NL9301134A - Method for detecting and, if necessary, quantifying the activity of at least one protease inhibitor in a mixture to be analysed, and also application of the method for determining the (residual) activity of one (or more) separate (iso)type(s) of protease inhibitor(s) and application of the method for determining the total (residual) activity of a mixture, possibly after a processing process such as a process for the removal or inactivation of protease inhibitor(s). - Google Patents
Method for detecting and, if necessary, quantifying the activity of at least one protease inhibitor in a mixture to be analysed, and also application of the method for determining the (residual) activity of one (or more) separate (iso)type(s) of protease inhibitor(s) and application of the method for determining the total (residual) activity of a mixture, possibly after a processing process such as a process for the removal or inactivation of protease inhibitor(s). Download PDFInfo
- Publication number
- NL9301134A NL9301134A NL9301134A NL9301134A NL9301134A NL 9301134 A NL9301134 A NL 9301134A NL 9301134 A NL9301134 A NL 9301134A NL 9301134 A NL9301134 A NL 9301134A NL 9301134 A NL9301134 A NL 9301134A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- protease
- protease inhibitor
- complex
- inhibitor
- activity
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
Abstract
Description
Titel: Werkwijze voor het detekteren en eventueel kwantificeren van akti-viteit van ten minste één protease-inhibitor in een te analyseren mengsel, alsmede toepassing van de werkwijze voor het bepalen van de (rest)-aktiviteit van één (of meer) afzonderlijke (iso)type(s) protease-inhibi-tor(en) en toepassing van de werkwijze voor het bepalen van de totale (rest)aktiviteit van een mengsel eventueel na een verwerkingsproces zoals een proces ter verwijdering of inaktivatie van protease-inhibitor(en).Title: Method for detecting and possibly quantifying the activity of at least one protease inhibitor in a mixture to be analyzed, and using the method for determining the (residual) activity of one (or more) separate (iso ) type (s) protease inhibitor (s) and use of the method for determining the total (residual) activity of a mixture, optionally after a processing process such as a process for removing or inactivating protease inhibitor (s).
Inleiding:Preface:
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het detekteren en eventueel kwantificeren van aktiviteit van ten minste één protease-inhibitor in een te analyseren mengsel, alsmede toepassing van de werkwijze voor het bepalen van de (rest)aktiviteit van één (of meer) afzonderlijke (iso)type(s) protease-inhibitor(en) en toepassing van de werkwijze voor het bepalen van de totale (rest)aktiviteit van protease-inhibitoren van een mengsel eventueel na een verwerkingsproces zoals een proces ter verwijdering of inaktivatie van protease-inhibitor(en). De werkwijze kan in het bijzonder worden toegepast voor het specifiek bepalen van de aktiviteit van protease-inhibitoren die voorkomen in plantaardige produkten waaronder sojabonen. Het te analyseren mengsel kan plantaardig, dierlijk, microbieel of humaan zijn.The present invention relates to a method for detecting and optionally quantifying the activity of at least one protease inhibitor in a mixture to be analyzed, and the use of the method for determining the (residual) activity of one (or more) individual (iso) type (s) protease inhibitor (s) and application of the method for determining the total (residual) activity of protease inhibitors of a mixture, optionally after a processing process such as a process for removing or inactivating protease inhibitor (and). In particular, the method can be used to specifically determine the activity of protease inhibitors found in vegetable products including soybeans. The mixture to be analyzed can be vegetable, animal, microbial or human.
AchtergrondinformatieBackground information
Planten, micro-organismen en dieren, waaronder ook mensen, bevatten eiwitten die de specifieke eigenschap hebben dat zij met proteolytische enzymen een stoïchiometrisch eiwit-eiwit-komplex vormen, hetgeen resulteert in kompetitieve remming van de katalytische aktiviteit van deze proteolytische enzymen, die ook proteases worden genoemd (Richardson 1977)· Dergelijke eiwitten, zogenaamde protease-inhibitoren komen onder meer voor in tal van produkten die voor menselijke en dierlijke konsump-tiedoeleinden worden gebruikt (Liener & Kakade, 1980). Er bestaan veel verschillende types protease-inhibitoren. In één produkt kunnen derhalve verschillende types protease-inhibitoren aanwezig zijn. De remmingskapa-citeit van de protease-inhibitor wordt beïnvloed door de herkomst van de protease (Birk, 1989)· Protease-inhibitoren uit verschillende gewassen hebben bijvoorbeeld verschillende eigenschappen wat betreft anti-nutriti-onele werking, chemische eigenschappen en inaktivatiekinetiek (Liener & Kakade, 1980; DiPietro & Liener, 1989a, Boisen, 1989)· De protease-inhi- bitoren verschillen ondermeer in molekuulgrootte, specificiteit, affiniteit en stabiliteit. Sommige protease-inhibitoren zijn zelfs in staat tegelijkertijd twee proteases te remmen. Vele protease-inhibitoren kunnen trypsine en/of chymotrypsine remmen. Sommige kunnen ook andere proteases zoals elastase, kallikreïne, piasmine, subtilisine, trombine, bromelaïne, carboxypeptidase, cathepsine, ficine, papaine en pepsine remmen (Birk, 1987; Liener & Kakade, 1980; Norton, 1991).Plants, microorganisms and animals, including humans, contain proteins that have the specific property of forming a stoichiometric protein-protein complex with proteolytic enzymes, resulting in competitive inhibition of the catalytic activity of these proteolytic enzymes, which are also proteases (Richardson 1977). Such proteins, so-called protease inhibitors, are found, inter alia, in many products used for human and animal consumption purposes (Liener & Kakade, 1980). Many different types of protease inhibitors exist. Different types of protease inhibitors may therefore be present in one product. The inhibition capacity of the protease inhibitor is influenced by the origin of the protease (Birk, 1989). Protease inhibitors from different crops, for example, have different properties in terms of anti-nutritional properties, chemical properties and inactivation kinetics (Liener & Kakade , 1980; DiPietro & Liener, 1989a, Boisen, 1989) · The protease inhibitors differ, inter alia, in molecular size, specificity, affinity and stability. Some protease inhibitors are even capable of simultaneously inhibiting two proteases. Many protease inhibitors can inhibit trypsin and / or chymotrypsin. Some may also inhibit other proteases such as elastase, kallikrein, piasmin, subtilisin, thrombin, bromelain, carboxypeptidase, cathepsin, ficin, papaine and pepsin (Birk, 1987; Liener & Kakade, 1980; Norton, 1991).
Het (protease- (protease-inhibitor) )-komplex is erg stabiel en de pro-teolytische aktiviteit van de protease wordt hierbij volledig geremd. Uit röntgenkristallografie en NMR-onderzoek van protease-inhibitoren uit sojabonen bleek dat in het (protease-(protease-inhibitor) )-komplex ongeveer 10-15 residuen van de protease-inhibitor interakties vertonen met residuen van de protease. Het specifieke karakter betreft ondermeer de sterkte van de interaktie en het type protease waarmee de interaktie wordt aangegaan (Birk 1989).The (protease (protease inhibitor)) complex is very stable and the protolytic activity of the protease is completely inhibited. X-ray crystallography and NMR studies of protease inhibitors from soybeans showed that in the (protease (protease inhibitor)) complex about 10-15 residues of the protease inhibitor interact with residues of the protease. The specific character concerns, among other things, the strength of the interaction and the type of protease with which the interaction is entered into (Birk 1989).
De grootste belangstelling gaat uit naar inhibitoren van serineprote-inases, maar er zijn ook inhibitoren van andere proteases, zoals thiol-, carboxyl- (of zure) en metallo-proteases (Birk 1987). Serineproteases hebben in hun aktieve centrum een zeer reaktieve serine die bij de katalytische aktiviteit betrokken is (Dickerson, 1969)· Op basis van sequen-tie-homologie, aard van de reaktieve protease-inhibitorzijde en interaktie met de protease volgens een standaardmechanisme, worden verschillende families onderscheiden: - Kunitz-type trypsine-inhibitoren (KTI); - Bowman-Birk-type proteinase-inhibitoren (BBI); - Potato I-inhibitoren; - Potato II-inhibitoren; - Squash-inhibitoren; - Barley-trypsine-inhibitoren; - en andere protease-inhibitoren.The greatest interest is in inhibitors of serine protein inases, but there are also inhibitors of other proteases, such as thiol, carboxyl (or acid) and metallo proteases (Birk 1987). Serine proteases have at their active center a highly reactive serine which is involved in the catalytic activity (Dickerson, 1969). Based on sequence homology, nature of the reactive protease inhibitor side and interaction with the protease by a standard mechanism, various distinguish families: - Kunitz type trypsin inhibitors (KTI); Bowman-Birk type proteinase inhibitors (BBI); - Potato I inhibitors; - Potato II inhibitors; - squash inhibitors; Barley trypsin inhibitors; and other protease inhibitors.
Hierbij wordt opgemerkt dat met de reaktieve protease-inhibitorzijde het gedeelte van het protease-inhibitormolekuul wordt bedoeld dat direkt met het aktieve centrum van de protease in kontakt staat bij de vorming van het (protease-(protease-inhibitor)-komplex.It is noted here that the reactive protease inhibitor side refers to the portion of the protease inhibitor molecule that contacts the active center of the protease directly to form the (protease (protease inhibitor) complex.
Binnen bovengenoemde families komt ook nog een aantal (iso)types voor (Birk, 1989; Laskowski, 1986). Protease-inhibitoren komen onder andere veelvuldig voor in peulvruchten. Met name in sojabonen is de koncentratie aan protease-inhibitor relatief hoog. In peulvruchten komen voornamelijk KTI en BBI voor. De verhouding waarin deze twee protease-inhibi toren in sojaoonen voorkomen is ongeveer 3:1. κπ m sojabonen beert een molekuul-gewicht van ca. 21.000 dalton en bevat 2 zwavelbruggen. BBI heeft een molekuulgewicht van ca. 8.000 dalton en bevat 7 zwavelbruggen. KTI remt voornamelijk trypsine, terwijl BBI ook chymotrypsine en andere enzymen remt (Birk, 1989; Liener & Kakade, 1980). Onderzoek bij sojabonen heeft uitgewezen dat BBI twee reaktieve protease-inhibitor-zijden heeft (de zgn. "double headed protease-inhibitor”). De protease-inhibitor vormt een 1:1 komplex met zowel trypsine als chymotrypsine en een drievoudig kom-plex met beide enzymen. In waterige oplossing ondergaat BBI een koncen-tratie afhankelijke zelf-associatie. Mogelijk kan dit ook optreden in het maagdarm-kanaal in het dier of bij enzymatische afbraak in-vitro, waardoor de aktiviteit en/of inaktivatie verandert.Within the above families there are also a number of (iso) types (Birk, 1989; Laskowski, 1986). Protease inhibitors are frequently found in legumes, among other things. Especially in soybeans, the concentration of protease inhibitor is relatively high. Legumes mainly contain KTI and BBI. The ratio in which these two protease inhibitors occur in soybeans is about 3: 1. κπ m soybeans bear a molecular weight of approximately 21,000 daltons and contain 2 sulfur bridges. BBI has a molecular weight of approximately 8,000 daltons and contains 7 sulfur bridges. KTI primarily inhibits trypsin, while BBI also inhibits chymotrypsin and other enzymes (Birk, 1989; Liener & Kakade, 1980). Soybean research has shown that BBI has two reactive protease inhibitor sides (the so-called "double headed protease inhibitor"). The protease inhibitor forms a 1: 1 complex with both trypsin and chymotrypsin and a triple complex with both enzymes In aqueous solution, BBI undergoes concentration-dependent self-association, which may also occur in the gastrointestinal tract in the animal or in-vitro enzymatic degradation, altering activity and / or inactivation.
