JP3018364B2 - 免疫化学アッセイへの二価陽イオンの使用 - Google Patents
免疫化学アッセイへの二価陽イオンの使用Info
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は二価または三価陽イオンを免疫化学的検出方
法および生物学的材料中の被分析物質（analyte）の測
定方法に用いることに関する。
法および生物学的材料中の被分析物質（analyte）の測
定方法に用いることに関する。
既知の免疫化学アツセイ系は、免疫化学的反応に関与
しないがこのタイプの反応結果に有益な効果を有するの
に適したタンパク質、多糖類および／または界面活性剤
を添加使用している。
しないがこのタイプの反応結果に有益な効果を有するの
に適したタンパク質、多糖類および／または界面活性剤
を添加使用している。
このタイプのアツセイ系の一つの選択である固相ELIS
Aの場合、必要とされる（緩衝溶液、インキユベーシヨ
ンミリユー（milieu）であり）、そして被分析物質を含
有し固相と接触させるインキユベーシヨン媒質は、コン
ジユゲートのおよび／または検体の随伴物質の固相への
非特異的結合が妨げられるような組成を有していなけれ
ばならない。そのために、既知の添加剤、例えばタンパ
ク質、例えばアルブミン、IgG、カゼイン、加水分解ゼ
ラチンおよびそれらの誘導体およびタンパク質混合物ま
たはヒトまたは動物血清、および界面活性剤などがイン
キユベーシヨン媒質に用いられている。
Aの場合、必要とされる（緩衝溶液、インキユベーシヨ
ンミリユー（milieu）であり）、そして被分析物質を含
有し固相と接触させるインキユベーシヨン媒質は、コン
ジユゲートのおよび／または検体の随伴物質の固相への
非特異的結合が妨げられるような組成を有していなけれ
ばならない。そのために、既知の添加剤、例えばタンパ
ク質、例えばアルブミン、IgG、カゼイン、加水分解ゼ
ラチンおよびそれらの誘導体およびタンパク質混合物ま
たはヒトまたは動物血清、および界面活性剤などがイン
キユベーシヨン媒質に用いられている。
EP 0,152,847はカルシウム塩およびポリオキシエチレ
ンを共に含有する酵素−抗原および酵素−抗体コンジユ
ゲートを記載しており、この場合、水性溶液中のコンジ
ユゲートの安定性は両物質の添加によっては増大するが
いずれか一方の物質単独では増大しない。
ンを共に含有する酵素−抗原および酵素−抗体コンジユ
ゲートを記載しており、この場合、水性溶液中のコンジ
ユゲートの安定性は両物質の添加によっては増大するが
いずれか一方の物質単独では増大しない。
DE 3,638,767は、ラクトフエリン、牛胎児血清、ポリ
オキシエチレン20ソルビタンモノラウレート（RTween 2
0）および緩衝塩を含む固相免疫化学アツセイ、例えばE
LISA、の為のインキユベーシヨン媒質を記載している。
オキシエチレン20ソルビタンモノラウレート（RTween 2
0）および緩衝塩を含む固相免疫化学アツセイ、例えばE
LISA、の為のインキユベーシヨン媒質を記載している。
DE 3,807,478は免疫化学剤、特にそれに含まれるイン
キユベーシヨン媒質、に対する有利な添加物としてアミ
ン酸化物を記載している。
キユベーシヨン媒質、に対する有利な添加物としてアミ
ン酸化物を記載している。
このたび驚くべきことに、検体中の被分析物質の免疫
化学反応による検出または測定に用いられる剤に対し、
特に前述の添加物と共に添加して、該被分析物質の検出
および測定の特異性を高める免疫化学反応に対する有益
な効果をもたらすのに二価または三価陽イオンが適して
いることを見出した。
化学反応による検出または測定に用いられる剤に対し、
特に前述の添加物と共に添加して、該被分析物質の検出
および測定の特異性を高める免疫化学反応に対する有益
な効果をもたらすのに二価または三価陽イオンが適して
いることを見出した。
従って、本発明は、生物学的材料中に含まれる被分析
物質の免疫化学検出方法および免疫化学測定方法に、好
ましくは水溶性マグネシウムおよび／またはカルシウム
塩の、二価または三価陽イオンを用い、被分析物質を未
標識反応物質と接触させる場合にそれら適切な塩を５〜
