ITMI20081273A1 - Procedimento di immunoematologia eritrocitaria - Google Patents

Description

Descrizione dell’invenzione avente per titolo:

“PROCEDIMENTO DI IMMUNOEMATOLOGIA ERITROCITARIA”

DESCRIZIONE

La presente invenzione concerne un procedimento di immunoematologia eritrocitaria. Più specificamente, la presente invenzione concerne un sistema atto a rilevare la presenza di anticorpi sui globuli rossi.

Le tecniche di ricerca di anticorpi anti-eritrocitari hanno subito nel corso del tempo importanti evoluzioni, allo scopo di sostituire e/o migliorare le tecniche tradizionali in provetta. Una prima tecnica detta “in fase solida” consiste nel fissare in modo stabile eritrociti campione sul fondo di pozzetti con fondo a U, realizzati in materiale plastico. Questi pozzetti sono associati sotto forma di piastre di microtitolazione che ne contengono 96 ovvero sotto forma di strip che ne contengono 8 o 12.

Secondo la tecnica proposta dalla società Immucor, si ricercano nel siero/plasma di un paziente gli anticorpi che possono essere indirizzati specificamente contro determinati antigeni presenti sui reattivi ematici immobilizzati, ossia fissati sulla materia plastica costituente il fondo del pozzetto. Questa ricerca si sviluppa attraverso una prima tappa di incubazione del siero/plasma in esame nel pozzetto così preparato, seguita da una operazione di lavaggio, in generale ripetuta 5 volte, che consente di eliminare gli anticorpi non legati, e infine dall’aggiunta di una sospensione di un indicatore costituito da eritrociti rivestiti con anticorpi anti-IgG umane. Grazie ad una centrifugazione, l’indicatore viene a contatto con il fondo del pozzetto: se gli eritrociti campione immobilizzati su detto fondo trattengono eventuali anticorpi presenti nel siero/plasma, ciò provoca l’adesione dell’indicatore e si traduce in una immagine omogenea sul fondo del pozzetto. Questa immagine è interpretata come una reazione positiva. Se, viceversa, non si è legato alcun anticorpo, l’indicatore non aderisce agli eritrociti immobilizzati sul fondo del pozzetto e si raggruppa al centro determinando l’immagine di un sedimento localizzato. Questa immagine è interpretata come una reazione negativa.

Nella tecnica Immucor, le piastre di microtitolazione vengono consegnate con uno strato di stromi di emazie campione già attaccato al fondo del pozzetto. Oppure il pozzetto contiene solo le sostanze di adesione e l’utente prepara lo strato di eritrociti campione.

Secondo una variante di questa tecnica in fase solida, proposta dalla società Biotest, il fondo del pozzetto è ricoperto di proteina A di stafilococco e le piastre di microtitolazione o le strip sono consegnate allo stato secco. In questo caso Γ utilizzatore deve incubare nel pozzetto la miscela costituita dal siero/plasma del paziente e da eritrociti campione consegnati in sospensione. Dopo l'incubazione, P utilizzatore deve lavare in situ gli eritrociti per eliminare gli anticorpi liberi contenuti nella miscela. In seguito si aggiunge un reagente antiglobuline liquido e si ottiene per centrifugazione la reazione degli eritrociti, degli anticorpi e delle antiglobuline con il fondo del pozzetto ricoperto da proteina A sulla quale si sono attaccate durante l'effettuazione della procedura anche immunoglobuline aspecifiche ed anche gli stessi anticorpi antiglobuline umane.

La tecnica Immucor evidenzia solo anticorpi di classe IgG, mentre la tecnica Biotest consente, in linea di principio, di mettere in evidenza tutte le classi di immunoglobuline.

Una seconda tecnica è nota come CAT, sigla che sta per “test di agglutinazione su colonna”, che viene proposta dalle società Diamed e Ortho. Queste tecniche su colonne, utilizzano microprovette unite sotto forma di schede o cassette comprendenti in generale 6 colonne, ciascuna costituita da una provetta contenente un gel di Sephadex<®>o simili ovvero microsfere di vetro in sospensione in un diluente specifico. La parte alta della colonna è svasata a formare una camera di incubazione atta a ricevere il siero/plasma e gli eritrociti per la ricerca degli anticorpi. Il gel o il diluente contengono siero di Coombs, a base di antiglobuline umane, o un diluente neutro nel caso di tecniche utilizzanti enzimi proteolitici. Per i gruppi sanguigni, il gel o il diluente specifico contengono antisieri specifici e il principio di funzionamento è analogo a quello della ricerca di anticorpi.

