JP2012145516A - 測定装置およびセンサチップ - Google Patents

Abstract

【課題】エバネッセント光を利用した測定装置において、迷光が光検出器に検出されることにより測定のための検出信号のＳ／Ｎが低下することや、迷光吸収による発熱のために測定の信頼性が損なわれることを防止する。
【解決手段】試料液を保持する反応槽１１および、この反応槽１１のセンサ部１４となる底面１２ｂを構成する導光性基板１２を有するセンサ１０と、導光性基板１２を通して底面１２ｂに全反射角以上の入射角で測定光Ｌ₀を入射させる光照射手段３０と、測定光Ｌ₀が底面１２ｂに照射されたとき、該底面から滲み出したエバネッセント光と試料液中の物質との相互作用により生じた光Ｌｆを検出する光検出器３１とからなる測定装置において、センサ１０に、上記光Ｌｆの少なくとも一部を光検出器３１側に通過させる開口１６ａを有し、その開口１６ａの周囲部分が光検出器側と導光性基板側とを隔絶する状態にして光拡散部材１６を取り付ける。
【選択図】図１

Description

本発明は、試料液中に含まれる可能性が有る被検出物質について測定を行う装置、特に詳細には、導光性基板から滲み出したエバネッセント光を利用して各種測定を行う装置に関するものである。
また本発明は、そのような測定装置において用いられるセンサチップに関するものである。

バイオ測定においては、抗原抗体反応などの生体分子反応を検出することにより、被検出物質である抗原（あるいは抗体）などの存在の有無、量を測定している。

例えば、互いに特異的に結合する２つの物質の一方（抗原、抗体、各種酵素、受容体など）を基板上に固定化し、他方の物質（これは被検出物質そのものであってもよいし、あるいは試料中で被検出物質と競合する競合物質であってもよい）を基板上に固定された固定層に結合させ、この結合反応を検出することにより、試料中における被検出物質の有無、量を測定することができる。具体的には、試料に含まれる被検出物質である抗原を検出するため、基板上にその抗原と特異的に結合する抗体を固定しておき、基板上に試料を供給することにより抗体に抗原を特異的に結合させ、次いで、抗原と特異的に結合する、標識が付与された標識抗体を添加し、抗原と結合させることにより、抗体―抗原―標識抗体の、所謂サンドイッチを形成し、標識からの信号を検出するサンドイッチ法や、標識された競合抗原を被検出物質である抗原と競合的に固定化抗体と結合させ、固定化抗体と結合した競合抗原に付与されている標識からの信号を検出する競合法などのイムノアッセイが知られている。

なお上記サンドイッチ法においては、被検出物質である抗原が上記「他方の物質」に相当し、競合法においては競合抗原が上記「他方の物質」に相当する。後者の競合法においては、固定化抗体と結合した競合抗原の量が多いほど、被検出物質である抗原の量が少ないという関係があるので、この関係に基づいて、競合抗原の量に対応する標識からの信号レベルにより抗原の量を求めることができる。

また、上述のようなバイオ測定に適用可能で、高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質が蛍光体ではない場合、蛍光色素で標識されて被検出物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち被検出物質の存在を確認することも広くなされている。

以上述べたようなバイオ測定に用いられる測定装置として、従来、例えば特許文献１に示されるように、
試料液を保持する反応槽および、この反応槽のセンサ部となる底面を構成する導光性基板を有するセンサと、
前記導光性基板を通して前記底面に全反射角以上の入射角で測定光を入射させる光照射手段と、
前記測定光が前記底面に照射されたとき、該底面から滲み出したエバネッセント光と試料液中の物質との相互作用により生じた蛍光等の光を検出する光検出器とからなる測定装置が知られている。

また特許文献２には、凹部形状の流路を有するプレート基板と、この基板に接合される蓋体とから構成された検査用プレートを用い、上記流路に供給された試料液等の検体に励起光を照射し、そのとき発せられた蛍光を検出して検体に含まれるＤＮＡの種類を判別する測定装置が示されている。

さらに、このような蛍光検出法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献３などに提案されている。この方法は、透明な支持体上の所定領域に金属層を設けたセンサチップを用い、支持体と金属膜との界面に対して支持体の金属層形成面と反対の面側から、全反射角以上の入射角で励起光を入射させ、この励起光の照射により金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって蛍光を増強させることにより、Ｓ／Ｎを向上させるものである。