500mmol/の濃度で溶解された形態で存在させることに
関する。
物質の免疫化学検出方法および免疫化学測定方法に、好
ましくは水溶性マグネシウムおよび／またはカルシウム
塩の、二価または三価陽イオンを用い、被分析物質を未
標識反応物質と接触させる場合にそれら適切な塩を５〜
500mmol/の濃度で溶解された形態で存在させることに
関する。
それらの群から好まれる水溶性マグネシウムまたはカ
ルシウム塩は、それらの陰イオンが免疫反応を阻害しな
いものである。好ましい陰イオンはアセテート、クロラ
イドおよびシトレート、特に好ましくはクロライド、で
ある。
ルシウム塩は、それらの陰イオンが免疫反応を阻害しな
いものである。好ましい陰イオンはアセテート、クロラ
イドおよびシトレート、特に好ましくはクロライド、で
ある。
本発明による方法は、沈殿が分散液として、またはゲ
ルまたは粒子凝集物として生成するもの、あるいはそれ
らを不存在とするもの、あるいは免疫化学反応が固相で
行われるものである。
ルまたは粒子凝集物として生成するもの、あるいはそれ
らを不存在とするもの、あるいは免疫化学反応が固相で
行われるものである。
好ましい方法は、固相免疫化学アツセイと呼ばれるも
のである。
のである。
これに関連して、固相とは非水溶性であって、一以上
の反応物質が結合される担体である。被分析物質は反応
物質に結合させることができ、あるいはいくつかの反応
物質が担体に結合して存在している場合には、少くとも
それらのうちの一つをそれ自身の結合により脱着させて
それを水性相中に放出させることができる。
の反応物質が結合される担体である。被分析物質は反応
物質に結合させることができ、あるいはいくつかの反応
物質が担体に結合して存在している場合には、少くとも
それらのうちの一つをそれ自身の結合により脱着させて
それを水性相中に放出させることができる。
担体の例はラテツクス粒子、顆粒状の膨潤性または非
膨潤性物質、ビーズ、チユーブ内側面、チユーブ装置の
特別な態様としてのマイクロアツセイプレート、および
吸収性マトリクスと称すべき多孔性材料である。
膨潤性物質、ビーズ、チユーブ内側面、チユーブ装置の
特別な態様としてのマイクロアツセイプレート、および
吸収性マトリクスと称すべき多孔性材料である。
免疫化学方法においては、抗原および抗体が、被分析
物としておよび反応物質として、用いられるほか反応物
質または被分析物質に対するその他のバイオアフイニテ
イ結合相手、例えばレクチン、補体、プロテインＡまた
はＧ、および誘導体化されたビオチンおよびアビジンが
用いられる。
物としておよび反応物質として、用いられるほか反応物
質または被分析物質に対するその他のバイオアフイニテ
イ結合相手、例えばレクチン、補体、プロテインＡまた
はＧ、および誘導体化されたビオチンおよびアビジンが
用いられる。
多価陽イオンは乾燥状態で検体受容装置に、例えば検
体受容容器に、あるいはいわゆる“ドライ・ケミカル”
アツセイ系における検体のための受容ゾーン例えば吸収
性マトリクスに、あるいは、そのほかに緩衝塩および洗
剤および適切な場合には同じく被分析物質を安定化する
物質として安定化用添加物例えばタンパク質または多糖
類を含有する水性溶液中に含まれていてもよく、そして
該多価陽イオンは５〜500mmol/、好ましくは30〜100m
mol/、特に好ましくは50〜60mmol/、の濃度で含ま
れる。
体受容容器に、あるいはいわゆる“ドライ・ケミカル”
アツセイ系における検体のための受容ゾーン例えば吸収
性マトリクスに、あるいは、そのほかに緩衝塩および洗
剤および適切な場合には同じく被分析物質を安定化する
物質として安定化用添加物例えばタンパク質または多糖
類を含有する水性溶液中に含まれていてもよく、そして
該多価陽イオンは５〜500mmol/、好ましくは30〜100m
mol/、特に好ましくは50〜60mmol/、の濃度で含ま
れる。
検体とも称される被分析物質を含む生物学的材料の例
は、生検または剖検で得た組織、血液細胞、血清または
血漿、分泌物、CSF、インフレームされたまたはされな
い組織、壊死生産物および代謝排泄物などである。
は、生検または剖検で得た組織、血液細胞、血清または
血漿、分泌物、CSF、インフレームされたまたはされな