Sul piano generale, questa seconda tecnica CAT si dimostra più sensibile delle tecniche tradizionali in provetta e più comoda delle tecniche in fase solida: evita all’utilizzatore le fasi di lavaggio necessarie ad eliminare gli anticorpi non fissati. In effetti il gel o il diluente, nel caso delle microsfere di vetro, svolgono un ruolo di gradiente di densità, lasciando passare gli eritrociti e non le proteine libere. Il gel o le microsfere hanno la capacità di trattenere gli agglutinati in cima alla colonna e di lasciarsi attraversare, sotto P influenza della forza centrifuga, dagli eritrociti non agglutinati. Gli agglutinati si creano a livello della camera di incubazione o al contatto dei reattivi contenuti nel gel o nel diluente.

Contrariamente alla tecnica in fase solida, i reattivi contenuti nelle colonne sono allo stato liquido. Una linguetta metallica plastificata è saldata sulla parte superiore della schedina per garantire la tenuta stagna. La tecnica CAT soffre, però, di alcuni inconvenienti. Infatti le colonne di gel o di microsfere possono facilmente danneggiarsi durante il trasporto, essendo particolarmente sensibili agli urti. Inoltre si osservano spesso dei fenomeni di condensazione a livello della linguetta metallica, tali da modificare la concentrazione dei prodotti contenuti nella colonna e in conseguenza alterarne le caratteristiche reattive.

Lo scopo della presente invenzione consiste nel proporre un sistema del tipo anzidetto, il quale sia in grado di superare gli inconvenienti sopra citati relativi alle due metodologie attualmente più diffuse. Questo ed altri scopi sono raggiunti con il procedimento della rivendicazione 1. Dei modi preferibili di realizzare l'invenzione risultano dalle restanti rivendicazioni.

Rispeto alle note metodologie del settore, quella secondo l'invenzione offre il vantaggio di una combinazione ottimale di caratteristiche già presenti sul mercato consentendo una sinergia dei loro aspetti più vantaggiosi.

Una caratteristica essenziale del procedimento dell’invenzione è rappresentata dal fato che non è necessario alcun lavaggio per rimuovere gli anticorpi non legati. In questo modo si riducono i tempi della metodica e si raggiunge una maggiore sensibilità, stabilità e riproducibilità. I lavaggi possono infati sfociare in un distacco degli eritrociti fìssati (metodica in fase solida Immucor) dando quindi luogo a reazioni falsamente positive per adsorbimento dell’indicatore o a reazioni dall’aspetto dubbio, oppure nel distacco degli anticorpi adesi ai globuli rossi campione durante l'incubazione, con risultato falsamente negativo.

Nel procedimento dell'invenzione il lavaggio è sostituito dalla centrifugazione su gradiente. Questa fase inoltre ingloba anche la fase di reazione con il siero di Coombs, che è contenuto nello stesso gradiente. Pertanto il tempo che intercorre fra la fase di incubazione, nella quale avviene l'attacco degli anticorpi agli antigeni sui globuli rossi, e lo sviluppo della reazione di agglutinazione che ne permette la visualizzazione, è minimo e non permette il distacco degli anticorpi a causa del rapporto più sfavorevole, rispetto all'incubazione, fra concentrazione di anticorpi e di antigeni.

Il procedimento dell'invenzione risulta altresì più sensibile rispetto al CAT, sia per il rapporto più elevato fra siero/plasma e globuli rossi, sia per le condizioni nelle quali si forma l'adesione fra i globuli rossi mediata dal siero di Coombs: la centrifugazione stratifica i globuli rossi sul fondo del pozzeto durante la reazione con il siero di Coombs all'atraversamento del gradiente, consentendo una otimale adesione intercellulare.