特開２００８−０６４５７４号公報 特開２００６−０７８４１４号公報 特開平１０−３０７１４１号公報

ところで、特許文献１に示された装置においては、導光性基板を導波する励起光が全反射を繰り返す間に基板外に洩れ出して迷光となり、それが反応槽内に存在する蛍光分子を励起して、検出信号のＳ／Ｎ低下などの問題を招くことがある。また特許文献２に示された装置においては、センサチップを構成する基板の材料である樹脂から自家蛍光が発生し、それが蛍光測定用の検出器に検出されて検査の精度が損なわれることがある。

そのような問題を解決するために特許文献１や２には、迷光を吸収する光吸収材（遮光部材）をセンサに設け、光検出器に向かう迷光をそこで吸収して、迷光が光検出器に到達するのを防止することが記載されている。

しかし上述のような光吸収材は、迷光を吸収してそのエネルギーの多くを熱に変換して発熱し、その熱は測定対象の試料液の温度を変動させたり、あるいはセンサを構成する基板に温度勾配を生じさせたりする。こうして試料液の温度が変動すると、測定時になされる反応例えば抗原抗体反応等の程度が変動し、測定の定量性が損なわれることになる。また、基板に温度勾配が発生すると、その基板中を伝搬する励起光等の測定光が屈折し、そのために測定結果が変動することもある。

そこで本発明は、迷光が光検出器に検出されることにより、測定のための検出信号のＳ／Ｎが低下する等の問題が生じることを防止可能で、さらに、迷光吸収による発熱のために測定の信頼性が損なわれることも防止できる測定装置を提供することを目的とする。
また本発明は、そのような測定装置を実現するセンサチップを提供することを目的とする。

本発明による測定装置は、先に述べたように、
試料液を保持する反応槽および、この反応槽のセンサ部となる底面を構成する導光性基板を有するセンサと、
前記導光性基板を通して前記底面に全反射角以上の入射角で、励起光などの測定光を入射させる光照射手段と、
測定光が前記底面に照射されたとき、該底面から滲み出したエバネッセント光と試料液中の物質との相互作用により生じた光を検出する光検出器とからなる測定装置において、
センサに、前記相互作用により生じた光の少なくとも一部を光検出器側に通過させる開口を有し、その開口の周囲部分が光検出器側と導光性基板側とを隔絶して、そこに入射した光を拡散させる光拡散部材が取り付けられていることを特徴とするものである。なお上記の「隔絶」とは、光拡散部材の開口周囲部分が存在することにより、該部分によって光検出器側と導光性基板側とが仕切られていることを意味するものである。

なお本発明の測定装置においては、上記センサに反応槽を閉じる蓋体が設けられ、この蓋体の光検出器側を向く表面に光拡散部材が取り付けられていることが望ましい。

また本発明の測定装置は、励起光などの測定光が、導光性基板において複数回全反射を繰り返す構成となっていることが望ましい。

また本発明の測定装置においては、反応槽の底面に、表面プラズモンを励起させる金属膜が形成されていることが望ましい。

さらに本発明の測定装置においては、反応槽の側壁部分に、光拡散部材あるいは光反射部材が形成されていることが望ましい。そしてそのような光反射部材としては、金属膜からなるものを好適に用いることができる。
一方、本発明によるセンサチップは、
試料液を保持する反応槽および、この反応槽のセンサ部となる底面を構成する導光性基板を有するセンサチップであって、
前記導光性基板を通して前記底面に全反射角以上の入射角で測定光を入射させる光照射手段と、
前記測定光が前記底面に照射されたとき、該底面から滲み出したエバネッセント光と試料液中の物質との相互作用により生じた光を検出する光検出器とを有する測定装置において用いられるセンサチップにおいて、
前記相互作用により生じた光の少なくとも一部を光検出器側に通過させる開口を有し、その開口の周囲部分が光検出器側と前記導光性基板側とを隔絶して、そこに入射した光を拡散させる光拡散部材が取り付けられていることを特徴とするものである。なお上記の「隔絶」とは、光拡散部材の開口周囲部分が存在することにより、該部分によって光検出器側と導光性基板側とが仕切られていることを意味するものである。