Er is veel onderzoek gedaan naar protease-inhibitoren vanwege de mogelijke effekten die zij kunnen hebben op de nutritionele waarde van produkten en vanwege de metabolische en toxische effekten ervan op mens en dier. Maar ook is er, vanwege de unieke eigenschappen die de protease-inhibitoren hebben, belangstelling voor het therapeutisch gebruik van protease-inhibitoren. Verschillende mogelijkheden worden hierbij onderzocht, waaronder het gebruik als anticarcinogeen en de toepassing ervan bij behandeling tegen pancreatitis, emfyseem, shock, allergische reakties en verschillende ontstekingsverschijnselen (Richardson, 1977; Birk, 1989; Friedman, 1986). Pancreaskallikreïne-trypsineinhibitor bijvoorbeeld is al in de handel verkrijgbaar onder de namen Trasylol, Iniprol en Contrykol (Richardson, 1977)»Much research has been done on protease inhibitors because of the possible effects they may have on the nutritional value of products and because of their metabolic and toxic effects on humans and animals. However, due to the unique properties of the protease inhibitors, there is also interest in the therapeutic use of protease inhibitors. Several possibilities are being investigated, including its use as an anticarcinogen and its use in treatment of pancreatitis, emphysema, shock, allergic reactions and various inflammatory symptoms (Richardson, 1977; Birk, 1989; Friedman, 1986). For example, pancreatic kallikrein trypsin inhibitor is already commercially available under the names Trasylol, Iniprol and Contrykol (Richardson, 1977) »
Eiwit van peulvruchten vormt, indien het voldoende met hitte is behandeld, een uitstekende, relatief goedkope eiwitbron voor mens en dier. Sojabonen worden bijvoorbeeld veel gebruikt, in een groot aantal humane produkten (babyvoeding, sojabloem, sojasaus, tofu, enz.) en in veevoe-derprodukten (kalvermelk, baby-biggenvoer, mengvoeder voor varkens, kippen enz.). In de eiwitfraktie komen echter ook protease-inhibitoren voor. Deze protease-inhibitoren kunnen metabolisme van mens of dier negatief beïnvloeden doordat ze komplexeren met verteringsenzymen (proteases zoals trypsine, chymotrypsine etc.). De effekten die hierdoor kunnen optreden zijn: 1. Remming van de eiwitvertering, hetgeen tot een niet-efficiënte voed-selopname en een hogere stikstofuitscheiding leidt; 2. Verhoging van de uitscheiding van endogene eiwitten onder invloed van een feed-back mechanisme; 3- Verhoging van de behoefte aan zwavelhoudende aminozuren vanwege het verlies aan endogene eiwitten zoals trypsine en chymotrypsine; 4. Remming van groei; 5· Vergroting van de pancreas; 6. Verhoging van de synthese van eiwitten, fosfolipiden en nucleinezuren door de pancreas; 6. Stimulatie van galuitscheiding en 7. Verlaging van de metaboliseerbare energie (Rackis en Gumbmann, 1981). Vanwege deze effekten is het belangrijk dat het gehalte aan aktieve pro-tease-inhibitoren in voedingsprodukten wordt verlaagd. Neutralisatie van protease-inhibitoraktiviteit kan worden bereikt door een (bio-) technologische behandeling of door veredeling van variëteiten.Legume protein, when sufficiently heat-treated, is an excellent, relatively inexpensive source of protein for humans and animals. For example, soybeans are widely used in many human products (baby food, soy flour, soy sauce, tofu, etc.) and in animal feed (calf milk, baby piglet feed, compound feed for pigs, chickens, etc.). However, protease inhibitors also occur in the protein fraction. These protease inhibitors can negatively affect human or animal metabolism by complexing with digestive enzymes (proteases such as trypsin, chymotrypsin, etc.). The effects that can occur are: 1. Inhibition of protein digestion, which leads to inefficient food intake and higher nitrogen excretion; 2. Increase the secretion of endogenous proteins under the influence of a feed-back mechanism; 3- Increase in the need for sulfur-containing amino acids due to the loss of endogenous proteins such as trypsin and chymotrypsin; 4. Inhibition of growth; 5 · Enlargement of the pancreas; 6. Increase the synthesis of proteins, phospholipids and nucleic acids by the pancreas; 6. Stimulation of bile secretion and 7. Decrease of the metabolizable energy (Rackis and Gumbmann, 1981). Because of these effects, it is important to reduce the content of active protease inhibitors in food products. Neutralization of protease inhibitor activity can be achieved by a (bio-) technological treatment or by breeding varieties.
Gewoonlijk worden protease-inhibitoren die in soja voorkomen geïnakti-veerd door een konventionele behandeling met hitte (Liener & Kakade, 1980; Birk, 1989) · Ondanks deze behandeling resteert 5"20 % van de protease-inhibitoraktiviteit. Hierbij wordt geen onderscheid gemaakt tussen de twee protease-inhibitoren KTI en BBI, terwijl de fysiologische effekten van beide inhibitoren verschillen. En ook blijkt de mate van inakti-vatie van KTI en BBI verschillend te zijn (DiPietro & Liener, 1989b; Rackis & Gumbmann, 1981).Usually, protease inhibitors found in soy are activated by conventional heat treatment (Liener & Kakade, 1980; Birk, 1989) · Despite this treatment, 5 "20% of the protease inhibitor activity remains. No distinction is made between the two protease inhibitors KTI and BBI, while the physiological effects of both inhibitors differ, and also the degree of inactivation of KTI and BBI appears to be different (DiPietro & Liener, 1989b; Rackis & Gumbmann, 1981).
Rest-aktiviteiten van protease-inhibitoren kunnen nog steeds signifi-kante effekten veroorzaken op vertering en metabolisme. Zeker wanneer de konsumptie van bijvoorbeeld sojaboonprodukten over lange termijn in ogenschouw wordt genomen. Risikogroepen zijn hierbij 1. Kinderen die allergisch zijn voor koemelk. Deze kinderen krijgen namelijk gedurende een lange periode sojamelkprodukten toegediend.Residual activities of protease inhibitors can still cause significant effects on digestion and metabolism. Especially when the long-term consumption of, for example, soybean products is considered. Risk groups are 1. Children who are allergic to cow's milk. These children are given soy milk products for a long period of time.
2. Mensen die om filosofische of religieuze redenen vegetarisch eten. Deze personen vervangen namelijk dierlijk eiwit door eiwit van plantaardige oorsprong. Hierbij worden hoofdzakelijk peulvruchten zoals soja 1 gebruikt.2. People who eat vegetarian food for philosophical or religious reasons. These persons replace animal protein with protein of vegetable origin. Legumes such as soy 1 are mainly used for this.
3. Patiënten die aan hyperlipidemie lijden. Ter verlaging van hun cholesterolgehalte vervangen zij namelijk dierlijk eiwit in hun dieet door plantaardig eiwit waaronder eiwit uit peulvruchten zoals soja.3. Patients suffering from hyperlipidemia. To lower their cholesterol levels, they replace animal protein in their diet with vegetable protein, including protein from legumes such as soy.
4. Mensen uit landen met een slechte voedsel-voorziening. Deze mensen 1 eten namelijk vaak eenzijdig en dan met name peulvruchten en granen.4. People from countries with poor food supplies. These people 1 often eat unilaterally, especially legumes and grains.
5. Landbouwhuisdieren voor produktiedoeleinden. Het voer van deze dieren bestaat vrijwel geheel uit mengvoeder (brokken, meel), melkpoeder of ander voer voor jonge dieren. Dit voer bestaat voor een groot gedeelte uit produkten van plantaardige oorsprong. Hierbij wordt veel gebruik gemaakt van peulvruchten zoals sojabonen. (Liener, 1986; Tan-Wilson & Wilson 1986).5. Farm animals for production purposes. The feed of these animals consists almost entirely of compound feed (chunks, flour), milk powder or other feed for young animals. This feed consists largely of products of vegetable origin. A lot of use is made of legumes such as soybeans. (Liener, 1986; Tan-Wilson & Wilson 1986).
Onderzoek naar het reduceren van het gehalte aan protease-inhibitor middels veredeling vindt eveneens plaats. Protease-inhibitoren hebben echter mogelijk een fysiologische rol in de natuurlijke afweer van de plant en de aanwezigheid van sommige protease-inhibitoren kan daardoor belangrijk zijn bij de teelt. Veredeling op cultivars met een lage algemene protease-inhibitoraktiviteit kan daarom een negatief effekt hebben op de opbrengst van het gewas (Birk, 1989; Boisen, 1983; Broadway et al., 1986; Richardson, 1977; Ryan, 1978; Ryan, 1983).Research into reducing the protease inhibitor content by means of breeding is also being conducted. However, protease inhibitors may have a physiological role in the plant's natural defenses and the presence of some protease inhibitors may therefore be important in cultivation. Breeding on cultivars with a low general protease inhibitor activity can therefore have a negative effect on the yield of the crop (Birk, 1989; Boisen, 1983; Broadway et al., 1986; Richardson, 1977; Ryan, 1978; Ryan, 1983) .
Daarnaast zijn plantaardige eiwitbronnen vaak deficiënt aan zwavelhoudende aminozuren, methionine en cysteine. Protease-inhibitoren die voorkomen in peulvruchten daarentegen zijn juist vaak behoorlijk rijk aan cysteine en kunnen daardoor ongeveer 40 % van het totaal aan cysteine bevatten. Eliminatie van protease-inhibitoren door middel van bijvoorbeeld veredeling zou derhalve een negatief effekt kunnen hebben op de voedingswaarde met name t.a.v. het gehalte aan cysteine van peulvruchten (Rackis & Gumbmann, 1981).In addition, vegetable protein sources are often deficient in sulfur-containing amino acids, methionine and cysteine. Protease inhibitors found in legumes, on the other hand, are often quite rich in cysteine and can therefore contain about 40% of the total cysteine. Elimination of protease inhibitors by, for example, breeding could therefore have a negative effect on the nutritional value, in particular with regard to the cysteine content of legumes (Rackis & Gumbmann, 1981).
Het beschikbaar zijn van een analysemethode waarmee lage rest-aktivi-teiten van de afzonderlijke protease-inhibitoren in plantaardig materiaal, in het bijzonder in peulvruchten zoals sojabonen en in van dergelijk plantaardig materiaal afgeleide produkten, kunnen worden gemeten na technologische behandeling of veredeling, is vanwege de fysiologische effek-ten die protease-inhibitoren kunnen hebben op mens en dier van groot belang. Tevens is het beschikbaar zijn van een goede analysemethode waarmee lage rest-aktiviteiten van protease-inhibitoren (totaal of afzonderlijk) bepaald kunnen worden van groot belang bij het optimaliseren van een hittebehandeling. In verband met de hoge kosten van een dergelijke technologische behandeling alsmede in verband met gerelateerde milieu-effekten, is het belangrijk om te weten onder welke omstandigheden protease-inhibitoren voldoende geïnaktiveerd zijn. Voor sojabonen bijvoorbeeld is het belangrijk om zowel van BBI als van KTI op de hoogte te zijn van de mate van inaktivatie. Wanneer een goede en snelle analysemethode beschikbaar is, kan de rest-aktiviteit snel en direkt worden gemeten, waardoor het proces zo rendabel mogelijk kan worden uitgevoerd. Verder is het ook voor de veredeling, belangrijk om lage aktiviteiten van de verschillende protease-inhibitoren afzonderlijk te kunnen meten.The availability of an analytical method with which low residual activities of the individual protease inhibitors in vegetable material, in particular in legumes such as soybeans and in products derived from such vegetable material, can be measured after technological treatment or breeding is due to the physiological effects that protease inhibitors may have on humans and animals are of great importance. The availability of a good analysis method with which low residual activities of protease inhibitors (total or separate) can be determined is also of great importance in optimizing a heat treatment. In view of the high cost of such technological treatment as well as related environmental impacts, it is important to know under which conditions protease inhibitors are sufficiently activated. For soybeans, for example, it is important to be aware of the degree of inactivation of both BBI and KTI. When a good and fast analysis method is available, the residual activity can be measured quickly and directly, so that the process can be carried out as profitably as possible. Furthermore, it is also important for breeding to be able to measure low activities of the different protease inhibitors separately.
Voorwaarden waar een protease-inhibitor-analysemethode aan zou moeten voldoen zi.in: 1. Er moet onderscheid kunnen worden gemaakt tussen aktieve protease-inhibitoren en inaktieve protease-inhibitoren (na toasting of veredeling) 2. De aktiviteit van de protease-inhibitoren moet gemeten kunnen worden.Conditions that a protease inhibitor analysis method should meet are: 1. A distinction must be made between active protease inhibitors and inactive protease inhibitors (after tasting or breeding). 2. The activity of the protease inhibitors must can be measured.
3. Er moet onderscheid kunnen worden gemaakt tussen verschillende (iso) types protease-inhibitoren.3. It must be possible to distinguish between different (iso) types of protease inhibitors.
4. De methode moet voldoende gevoelig en nauwkeurig zijn om lage aktivi-teiten van protease-inhibitoren te kunnen bepalen (bijvoorbeeld om de restaktiviteit te bepalen na toasting of veredeling).4. The method must be sufficiently sensitive and accurate to be able to determine low activities of protease inhibitors (for example, to determine the residual activity after toasting or breeding).
Analysemethoden die momenteel worden gebruikt voor het direkt of indi-rekt aantonen van protease-inhibitoraktiviteit zijn: 1. de enzymatische trypsine-inhibitorbepaling; 2. de ureasebepaling en 3. immunochemische bepalingsmethoden.Analytical methods currently used to directly or indirectly demonstrate protease inhibitor activity are: 1. the enzymatic trypsin inhibitor assay; 2. the urease determination and 3. immunochemical determination methods.