Il gradiente svolge un ruolo essenziale nel procedimento: esso deve possedere i seguenti requisiti: densità sufficiente da separare la miscela di siero/plasma e mezzo potenziante dai globuli rossi (deve essere intermedia fra il mezzo di incubazione ed i globuli rossi, cioè fra 1,03 ed 1,09 di densità relativa); viscosità elevata, in modo da evitare il mescolamento fra sospensione di globuli rossi e gradiente quando la sospensione è stratificata al di sopra del gradiente, ma non così tanto da rendere necessaria una eccessiva forza centrifuga; nessuna tendenza a provocare aggregazione aspecifica dei globuli rossi; osmolarità (in termini di soluti che non passano la membrana eritrocitaria) tale da non provocare emolisi e da non interferire con la reazione di agglutinazione. Il gradiente deve inoltre contenere una quantità sufficiente di siero di Coombs per consentire la reazione di agglutinazione se degli anticorpi si sono attaccati ai globuli rossi durante l'incubazione.

Un altro aspetto essenziale della procedura dell'invenzione è la presenza di una sostanza reattiva sul fondo dei pozzetti nei quali si sviluppa la reazione finale. Questa sostanza deve permettere l'adesione del primo strato dei globuli rossi. Gli altri globuli rossi aderiranno al monostrato sul fondo solo se hanno anticorpi, attaccati durante l'incubazione, con i quali avrà reagito il siero di Coombs. Altrimenti, gli altri globuli rossi saranno spinti dalla forza centrifuga a raggrupparsi in un fondello.

Questi ed altri scopi, vantaggi e caratteristiche risultano dalla descrizione che segue di un modo preferito di realizzare il procedimento dell’invenzione illustrato, a titolo di esempio non limitativo, nelle figure delle allegate tavole di disegni. In queste:

- la figura 1 illustra uno schema delle differenti fasi che contraddistinguono il procedimento e

- le figure 2 e 3 rappresentano il fondo di un pozzetto rivestito, dopo il procedimento dell'invenzione, rispettivamente in caso di reazione positiva e di reazione negativa.

Il procedimento dell'invenzione è adatto per effettuare il rilevamento di anticorpi/antigeni eritrocitari per aderenza di globuli rossi sensibilizzati su pozzetti rivestiti con una sostanza reattiva, in cui i globuli rossi cui abbiano aderito anticorpi in vivo (test diretto) oppure in vitro (test indiretto) sono fatti passare attraverso un gradiente dispensato direttamente nei citati pozzetti e raggiungono il fondo di questi ultimi per centrifugazione. La detta sostanza reattiva permette di formare un monostrato di globuli rossi e successivamente l'adesione degli altri globuli rossi che hanno eventualmente reagito con il detto gradiente. La dispensazione del sistema gradiente è effettuata direttamente al di sopra dei pozzetti rivestiti con la citata sostanza reattiva.

Il procedimento dell'invenzione si presta ad essere applicato a vasti campi deU’immunoematologia: dalla ricerca di anticorpi irregolari nel siero/plasma e sui globuli rossi, alla identificazione degli anticorpi irregolari, alla determinazione degli antigeni eritrocitari. Per esempio, nel caso della ricerca degli anticorpi irregolari (comunemente nota come test di Coombs indiretto), tali agglutinati, analogamente alle tecniche sopra esposte, si ottengono mettendo a contatto il siero/plasma in esame con delle emazie rivestite di antigeni noti (pannelli a 1, 2, 3, 4 o più cellule), in una soluzione fisiologica opportunamente modificata, allo scopo di ottenere emazie sensibilizzate (in caso di presenza di anticorpi nel siero/plasma). Tale miscela è incubata a 37° C per 20-30 minuti. Questa reazione è tipicamente allestita in uno o più pozzetti ricavati su materiale plastico in strip da 8 o 12 o ancora in piastra da 96. In alternativa, con il metodo diretto, le emazie in esame risultano già sensibilizzate in vivo (in caso di campione positivo), pertanto non è necessaria la fase di incubazione.

Affinché le emazie sensibilizzate possano tra di loro agglutinarsi, è necessario aggiungere il reattivo all’antiglobulina umana (siero di Coombs). La miscela pre-incubata viene direttamente, senza lavaggi, depositata al di sopra di uno strato di materiale viscoso, denso e reattivo, la cui composizione è peculiare ai fini della formazione e rilevazione degli agglutinati. La dispensazione della miscela pre-incubata avviene in condizioni controllate di velocità e forza in modo da evitare il mescolamento di parte della miscela stessa con il gradiente prima delle fasi di centrifugazione. Il gradiente sopra al quale avviene tale dispensazione, può essere composto nel modo seguente: una parte di soluzione glicerolizzante (glicerolo, sodio-lattato, potassìo-cloruro, acqua distillata, a pH 6,8), una parte di siero di Coombs, due parti di albumina al 20 %.