本発明による測定装置は、センサに、検出対象の光（つまりエバネッセント光と試料液中の物質との相互作用により生じた光）の少なくとも一部を光検出器側に通過させる開口を有し、その開口の周囲部分が光検出器側と導光性基板側とを隔絶して、そこに入射した光を拡散させる光拡散部材が取り付けられていることにより、導光性基板において生じた迷光の多くはこの光拡散部材で拡散し、光検出器に到達することがなくなる。そこで、この迷光が光検出器に検出されることにより、測定のための検出信号のＳ／Ｎが低下する等の問題が生じることを防止できる。

また上述の光拡散部材は、光吸収部材とは異なって、迷光を吸収して顕著に発熱することがないので、その熱のために測定の信頼性が損なわれることも防止できる。

なお本発明の測定装置において特に、センサに反応槽を閉じる蓋体が設けられ、この蓋体の光検出器側を向く表面に光拡散部材が取り付けられる場合は、光拡散部材を配設する構造が簡素化される。さらにその光拡散部材が、蓋体の表面に凹凸を形成して構成される場合は、光拡散部材の作製そのものも簡単になる。

また本発明の測定装置が特に、励起光などの測定光が、導光性基板において複数回全反射を繰り返す構成となっている場合は、上記検出信号のＳ／Ｎが低下する等の問題を防止する効果が特に顕著なものとなる。すなわち、そのように測定光が複数回全反射を繰り返す場合は、導光性基板とその外側の媒質との界面で測定光が散乱したり、その界面から洩れ出したりする機会が多く、本来迷光が多く発生しやすくなっているので、上記問題を防止する効果が特に顕著になる。

また本発明の測定装置において特に、反応槽の底面に、表面プラズモンを励起させる金属膜が形成されている場合は、導光性基板において発生した迷光がこの金属膜で反射、吸収されるので、迷光が光検出器に到達する可能性がより低くなる。なお、このように迷光が金属膜に吸収される場合でも、その吸収による温度上昇は、特許文献１や２に示された構成と比べればより低く抑えられる。その点に関しては、以下に述べる反応槽側壁部分に金属膜が形成された場合とともに、後に実施形態に即して詳しく説明する。

さらに本発明の測定装置において特に、反応槽の側壁部分に、光拡散部材あるいは光反射部材が形成されている場合は、導光性基板において発生した迷光がこの側壁部分で拡散あるいは反射されるようになるので、迷光が光検出器に到達する可能性がより低くなる。
一方、本発明によるセンサチップは、前述の相互作用により生じた光の少なくとも一部を光検出器側に通過させる開口を有し、その開口の周囲部分が光検出器側と前記導光性基板側とを隔絶する状態とされた光拡散部材が取り付けられたものであるので、上述した本発明による測定装置を実現できるものとなる。

本発明の第１の実施形態による測定装置を示す概略側面図 上記測定装置に用いられるセンサチップの要部を示す概略図 図１の測定装置における散乱光発生の様子を説明する図 本発明の第２の実施形態による測定装置を示す概略側面図 図４の測定装置における問題を説明する概略図 本発明の第３の実施形態による測定装置を示す概略側面図 本発明の第４の実施形態による測定装置を示す概略側面図 光拡散部材における光拡散の好ましい態様を説明する図 光拡散部材の他の態様を説明する概略図

以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。図１は、本発明の第１の実施形態による測定装置１００の概略構成を示すものである。本実施形態の測定装置は、センサチップ（以下、単にセンサチップという）１０を用いて生体由来物質を検出する装置として構成されたものである。

まず図２も参照して、このセンサチップ１０について説明する。図１および図２に示される通りセンサチップ１０は、試料液が保持される反応槽１１が上部に形成された基板（プリズム）１２と、この基板１２において反応槽１１の底部を構成して、互いに特異的に結合する２つの物質のうちの一方の物質１３を壁面に固定しているセンサ部１４と、基板１２の表面１２ａ上に固着された上蓋１５と、この上蓋１５の表面の一部に取り付けられた光拡散部材１６とを備えてなるものである。なお、反応槽１１は微小流路とされて、そこを試料液が流される構成を採用してもよい
なお本実施形態では、抗原抗体反応においてサンドイッチ法によるアッセイを行う場合を例とし、そこで上記物質１３が、被検出物質である抗原Ａと特異的に結合する抗体であるとして説明する。その場合、抗体１３は反応槽１１の底面となる基板１２の一面１２ｂに直接固定されてもよいが、後述するように表面プラズモンによる電場増強により蛍光を増強する場合は、上記一面１２ｂの上に金属膜Ｍが形成され、その上に抗体１３が固定される。