1. Enzymatische trypsine-inhibitorbepaling (volgens Kakade et al., 1969). Met deze methode wordt de totale trypsine-inhibitoraktiviteit bepaald, dat wil zeggen de aktiviteit van zowel KTI als BBI en tevens de tryp-sine remmende aktiviteit van andere komponenten uit het monster, zoals tanninen. De trypsine-inhibitoraktiviteit wordt gemeten aan de hand van de remming van trypsine-aktiviteit. De trypsine-aktiviteit wordt gerelateerd aan de omzetting, bij een bepaalde temperatuur en gedurende een bepaalde tijd, van een synthetisch substraat, ΒΑΡΑ (Να-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanalide-waterstofchloride), door trypsine. Het omzettingsprodukt, PA (p-nitroanaline), wordt spektrofotometrisch gemeten na het beëindigen van de reaktie. Door toevoeging van de pro-tease-inhibitor wordt de aktiviteit van trypsine geremd en wordt er 'minder PA gevormd. Voor het verkrijgen van een goede meting van de trypsine-inhibitoraktiviteit moet de remming tussen de 40 en 60% van de maximale aktiviteit (zonder protease-inhibitor) liggen. Wanneer het precieze gehalte van de protease-inhibitor niet bekend is, zal via trial en error de goede verdunning moeten worden gezocht. Dit kost veel tijd, omdat één aktiviteitsbepaling al ongeveer 60 min. kost. Daar deze test een dubbele aktiviteitsmeting betreft (remming van enzym en omzetting van ΒΑΡΑ) worden er extra fouten geïntroduceerd, waardoor relatief grote spreidingen worden verkregen. De test wordt verder o.a. gekenmerkt door invloeden van de toevoeging (eerst synthetisch substraat en dan monster, of eerst monster en vervolgens synthetisch substraat). Bovendien kunnen andere komponenten uit het extrakt, bijvoorbeeld tanninen fytaat, vet en vezel, storend werken. Verder geeft de methode onnauwkeurige resultaten bij behandelde produkten met een lage rest-aktiviteit. Veel onderzoekers hebben daarom gezocht naar verbetering van de methode, (Kakade et al., 1974; Lehnhardt and Dills, 1984; Liu & Markakis, 1989; Hamerstrand et al., 1981; Stauffer, 1990; Van Oort et al., 1989; Van Oort en Westerop 1993; Smith et al., 1980) maar tot dusver is er nog steeds geen gestandaardiseerde methode ontwikkeld. De test wordt binnen de verschillende laboratoria naar eigen inzicht geoptimaliseerd, waardoor de resultaten onderling niet vergelijkbaar zijn. Een ander nadeel van de methode is, dat het onmogelijk is de protease-inhibitorsamenstelling van een monster te bepalen. Er wordt geen onderscheid gemaakt tussen KTI en BBI of andere protease remmende komponenten (Liener, 1986; Brandon, 1988; DiPietro en Liener, 1989a en 1989b).1. Enzymatic trypsin inhibitor assay (according to Kakade et al., 1969). This method determines the total trypsin inhibitor activity, that is, the activity of both KTI and BBI, and also the trypsin inhibitory activity of other components of the sample, such as tannins. The trypsin inhibitor activity is measured by the inhibition of trypsin activity. The trypsin activity is related to the conversion, at a certain temperature and for a certain time, of a synthetic substrate, ΒΑΡΑ (Να-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanalide hydrochloride), by trypsin. The reaction product, PA (p-nitroanaline), is measured spectrophotometrically after the completion of the reaction. By adding the protease inhibitor, the activity of trypsin is inhibited and less PA is formed. In order to obtain a good measurement of the trypsin inhibitor activity, the inhibition must be between 40 and 60% of the maximum activity (without protease inhibitor). If the exact content of the protease inhibitor is not known, the correct dilution will have to be found via trial and error. This takes a lot of time, because one activity determination already takes about 60 minutes. Since this test involves a double activity measurement (inhibition of enzyme and conversion of ΒΑΡΑ), additional errors are introduced, resulting in relatively large spreads. The test is further characterized by influences of the addition (first synthetic substrate and then sample, or first sample and then synthetic substrate). In addition, other components from the extract, for example tannins phytate, fat and fiber, can be disturbing. Furthermore, the method gives inaccurate results in treated products with low residual activity. Many researchers have therefore sought to improve the method, (Kakade et al., 1974; Lehnhardt and Dills, 1984; Liu & Markakis, 1989; Hamerstrand et al., 1981; Stauffer, 1990; Van Oort et al., 1989; Van Oort and Westerop 1993; Smith et al., 1980) but so far no standardized method has yet been developed. The test is optimized at the discretion of the various laboratories, so that the results are not mutually comparable. Another drawback of the method is that it is impossible to determine the protease inhibitor composition of a sample. No distinction is made between KTI and BBI or other protease inhibiting components (Liener, 1986; Brandon, 1988; DiPietro and Liener, 1989a and 1989b).
2. Ureasebenaling. De ureasebepaling is een indirekte methode om protease -inhibi toren aan te tonen. Omdat het omslachtig is tijdens technologische behandeling van plantaardig materiaal zoals sojabonen met de enzymatische trypsineremmingstest de trypsine-inhibitoraktiviteit te meten, wordt in de praktijk volstaan met de bepaling van een marker-enzym, urease. De rest-aktiviteit van dit enzym wordt gezien als (indirekte) maat voor de efficiëntie van de inaktivatiebehandeling met hitte (Publikatieblad EEG, 1971)· Het is, echter zoals hiervoor reeds is uiteengezet, van groot fysiologisch en economisch belang om een goed inzicht te hebben in het verloop van de hitte-stap, in het bijzonder voor peulvruchten zoals de sojaboon, om inzicht te krijgen in de inaktivatie van zowel KTI als BBI. Verder geeft de ureasebepaling geen goede korrelatie met belangrijke parameters zoals restaktiviteit van protease-inhibitoren en nutritionele waarde (Waldroup et al.2. Urease payment. The urease assay is an indirect method of demonstrating protease inhibitors. Since it is cumbersome to measure trypsin inhibitor activity during technological treatment of vegetable matter such as soybeans with the enzymatic trypsin inhibition test, the determination of a marker enzyme, urease, suffices in practice. The residual activity of this enzyme is seen as an (indirect) measure of the efficiency of the inactivation treatment with heat (Official Journal EEC, 1971). However, as already explained above, it is of great physiological and economic importance to in the course of the heat step, especially for legumes such as the soybean, to gain insight into the inactivation of both KTI and BBI. Furthermore, the urease determination does not give a good correlation with important parameters such as residual activity of protease inhibitors and nutritional value (Waldroup et al.
1985)· 3. Immunochemische bepalingsmethode.1985) 3. Immunochemical determination method.
Al sinds 1969 kunnen protease-inhibitoren met behulp van antilichamen worden aangetoond (Catsimpoolas en Leuthner, 1969a; Catsimpoolas et al., 1969b; Brandon et al., 1985, 1987, 1988, 1989; Sessa en Bietz, 1986; DiPietro en Liener, 1985, 1989a en 1989b). Een groot voordeel van het gebruik van antilichamen is dat een bepaalde struktuur van het oppervlak van het eiwitmolekuul wordt herkend en gebonden. Op deze manier wordt heel specifiek de aanwezigheid van een bepaald (iso)type protease-inhibitor vastgesteld. Het aantonen van de aanwezigheid van een bepaalde protease-inhibitor geeft echter geen uitsluitsel over de aktiviteit van deze protease-inhibitor of over aanwezigheid of aktivi-teit van andere eventueel in het monster aanwezige protease-inhibito-ren. Terwijl juist deze protease-inhibitor-(rest)aktiviteit (afzonderlijk of totaal) belangrijk is.Protease inhibitors can be detected with antibodies since 1969 (Catsimpoolas and Leuthner, 1969a; Catsimpoolas et al., 1969b; Brandon et al., 1985, 1987, 1988, 1989; Sessa and Bietz, 1986; DiPietro and Liener, 1985, 1989a and 1989b). A major advantage of the use of antibodies is that a certain structure of the surface of the protein molecule is recognized and bound. In this way, the presence of a certain (iso) type protease inhibitor is specifically determined. Detection of the presence of a particular protease inhibitor does not, however, provide any information about the activity of this protease inhibitor or about the presence or activity of other protease inhibitors possibly present in the sample. While this protease inhibitor (residual) activity (individual or total) is important.
Uit het voorafgaande blijkt dat de huidige analysemethoden voor bepaling van (rest)aktiviteit van protease-inhibitoren niet voldoen aan de hiervoor genoemde specifieke voorwaarden voor een goede analysemethode. Een protease-inhibitor-bepalingsmethode waarbij de zojuist geschetste problemen worden overkomen is nu gevonden.From the foregoing it appears that the current analysis methods for determining (residual) activity of protease inhibitors do not meet the aforementioned specific conditions for a good analysis method. A protease inhibitor assay method that overcomes the problems just outlined has now been found.
Beschrijving van de uitvindingDescription of the invention
Het algemene principe van de onderhavige uitvinding berust op herkenning en aan toning van aktieve protease-inhibitoren, waarbij enzymatische aktiviteit niet van belang is. Uitgaande van dit principe zijn verschillende toets-opzetten mogelijk, waarmee dezelfde of vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen. Sommige toets-opzetten meten specifiek de aktiviteit van één (of meer) afzonderlijke (iso)type(s) protease-inhibi-tor, terwijl andere een totale maat voor protease-inhibitoraktiviteit geven.The general principle of the present invention is based on recognition and toning of active protease inhibitors, in which enzymatic activity is not important. Based on this principle, different test designs are possible, with which the same or comparable results can be obtained. Some test designs specifically measure the activity of one (or more) discrete (iso) type (s) protease inhibitor, while others provide an overall measure of protease inhibitor activity.
Het principe van de toetsmethoden om protease-inhibitoraktiviteit te bepalen volgens de onderhavige uitvinding is gebaseerd op de kombinatie van: specifieke herkenning tussen protease en protease-inhibitor, gevoelig en nauwkeurig aantonen van (ten minste één van) de reaktan-ten of het komplex als zodanig door bijvoorbeeld: a. specifieke antilichamen en/of b. een, van een detekteerbaar of detekteerbaar te maken merkmiddel voorziene protease, protease-inhibitor of het (protease-(protease-inhibitor) ) -komplex.The principle of the test methods to determine protease inhibitor activity according to the present invention is based on the combination of: specific recognition between protease and protease inhibitor, sensitive and accurate detection of (at least one of) the reactants or the complex as such by, for example: a. specific antibodies and / or b. a protease, protease inhibitor or the (protease (protease inhibitor)) complex provided with a label to be detectable or detectable.
Door gebruik te maken van de specifieke herkenning tussen protease en protease-inhibitor kan een onderscheid worden gemaakt tussen de aktieve en inaktieve vormen van protease-inhibitoren.By using the specific recognition between protease and protease inhibitor, a distinction can be made between the active and inactive forms of protease inhibitors.
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het detekteren en eventueel kwantificeren van aktiviteit van ten minste één protease-inhibitor in een te analyseren mengsel, waarbij men a) het te analyseren mengsel of een monster daarvan in kontakt brengt met ten minste één protease voor de te detekteren protease-inhibitor, met welke protease de aktieve vorm van de protease-inhibitor komplexvorming ondergaat tot (protease- (protease-inhibitor) )-komplex en met welke protease noch inaktieve protease-inhibitor noch reeds gekomplexeerde protease-inhibitor bindt, b) de in stap a gevormde hoeveelheid (protease-(protease-inhibitor))-komplex bepaalt.The present invention relates to a method for detecting and optionally quantifying activity of at least one protease inhibitor in a mixture to be analyzed, wherein a) the mixture to be analyzed or a sample thereof is contacted with at least one protease for the protease inhibitor to be detected, with which protease the active form of the protease inhibitor undergoes complex formation to (protease (protease inhibitor)) complex and with which protease binds neither inactive protease inhibitor nor already complexed protease inhibitor, b ) determines the amount (protease (protease inhibitor)) complex formed in step a.
In de werkwijze volgens de uitvinding kan men in stap a) het te analyseren mengsel of een monster daarvan tevens in kontakt brengen met een geïmmobiliseerde komponent die specifiek aan ten minste één van de bestanddelen van het (protease-(protease-inhibitor) )-komplex bindt of aan het komplex als zodanig bindt, welke komponent de komplexvorming van de protease met de protease-inhibitor niet verstoort. Een uitvoeringsvorm omvat het gebruik van een geïmmobiliseerde komponent die specifiek (protease- (protease-inhibitor)) -komplex als zodanig en niet de afzonderlijke bestanddelen van het (protease- (protease-inhibitor)) -komplex kan binden. Een andere uitvoeringsvorm omvat het gebruik van een geïmmobiliseerde komponent die specifiek de protease bindt, waarbij noch de komplexvorming van (protease- (protease-inhibitor)) -komplex noch het (protease- (protease-inhibitor))-komplex worden verstoord. De geïmmobiliseerde komponent bindt aan een deel van de protease dat niet bij komplexvorming met de te bepalen protease-inhibitor betrokken is. De geïmmobiliseerde komponent kan, in weer een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding, specifiek de te detekteren protease-inhibitor binden. Hierbij bindt de geïmmobiliseerde komponent aan een deel van de protease-inhibitor dat niet bij komplexvorming met de protease betrokken is.In the method according to the invention, in step a) the mixture to be analyzed or a sample thereof can also be contacted with an immobilized component which is specific to at least one of the components of the (protease (protease inhibitor)) complex. binds or binds to the complex as such, which component does not interfere with the complex formation of the protease with the protease inhibitor. One embodiment involves the use of an immobilized component which can bind specifically (protease (protease inhibitor)) complex as such and not the individual components of the (protease (protease inhibitor)) complex. Another embodiment involves the use of an immobilized component that specifically binds the protease, disrupting neither the complexation of (protease (protease inhibitor)) complex nor the (protease (protease inhibitor)) complex. The immobilized component binds to a portion of the protease that is not involved in complex formation with the protease inhibitor to be determined. The immobilized component, in yet another embodiment of the present invention, can specifically bind the protease inhibitor to be detected. Here, the immobilized component binds to a portion of the protease inhibitor that is not involved in complex formation with the protease.
In de vier zojuist genoemde uitvoeringsvormen kan de geïmmobiliseerde komponent bijvoorbeeld een antilichaam zijn. Er zijn antilichamen bekend dië specifiek zijn voor een bepaalde protease-inhibitor of voor een bepaalde protease. Afhankelijk van de uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding kan men specifiek de aktiviteit van één (of meer) afzonderlijke (iso)type(s) protease-inhibitor of de totale protease-inhi-bitoraktiviteit van een mengsel bepalen. Het is duidelijk dat de keuze van een bepaalde geïmmobiliseerde komponent afhankelijk is van hetgeen men beoogt te bepalen.For example, in the four embodiments just mentioned, the immobilized component may be an antibody. Antibodies are known which are specific for a particular protease inhibitor or for a particular protease. Depending on the embodiment of the method according to the invention, one can specifically determine the activity of one (or more) separate (iso) type (s) protease inhibitor or the total protease inhibitory activity of a mixture. It is clear that the choice of a particular immobilized component depends on what is intended to be determined.
