KR890000393B1 - 비루스성 적혈구 응집 반응 시험용 조류(鳥類)고정 적혈구의 보존액 - Google Patents
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Description
제1도는 실시예 1의 적혈구 현탁액 및 실시예 2, 3 및 4의 보존액을 사용한 각각의 적혈구 현탁액내에서 β-지방단백질 삼출 표준가의 변화를 나타낸다.
제2도는 실시예1의 적혈구 현탁액 및 실시예2의 보존액, 인산완충식염수(PBS) 및 생리 식염수를 사용한 각각의 적혈구 현탁액내에서의 β-지방단백질 삼출의 표준가의 변화를 나타낸다.
어떤 종류의 비루스는 그 표면에 동물의 적혈구를 응집시키는 HA항원(Hemagglutination 항원, 적혈구 응집항원)이라 불리는 물질을 보유하고 있다. HA항원의 적혈구 응집 반응에서, 특정 비루스가 그에 대응하는 동물의 적혈구를 응집시킨다는 것은 잘 알려져 있다. 예를들어, 풍진 비루스는 생후 1일된 병아리와 거위의 적혈구를 응집시키고, 인플루엔자 비루스는 닭(생후 1일된 것과 성숙한 것)의 적혈구를 응집시키고, 파라인플루엔자 비루스는 기니아 피그와 닭의 적혈구를 응집시키고, 마진 비루는 원숭이의 적혈구를 응집시킨다. 따라서 상기 특성을 이용하여 비루스를 동정(同定)하고 정량할 수 있다.
본 반응은 상기 비루스의 적혈구 응집 반응에 근거를 둔 적혈구 응집 반응(HA 반응)과 적혈구 응집 억제반응(HI반응)에 이용되는 고정적혈구의 보존액에 관한 것이다. HA 및 HI 반응은 통상적으로 임상 검사분야에서 비루스 감염의 유무를 진단하는데 이용되어 왔다.
각종 비루스의 상기한 특이 항원성을 이용하여 비루스를 동정하고 그 역가를 측정하는 것에 HA반응을 이용하고 HA항원의 항체, 즉 비루스의 감염에 대한 면역 반응의 결과로서 생체가 보유하게된 HI항체를 결정하는 것에 HI반응을 이용하는데, 두 반응 공히 반응 시약으로서 적혈구를 필요로 한다. 명확하고 정확한 응집반응 및 응집 억제반응을 일으키기 위해 신선한 적혈구를 사용하는 것이 바람직하지만, 각 시험마다 신선한 적혈구를 얻는 것이 쉽지 않기 때문에 이것은 실질적으로 불가능하다. 따라서 장기간 보존후에도 적혈구의 피응집 능력이 저하되지 않도록 하기 위한 보존방법이 연구되어 왔다. 예를들어, 포르말린등에 의한 고정화, 고정적혈구의 동결 보존 또는 동결건조등을 예시할 수 있다. 동결건조에서, 동결건조시키기 전에 적혈구로부터 염을 제거시키시 위한 세정처리(일본국, 특허 50-37724호), 글루코오스 또는 혈정 알부민의 첨가처러(일본국, 특허출원 공개 54-23119호)등을 실시하여 적혈구를 더욱 안정화시키고자 하는 시도가 이루어져왔다. 그러나 동결건조처리를 하지 않은 용액중의 고정 적혈구를 장기 보존하는 방법은 아직 개발되지 않았다.
적혈구의 피응집 능력을 저하시키지 않고 적혈구를 장기간 안정하게 보존하는 보존액을 개발하는데 있어서, 발명자들은 우선 풍진 비루스의 특이적 적혈구 응집을 방해하여 결과를 부정확하게 만드는 비특이적 응집 억제의 원인을 해명하고자 하였다. 그 결과로서, 비특이적 응집 억제는 적혈구의 보존액으로 통상 사용되는 인산 완충용액 또는 생리식염수에 원인이 있음을 밝혀냈다. 즉, 이들 용액이 고정 적혈구로부터 β-지방단백질의 삼출을 유발하여 적혈구 응집 반응을 비특이적으로 억제하는 것이다. 따라서 고정 적혈구가 β-지방단백질을 함유하고 있는 경우, 풍진 HI항체가 검사에서 음성표본(항체가 ; 8배 미달)이 양성으로 오판될 수 있으므로 검사판정이 불가능해진다.