Questa composizione garantisce da una parte la densità che consente di mantenere la miscela incubata al di sopra del gradiente stesso, dall’altra l'agglutinazione delle emazie sensibilizzate mediata dal reattivo airantiglobulina umana che entra in contatto con la miscela di incubazione a seguito di due fasi di centrifugazione.

La dispensazione della miscela di reazione pre-incubata è eseguita in condizioni controllate di velocità e forza, direttamente al di sopra del sistema gradiente.

Una prima centrifugazione è finalizzata a far penetrare le emazie sensibilizzate presenti nella miscela pre-incubata nel gradiente pre-dispensato e successivamente a formare un primo strato di emazie sul fondo del pozzetto. La seconda centrifugazione è invece finalizzata a formare l’agglutinato di emazie sensibilizzate mediante legami intercellulari dell’ antiglobulina umana presente nel sistema gradiente.

La componente viscosa del gradiente ha lo scopo di impedire il mescolamento della miscela di incubazione con il gradiente quando viene dispensata sopra il gradiente, consentire la separazione delle proteine del siero/plasma in esame dalle emazie e favorire l’interazione per un tempo sufficiente tra le emazie sensibilizzate ed il reattivo all’antiglobulina umana.

Il gradiente viene dispensato in uno o più pozzetti, ricavati su materiale plastico in strip da 8 o 12 o ancora in piastra da 96, rivestiti con proteina A che è in grado di interagire con il frammento Fc di IgG. In caso di reazione positiva si avrà la formazione di agglutinato, che andrà a ricoprire interamente il fondo dei pozzetti rivestiti, generando un tappeto di emazie (vedi figura N° 2); in caso di reazione negativa non si avrà la formazione di agglutinato pertanto le emazie, a seguito della centrifugazione, non essendo legate dall’ antiglobulina umana, confluiranno al centro del pozzetto ( vedi figura N° 3).

La rilevazione dell’ agglutinato eritrocitario è eseguita sul fondo sensibile del pozzetto rivestito dalla sostanza reattiva.

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per il rilevamento di anticorpi/antigeni eritrocitari per aderenza di globuli rossi sensibilizzati su pozzetti rivestiti con una sostanza reattiva, in cui i globuli rossi cui abbiano aderito anticorpi in vivo (test diretto) oppure in vitro (test indiretto) sono fatti passare attraverso un gradiente dispensato direttamente nei citati pozzetti e raggiungono il fondo di questi ultimi per centrifugazione, la detta sostanza reattiva permettendo la formazione di un monostrato di globuli rossi e successivamente l'adesione degli altri globuli rossi che hanno eventualmente reagito con il detto gradiente, 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dalla dispensazione del sistema gradiente direttamente al di sopra dei pozzetti rivestiti con la sostanza reattiva. 3. Procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 2 caratterizzato dalla composizione specifica del sistema gradiente atta a garantire effetti di reattività, densità, viscosità e osmolarità: una parte di soluzione glicerolizzante (glicerolo, sodio-lattato, potassio-cloruro, acqua distillata, a pH 6,8), una parte di siero di Coombs, due parti di albumina al 20%. 4. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 e 3 che prevede, in condizioni controllate di velocità e forza, la dispensazione della miscela di reazione pre-incubata direttamente al di sopra del sistema gradiente. 5. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 ,3 e 4 che prevede 2 fasi di centrifugazione. 6. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 e 5 che prevede una prima centrifugazione finalizzata a far penetrare le emazie sensibilizzate presenti nella miscela pre-incubata nel gradiente pre-dispensato e successivamente a formare un primo strato di emazie sul fondo del pozzetto. 7. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2, 3, 5 e 6 caratterizzato da una seconda centrifugazione finalizzata a formare l’agglutinato di emazie sensibilizzate mediante legami intercellulari dell’antiglobulina umana presente nel sistema gradiente. 8. Procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 7 caratterizzato dalla rilevazione dell’ agglutinato eritrocitario sul fondo sensibile del pozzetto rivestito dalla sostanza reattiva.