In een andere uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding kan de geïmmobiliseerde komponent die specifiek de te detekteren protease-inhibitor bindt ten minste één protease voor de te detekteren protea-se-inhibitor zijn, welke geïmmobiliseerde protease met de aktieve vorm van de protease-inhibitor komplexvorming ondergaat en welke protease niet Λ M rn All* 4«. m J A J Ik a l*. M «3 4» «A S <k ik JX A 1 I A ---* Μ ______ andere proteases aan eventueel andere aanwezige reactieve protease-inhibitor zijden dan waaraan de geïmmobiliseerde protease zelf bindt beïnvloedt. Wanneer de te detekteren protease-inhibitor ten minste twee voor proteaseremming reaktieve inhibitorzijden heeft is het mogelijk de akti-viteit van een dergelijke protease-inhibitor t.a.v. een bepaalde protease in een uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding te bepalen, waarbij men de protease-inhibitor zowel aan de geïmmobiliseerde protease als aan de vrije protease bindt zodat een drievoudig geïmmobiliseerd komplex wordt gevormd.In another embodiment of the method of the invention, the immobilized component that specifically binds the protease inhibitor to be detected can be at least one protease for the protease inhibitor to be detected, which immobilized protease with the active form of the protease inhibitor undergoes complex formation and which protease does not Λ M rn All * 4 «. m Y A J I a l *. M «3 4» «A S <k I JX A 1 I A --- * Μ ______ affects other proteases on any other reactive protease inhibitor present than those to which the immobilized protease itself binds. When the protease inhibitor to be detected has at least two protease inhibitor reactive inhibitor sides, it is possible to determine the activity of such a protease inhibitor with respect to a particular protease in an embodiment of the method of the present invention, wherein the protease inhibitor is inhibitor binds to both the immobilized protease and the free protease to form a triple immobilized complex.
Hen kan in een andere uitvoeringsvorm in stap a) het te analyseren mengsel of monster daarvan in kontakt brengen met een geïmmobiliseerd bestanddeel van het (protease-(protease-inhibitor))-komplex. Het geïmmobiliseerde bestanddeel kan hetzij protease, hetzij protease-inhibitor zijn.In another embodiment, in step a), they can contact the mixture to be analyzed or sample thereof with an immobilized component of the (protease (protease inhibitor)) complex. The immobilized component can be either protease or protease inhibitor.
Het bepalen van de in stap a gevormde hoeveelheid (protease- (protease-inhibitor) )-komplex in stap b van de onderhavige werkwijze kan direkt of indirekt plaatsvinden. Bij de direkte bepaling wordt in stap b) het te analyseren mengsel of monster daarvan tevens in kontakt gebracht met een hoeveelheid detekteerbaar of detekteerbaar te maken merkmiddel dat specifiek aan ten minste één van de bestanddelen van het (protease- (protease-inhibitor) ) -komplex of aan het komplex als zodanig bindt of aan een geïmmobiliseerde komponent genoemd in conclusies 4-9, welke komponent niet gebonden is aan (protease-(protease-inhibitor))-komplex, bindt en welk merkmiddel noch het komplex noch de komplexvorming verstoort. i Bij de indirekte werkwijze volgens de uitvinding brengt men het te analyseren mengsel of een monster daarvan tevens in kontakt met een bekende hoeveelheid van ten minste één van merkmiddel voorzien bestanddeel van het (protease-(protease-inhibitor))-komplex, welk merkmiddel detekteerbaar of detekteerbaar te maken is en welk merkmiddel noch het (prote-I ase-(protease-inhibitor))-komplex noch de vorming van het komplex verstoort.Determination of the amount (protease (protease inhibitor)) complex formed in step a of step b of the present process can take place directly or indirectly. In the direct determination, in step b), the mixture or sample to be analyzed is also contacted with an amount of detectable or detectable marker specific to at least one of the components of the (protease (protease inhibitor)) - complex or binds to the complex as such or to an immobilized component mentioned in claims 4-9, which component is not bound to (protease (protease inhibitor)) complex, binds and which label does not interfere with the complex or complex formation. In the indirect method of the invention, the mixture to be analyzed or a sample thereof is also contacted with a known amount of at least one labeled component of the (protease (protease inhibitor)) complex, which label is detectable or detectable and which label does not interfere with the (protein-Ise (protease inhibitor)) complex nor the formation of the complex.
Bij de werkwijze volgens de uitvinding kunnen gebruikelijke werkwijzen voor het immobiliseren van hetzij protease hetzij protease-inhibitor aan een vaste drager zoals het kunststofoppervlak van een microtiterplaat ί of reageerbuis van bijvoorbeeld polystyreen, polypropyleen of polyvinylchloride, op glas of kunststofkralen, op filtreerpapier of dextraan, op een membraan van bijvoorbeeld cellulose-acetaat of nitrocellulose-acetaat worden toegepast. Men kan bij imraobilisatie het gewenste bestanddeel kovalent of niet kovalent koppelen, bijvoorbeeld door eenvoudige adsorp- tie of eventueel na aktivering van de drager. Hetzelfde geldt ten aanzien van de immobilisatie van de komponent die specifiek ten minste één van de bestanddelen van het (protease-(protease-inhibitor) )-komplex of het kom-plex als zodanig bindt.In the method of the invention, conventional methods of immobilizing either protease or protease inhibitor to a solid support such as the plastic surface of a microtiter plate or test tube of, for example, polystyrene, polypropylene or polyvinyl chloride, on glass or plastic beads, on filter paper or dextran, applied to a membrane of, for example, cellulose acetate or nitrocellulose acetate. Upon immobilization, the desired component can be coupled covalently or non-covalently, for example by simple adsorption or optionally after activation of the carrier. The same applies to the immobilization of the component which specifically binds at least one of the components of the (protease (protease inhibitor)) complex or the complex as such.
Bij de onderhavige werkwijze kunnen de gebruikelijke merkmiddelen en detektiewijzen van dergelijke merkmiddelen worden toegepast voor de de-tektie en eventuele kwantifikatie van de aktiviteit van de protease-inhibitor (en). Voorbeelden van gebruikelijke merkmiddelen zijn met radioakti-viteit gemerkte deeltjes, fluorescentiemerkmiddelen, enzymen, met kleurstof gemerkte deeltjes of kolloïdale deeltjes. Het merkmiddel kan bij direkte of indirekte bepaling een antilichaam zijn.In the present process, the conventional markers and methods of detection of such markers can be used for the detection and optional quantification of the activity of the protease inhibitor (s). Examples of common markers are radio-labeled particles, fluorescent labels, enzymes, dye-labeled particles or colloidal particles. The label may be an antibody, by direct or indirect determination.
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het specifiek bepalen van de aktiviteit van protease-inhibitoren. Met deze werkwijze is het mogelijk om het aktieve gedeelte van de protease-inhibi-torpopulatie te bepalen zonder daarbij gebruik te maken van de enzymatische aktiviteit van de geremde protease. De test kombineert de specifieke herkenning tussen protease en protease-inhibitor met gevoelige en nauwkeurige aantoning van één van de reaktanten door bijvoorbeeld specifieke antilichamen of met behulp van een merkmiddel.The present invention relates to a method for specifically determining the activity of protease inhibitors. With this method it is possible to determine the active portion of the protease inhibitor population without using the enzymatic activity of the inhibited protease. The test combines the specific recognition between protease and protease inhibitor with sensitive and accurate detection of one of the reactants by, for example, specific antibodies or with the aid of a label.
Door gebruik te maken van de specifieke herkenning tussen protease en protease-inhibitor kan een onderscheid worden gemaakt tussen aktieve protease-inhibitoren en inaktieve protease-inhibitoren.By using the specific recognition between protease and protease inhibitor, a distinction can be made between active protease inhibitors and inactive protease inhibitors.
Door bij de aantoning, gebruik te maken van specifieke antilichamen gericht tegen de te detekteren protease-inhibitor of het (protease-(protease-inhibitor) )-komplex kunnen de aktieve (iso)type(s) protease-inhibitoren afzonderlijk worden gedetecteerd en eventueel gekwantificeerd. Door gebruik te maken van antilichamen is de analyse zeer gevoelig, waardoor lage koncentraties van de protease-inhibitor bepaald kunnen worden.By using specific antibodies directed against the protease inhibitor to be detected or the (protease (protease inhibitor)) complex in the detection, the active (iso) type (s) protease inhibitors can be detected separately and possibly quantified. Using antibodies, the analysis is very sensitive, allowing low concentrations of the protease inhibitor to be determined.
Door bij de aantoning, gebruik te maken van specifieke antilichamen gericht tegen meerdere protease-inhibitortypes of komplexen of de andere reaktanten (bijvoorbeeld protease) of van andere merkmiddelen is het mogelijk om het totaal aan aktieve protease-inhibitoren via indirekte of direkte bepaling te detecteren en eventueel te kwantificeren. Met deze methode kunnen eveneens lage koncentraties van het totaal aan aktieve protease-inhibitoren worden bepaald.By using specific antibodies against multiple protease inhibitor types or complexes or the other reactants (for example protease) or other markers, it is possible to detect the total number of active protease inhibitors by indirect or direct determination and quantify if necessary. Low concentrations of the total of active protease inhibitors can also be determined with this method.
De onderhavige uitvinding is gericht op toepassing van de beschreven werkwijze voor detekteren en eventueel kwantificeren van de aktieve (iso) types protease-inhibitor (en) zoals Kil en BBI. Afhankelijk van de uitvoeringsvorm kan de totale protease-inhibitoraktiviteit of specifiek de aktiviteit van één (of meer) afzonderlijke protease-inhibitor(en) worden bepaald. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen aktieve en inaktieve vormen van de protease-inhibitor.The present invention is directed to the use of the described method for detecting and optionally quantifying the active (iso) types of protease inhibitor (s) such as Kil and BBI. Depending on the embodiment, the total protease inhibitor activity or specifically the activity of one (or more) individual protease inhibitor (s) can be determined. A distinction is made between active and inactive forms of the protease inhibitor.
De bepaling is simpel en snel en er kunnen veel monsters tegelijkertijd worden geanalyseerd. De bepalingsmethode die hier wordt beschreven, is geschikt om de kwaliteit (die gekoppeld is aan protease-inhibitorakti-viteit) van plantaardige produkten, in het bijzonder van peulvruchten, maar ook van aardappelen, granen, etc. en van dergelijk plantaardig materiaal afgeleide produkten, te bepalen. Onder andere kan het gehalte aan aktieve protease-inhibitoren KTI en BBI in sojabonen en in daarvan afgeleide produkten worden bepaald. Ook aktiviteiten van dierlijke, micro-biële en synthetische protease-inhibitoren kunnen met de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding worden bepaald.The determination is simple and fast and many samples can be analyzed simultaneously. The assay method described here is suitable for determining the quality (which is linked to protease inhibitor activity) of vegetable products, in particular legumes, but also of potatoes, grains, etc. and products derived from such vegetable material, to decide. Among other things, the content of active protease inhibitors KTI and BBI in soybeans and in products derived therefrom can be determined. Activities of animal, microbial and synthetic protease inhibitors can also be determined by the method according to the present invention.
De werkwijze kan ook worden toegepast voor het bepalen van zeer lage koncentraties protease-inhibitor in voor voedsel of voeder bestemde produkten na bepaalde verwerkingsstappen. De onderhavige werkwijze kan ook worden toegepast om nieuwe plantvariëteiten die bijvoorbeeld door veredeling zijn ontstaan, te screenen. Ook kan de onderhavige werkwijze worden toegepast om (nieuwe) plantvariëteiten, plantweefselkweken en microörga-nismen, etc. te screenen op expressie van een gen dat voor protease-inhibitor codeert.The method can also be used to determine very low concentrations of protease inhibitor in food or feed products after certain processing steps. The present method can also be used to screen new plant varieties that have been created, for example, by breeding. The present method can also be used to screen (new) plant varieties, plant tissue cultures and microorganisms, etc. for expression of a gene encoding a protease inhibitor.
Uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding kan ondermeer plaatsvinden in microtiterplaten, maar een "dipstick”-achtige testopzet behoort ook tot de mogelijkheden. Bij een dergelijke testopzet kan worden geïmmobiliseerd op een membraan.Implementation of the method according to the invention can take place, inter alia, in microtiter plates, but a "dipstick" -like test design is also possible. In such a test design, immobilization can be carried out on a membrane.
De onderhavige uitvinding heeft eveneens betrekking op een kit die bestemd is voor het uitvoeren van de werkwijze volgens de uitvinding. De exakte uitvoeringsvorm van een dergelijke kit zal afhangen van de toepassing die men beoogt voor de onderhavige werkwijze. i In de onderstaande tabel staan een aantal verschillende denkbare protokollen, waarmee men de werkwijze volgens de uitvinding kan toepassen schematisch weergegeven. Het zal voor een deskundige zondermeer duidelijk zijn welke kitvormen voor dergelijke protokollen mogelijk zijn en onder de onderhavige uitvinding vallen, i Is stelt de te detekteren protease-inhibitor voor.The present invention also relates to a kit intended for carrying out the method according to the invention. The exact embodiment of such a kit will depend on the application contemplated for the present process. The table below shows a number of different conceivable protocols with which one can apply the method according to the invention. It will be readily apparent to one skilled in the art which kit forms are possible for such protocols and are covered by the present invention. Is represents the protease inhibitor to be detected.
E stelt de protease die aan protease-inhibitor kan komplexeren voor.E represents the protease capable of complexing with a protease inhibitor.
I stelt een tweede protease-inhibitor voor, welke tweede protease-inhibitor niet dezelfde is als de te detekteren protease-inhibitor. De tweede protease-inhibitor kan wel van hetzelfde (iso)type zijn als de te detek-teren protease-inhibitorI represents a second protease inhibitor, which second protease inhibitor is not the same as the protease inhibitor to be detected. The second protease inhibitor may be of the same (iso) type as the protease inhibitor to be detected
Ce stelt een komponent voor dat specifiek protease bindt Ci stelt een komponent voor dat specifiek de te detekteren protease-inhibitor bindtCe proposes a component that specifically binds protease Ci proposes a component that specifically binds the protease inhibitor to be detected
Cei stelt een komponent voor dat specifiek (protease-(protease-inhibitor) )-komplex bindt.Cei proposes a component that specifically binds (protease (protease inhibitor)) complex.
# stelt immobilisatie voor van het type bestanddeel dat het daarna gegeven symbool voorstelt.# represents immobilization of the type of component representing the symbol given thereafter.
Uit deze tabel kunnen de volgende hoofdkategoriën worden afgeleid: 1) Men inkubeert protease (E) en te detekteren protease-inhibitor (Is).The following main categories can be derived from this table: 1) Protease (E) is incubated and protease inhibitor (Is) to be detected.