일반적으로 알데히드로 고정화한 적혈구는 장기간 보존할 수 있다. 그러나 이들은 진탕, 혼합등의 기계적 충격에 의해 파괴되고, 그러면 β-지방단백질이 적혈구 현탁액으로 삼출되어 나온다. 과량의 β-지방단백질이 삼출되어 나오는 이유는, 여러 염을 함유하는 생리 식염수등의 통상의 수용액에 보존되어 있는 고정 적혈구가 염의 영향하에서 상호간에 강하게 접착됨으로써, 사용시 효과적으로 분산시키기 위하여 장시간 보다 많은 기계적 자극을 주게되기 때문이다.
본 발명의 비루스성 적혈구 응집 시험용조류의 고정적혈구용 보존액은 증류수 또는 이온 교환수등의 정제수를 함유한다. 필요에 따라서, 혈청 알부민, 글리세롤 또는 디메틸설폭시드등을 가할 수 있다. 덧붙여, 필요에 따라 세균증식방지제(예, 소듐아지드, 티메로살등)를 가할 수 있다.
본 발명의 보존액에 조류의 고정 적혈구를 보존하면, 적혈구는 잘 분산되며 장기간의 저온 보존후에도 안정하며, 고정 적혈구의 상호 접착이 방해되고 β-지방단백질의 삼출이 억제된다. 따라서 응집 형태가 정확하고 명확하기 때문에 응집 판단이 용이하다. 비특이적 응집 억제가 제한되기 때문에, 정확한 HA역가 및 HI역가를 수득하게 된다. 이 적혈구 현탁액은 풍진 비루스, 일본 뇌염 비루스, 유행성 이하선염 비루스등의 HA반응 및 HI반응에서 명확한 응집형태를 나타내며, 장기간 보존후에도 그 효과가 변하지 않는다.
본 발명의 용액에 보존할 수 있는 적혈구는 거위, 닭 등의 적혈구이고, 특히 거위 적혈구에 대한 효과는 뛰어나다. 고정화는 포름알데히드, 글루타르알데히드등의 공지의 고정액을 이용하여 통상의 방법에 따라 실시한다. 예를들어, 적혈구는 0.1~0.3(V/V)의 글루타르알데히드용액을 이용하여 1~2시간내에 고정시킬 수 있다.
본 발명의 보존액은 증류수 또는 이온 교환수 등의 정제수를 함유한다. 필요에 따라서, 혈청 알부민, 글리세롤 또는 디메틸설폭시드를 가할 수 있다. 혈청 알부민은 그 농도가 약 0.01~약 1.0%(W/V)에 이르도록, 바람직하게는 약 0.05~약 0.25(W/V)가 되도록 가한다. 인체, 소, 말, 토끼등의 혈청 알부민을 사용할 수 있으며 소 혈청 알부민이 보다 바람직하다. 글리세롤 또는 디메틸 설폭시드는 농도가 약 5~약10%(V/V)에 이르도록 가한다.
나아가, 필요에 따라 세균 증식 방지제(예, 소듐아지드, 티메로살 등)를 가할 수 있고, 그 농도는 통상방부를 목적으로 하여 제조한 것만큼 진해야 하는데, 예를들어 약 0.01~약 0.2%(W/V)이다. 특히 소듐 아지드의 사용은 높은 안정성을 부여한다.
비루스, 특히 풍전 비루스, 일본뇌염 비루스, 유행성 이하선염 비루스, 인플루엔자 비루스등에 대한 HA시험 및, 혈청내의 HI항체 정량을 위한 HI시험은 본 발명의 보존액에 현탁시킨 상기 조류 적혈구를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 보존액에 현탁시킨 조류 고정 적혈구의 농도는, 상기 저온 보존후에도 적혈구가 잘 분산되고 안정할 수 있는 소정농도이어야 하고, 바람직하게는 약 8~약 12%(V/V)이다. 이 상태에서 응집 형태가 명확하고 선명하여 응집 반응 판정이 용이하다. 비특이적 응집반응 억제가 제한되기 때문에 정확한 HA 역가와 HI반응에서 선명한 응집형태를 나타내며, 장기 보존후에도 그 효과가 변하지 않는다.
[실시예]
본 발명은 하기 실시예에 의해 설명되지만 거기에 국한 되는 것은 아니다.
[실시예 1]
정제수에 거위의 고정 적혈구 100ml를 분산시켜 10%적혈구 현탁액을 제조한다.
[실시예 2]
1g의 소혈청 알부민과 1g의 소듐 아지드를 교반하며 정제수(총부피 1000ml)에 용해시켜 고정 적혈구의 보존액으로 사용한다.
[실시예 3~10]
실시예 2와 동일한 방법으로 하기 성분과 정제수(총부피 1000ml)를 혼합하여 보존액을 제조한다.