い組織、壊死生産物および代謝排泄物などである。
好ましい免疫化学方法は、反応物質のうちの一つが固
相に存在するものであるが、その場合には検体を多価陽
イオンの存在下に固相と、そして適切な場合には固相上
のもの以外の免疫化学反応物質および被分析物質検出用
試薬と共に接触させ、次いでその固相を液相から分離し
そして固相に結合した被分析物質を測定するかまたは未
結合の被分析物質を測定する。
相に存在するものであるが、その場合には検体を多価陽
イオンの存在下に固相と、そして適切な場合には固相上
のもの以外の免疫化学反応物質および被分析物質検出用
試薬と共に接触させ、次いでその固相を液相から分離し
そして固相に結合した被分析物質を測定するかまたは未
結合の被分析物質を測定する。
以下の実施例では、（１）感染症ウシ鼻気管炎（infe
ctions bovine rhinotracheitis（IBR））または感染性
膿疱性外陰部膣炎（infections pustular vulvovaginit
is（IPV））および（２）ウシ白血症の原因となる作用
体に対する抗体の検出方法および測定方法に多価陽イオ
ンを用いることの利点を説明する。
ctions bovine rhinotracheitis（IBR））または感染性
膿疱性外陰部膣炎（infections pustular vulvovaginit
is（IPV））および（２）ウシ白血症の原因となる作用
体に対する抗体の検出方法および測定方法に多価陽イオ
ンを用いることの利点を説明する。
実施例 実施例 １ IBRおよびIPVの原因体に対する抗体を検出するためのEL
ISA 1.1 緩衝および試薬溶液 以下の緩衝および試薬溶液を調整した： 1.1.1 PBS−RTween 20 10g/ポリオキシエチレン20ソルビタンモノラウレー
ト（RTween 20）を含有する、リン酸緩衝生理学的食塩
水、pH7.2（PBS）、すなわち140mmol/ NaCl中の10mmo
l/ Na2HPO4/KH2PO4、pH7.2。
ISA 1.1 緩衝および試薬溶液 以下の緩衝および試薬溶液を調整した： 1.1.1 PBS−RTween 20 10g/ポリオキシエチレン20ソルビタンモノラウレー
ト（RTween 20）を含有する、リン酸緩衝生理学的食塩
水、pH7.2（PBS）、すなわち140mmol/ NaCl中の10mmo
l/ Na2HPO4/KH2PO4、pH7.2。
1.1.2 検体希釈緩衝液（PT） 40g/ RTween 20を含有するPBS。
1.1.3 50mmol/ MgCl2を含有する検体希釈緩衝液（PT
−Mg） 10g/ MgCl2×6H2OをPTに溶解した。
−Mg） 10g/ MgCl2×6H2OをPTに溶解した。
1.1.4 Tris/EDTA 50mmol/ tris、50mmol/エチレンジアミン四酢酸
二ナトリウムの水性溶液をHClでpH7.2に調節した。
二ナトリウムの水性溶液をHClでpH7.2に調節した。
1.1.5 APコンジユゲート 抗−ウシ免疫グロブリン−アルカリ性ホスフアターゼ
コンジユゲートと呼ばれ製品No.OUDY01の下に入手でき
るBehringwerke AG試薬をPTで1:70に希釈した。
コンジユゲートと呼ばれ製品No.OUDY01の下に入手でき
るBehringwerke AG試薬をPTで1:70に希釈した。
1.1.6 AP基質溶液 100g/ジエタノールアミン水溶液中の1.5g/ ｐ−
ニトロフエニルホスフエートをHClでpH9.5に調節した。
ニトロフエニルホスフエートをHClでpH9.5に調節した。
1.2 ウシヘルペスウイルスＩ（BHV I）によるマイクロ
アツセイのコーテイング 使用マイクロアツセイプレートは丸底を有するImmuno
plates II 96 F（Nunc,Roskilide,Denmark,製品No.262
162）とした。BHV Iを増殖させたMadin−Darbyウシ腎細
胞（MDBK細胞）の組織培養、およびBHV Iを全く含まな
い組織培養を、Nicolai−Scholtenらがおたふくかぜ
（流行性耳下腺炎）ウイルスについてMed.Microbiol.Im