上記基板１２および上蓋１５は例えばポリスチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：Polydimethylsiloxane）、ガラス等の透明な誘電体材料からなり、射出成型等によってそれぞれ成型されている。そしてそれら両者は、例えば超音波溶接により接合されている。

また本例のセンサチップ１０においては、図２に示すように、反応槽１１の内面に標識抗体２０が付着されている。標識抗体２０は、被検出物質に対して、前述の抗体１３とは異なるエピトープに特異的に結合する抗体２３と蛍光標識２２とから構成されたものである。ここでは蛍光標識２２として、多数の蛍光色素分子ｆと該蛍光色素分子ｆを内包する光透過材料２１とからなる蛍光微粒子が用いられている。

上記蛍光微粒子の大きさには特に制限はないが、直径数十ｎｍ〜数百ｎｍ程度が好ましく、ここでは一例として直径１００ｎｍのものが用いられている。光透過材料２１としては、具体的には、ポリスチレンやＳｉＯ₂などが挙げられるが、蛍光色素分子ｆを内包でき、かつ該蛍光色素分子ｆからの蛍光を透過させて外部に放出できるものであれば特に制限されない。本例における標識抗体２０は、蛍光標識２２を、それよりも小さい抗体２３により表面修飾して構成されている。

次に図１に戻って測定装置１００について説明する。この測定装置１００は、反応槽１１の底面つまり、該反応槽１１内の試料液Ｓと基板１２との界面となる基板１２の一面１２ｂに対して、全反射条件となる入射角で励起光Ｌ₀を入射させる半導体レーザ等からなる光源３０と、センサチップ１０のセンサ部１４の近傍部分から後述するようにして発せられる蛍光Ｌｆを検出する光検出器３１と、この光検出器３１とセンサチップ１０との間に介設されたフィルタ３２とを備えている。

上記光源３０としては、例えば波長６３５ｎｍ、出力０．６ｍＷの励起光Ｌ₀を発するものが用いられる。その場合、光検出器３１としては例えば浜松ホトニクス（株）製のＳ２３８６−１８Ｋが用いられる。またフィルタ３２としては、後述する蛍光Ｌｆの波長領域の光を選択的に通過させるものが用いられる。なお、本例のように表面プラズモンによる電場増強を利用する場合、励起光Ｌ₀は表面プラズモンを誘起するように、上記界面に対してｐ偏光で入射させる。

次に、この測定装置１００による被検出物質の検出について説明する。ここでは一例として、血漿である試料液Ｓに含まれる可能性のある抗原Ａを検出する場合について説明する。まず、図１に示すセンサチップ１０の反応槽１１内に、試料液Ｓが導入される。この試料液Ｓには、図２に模式的に示すように、反応槽１１に吸着固定されていた標識抗体２０が混ぜ合わされる。それにより、抗原Ａが標識抗体２０の抗体２３と結合し、さらに抗体２３と結合した抗原Ａが、センサ部１４の抗体１３と結合し、抗原Ａが抗体１３と抗体２３で挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。

このようにしてセンサ部１４に吸着した抗原Ａは、以下の通りにして検出される。光源３０から発せられた励起光Ｌ₀は、試料液Ｓと基板１２との界面（基板１２の一面１２ｂ）に対して、全反射条件となる入射角で入射する。すると、金属膜Ｍ上の試料液Ｓ中にエバネッセント光が滲み出し、このエバネッセント光によって金属膜中に表面プラズモンが励起される。この表面プラズモンにより金属膜表面に電界分布が生じ、電場増強領域が形成される。

このとき、エバネッセント光の滲み出し領域内に蛍光標識２２が存在すると、その蛍光標識２２が励起されて蛍光Ｌｆが発生する。ここで、エバネッセント光の滲み出し領域とほぼ同等の領域に存在する表面プラズモンによる電場増強効果により、蛍光Ｌｆは増強されたものとなる。光検出器３１は、この増強された蛍光Ｌｆをフィルタ３２を通して検出する。以上のようにして蛍光標識２２の存在を検出することは、すなわち、抗体１３と結合した抗原Ａの存在を検出することになる。こうして、光検出器３１の蛍光検出信号に基づいて、抗原Ａの存在の有無や、その量を検出可能となる。