[표 1]
(1) 하기의 방법에 따라 제조한 고정 적혈구를 실시예 1의 정제수 및 실시예 2~4의 보존액에 현탁시켜 10%현탁액을 제조하고, 이를 때때로 교반하여 냉장보존한다. 35, 39 및 64일후에 정량한 β-지방단백질의 삼출량을 제1도에 나타내었다. 이들 보존액에서 β-지방단백질의 삼출은 발견되지 않았다.
실험방법
a. 거위의 고정 적혈구의 제조
시판되는 거위 적혈구를 생리 식염수로 세번, 하기 조성물을 함유하는 인산 완충용액-식염수(PBS)로 한번씩 세척한후, 동일 PBS에 현탁시켜 5%(V/V)현탁액을 제조한다. 이 적혈구 현탁액에 적혈구 9부피부당 1부피부의 PBS를 가하여 희석하고, 1.5%글루타르알데히드 용액을 가하고, 혼합물을 교반기로 교반하며 60분간 실온에서 반응시킨다. 생성된 고정 적혈구를 정제수로 6번 세척하고 보존액에 현탁시킨다.
PBS: 염화칼륨 0.2g
인산수소나트륨 1.15g 염화나트륨 8.0g
인산이수소칼륨 0.2g 정제수를 가하여 1000ml가 되도록 한다.
b. 지방 단백질의 정량법
지방단백질은 풍진 HA항원의 적혈구 응집반응을 억제하는 그 능력을 통하여 정량할 수 있다. 즉, 고정적혈구를 잘 분산시킨 보존액 0.5ml를 시험관에 접종하고 원심분리한후, 생성된 상층액을 이용하여 풍진 HI시험을 실시한다. β-지방단백질의 검출감도를 증가시키기 위하여, 2단위의 풍진 HA항원을 사용한다. 풍진 비루스의 적혈구 응집 반응을 억제할 수 있는 최대 희석 배수를 β-지방단백질의 값으로 정의한다. β-지방단백질을 삼출하는 적혈구를 이용하여 내쇼날 인스터튜트 오브 헬스(National Institute of Health, Tokyo)의 마이크로 플레이트법에 따라 풍진 HI시험[희석액으로는 BSA 겔라틴, Mg2+및 Ca2+를 함유하는 VBS(베로날 완충용액)을 사용하고, 거위 또는 생후 1일된 병아리의 적혈구를 이용한다. 일반적인 방법은 문헌(Stewartet et al. N.Engl.J.Med.276,554(1967). Halonen et al.Proc. Soc.Exp .Biol.Med.125.167(1967)에 기재되어 있다]을 실시했을때, 그 값이 본 발명에 의한 값의 8배 이상이면, 음성 혈청을 양성으로 판정하다.
(2) (1)의 거위의 고정 적혈구를 실시예 2의 보존액, PBS 및 생리 식염수에 현탁시켜 10% 현탁액을 제조한다. 이들 현탁액과 실시예 1의 현탁액을 4~10℃에서 보관하며 하루에 한번씩 혼합해 주고, 8일 및 28일후에 β-지방단백질의 삼출가를 결정한다. 결과를 표2에 나타내었다. 실시예 2의 보존액에서는 β-지방단백질의 삼출이 검출되지 않았다.
(3) 실시예 2의 보존액에 현탁시킨 거위 고정 적혈구와 NIH(도오쿄오)에 의한 마이크로플레이트법에 따른 DGV(덱스트로오스 겔라틴 베로날)완충용액에 현탁시킨 신선한 적혈구를 이용하여 48명의 임상 환자의 혈청표본에 대한 풍진 HA(항원역가)시험 및 HI(항체역가)시험을 실시한다. 제2도 및 3도에 나타낸대로, 본 발명의 보존액에 현탁시킨 기위 고정 적혈구를 사용한 경우와 신선한 적혈구를 사용한 경우의 결과는 동일하다.
[표 2]
[표 3]
Claims (7)
- 정제수를 함유하는 비루스성 적혈구 응집반응 시험용 조류(鳥類)고정 적혈구의 보존액.
- 제1항에 있어서, 약 0.01~약 1.0%(W/V)의 혈청 알부민을 함유하는 보존액.
- 제2항에 있어서, 혈청 알부민이 소혈청 알부민인 보존액.
- 제1항에 있어서, 약 5~ 약 10%(V/V)의 글리세롤을 함유하는 보존액.
- 제1항에 있어서, 약 5~ 약 10%(V/V)의 디메틸 설폭시드를 함유하는 보존액.
- 제1, 2, 4 또는 5항에 있어서, 세균 증식 방지제를 함유하는 보존액.
- 제6항에 있어서, 세균 증식 방지제가 소듐 아지드인 보존액.
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