. Analysis of trypsin inhibitors in soyproducts: evaluation of methodology and improvements, J. Am. Oil Chem. Soc. 61, 691·

Liener, I.E. and M.L. Kakade, 1980. Protease-inhibitors, In: Toxic constituents of plant foodstuffs, Ed. I.E. Liener, Academic Press, London, 7-71.

Liener, I.E., 1986. Trypsin inhibitors: concern for human nutrition or not?, J. Nutrition 116, 920-923.

Liener, I.E., 1989. Antinutritional factors in legume seeds: state of the art. In: Recent advances of research in antinutritional factors in legume seeds, Eds: J. Huisman, T.F.B. van der Poel, I.E. Liener. Pudoc Wageningen, The Netherlands, 6-13·

Liu, K. and P. Markakis, 1989· Trypsin inhibition assay as related to limited hydrolysis of inhibitors, Analytica; Biochemistry, 178, 159" I65.

Meader, D.L., M. Sunde and D.P. Botes, 1992. Design and inhibitory properties of synthetic Bowman Birk loops, Peptide Protein Res. 40, 97" 102.

Norton, G., 1991· Proteinase inhibitors. In: Toxic substances in crop plants, Eds. J.P.F D'Mello, C.M, Duffus, J.H. Duffus, The Royal Society of Chemistry, Cambridge, England, 68-108.

Publikatieblad EEG, 1971· Bepaling van de urease-activiteit van sojapro-dukten, Nr. L155/36-37» no. 16, 12 juli 1971·

Rackis J.J. and M.R. Gumbmann, 1981. Protease inhibitors:physiological properties and nutritional significance. In: Antinutrients and natural toxicants in foods. Eds R.L. Ory, Pood and nutrition press, Westport, 203-237.

Richardson M., 1977· The proteinase inhibitors of plants and micro-organismes. Phytochemistry, 16, 159“l69·

Ryan C.A., 1978. Proteinase inhibitors in plant leaves: a biochemical model for pest-induced natural plant protection. In: Trends in biochemical sciences, 3· 148-150

Ryan C.A., 1983· Insect-induced chemical signals regulating natural plant protection response. In: variable plant and herbivores in natural and managed systems, Eds. R.F. Denno and M.S. McClure, NY, Academic Press, 43-60.

Sessa, D.J. and J.A. Bietz, 1986. Toasted soybean flour components with trypsin inhibitor activity, J.Am. Oil Chem.Soc. 63. 784-788.

Smith C., W. van Megen, L. Twaalf hoven and C. Hitchcock, 1980. The determination of trypsin inhibitor levels in foodstuffs, J.Sci. Food Agr., 31, 341-350.

Spencer, M.E. and R. Hodge, 1991· Cloning and sequencing of the cDNA encoding the major albumin of Theobroma cacao, identification of the protein as a member of the Kunitz protease inhibitory family, Planta: 183. 528-535.

Stauffer, C.E., 1990. Measuring trypsin inhibitor in soy meal: suggested improvements in the standard method. Cereal Chem., 67, 296-302.

ran-Wilson, A.L. and K.A. Wilson, 1986. Relevance of multiple soybean trypsin inhibitor forms to nutritional quality. In: Nutritional and toxicological significance of enzyme inhibitors in foods, Ed. M. Friedman, Advances in experimental medicine and biology, Plenum, NY, 391-411

Van Oort M.G., R.J. Hamer and E.A. Slager, 1989· Analysis of residual trypsin inhibitor activity in legumes and cereals, In: Recent advances of research in antinutritional factors in legume seeds, Eds. J. Huisman, T.F.B. van der Poel, I.E. Liener, Pudoc, Wageningen, The Netherlands, 110-114.

Van Oort, M.G. and I.J.M. Van Westerop, 1993· Classificatie en analyse van trypsineinhibitors, In: Antinutritionele factoren in vlinderbloemigen en nutritionele effecten bij eermagige landbouwhuisdieren. Produkt-schap voor veevoeder kwaliteitsreeks nr. 23, 53“62.

Waldroup, P.W., B.E. Ramsey, H.M. Hellwig and N.K. Smith, 1985. Optimum processing for soybean meal used in broiler diets, Poultry Sci. 64, 2314-2320.

Claims

1. Werkwijze voor het detekteren en eventueel kwantificeren van aktivi-teit van ten minste één protease-inhibitor in een te analyseren mengsel, waarbij men a) het te analyseren mengsel of een monster daarvan in kontakt brengt met ten minste één protease voor de te detekteren protease-inhibitor, met welke protease de aktieve vorm van de protease-inhibitor komplexvorming ondergaat tot (protease-(protease-inhibitor))-komplex en met welke protease noch inaktieve vrije protease-inhibitor noch reeds gekomplexeerde protease-inhibitor bindt, b) de in stap a gevormde hoeveelheid (protease-(protease-inhibitor))-komplex bepaalt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de protease waarmee men het te analyseren mengsel of een monster daarvan in stap a) in kontakt brengt geïmmobiliseerd is.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij men het te analyseren mengsel of een monster daarvan in stap a) tevens in kontakt brengt met protease-inhibitor die geïmmobiliseerd is.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij men in stap a) het te analyseren mengsel of een monster daarvan tevens in kontakt brengt met een geïmmobiliseerde komponent die specifiek aan ten minste één van de bestanddelen van het (protease- (protease-inhibitor)) -komplex bindt of aan het komplex als zodanig bindt, welke komponent de komplexvorming van de protease met de protease-inhibitor of het komplex niet verstoort.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij de geïmmobiliseerde komponent specifiek het (protease-(protease-inhibitor))-komplex als zodanig bindt en niet de afzonderlijke bestanddelen.

6. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij de geïmmobiliseerde komponent specifiek de protease bindt.

7. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij de geïmmobiliseerde komponent specifiek de protease-inhibitor bindt.

8. Werkwijze volgens één van de conclusies 4-7. waarbij de geïmmobiliseerde komponent een antilichaam is.

9. Werkwijze volgens conclusie 4 of 7. waarbij de geïmmobiliseerde komponent ten minste één protease voor de te detekteren protease-inhibitor is, welke protease met de aktieve vorm van de protease-inhibitor komplex-vorming ondergaat en welke protease niet de inaktieve protease-inhibitor bindt en niet de komplexvorming van andere proteases aan eventueel andere aanwezige reaktieve protease-inhibitor zijden dan waaraan de geïmmobiliseerde protease zelf bindt beïnvloedt.

10. Werkwijze volgens conclusie 1-8, waarbij .men voor detektie en eventuele kwantifikatie van een protease-inhibitor -met ten minste twee reaktieve protease-inhibitorzijden voor komplexvorming met proteases, na stap a) het te analyseren mengsel of een monster daarvan in kontakt brengt met ten minste één tweede protease, welke tweede protease met de te detekteren aktieve protease-inhibitor en niet de inaktieve protease-inhibitor bindt en welke tweede protease het in stap a) gevormde (protease-(protease-inhibitor) )-komplex niet verstoort.

11. Werkwijze volgens één van de conclusies 2-10, waarbij geïmmobiliseerd is op een vaste drager zoals een membraan of een microtiterplaat.

12. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij men het te analyseren mengsel of monster daarvan in kontakt brengt met een bekende hoeveelheid van ten minste één van merkmiddel voorzien bestanddeel van het (protease-(protease-inhibitor) )-komplex of ten minste één van merkmiddel voorzien komplex, welk merkmiddel detekteerbaar of detekteerbaar te maken is en welk merkmiddel het (protease- (protease-inhibitor)) -komplex en de vorming van het komplex niet verstoort.

13. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij men in stap b) gebruik maakt van een detecteerbaar of detecteerbaar te maken merkmiddel dat specifiek aan ten minste één van de bestanddelen van het (protease-(protease-inhibitor))-komplex bindt of aan het komplex als zodanig bindt of aan een geïmmobiliseerde komponent genoemd in conclusies 4-9» welke komponent niet gebonden is aan (protease-(protease-inhibitor) )-komplex, bindt en welk merkmiddel noch het komplex noch de komplexvorming verstoort.

14. Werkwijze volgens conclusie 12 of 13, waarbij men als detekteerbaar of detekteerbaar te maken merkmiddel een enzym, een fluorescentiemarker, een met radioaktiviteit gemerkt deeltje, een met kleurstof gemerkt deeltje of een kolloïdaal deeltje toepast.

15· Werkwijze volgens één van de conclusies 12-14, waarbij het merkmiddel een antilichaam is.

16. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij de te detekteren protease-inhibitor voorkomt in peulvruchten, zoals sojabonen en in van peulvruchten zoals sojabonen afgeleide produkten.

17. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij de te detekteren protease-inhibitor een Kunitz type trypsine-inhibitor (KTI-type) is.

18. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij de te detekteren protease-inhibitor een Bowman Birk type proteïnase-inhibitor (BBI-type) is.

19. Toepassing van een werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies voor het bepalen van de aktiviteit van afzonderlijke (iso)type(s) protea-se-inhibitor(en) in een mengsel of een monster daarvan van plantaardig, dierlijk, humaan of microbieel materiaal.

20. Toepassing van een werkwijze volgens één van de conclusies 1-18 voor het bepalen van de totale aktiviteit van alle in een mengsel of een monster daarvan, van plantaardig, dierlijk, humaan of microbieel materiaal aanwezige protease-inhibitoren.

21. Toepassing volgens één van de conclusies 19 of 20 voor het bepalen van de restaktiviteit na een verwerkingsproces zoals een proces ter verwijdering of inaktivatie van in een mengsel of een monater daarvan, van plantaardig, dierlijk of microbieel materiaal aanwezige protease-inhibi-tor(en).

22. Toepassing van een werkwijze volgens conclusie 21 voor het bepalen van de restaktiviteit van ten minste één protease-inhibitor in een meng sel van plantaardig, dierlijk of microbieel materiaal dat met hitte is geïnaktiveerd.

23. Toepassing van een werkwijze volgens één van de conclusies 1-18 voor het screenen van plantaardig, dierlijk (humaan) of microbieel materiaal op expressie van een gen dat voor een protease-inhibitor codeert.

24. Toepassing van een werkwijze volgens één van de conclusies 1-18 bij veredelingsonderzoek.

25. Kit bestemd voor het uitvoeren van een werkwijze volgens één van de conclusies 1-18 en/of geschikt voor een toepassing volgens één van de conclusies 19-24, welke kit ten minste één op een vaste drager, zoals een membraan, bijvoorbeeld in de vorm van een dipstick geïmmobiliseerd bestanddeel van het te vormen protease- (protease-inhibitor) -komplex van de te detekteren protease-inhibitor omvat, alsmede houders met eventuele andere benodigde reaktanten voor het uitvoeren van een werkwijze volgens een van de conclusies 1-18 in de daartoe benodigde vorm.