2) Men immobiliseert protease (#E) en brengt dit in kontakt met te detekteren protease-inhibitor (Is).2) Protease (#E) is immobilized and brought into contact with the protease inhibitor (Is) to be detected.
3) Men immobiliseert een tweede protease-inhibitor (die specifiek voor de protease is) (#1) en brengt dit in kontakt met protease (E) en te detekteren protease-inhibitor (Is).3) A second protease inhibitor (specific for the protease) is immobilized (# 1) and contacted with protease (E) and protease inhibitor (Is) to be detected.
4) Men immobiliseert een komponent die specifiek protease bindt (#Ce) en brengt dit in kontakt met protease (E) en te detekteren protease-inhibitor (Is).4) A component which specifically binds protease (#Ce) is immobilized and brought into contact with protease (E) and protease inhibitor (Is) to be detected.
5) Men immobiliseert een komponent die specifiek protease-inhibitor bindt (#Ci) en brengt dit in kontakt met protease (E) en te detekteren protea-se-inhibitor (Is).5) A component which specifically binds protease inhibitor (#Ci) is immobilized and brought into contact with protease (E) and protease inhibitor (Is) to be detected.
6) Men immobiliseert een komponent die specifiek (protease-(protease-inhibitor) )-komplex bindt (#Cei) en brengt dit in kontakt met protease (E) en te detekteren protease-inhibitor (Is).6) A component which specifically binds (protease (protease inhibitor)) complex (#Cei) is immobilized and brought into contact with protease (E) and protease inhibitor (Is) to be detected.
Indien men een protease-inhibitor met ten minste twee reaktieve pro-te&se-inhibitorzijden wil detekteren kan men gebruikmaken van de eigenschap dat ten minste twee proteases aan de protease-inhibitor kunnen binden. Door de te detekteren protease-inhibitor (Is) volgens een methode van één van de zes hiervoor genoemde hoofdkategoriën tevens in contact te brengen met een tweede protease (E2), kan de protease-inhibitor zowel aan de eerste protease (El) als aan de tweede protease binden, zodat een drievoudig geïmmobiliseerd komplex wordt gevormd. Het tweede protease kan eenzelfde type protease zijn als de eerste protease of een ander type protease. Eén van de mogelijke en in het volgende voorbeeld uitgewerkte uitvoeringsvormen is:If one wishes to detect a protease inhibitor with at least two reactive protease inhibitor sides, one can use the property that at least two proteases can bind to the protease inhibitor. By also bringing the protease inhibitor (Is) to be detected into contact with a second protease (E2) according to a method of one of the six main categories mentioned above, the protease inhibitor can act on both the first protease (E1) and the second protease to form a triple immobilized complex. The second protease can be the same type of protease as the first protease or a different type of protease. One of the possible embodiments and elaborated in the following example is:
Inkubatie Mogeliike produkten #E1 + Is + E2 #ElIsE2, #ElIs, #E1, IsE2, E2, Is.Incubation Possible products # E1 + Is + E2 # ElIsE2, #ElIs, # E1, IsE2, E2, Is.
Vervolgens kan men direkt of indirekt één van de (gevormde) produkten detekteren en eventueel kan men de hoeveelheid aktieve te detekteren protease-inhibitor daaruit afleiden. Bij de direkte methode wordt gebruik gemaakt van een hoeveelheid detekteerbaar of detekteerbaar te maken merkmiddel, dat specifiek aan ten minste één van de bestanddelen van het (protease- (protease-inhibitor) )-komplex of aan het komplex als zodanig bindt of aan een geïmmobiliseerde komponent genoemd in conclusies 4-9, welke komponent niet gebonden is aan (protease-(protease-inhibitor))-komplex, bindt en welk merkmiddel noch het gevormde komplex noch de kom-plexvorming verstoort. Bij indirekte bepaling wordt een kompetitie-reak-tie uitgevoerd met hetzij een bekende hoeveelheid van merkmiddel voorziene protease (@E) hetzij een bekende hoeveelheid van merkmiddel voorziene tweede protease-inhibitor (@I), hetzij met een bekende hoeveelheid van merkmiddel voorzien (protease-(protease-inhibitor))-komplex (@IE). (@ stelt hierbij het merkmiddel voor, direkt gekoppeld aan het type bestanddeel dat het daarna gegeven symbool voorstelt). Eén van de mogelijke en in het volgende voorbeeld uitgewerkte uitvoeringsvormen is:Subsequently, one can directly or indirectly detect one of the (shaped) products and, if desired, the amount of active protease inhibitor to be detected can be deduced therefrom. The direct method uses an amount of detectable or detectable label which specifically binds to at least one of the components of the (protease (protease inhibitor)) complex or to the complex as such or to an immobilized component mentioned in claims 4-9, which component is not bound to (protease (protease inhibitor)) complex, binds and which label does not interfere with the complex formed or complex formation. In indirect determination, a competition reaction is performed with either a known amount of labeled protease (@E) or a known amount of labeled second protease inhibitor (@I) or with a known amount of labeled (protease - (protease inhibitor)) - complex (@IE). (@ here represents the marker directly linked to the type of constituent representing the symbol given thereafter). One of the possible embodiments and elaborated in the following example is:
Inkubatie Mogeli.ike produkten #E + Is + ei #EIs, #E@I, #E, Is, §1Incubation Mogeli.ike products #E + Is + ei #EIs, # E @ I, #E, Is, §1
De volgorde waarin produkten moeten of kunnen worden toegepast is zonder meer voor een deskundige duidelijk. Welk produkt de deskundige detekteert is geheel vrij aan degene die de reaktie uitvoert. Het zal afhangen van de toepassing die men beoogt, de reaktanten en de daaruit gevormde produkten welk produkt het eenvoudigst en het goedkoopst kan worden gedetek-teerd.The order in which products must or can be used is clearly clear to a person skilled in the art. Which product the expert detects is entirely up to the person who carries out the reaction. It will depend on the intended application, the reactants and the products formed therefrom, which product is most easily and inexpensively detected.
TABEL: Schematische weergave van diverse uitvoeringsvormenTABLE: Schematic representation of various embodiments
Enkele nadere uitwerkingen van de werkwijze volgens de uitvinding zullen nu worden gegeven.Some further elaborations of the method according to the invention will now be given.
Ten eerste kan gebruik worden gemaakt van de kombinatie van de specifieke herkenning tussen protease en protease-inhibitor met de gevoelige en nauwkeurige aantoning van ten minste één van de reaktanten door specifieke antilichamen. Wanneer specifieke antilichamen gebruikt worden gericht tegen de te detekteren protease-inhibitor of tegen het (protease-(protease-inhibitor))-komplex als zodanig, kan elke (iso)type protease-inhibitor afzonderlijk worden gedetecteerd. Voor een betere fijnafstemming is deze vorm zeer geschikt. Maar, door gebruik te maken van antilichamen tegen meerdere protease-inhibitortypes of komplexen of tegen andere reaktanten, is het ook mogelijk het totaal aan protease-inhibitor-aktiviteit te meten.First, use can be made of the combination of the specific recognition between protease and protease inhibitor with the sensitive and accurate detection of at least one of the reactants by specific antibodies. When specific antibodies are used directed against the protease inhibitor to be detected or the (protease (protease inhibitor)) complex as such, each (iso) type protease inhibitor can be detected separately. This shape is very suitable for better fine-tuning. However, by using antibodies against multiple protease inhibitor types or complexes or against other reactants, it is also possible to measure the total protease inhibitor activity.
Mogelijke protokollen zijn: 1. Een bestanddeel van het (protease- (protease-inhibitor) )-komplex bijvoorbeeld de protease zoals trypsine wordt geïmmobiliseerd door binding aan een microtiterplaat. Vervolgens wordt geïnkubeerd met protease-inhi-bitorstandaardoplossing voor bepaling van een kalibratiekurve of met te meten soja-monsters. Geïnaktiveerde protease-inhibitoren kunnen niet aan trypsine binden; aktieve protease-inhibitoren wel. De gebonden protease-inhibi torfraktie wordt dan aangetoond met specifieke antilichamen, gevolgd door detektie en eventueel kwantifikatie in een kleuringsstap. Door gebruik te maken van specifieke antilichamen kan de aktiviteit van elke protease-inhibitor in het mengsel of monster afzonderlijk worden aangetoond, iets wat met de huidige analysemethoden niet mogelijk is. Deze testopzet leidt aldus tot een direkte maat voor de aktiviteit van de verschillende protease-inhibitoren die in een te onderzoeken mengsel aanwezig zijn.Possible protocols are: 1. A component of the (protease (protease inhibitor)) complex, for example the protease such as trypsin, is immobilized by binding to a microtiter plate. Incubation is then made with protease-inhibitor standard solution to determine a calibration curve or to measure soy samples. Activated protease inhibitors cannot bind to trypsin; active protease inhibitors do. The bound protease inhibitor fraction is then detected with specific antibodies, followed by detection and optionally quantification in a staining step. Using specific antibodies, the activity of each protease inhibitor in the mixture or sample can be demonstrated separately, something that is not possible with current analysis methods. This test design thus leads to a direct measure of the activity of the various protease inhibitors present in a test mixture.
2. Een specifieke protease-inhibitor wordt gebonden aan een microtiterplaat. Vervolgens wordt geïnkubeerd met protease-inhibitorstandaardoplos-singen voor bepaling van de kalibratiekurve of er wordt geïnkubeerd met te meten monsters bij aanwezigheid van een bekende hoeveelheid protease zoals trypsine. De aanwezige protease kan komplexeren met protease-inhibitor in oplossing of met de geïmmobiliseerde protease-inhibitor. Als maat voor de aktiviteit in het monster wordt vervolgens protease die aan geïmmobiliseerde protease-inhibitor is gebonden of nog onbezette geïmmobiliseerde protease-inhibitor bepaald door middel van binding van speci- fieke antilichamen tegen de protease resp. tegen de protease-inhibitor, welke bindingsreaktie kan worden gevolgd door een signaalreaktie.2. A specific protease inhibitor is bound to a microtiter plate. It is then incubated with protease inhibitor standard solutions to determine the calibration curve or incubated with samples to be measured in the presence of a known amount of protease such as trypsin. The protease present can complex with protease inhibitor in solution or with the immobilized protease inhibitor. As a measure of activity in the sample, protease bound to immobilized protease inhibitor or unoccupied immobilized protease inhibitor is then determined by binding specific antibodies to the protease, respectively. against the protease inhibitor, which binding reaction can be followed by a signal reaction.
3. Specifieke aantoning van in oplossing gevormde (protease-(protease-inhibitor) )-komplexen kan plaatsvinden, wanneer een antilichaam wordt gebruikt dat het (protease-(protease-inhibitor))-komplex als zodanig herkent en niet één van de reaktanten afzonderlijk herkent. Ook deze toets-opzet kan leiden tot een specifieke waarde voor één (iso)type protease-inhibitor. Men kan bijvoorbeeld het specifieke antilichaam door binding aan een microtiterplaat immobiliseren, waarna men vervolgens met protease-inhibitorstandaardoplossingen voor het bepalen van de kalibra-tiekurve of met te meten monsters bij aanwezigheid van een bekende hoeveelheid protease zoals trypsine inkubeert. Daarna kan men op verschillende wijzen de protease-inhibitoraktiviteit bepalen, bijvoorbeeld met behulp van, van merkmiddel voorzien specifiek antilichaam dat protease-inhibitor of protease of het (protease- (protease-inhibitor) )-komplex als zodanig herkent. Men kan de protease-inhibitoraktiviteit ook bepalen door het toevoegen van een bekende hoeveelheid van merkmiddel voorzien protease, welk merkmiddel detekteerbaar of detekteerbaar te maken is en welk merkmiddel het (protease-(protease-inhibitor))-komplex en de vorming van het komplex niet verstoort.3. Specific demonstration of (protease (protease inhibitor)) complexes formed in solution can take place when an antibody is used which recognizes the (protease (protease inhibitor)) complex as such and not one of the reactants separately recognizes. This test design can also lead to a specific value for one (iso) type protease inhibitor. For example, the specific antibody can be immobilized by binding to a microtiter plate, then incubated with protease inhibitor standard solutions to determine the calibration curve or with samples to be measured in the presence of a known amount of protease such as trypsin. The protease inhibitor activity can then be determined in various ways, for example, using a labeled specific antibody which recognizes protease inhibitor or protease or the (protease (protease inhibitor)) complex as such. Protease inhibitor activity can also be determined by adding a known amount of labeled protease, which label is detectable or detectable, and which label does not inhibit the (protease (protease inhibitor)) complex and the formation of the complex. disturbs.
Als tweede mogelijkheid, kan gebruik worden gemaakt van de kombinatie van de specifieke herkenning tussen protease en protease-inhibitor en van aantoning van één van de reaktanten met behulp van ten minste één van merkmiddel voorzien bestanddeel van het (protease-(protease-inhibitor))-komplex of ten minste één van merkmiddel voorzien komplex als zodanig. Dit toetsprincipe kaneen algemene maat geven voor de totale aktiviteit van aanwezige protease-inhibitoren. Twee protokollen daarvan kunnen zijn: 1. Een vaste hoeveelheid protease zoals trypsine wordt door binding aan een microtiterplaat geïmmobiliseerd. Vervolgens wordt geïnkubeerd met protease-inhibitorstandaardoplossingen voor het bepalen van een kalibra-tiekurve of met te meten monsters bij aanwezigheid van een bekende hoeveelheid, van een merkmiddel voorziene protease-inhibitor. Als maat voor de protease-inhibitoraktiviteit in de oplossing of in het monster wordt vervolgens van een merkmiddel voorziene protease-inhibitor die zich aan de geïmmobiliseerde protease zoals trypsine heeft gehecht bepaald. Hierbij kan bijvoorbeeld een enzym, een fluorescente groep, een kolloidaal label, enz. als merkmiddel dienen.As a second possibility, use can be made of the combination of the specific recognition between protease and protease inhibitor and detection of one of the reactants using at least one labeled component of the (protease (protease inhibitor)) -Complex or at least one labeled complex as such. This testing principle can provide a general measure of the total activity of protease inhibitors present. Two protocols thereof can be: 1. A fixed amount of protease such as trypsin is immobilized by binding to a microtiter plate. It is then incubated with protease inhibitor standard solutions to determine a calibration curve or samples to be measured in the presence of a known amount of labeled protease inhibitor. As a measure of the protease inhibitor activity in the solution or sample, a labeled protease inhibitor that has attached to the immobilized protease such as trypsin is then determined. Here, for example, an enzyme, a fluorescent group, a colloidal label, etc. can serve as a marker.