munol.168,81〜90,1980に記載した如く処理して以下BHV
I抗原（Ag）および（陰性）コントロール抗原（coAg）
と呼ばれる調製物を得た。コーテイングには、50μｇの
BHV I抗原（Ag）およびcoAgを前述のマイクロアツセイ
プレートのウエルに交互に入れ、そしてそれらプレート
を20〜25℃に20時間放置した。それらウエルの内容物を
次いで吸引により除去しそしてウエルを、充填後吸引を
行うことによりPBS−TweenR20で１回、そしてtris/EDTA
で２回洗浄した。
アツセイのコーテイング 使用マイクロアツセイプレートは丸底を有するImmuno
plates II 96 F（Nunc,Roskilide,Denmark,製品No.262
162）とした。BHV Iを増殖させたMadin−Darbyウシ腎細
胞（MDBK細胞）の組織培養、およびBHV Iを全く含まな
い組織培養を、Nicolai−Scholtenらがおたふくかぜ
（流行性耳下腺炎）ウイルスについてMed.Microbiol.Im
munol.168,81〜90,1980に記載した如く処理して以下BHV
I抗原（Ag）および（陰性）コントロール抗原（coAg）
と呼ばれる調製物を得た。コーテイングには、50μｇの
BHV I抗原（Ag）およびcoAgを前述のマイクロアツセイ
プレートのウエルに交互に入れ、そしてそれらプレート
を20〜25℃に20時間放置した。それらウエルの内容物を
次いで吸引により除去しそしてウエルを、充填後吸引を
行うことによりPBS−TweenR20で１回、そしてtris/EDTA
で２回洗浄した。
1.3 IBR/IPVの原因体に対するIgM、IgG抗体の測定方法 陽性コントロールをPTおよびPT−Mg緩衝液を用いて1:
40乃至1:640の連続希釈液として希釈した。血清検体を
前記緩衝液を用いて1:44に希釈した。150μの各溶液
をAgおよびcoAgでコーテイングしたマイクロアツセイプ
レートのウエルに入れた。次にそのアツセイプレートを
大気湿度を飽和させて37℃で１時間維持した。次いでそ
れらウエルをPBS−(R)Tweenを用いて、ウエルを充填し
該液体を吸引除去することにより、３回洗浄した。次い
で、50μのAPコンジユゲートを添加し、そしてそれら
プレートを再び37℃に１時間放置後、前述の如く洗浄し
た。ウエル中のコンジユゲートとして結合したAPの活性
を測定するために、100μのAP基質溶液を添加し、マ
イクロアツセイプレートを37℃に45分間放置し、そして
黄色溶液の405nmにおける吸光度を、空のウエルを基準
として用いて測定した。
40乃至1:640の連続希釈液として希釈した。血清検体を
前記緩衝液を用いて1:44に希釈した。150μの各溶液
をAgおよびcoAgでコーテイングしたマイクロアツセイプ
レートのウエルに入れた。次にそのアツセイプレートを
大気湿度を飽和させて37℃で１時間維持した。次いでそ
れらウエルをPBS−(R)Tweenを用いて、ウエルを充填し
該液体を吸引除去することにより、３回洗浄した。次い
で、50μのAPコンジユゲートを添加し、そしてそれら
プレートを再び37℃に１時間放置後、前述の如く洗浄し
た。ウエル中のコンジユゲートとして結合したAPの活性
を測定するために、100μのAP基質溶液を添加し、マ
イクロアツセイプレートを37℃に45分間放置し、そして
黄色溶液の405nmにおける吸光度を、空のウエルを基準
として用いて測定した。
血清は、Agでコーテイングされたウエル内の有色溶液
の吸光度とcoAgでコーテイングされたウエル内の溶液の
吸光度の差がプラス200ミリ吸光度（mE）より大である
ときは陽性と判定され、またその差がプラス200mE以下
または負であるときは陰性と判定された。コントロール
血清の力価をこの差が200mEである希釈度とした。従っ
て200mEの数値はカツトオフと呼ばれる。
の吸光度とcoAgでコーテイングされたウエル内の溶液の
吸光度の差がプラス200ミリ吸光度（mE）より大である
ときは陽性と判定され、またその差がプラス200mE以下
または負であるときは陰性と判定された。コントロール
血清の力価をこの差が200mEである希釈度とした。従っ
て200mEの数値はカツトオフと呼ばれる。
1.4 結 果 測定結果を表に示す。これより、検体希釈緩衝液PTに
MgCl2を添加すると、1:640に希釈された二つのコントロ
ール血清の場合に、Agでコーテイングされたウエル内ま
たはcoAgでコーテイングされたウエル内のいずれにおい
ても吸光度差が全く生じないことが明らかである。しか
しながら、1:44に希釈された血清の場合には、MgCl2の
添加は、AgでコーテイングされたウエルおよびcoAgでコ
ーテイングされたウエルのいずれについてもその吸光度
の絶対値が該添加物を含まない緩衝液を用いたときの吸
光度の絶対値よりも低く有利である。特に、coAgでコー
テイングされたウエル内で、吸光度が低下することは、
バツクグラウンド吸光度が減少したこと、従ってアツセ
イの特異度が増大したことを意味する。
MgCl2を添加すると、1:640に希釈された二つのコントロ
ール血清の場合に、Agでコーテイングされたウエル内ま
たはcoAgでコーテイングされたウエル内のいずれにおい
ても吸光度差が全く生じないことが明らかである。しか
しながら、1:44に希釈された血清の場合には、MgCl2の
添加は、AgでコーテイングされたウエルおよびcoAgでコ
ーテイングされたウエルのいずれについてもその吸光度
の絶対値が該添加物を含まない緩衝液を用いたときの吸
光度の絶対値よりも低く有利である。特に、coAgでコー
テイングされたウエル内で、吸光度が低下することは、
バツクグラウンド吸光度が減少したこと、従ってアツセ
イの特異度が増大したことを意味する。
実施例 ２ ウシ白血病の原因体に対する抗体の検出方法 2.1 緩衝溶液 以下の検体希釈緩衝液を調製した。
2.1.1 STD 10ml/牛胎児血清、18mmol/クエン酸三ナトリウム
×2H2O、10mmol/ KCl、40g/ 1−アルキル（C8〜
C18）アミノ−３−ジメチルアミノプロパン３−Ｎ−オ
キサイドの水性溶液。
×2H2O、10mmol/ KCl、40g/ 1−アルキル（C8〜
C18）アミノ−３−ジメチルアミノプロパン３−Ｎ−オ
キサイドの水性溶液。
2.1.2 STD−Mg 50mmol/ MgCl2、すなわち10g/ MgCl2×6H2O、を
2.1.1に記載の検体希釈液に溶解した。
2.1.1に記載の検体希釈液に溶解した。
2.1.3 STD−Ca 68mmol/ CaCl2、すなわち10g/ CaCl2×2H2O、を
2.1.1に記載の検体希釈液に溶解した。
2.1.1に記載の検体希釈液に溶解した。
2.2 ウシ白血症ウイルス（BLV）によるマイクロアツセ
イプレートのコーテイング マイクロアツセイプレートは実施例1.2で使用したも
のと同じにした。BLVは永久羊胎児腎セルラインを用い
て増殖させ、そしてNicolaiScholtenらがおたふくかぜ
ウイルスについてMed.Microbial.Immunol.168,81〜90,1
980に記載した如く処理してBLV抗原の調製物を得た。コ
ーテイングには、50μのBLV抗原を各ウエルに入れ
た。ウイルス不含羊腎細胞の調製物によるコーテイング
は行わなかった。次いで、ウエルの内容物を吸引により
除去しそしてそれらウエルを、充填後吸引を行うことに
より、PBS−(R)Tweenで１回、そしてtris/EDTAで２回洗
浄した。
イプレートのコーテイング マイクロアツセイプレートは実施例1.2で使用したも
のと同じにした。BLVは永久羊胎児腎セルラインを用い
て増殖させ、そしてNicolaiScholtenらがおたふくかぜ
ウイルスについてMed.Microbial.Immunol.168,81〜90,1
980に記載した如く処理してBLV抗原の調製物を得た。コ
ーテイングには、50μのBLV抗原を各ウエルに入れ
た。ウイルス不含羊腎細胞の調製物によるコーテイング
は行わなかった。次いで、ウエルの内容物を吸引により
除去しそしてそれらウエルを、充填後吸引を行うことに
より、PBS−(R)Tweenで１回、そしてtris/EDTAで２回洗
浄した。
2.3 BLVに対するIgMおよびIgG抗体の測定方法 STD、STD−MgCl2およびSTD−CaCl2緩衝液を用いてBLV
−陽性牛血清の1:20の希釈液を調製した。150μのこ