2. Een specifieke protease-inhibitor kan aan een microtiterplaat worden gebonden. Vervolgens wordt geïnkubeerd met protease-inhibitorstandaardop-lossingen voor bepaling van de kalibratiekurve of met te meten monsters bij aanwezigheid van een bekende hoeveelheid, van merkmiddel voorziene protease zoals trypsine. Als maat voor de protease-inhibitoraktiviteit in de oplossing of in het monster wordt vervolgens van een merkmiddel voorziene protease zoals trypsine, die zich aan geïmmobiliseerde protease-inhibitor heeft gehecht bepaald.2. A specific protease inhibitor can be bound to a microtiter plate. It is then incubated with protease inhibitor standard solutions to determine the calibration curve or with samples to be measured in the presence of a known amount of labeled protease such as trypsin. As a measure of the protease inhibitor activity in the solution or sample, a labeled protease such as trypsin which has adhered to immobilized protease inhibitor is then determined.
In principe is het mogelijk het toetsprincipe volgens de onderhavige uitvinding toe te passen in een snelle, dipstick-achtige assay.In principle, it is possible to apply the testing principle according to the present invention in a fast, dipstick-like assay.
In een uitvoeringsvorm van een dergelijke toets wordt het ene bestanddeel van het te vormen (protease- (protease-inhibitor) )-komplex op een membraan geïmmobiliseerd. Het andere bestanddeel wordt aan kolloïdale deeltjes geadsorbeerd. In een andere uitvoeringsvorm wordt een komponent die specifiek aan ten minste één van de bestanddelen van het (protease-(protease-inhibitor))-komplex bindt of aan het komplex als zodanig bindt op een membraan geïmmobiliseerd en wordt één van de bestanddelen van het te vormen (protease-(protease-inhibitor))-komplex aan kolloïdale deeltjes geadsorbeerd, terwijl het andere bestanddeel vrij wordt toegevoegd.In one embodiment of such a test, one component of the (protease (protease inhibitor)) complex to be formed is immobilized on a membrane. The other component is adsorbed on colloidal particles. In another embodiment, a component that specifically binds to at least one of the components of the (protease (protease inhibitor)) complex or binds to the complex as such is immobilized on a membrane and one of the components of the (protease (protease inhibitor)) complex adsorbed on colloidal particles while the other component is added freely.
De deeltjes-eiwitkonjugaten worden vervolgens gebruikt als merkmiddel in een chromatografische toets-opzet. In een protokol van dit principe wordt een antilichaam gericht tegen een protease-inhibitor op een membraan (dipstick) geïmmobiliseerd; kolloïdale deeltjes worden gecoat met de protease, bijvoorbeeld trypsine en een aantal centimeters onder het geïmmobiliseerde antilichaam op het membraan aangebracht; het membraan wordt vervolgens in een bepaald volume van het te analyseren mengsel (bijvoorbeeld soja-extrakt) geplaatst; het mengsel wordt door kapillaire kracht door het membraan getrokken en neemt de aangebrachte kolloïdale konjugaat mee (flow-through assay); protease-inhibitoren in het mengsel binden aan de protease en dus aan de kolloïdale deeltjes; het komplex wordt tenslotte gebonden door de geïmmobiliseerde antilichamen; dit geeft aanleiding tot een gekleurde spot ter plaatse. De intensiteit van de kleur is afhankelijk van de hoeveelheid aktieve protease-inhibitor in het te analyseren mengsel. Door bepaling van de intensiteit kan deze toets worden gekwantificeerd. Dit is mogelijk door gebruik te maken van bijvoorbeeld eenvoudige handdensitometers of door toepassing van komputer-beeld-analyse.The particle protein conjugates are then used as a marker in a chromatographic assay format. In a protocol of this principle, an antibody directed against a protease inhibitor is immobilized on a membrane (dipstick); colloidal particles are coated with the protease, for example trypsin, and placed on the membrane a few centimeters below the immobilized antibody; the membrane is then placed in a certain volume of the mixture to be analyzed (e.g. soy extract); the mixture is pulled through the membrane by capillary force and takes the applied colloidal conjugate with it (flow-through assay); protease inhibitors in the mixture bind to the protease and thus to the colloidal particles; the complex is finally bound by the immobilized antibodies; this gives rise to a colored spot on the spot. The intensity of the color depends on the amount of active protease inhibitor in the mixture to be analyzed. This test can be quantified by determining the intensity. This is possible by using, for example, simple hand densitometers or by using computer image analysis.
Met de onderhavige werkwijze kan niet alleen de aktiviteit van in de natuur voorkomende protease-inhibitoren worden bepaald maar kunnen van synthetische en ook genetisch gemanipuleerde polypeptiden met soortgelijke type werking als de natuurlijke protease-inhibitoren de aktiviteiten worden bepaald (Hammond et al, 198*1; Jondrier et al, 1987; Spencer en Hodge, I99I; Meader et al, 1992; Leatherbarrow en Salasinski, 1991)· Hiermee kunnen bijvoorbeeld de gevolgen van manipulaties op de aktiviteit van gemuteerde protease-inhibitoren worden vergeleken met wildtype protease-inhibitoren. Hetgeen in het bijzonder bij medicinale toepassingen zeer interessant is.In addition to determining the activity of naturally occurring protease inhibitors, the present method can be used to determine the activities of synthetic and also genetically engineered polypeptides having a similar type of activity to the natural protease inhibitors (Hammond et al, 198 * 1 ; Jondrier et al, 1987; Spencer and Hodge, I99I; Meader et al, 1992; Leatherbarrow and Salasinski, 1991) This compares, for example, the effects of manipulations on the activity of mutated protease inhibitors with wild-type protease inhibitors. Which is particularly interesting in medicinal applications.
Vanwege fysiologische effekten die protease-inhibitoren kunnen hebben op mens en dier en vanwege economische en milieukundige aspekten is het van groot belang te kunnen beschikken over een analysemethode waarmee de aktiviteit van protease-inhibitoren, totaal of afzonderlijk, gevoelig en nauwkeurig kan worden bepaald. De huidig gebruikte ureasetest en trypsi-neremmingstest zijn hiervoor ontoereikend. De onderhavige methode voldoet wel aan bovengenoemde eisen en is derhalve superieur aan de huidige bepalingsmethoden. De ureasetest is een indirekte methode die niet goed kor-releert met de restaktiviteit van de protease-inhibitoren en dus ongeschikt is om protease-inhibitor te meten (Waldroup et al, 1985)· De tryp-sineremmingstest geeft onnauwkeurige resultaten bij produkten met een lage (rest)aktiviteit, bijvoorbeeld bij met hitte behandelde van soja afgeleide produkten (Brandon et al, 1988). Verder is de test omslachtig en tijdrovend, terwijl bovendien andere komponenten uit het extrakt storend werken. Het is met beide testen (urease- en trypsineremmingstest) niet mogelijk een onderscheid te maken tussen verschillende protease-inhibitoren.Because of the physiological effects that protease inhibitors can have on humans and animals and because of economic and environmental aspects, it is very important to have an analysis method with which the activity of protease inhibitors, in total or separately, can be determined sensitive and accurately. The currently used urease test and trypsin inhibition test are insufficient for this. The present method does meet the above requirements and is therefore superior to the current determination methods. The urease test is an indirect method that does not correlate well with the residual activity of the protease inhibitors and is therefore unsuitable for measuring protease inhibitor (Waldroup et al, 1985). The trypin inhibition test gives inaccurate results in products with a low (residual) activity, for example, with heat-treated soy-derived products (Brandon et al, 1988). Furthermore, the test is cumbersome and time-consuming, while other components from the extract are also disturbing. It is not possible to distinguish between different protease inhibitors with both tests (urease and trypsin inhibition test).
Met de onderhavige analysemethode kan de protease-inhibitoraktivi-teit, zowel totaal als afzonderlijk, direkt worden bepaald, zonder hierbij gebruik te maken van de katalytische aktiviteit van de protease. De methode is gevoelig en nauwkeurig en matrixeffekten spelen hier niet of nauwelijks een rol.With the present analysis method, the protease inhibitor activity, both total and separate, can be determined directly, without using the catalytic activity of the protease. The method is sensitive and accurate and matrix effects hardly play a role here.
Eén van de voordelen van de onderhavige analysemethode boven de huidige immunochemische analysemethode is dat in sommige testopzetten, gebruik wordt gemaakt van zowel de herkenning van de protease met de protease-inhibitor alsook van de specifieke aantoning van de protease-inhibitor, zodat de aktiviteit van de protease-inhibitor zelf wordt gemeten. Terwijl bij gebruikmaking van alleen antilichamen die in de huidige immunochemische bepalingsmethoden worden toegepast, alleen de aanwezigheid van een bepaalde protease-inhibitor wordt bepaald en niet de aktiviteit zelf.One of the advantages of the present analysis method over the current immunochemical analysis method is that in some test designs, use is made of both the recognition of the protease with the protease inhibitor and the specific demonstration of the protease inhibitor, so that the activity of the protease inhibitor itself is measured. While using only antibodies used in current immunochemical assay methods, only the presence of a particular protease inhibitor is determined and not the activity itself.
Samenvattend kunnen de volgende kenmerken van de onderhavige analysemethode worden geformuleerd: 1. De aktiviteit van de protease-inhibitoren wordt bepaald zonder daarbij gebruik te maken van een enzymatische aktiviteit van de geremde protease.In summary, the following characteristics of the present method of analysis can be formulated: 1. The activity of the protease inhibitors is determined without using an enzymatic activity of the inhibited protease.
2. Alleen aktieve protease-inhibitoren worden bepaald. Inaktieve protea-se-inhibitor of andere protease remmende komponenten worden niet mee bepaald.2. Only active protease inhibitors are determined. Inactive protease inhibitor or other protease inhibiting components are not included.
3. Afhankelijk van het gebruikte testprincipe kan onderscheid worden gemaakt tussen de afzonderlijke (iso)type(s) protease-inhibitor(en) maar ook het bepalen van de totale protease-inhibitoraktiviteit behoort tot de mogelijkheden.3. Depending on the test principle used, a distinction can be made between the individual (iso) type (s) protease inhibitor (s), but it is also possible to determine the total protease inhibitor activity.
4. Matrixeffekten spelen niet of nauwelijks een rol bij de bepaling van de protease-inhibitoraktiviteit.4. Matrix effects play little or no role in determining the protease inhibitor activity.
5- De bepaling is snel (bijvoorbeeld ELISA-achtige uitvoering) tot eventueel zeer snel (bijvoorbeeld dipstick-achtige uitvoering).5- The determination is fast (for example ELISA-like version) to possibly very fast (for example dipstick-like version).
6. Er kunnen veel monsters/verdunningen tegelijkertijd worden gemeten.6. Many samples / dilutions can be measured simultaneously.
7· Tegelijk met de monsters wordt de ijklijn gemeten (geen tijds- en testverschillen zoals bij de enzymatische bepaling).7 · The calibration curve is measured simultaneously with the samples (no time and test differences as in the enzymatic determination).
8. De test is gevoelig.8. The test is sensitive.
9. Met de test wordt een grote nauwkeurigheid en specificiteit bereikt.9. The test achieves high accuracy and specificity.
10. Er zijn slechts kleine volumina nodig voor de bepaling, waardoor ook kleine monsters kunnen worden bepaald (interessant i.v.m. veredeling) .10. Only small volumes are required for the determination, so that also small samples can be determined (interesting in connection with breeding).
11. De kosten zijn aanzienlijk lager dan bij bestaande methoden.11. The costs are considerably lower than with existing methods.
Voörbeeld IExample I
- Het bekleden van de microtiterplaat met trypsine.- Coating the microtiter plate with trypsin.
Trypsine werd opgelost in PBS (0.8% NaCl, 10 mM fosfaat, pH 7*4) in een koncentratie van 10 pg/ml. Aan elk putje van de microtiterplaat werd 100 μΐ van deze oplossing toegevoegd (1 pg / well). Het bekleden vond gedurende de nacht plaats bij 4 eC. Vervolgens werd de plaat één keer met water, drie keer met PBST (0.8% NaCl, 10 mM Fosfaat, 0.1% Tween-20, pH 7.4) en nog één keer met water gewassen.Trypsin was dissolved in PBS (0.8% NaCl, 10 mM phosphate, pH 7 * 4) at a concentration of 10 µg / ml. 100 µl of this solution (1 µg / well) was added to each well of the microtiter plate. The coating took place at 4 eC overnight. The plate was then washed once with water, three times with PBST (0.8% NaCl, 10 mM Phosphate, 0.1% Tween-20, pH 7.4) and one more time with water.
- De inkubatie met Kunitz trypsine inhibitor (KTI) van de sojaboon.- Incubation with Kunitz trypsin inhibitor (KTI) of the soybean.