れら希釈液を実施例2.2に記載のマイクロアツセイプレ
ートのBLV抗原でコーテイングされたウエル内に移し
た。そのマイクロアツセイプレートを実施例1.3に記載
の如くに更に処理した。
−陽性牛血清の1:20の希釈液を調製した。150μのこ
れら希釈液を実施例2.2に記載のマイクロアツセイプレ
ートのBLV抗原でコーテイングされたウエル内に移し
た。そのマイクロアツセイプレートを実施例1.3に記載
の如くに更に処理した。
2.4結 果 二つの被分析物質−陰性血清はSTD中ではそれぞれ0.4
6Eおよび0.48Eの吸光度を与えることが判明した。STD−
MgおよびSTD−Ca中では、この数値はそれぞれ0.14Eおよ
び0.22Eに、すなわちそれぞれ69.6％および54.2％減少
した。これとは対照的に、BLV−特異抗体を含む牛血清
により得られた吸光度はSTD中で1.28E、STD−Mg中で1.0
6E、STD−Ca中で1.02Eであった。すなわち、STD中で得
られた数値はこの場合にはそれぞれわずか17.2％および
20.3％しか減少しなかった。
6Eおよび0.48Eの吸光度を与えることが判明した。STD−
MgおよびSTD−Ca中では、この数値はそれぞれ0.14Eおよ
び0.22Eに、すなわちそれぞれ69.6％および54.2％減少
した。これとは対照的に、BLV−特異抗体を含む牛血清
により得られた吸光度はSTD中で1.28E、STD−Mg中で1.0
6E、STD−Ca中で1.02Eであった。すなわち、STD中で得
られた数値はこの場合にはそれぞれわずか17.2％および
20.3％しか減少しなかった。
それらの結果を併せ考慮すれば、被分析物質−陽性お
よび−陰性血清についての吸光度差が検体希釈媒質中の
MgCl2およびCaCl2の影響の下に大きくなる、すなわち、
このアツセイ系の特異性が明らかに向上していることが
明らかである。
よび−陰性血清についての吸光度差が検体希釈媒質中の
MgCl2およびCaCl2の影響の下に大きくなる、すなわち、
このアツセイ系の特異性が明らかに向上していることが
明らかである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/531
Claims (10)
- 【請求項１】生物学的材料中に含まれる被分析物質を未
標識反応物質と接触させる際に二価陽イオンを５〜500m
mol/の濃度の溶解された形態で存在させることより成
る上記被分析物質の免疫化学検出または測定のための方
法。 - 【請求項２】二価陽イオンがカルシウムおよび／または
マグネシウム塩である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】塩がクロライドである請求項２記載の方
法。 - 【請求項４】被分析物質が抗原である請求項１記載の方
法。 - 【請求項５】被分析物質が抗体である請求項１記載の方
法。 - 【請求項６】一つの反応物質が固相として存在する請求
項１記載の方法。 - 【請求項７】塩が乾燥状態で吸収性マトリクス中に含ま
れているか、または免疫化学方法において液体検体また
は他の液体によって溶解されている請求項２記載の方
法。 - 【請求項８】塩が被分析物質を含有し、そして適切な場
合にはその被分析物質の希釈に用いられる溶液に添加さ
れる請求項２記載の方法。 - 【請求項９】二価陽イオンが30〜100mmol/の濃度で存
在する請求項１〜８のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】二価陽イオンが50〜60mmol/の濃度で
存在する請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3901458A DE3901458A1 (de) | 1989-01-19 | 1989-01-19 | Verwendung von zwei- oder dreiwertigen kationen in immunchemischen tests |
| DE3901458.4 | 1989-01-19 |
Publications (2)
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