100 μΐ van een oplossing van KTI (Sigma Chemical Co., gezuiverd m.b.v. FPLC DEAE-mono-Q kolom) in verschillende koncentraties werd geïnkubeerd gedurende 30 minuten bij 37 eC. Als buffer is bij deze inkubatiestap 1% runderserumalbumine, 50 mM Tris en 20 mM CaCl2. pH 8.2 gebruikt. De KTI-koncentraties van de ijklijn waren 1000, 100, 10 en 1 ng/100 μΐ. De ijklijn werd in duplo ingezet. Daarna werd de plaat één keer met water, drie keer met PBST en nog één keer met water gewassen.100 µl of a solution of KTI (Sigma Chemical Co., purified by FPLC DEAE mono-Q column) at various concentrations was incubated for 30 minutes at 37 eC. The buffer in this incubation step is 1% bovine serum albumin, 50 mM Tris and 20 mM CaCl2. pH 8.2 used. The KTI concentrations of the calibration curve were 1000, 100, 10 and 1 ng / 100 μΐ. The calibration line was used in duplicate. The plate was then washed once with water, three times with PBST and one more time with water.
- De inkubatie met anti-KTI-serum.- Incubation with anti-KTI serum.
De plaat werd vervolgens geïnkubeerd met 100 μΐ K338-4 (500 x verdund in 1% runderserumalbumine, 100 mM fosfaat, 2 mM EDTA, pH 7.8 )/putje gedurende 1 uur bij 37 *C. Serum K338-4 is serum van een konijn na 4 immuni-saties met KTI (3 x KTI-Sigma en 1 x KTI-Sigma-FPLC gezuiverd). De plaat werd daarna één keer met water, drie keer met PBST en nog één keer met water gewassen.The plate was then incubated with 100 μΐ K338-4 (diluted 500x in 1% bovine serum albumin, 100 mM phosphate, 2 mM EDTA, pH 7.8) / well for 1 hour at 37 ° C. Serum K338-4 is rabbit serum after 4 immunizations with KTI (3 x KTI-Sigma and 1 x KTI-Sigma-FPLC purified). The plate was then washed once with water, three times with PBST and one more time with water.
- De inkubatie met GARAP.- The incubation with GARAP.
De plaat werd geïnkubeerd met 100 μΐ met alkalische fosfatase gemerkte geit-(anti-konijn)-IgG (1000 x verdund in 1% runderserumalbumine, 100 mM fosfaat, 2 mM EDTA, pH 7*8 )/putje gedurende 1 uur bij 37 °C. Vervolgens werd de plaat één keer met water, drie keer met PBST en nog één keer met water gewassen.The plate was incubated with 100 μΐ alkaline phosphatase-labeled goat (anti-rabbit) IgG (diluted 1000x in 1% bovine serum albumin, 100 mM phosphate, 2 mM EDTA, pH 7 * 8) / well for 1 h at 37 ° C. The plate was then washed once with water, three times with PBST and one more time with water.
- Toevoeging van substraat.- Addition of substrate.
Aan elk putje werd 200 μΐ substraatoplossing toegevoegd (1 mg p-nitrofe-nylfosfaat/ml 50 mM carbonaat, 0.5 mM MgCl2.6H20, pH 9*6). Inkubatie vond plaats gedurende 30 minuten bij 37 °C. De extinktie werd vervolgens bij 405 nm m.b.v. een microplate reader gemeten.200 µl of substrate solution was added to each well (1 mg p-nitrophenyl phosphate / ml 50 mM carbonate, 0.5 mM MgCl2.6H20, pH 9 * 6). Incubation took place at 37 ° C for 30 minutes. The extinction was then performed at 405 nm using measured a microplate reader.
Li teratuurlijst:Literature list:
Birk Y, 1987. Protease inhibitors. In: (Eds.) Hydrolytic enzymes. A. Neu-berger & K. Brocklehurst : Elsevier, Amsterdam. 257"305·Birk Y, 1987. Protease inhibitors. In: (Eds.) Hydrolytic enzymes. A. Neu-berger & K. Brocklehurst: Elsevier, Amsterdam. 257 "305 ·
Birk, Y., 1989* Protein protease inhibitors of plant origin and their significance in nutrition. In: Becent advances of research in anti-nutritional factors in legume seeds, Eds: J. Huisman, T.F.B. van der Poel, I.E. Liener. Pudoc Wageningen, The Netherlands, 83“95·Birk, Y., 1989 * Protein protease inhibitors of plant origin and their significance in nutrition. In: Becent advances of research in anti-nutritional factors in legume seeds, Eds: J. Huisman, T.F.B. van der Poel, I.E. Liener. Pudoc Wageningen, The Netherlands, 83 “95 ·
Boisen S., 1983· Protease inhibitors in cereals, Acta Agricult. Scandi- navica 33· 369-301..Boisen S., 1983 · Protease inhibitors in cereals, Acta Agricult. Scandi- navica 33369-301 ..
Boisen, S., 1989· Comparative studies on trypsin inhibitors in legumes and cereals. In: Becent advances of research in antinutritional factors in legume seeds, Ed. J. Huisman, T.F.B. van der Poel, I.E. Liener, Pudoc, Wageningen, The Netherlands. 118-120.Boisen, S., 1989 · Comparative studies on trypsin inhibitors in legumes and cereals. In: Becent advances of research in antinutritional factors in legume seeds, Ed. J. Huisman, T.F.B. van der Poel, I.E. Liener, Pudoc, Wageningen, The Netherlands. 118-120.
Brandon, D.L., S. Hague and M. Friedman, 1985. Antigenicity of native and modified Kunitz Soybean Trypsin Inhibitor, (Abstract), 7th European Immunology Meeting, Jerusalem, Israel, 8-13·Brandon, D.L., S. Hague and M. Friedman, 1985. Antigenicity of native and modified Kunitz Soybean Trypsin Inhibitor, (Abstract), 7th European Immunology Meeting, Jerusalem, Israel, 8-13
Brandon, D.L., S. Hague and M. Friedman, 1987· Interaction of monoclonal antibodies with soybean trypsin inhibitors, J. Agric. Food Chem. 35» I95-2OO.Brandon, D.L., S. Hague and M. Friedman, 1987 Interaction of monoclonal antibodies with soybean trypsin inhibitors, J. Agric. Food Chem. 35 I95-2OO.
Brandon, D.L., A.H. Bates and M. Friedman, 1988. Enzyme-linked immunoassay of soybean Kunitz Trypsin inhibitor using monoclonal antibodies, J. Food Sci., 53 (1), 102-106.Brandon, D.L., A.H. Bates and M. Friedman, 1988. Enzyme-linked immunoassay of soybean Kunitz Trypsin inhibitor using monoclonal antibodies, J. Food Sci., 53 (1), 102-106.
Brandon, D.L., A.H. Bates and M. Friedman, 1989. Monoclonal antibody-based enzyme immunoassay of the Bowman-Birk Protease Inhibitor of soybeans, J. Agric. Food Chem. 37. 1192-1196.Brandon, D.L., A.H. Bates and M. Friedman, 1989. Monoclonal antibody-based enzyme immunoassay of the Bowman-Birk Protease Inhibitor of soybeans, J. Agric. Food Chem. 37, 1192-1196.
Broadway R.M., S.S. Duffey, G. Pearce and C.A. Ryan, 1986. Plant proteinase inhibitors: a defense against herbivorous insects? Entomol.Broadway R.M., S.S. Duffey, G. Pearce and C.A. Ryan, 1986. Plant proteinase inhibitors: a defense against herbivorous insects? Entomol.
exp. appl. 41: 33-38exp. appl. 41: 33-38
Catsimpoolas, N. and E. Leuthner, 1969· Immunological methods for detection and quantitation of Kunitz Soybean Trypsin Inhibitor, Anal.Bio- chem. 31, 437-447.Catsimpoolas, N. and E. Leuthner, 1969 · Immunological methods for detection and quantitation of Kunitz Soybean Trypsin Inhibitor, Anal. Biochem. 31, 437-447.
Catsimpoolas, N., D.A. Rogers and E.W. Meyer, 1969· Immunochemical and disc electrophoresis study of Soybean Trypsin Inhibitor SBTIA-2, Cereal Chem. 46, 136-144.Catsimpoolas, N., D.A. Rogers and E.W. Meyer, 1969 · Immunochemical and disc electrophoresis study of Soybean Trypsin Inhibitor SBTIA-2, Cereal Chem. 46, 136-144.
Dickerson R.E. and I. Geis, 1969· The structure and action of proteins, Harper & Row, Publishers, New York, 120 p, 83·Dickerson R.E. and I. Geis, 1969 · The structure and action of proteins, Harper & Row, Publishers, New York, 120 p, 83 ·
DiPietro, C.M. and I.E. Liener, 1985· Heat inactivation of soybean trypsin inhibitor is quantified by ELISA, Fed. Proc. 749·DiPietro, C.M. and I.E. Liener, 1985 · Heat inactivation of soybean trypsin inhibitor is quantified by ELISA, Fed. Proc. 749
DiPietro, C.M. and I.E. Liener, 1989a. Soybean protease inhibitors in foods, J. Food Science, 54, 606-609, 617.DiPietro, C.M. and I.E. Liener, 1989a. Soybean protease inhibitors in foods, J. Food Science, 54, 606-609, 617.
DiPietro, C.M. and I.E. Liener, 1989b. Heat inactivation of the Kunitz and Bowman-Birk Soybean Protease Inhibitors, J. Agric. Food Chem., 37, 39-44.DiPietro, C.M. and I.E. Liener, 1989b. Heat inactivation of the Kunitz and Bowman-Birk Soybean Protease Inhibitors, J. Agric. Food Chem., 37, 39-44.
Friedman, M. (Ed.), 1986. Nutritional and toxicological significance of enzyme inhibitors in foods. Plenum, NYFriedman, M. (Ed.), 1986. Nutritional and toxicological significance of enzyme inhibitors in foods. Plenum, NY
Hamerstrand, G.E., L.T. Black and J.D. Glover, 1981. Trypsin inhibitors in soy products: Modification of the standard analytical procedure, Cereal Chem. 58, 42-45.Hamerstrand, G.E., L.T. Black and J.D. Glover, 1981. Trypsin inhibitors in soy products: Modification of the standard analytical procedure, Cereal Chem. 58, 42-45.
Hammond, R.W., D.E. Foard, B.A. Larkins, 1984. Molecular cloning and analysis of a gene coding for the Bowman Birk protease inhibitor in soybean, J. of Biol. Chem., 259, 15, 9883-9890.Hammond, R.W., D.E. Foard, B.A. Larkins, 1984. Molecular cloning and analysis of a gene coding for the Bowman Birk protease inhibitor in soybean, J. of Biol. Chem., 259, 15, 9883-9890.
Jondrier, P.E., D.E. Foard, L.A. Floener and B.A. Larkins, 1987· Isola tion and sequence of cDNA encoding the soybean protease inhibitors pl-IV and C-II, Plant Molecular Biology 10, 35-42.Jondrier, P.E., D.E. Foard, L.A. Floener and B.A. Larkins, 1987 Isolation and sequence of cDNA encoding the soybean protease inhibitors pl-IV and C-II, Plant Molecular Biology 10, 35-42.
Kakade, M.L., N. Simons and I.E. Liener, 1969· An evaluation of natural versus synthetic substrates for measuring the antitryptic activity of soybean samples, Cereal Chem., 46: 518-526.Kakade, M.L., N. Simons and I.E. Liener, 1969 An evaluation of natural versus synthetic substrates for measuring the antitryptic activity of soybean samples, Cereal Chem., 46: 518-526.
Kakade, M.L., J.J. Rackis, J.E. McGhee and G. Puski, 1974. Determination of trypsin inhibitor activity of soy products: A collaborative analysis of an improved method, Cereal Chem., 51* 376-382.Kakade, M.L., J.J. Rackis, J.E. McGhee and G. Puski, 1974. Determination of trypsin inhibitor activity of soy products: A collaborative analysis of an improved method, Cereal Chem., 51 * 376-382.
Laskowski, M. Jr., 1986. Protein inhibitors of serine proteinases - mechanism and classification. In: nutritional and toxicological significance of enzyme inhibitors in foods Ed: M. Friedman, Plenum, New York, 1-17.Laskowski, M. Jr., 1986. Protein inhibitors of serine proteinases - mechanism and classification. In: nutritional and toxicological significance of enzyme inhibitors in foods Ed: M. Friedman, Plenum, New York, 1-17.
Leatherbarrow, R.J. and H.J. Salacinski, 1991· Design of a small peptide based proteinase inhibitor by modeling the active site region of Barley chymotrypsin inhibitor 2, Biochem. 30, 10717“10721.Leatherbarrow, R.J. and H.J. Salacinski, 1991 Design of a small peptide based proteinase inhibitor by modeling the active site region of Barley chymotrypsin inhibitor 2, Biochem. 30, 10717, "10721.
Lehnhardt, W.L. and H.G. Dills, 1984. Analysis of trypsin inhibitors in soyproducts: evaluation of methodology and improvements, J. Am. Oil Chem. Soc. 61, 691·Lehnhardt, W.L. and H.G. Dills, 1984. Analysis of trypsin inhibitors in soy products: evaluation of methodology and improvements, J. Am. Oil Chem. Soc. 61, 691
Liener, I.E. and M.L. Kakade, 1980. Protease-inhibitors, In: Toxic constituents of plant foodstuffs, Ed. I.E. Liener, Academic Press, London, 7-71.Liener, I.E. and M.L. Kakade, 1980. Protease inhibitors, In: Toxic constituents of plant foodstuffs, Ed. I.E. Liener, Academic Press, London, 7-71.
Liener, I.E., 1986. Trypsin inhibitors: concern for human nutrition or not?, J. Nutrition 116, 920-923.Liener, I.E., 1986. Trypsin inhibitors: concern for human nutrition or not?, J. Nutrition 116, 920-923.
Liener, I.E., 1989. Antinutritional factors in legume seeds: state of the art. In: Recent advances of research in antinutritional factors in legume seeds, Eds: J. Huisman, T.F.B. van der Poel, I.E. Liener. Pudoc Wageningen, The Netherlands, 6-13·Liener, I.E., 1989. Antinutritional factors in legume seeds: state of the art. In: Recent advances of research in antinutritional factors in legume seeds, Eds: J. Huisman, T.F.B. van der Poel, I.E. Liener. Pudoc Wageningen, The Netherlands, 6-13
Liu, K. and P. Markakis, 1989· Trypsin inhibition assay as related to limited hydrolysis of inhibitors, Analytica; Biochemistry, 178, 159" I65.Liu, K. and P. Markakis, 1989 · Trypsin inhibition assay as related to limited hydrolysis of inhibitors, Analytica; Biochemistry, 178, 159, I65.
Meader, D.L., M. Sunde and D.P. Botes, 1992. Design and inhibitory properties of synthetic Bowman Birk loops, Peptide Protein Res. 40, 97" 102.Meader, D.L., M. Sunde and D.P. Botes, 1992. Design and inhibitory properties of synthetic Bowman Birk loops, Peptide Protein Res. 40, 97 "102.
Norton, G., 1991· Proteinase inhibitors. In: Toxic substances in crop plants, Eds. J.P.F D'Mello, C.M, Duffus, J.H. Duffus, The Royal Society of Chemistry, Cambridge, England, 68-108.Norton, G., 1991 Proteinase inhibitors. In: Toxic substances in crop plants, Eds. J.P.F D'Mello, C.M, Duffus, J.H. Duffus, The Royal Society of Chemistry, Cambridge, England, 68-108.
Publikatieblad EEG, 1971· Bepaling van de urease-activiteit van sojapro-dukten, Nr. L155/36-37» no. 16, 12 juli 1971·Official Journal of the EEC, 1971 · Determination of the urease activity of soy products, no. L155 / 36-37 »no. 16, July 12, 1971
Rackis J.J. and M.R. Gumbmann, 1981. Protease inhibitors:physiological properties and nutritional significance. In: Antinutrients and natural toxicants in foods. Eds R.L. Ory, Pood and nutrition press, Westport, 203-237.Rackis J.J. and M.R. Gumbmann, 1981. Protease inhibitors: physiological properties and nutritional significance. In: Antinutrients and natural toxicants in foods. Eds R.L. Ory, Pood and nutrition press, Westport, 203-237.
Richardson M., 1977· The proteinase inhibitors of plants and micro-organismes. Phytochemistry, 16, 159“l69·Richardson M., 1977 · The proteinase inhibitors of plants and microorganisms. Phytochemistry, 16, 159 "l69 ·
Ryan C.A., 1978. Proteinase inhibitors in plant leaves: a biochemical model for pest-induced natural plant protection. In: Trends in biochemical sciences, 3· 148-150Ryan C.A., 1978. Proteinase inhibitors in plant leaves: a biochemical model for pest-induced natural plant protection. In: Trends in biochemical sciences, 3 · 148-150
Ryan C.A., 1983· Insect-induced chemical signals regulating natural plant protection response. In: variable plant and herbivores in natural and managed systems, Eds. R.F. Denno and M.S. McClure, NY, Academic Press, 43-60.Ryan C.A., 1983 · Insect-induced chemical signals regulating natural plant protection response. In: variable plant and herbivores in natural and managed systems, Eds. R.F. Denno and M.S. McClure, NY, Academic Press, 43-60.
Sessa, D.J. and J.A. Bietz, 1986. Toasted soybean flour components with trypsin inhibitor activity, J.Am. Oil Chem.Soc. 63. 784-788.Sessa, D.J. and J.A. Bietz, 1986. Toasted soybean flour components with trypsin inhibitor activity, J.Am. Oil Chem. Soc. 63, 784-788.
Smith C., W. van Megen, L. Twaalf hoven and C. Hitchcock, 1980. The determination of trypsin inhibitor levels in foodstuffs, J.Sci. Food Agr., 31, 341-350.Smith C., W. van Megen, L. Twelve Courts and C. Hitchcock, 1980. The determination of trypsin inhibitor levels in foodstuffs, J.Sci. Food Agr., 31, 341-350.
Spencer, M.E. and R. Hodge, 1991· Cloning and sequencing of the cDNA encoding the major albumin of Theobroma cacao, identification of the protein as a member of the Kunitz protease inhibitory family, Planta: 183. 528-535.Spencer, M.E. and R. Hodge, 1991 · Cloning and sequencing of the cDNA encoding the major albumin of Theobroma cacao, identification of the protein as a member of the Kunitz protease inhibitory family, Planta: 183. 528-535.
Stauffer, C.E., 1990. Measuring trypsin inhibitor in soy meal: suggested improvements in the standard method. Cereal Chem., 67, 296-302.Stauffer, C.E., 1990. Measuring trypsin inhibitor in soy meal: suggested improvements in the standard method. Cereal Chem., 67, 296-302.
ran-Wilson, A.L. and K.A. Wilson, 1986. Relevance of multiple soybean trypsin inhibitor forms to nutritional quality. In: Nutritional and toxicological significance of enzyme inhibitors in foods, Ed. M. Friedman, Advances in experimental medicine and biology, Plenum, NY, 391-411ran-Wilson, A.L. and K.A. Wilson, 1986. Relevance of multiple soybean trypsin inhibitor forms to nutritional quality. In: Nutritional and toxicological significance of enzyme inhibitors in foods, Ed. M. Friedman, Advances in experimental medicine and biology, Plenum, NY, 391-411
Van Oort M.G., R.J. Hamer and E.A. Slager, 1989· Analysis of residual trypsin inhibitor activity in legumes and cereals, In: Recent advances of research in antinutritional factors in legume seeds, Eds. J. Huisman, T.F.B. van der Poel, I.E. Liener, Pudoc, Wageningen, The Netherlands, 110-114.Van Oort M.G., R.J. Hamer and E.A. Butcher, 1989 · Analysis of residual trypsin inhibitor activity in legumes and cereals, In: Recent advances of research in antinutritional factors in legume seeds, Eds. J. Huisman, T.F.B. van der Poel, I.E. Liener, Pudoc, Wageningen, The Netherlands, 110-114.
Van Oort, M.G. and I.J.M. Van Westerop, 1993· Classificatie en analyse van trypsineinhibitors, In: Antinutritionele factoren in vlinderbloemigen en nutritionele effecten bij eermagige landbouwhuisdieren. Produkt-schap voor veevoeder kwaliteitsreeks nr. 23, 53“62.Van Oort, M.G. and I.J.M. Van Westerop, 1993 · Classification and analysis of trypsin inhibitors, In: Anti-nutritional factors in leguminous plants and nutritional effects in pungent farm animals. Product board for animal feed quality series no. 23, 53 “62.
Waldroup, P.W., B.E. Ramsey, H.M. Hellwig and N.K. Smith, 1985. Optimum processing for soybean meal used in broiler diets, Poultry Sci. 64, 2314-2320.Waldroup, P.W., B.E. Ramsey, H.M.Hellwig and N.K. Smith, 1985. Optimum processing for soybean meal used in broiler diets, Poultry Sci. 64, 2314-2320.
Claims (25)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9301134A NL9301134A (en) | 1993-06-29 | 1993-06-29 | Method for detecting and, if necessary, quantifying the activity of at least one protease inhibitor in a mixture to be analysed, and also application of the method for determining the (residual) activity of one (or more) separate (iso)type(s) of protease inhibitor(s) and application of the method for determining the total (residual) activity of a mixture, possibly after a processing process such as a process for the removal or inactivation of protease inhibitor(s). |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9301134 | 1993-06-29 | ||
| NL9301134A NL9301134A (en) | 1993-06-29 | 1993-06-29 | Method for detecting and, if necessary, quantifying the activity of at least one protease inhibitor in a mixture to be analysed, and also application of the method for determining the (residual) activity of one (or more) separate (iso)type(s) of protease inhibitor(s) and application of the method for determining the total (residual) activity of a mixture, possibly after a processing process such as a process for the removal or inactivation of protease inhibitor(s). |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL9301134A true NL9301134A (en) | 1995-01-16 |
Family
ID=19862598
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL9301134A NL9301134A (en) | 1993-06-29 | 1993-06-29 | Method for detecting and, if necessary, quantifying the activity of at least one protease inhibitor in a mixture to be analysed, and also application of the method for determining the (residual) activity of one (or more) separate (iso)type(s) of protease inhibitor(s) and application of the method for determining the total (residual) activity of a mixture, possibly after a processing process such as a process for the removal or inactivation of protease inhibitor(s). |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| NL (1) | NL9301134A (en) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0048989A2 (en) * | 1980-09-30 | 1982-04-07 | Cornell Research Foundation, Inc. | Process for determining inhibitor-enzyme complexes |
| EP0080279A1 (en) * | 1981-11-02 | 1983-06-01 | James Walter Ryan | Method for assaying proteases with tagged proteinaceous inhibitors |
| WO1990003574A1 (en) * | 1988-09-20 | 1990-04-05 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce | High affinity monoclonal antibodies to bowman-birk inhibitor and immunoassay methods |
| US4959310A (en) * | 1987-09-28 | 1990-09-25 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Monoclonal antibodies to soybean kunitz trypsin inhibitor and immunoassay methods |
| EP0519720A1 (en) * | 1991-06-18 | 1992-12-23 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. | Immunoassay of human granulocyte elastase |
| EP0528525A1 (en) * | 1991-07-03 | 1993-02-24 | The Scripps Research Institute | Assay methods and compositions for detecting serum proteases,particularly activated protein C. |
-
1993
- 1993-06-29 NL NL9301134A patent/NL9301134A/en not_active Application Discontinuation
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0048989A2 (en) * | 1980-09-30 | 1982-04-07 | Cornell Research Foundation, Inc. | Process for determining inhibitor-enzyme complexes |
| EP0080279A1 (en) * | 1981-11-02 | 1983-06-01 | James Walter Ryan | Method for assaying proteases with tagged proteinaceous inhibitors |
| US4959310A (en) * | 1987-09-28 | 1990-09-25 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Monoclonal antibodies to soybean kunitz trypsin inhibitor and immunoassay methods |
| WO1990003574A1 (en) * | 1988-09-20 | 1990-04-05 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce | High affinity monoclonal antibodies to bowman-birk inhibitor and immunoassay methods |
| EP0519720A1 (en) * | 1991-06-18 | 1992-12-23 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. | Immunoassay of human granulocyte elastase |
| EP0528525A1 (en) * | 1991-07-03 | 1993-02-24 | The Scripps Research Institute | Assay methods and compositions for detecting serum proteases,particularly activated protein C. |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Proll et al. | Low nutritional quality of unconventional tropical crop seeds in rats | |
| Alonso et al. | Effects of extrusion and conventional processing methods on protein and antinutritional factor contents in pea seeds | |
| Pusztai et al. | Inhibition of starch digestion by α-amylase inhibitor reduces the efficiency of utilization of dietary proteins and lipids and retards the growth of rats | |
| Friedman et al. | Nutritional and health benefits of soy proteins | |
| Gatehouse et al. | Assessment of the antimetabolic effects of trypsin inhibitors from cowpea (Vigna unguiculata) and other legumes on development of the bruchid beetle Callosobruchus maculatus | |
| Hossain et al. | Nutritive value and antinutritional factors in different varieties of Sesbania seeds and their morphological fractions | |
| Ahrens et al. | Almond (Prunus dulcis L.) protein quality | |
| Griffiths | The trypsin and chymotrypsin inhibitor activities of various pea (Pisum spp.) and field bean (Vicia faba) cultivars | |
| Boisen | Protease inhibitors in cereals: occurrence, properties, physiological role, and nutritional influence | |
| Devi et al. | Amino acid digestibility of extruded chickpea and yellow pea protein is high and comparable in moderately stunted South Indian children with use of a dual stable isotope tracer method | |
| Ribeiro et al. | Identification of chickpea seed proteins resistant to simulated in vitro human digestion | |
| Gatehouse et al. | Role of carbohydrates in insect resistance in Phaseolus vulgaris | |
| Shams Tabrez et al. | Microbial biofertilizers and micronutrient availability: the role of zinc in agriculture and human health | |
| Clemente et al. | Active Bowman–Birk inhibitors survive gastrointestinal digestion at the terminal ileum of pigs fed chickpea‐based diets | |
| Call et al. | Development of an enzymatic assay for the quantitative determination of trypsin inhibitory activity in wheat | |
| Rizzi et al. | Active soybean lectin in foods: quantitative determination by ELISA using immobilised asialofetuin | |
| Al‐Wesali et al. | The influence of pea seed trypsin inhibitors on the in vitro digestibility of casein | |
| Zarkadas et al. | Determination of the protein quality of three new northern adapted cultivars of common and miso type soybeans by amino acid analysis | |
| Warchalewski | Review article Present‐day studies on cereals protein nature alpha‐amylase inhibitors | |
| de Luis et al. | Immunochemical detection of Cry1A (b) protein in model processed foods made with transgenic maize | |
| NL9301134A (en) | Method for detecting and, if necessary, quantifying the activity of at least one protease inhibitor in a mixture to be analysed, and also application of the method for determining the (residual) activity of one (or more) separate (iso)type(s) of protease inhibitor(s) and application of the method for determining the total (residual) activity of a mixture, possibly after a processing process such as a process for the removal or inactivation of protease inhibitor(s). | |
| Chandran et al. | Stability of transgene expression in reduced allergen peanut (Arachis hypogaea L.) across multiple generations and at different soil sulfur levels | |
| JP4505281B2 (en) | Stabilizer and blocking agent | |
| Sotelo et al. | Nutrient composition and toxic factor content of four wild species of Mexican potato | |
| Hivrale et al. | Unraveling biochemical properties of cockroach (Periplaneta americana) proteinases with a gel X-ray film contact print method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1B | A search report has been drawn up | ||
| BV | The patent application has lapsed |