なお反応槽１１中には、固定されている抗体１３と結合していない抗原Ａや標識抗体２０が浮遊しており、またセンサ部１４には標識抗体２０が非特異吸着している。これらを除去するため、蛍光Ｌｆの検出前に、適宜洗浄液を反応槽１１に導入するようにしてもよい。

また、例えば励起光Ｌ₀として中心波長が６３５ｎｍのレーザ光を用い、金属膜Ｍとして金（Ａｕ）膜を用いる場合、その厚みは５０ｎｍ±２０ｎｍが好適である。さらに好ましくは、４７ｎｍ±１０ｎｍである。なお、金属膜Ｍは、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。

次に、センサチップ１０に形成された光拡散部材１６について詳しく説明する。測定光としての励起光Ｌ₀は、誘電体材料からなる基板１２内に導入されると、いろいろな部分で散乱することがある。図３は、そのような散乱光が発生する部分を示すものであり、図中Ａ〜Ｄの円を付した部分が主な発生部分である。すなわち励起光Ｌ₀は、基板１２の入射端面（Ａ）や出射端面（Ｄ）で散乱し、また基板１２内に異物や成型歪み等の不均質な部分３５が存在するとその部分（Ｂ）でも散乱し、さらに、上記入射あるいは出射端面で散乱した光が上蓋１５の方に進行すると、その上蓋１５と基板１２との界面（Ｃ）でも散乱する。なおこの図３では、励起光Ｌ₀以外の直線の矢印が散乱光を示している。

上述のようにして生じた散乱光が迷光となって光検出器３１に入射すると、蛍光Ｌｆの検出信号にノイズを発生させ、それにより蛍光検出の感度低下を招く。光拡散部材１６は、そのような不具合の発生を防止するために設けられたものである。すなわち、この光拡散部材１６は、ほぼ光検出器３１がセンサ部１４を見込む部分に開口１６ａが存在し、その周囲部分が光検出器３１側と光源３０側とを隔絶する状態にして、上蓋１５の表面に形成されている。

このような光拡散部材１６が設けられていると、上述した（Ａ）〜（Ｄ）等の部分で生じた散乱光のうちの一部は光検出器３１に向かうように進むが、それらは散乱によって光強度が低下している。そのような弱い散乱光はフィルタ３２によって十分カットされるので、高強度の散乱光が光検出器３１に入射することがなくなる。そこで、上述のように散乱光が光検出器３１に検出されて、蛍光検出信号にノイズを発生させることがなくなり、ひいては蛍光検出のＳ／Ｎが向上して、蛍光検出の感度低下が防止される。なお、光検出器３１によって検出されるべき蛍光Ｌｆは、上記開口１６ａを通過して光検出器３１に到達する。

上記の効果を奏する光拡散部材１６は光吸収部材と異なって、散乱光のエネルギーを熱に変換することが起こり難い。もし散乱光のエネルギーが多く熱に変換されて、その熱が試料液Ｓに伝わると、前述した抗原抗体反応の程度が熱のために変動し、測定の定量性が損なわれることになる。また、そのような熱は基板１２において温度勾配を発生させて、該基板１２中を伝搬する励起光Ｌ₀を屈折させるので、それに起因して測定結果が変動することもある。本実施形態の測定装置１００では、上述した通り、散乱光のエネルギーを熱に変換し難い光拡散部材１６を適用しているので、熱に起因する上記不具合の発生を防止可能である。

なお、上記の作用を果たす光拡散部材１６としては、表面に多数の微細な凹凸を形成したフィルム状、シート状もしくは板状の樹脂材料を好適に用いることができる。その種の光拡散部材１６は具体的に、ホーニング加工やエンボスロール加工など一般的な凹凸形成技術によって作製可能である。ホーニング加工によれば、凹凸の溝深さが浅いが、密度の高い凹凸を形成できる。一方、エンボスロール加工によれば、溝深さが深い凹凸を形成できる。また凹凸の形状は、センサチップ１０や光検出器３１のサイズ、配置状態に応じて適宜選択するようにしてもよい。

また光拡散部材１６は、上記のように表面加工で形成する他、樹脂材料内に酸化アルミニウム等の金属酸化物、雲母等の鉱物、金粉、銀粉等の金属粉などの光拡散性物質を混合分散させて形成することもできる。さらに、光拡散部材１６は上述のような樹脂材料から形成する他、光拡散ガラスを適用することもできる。そのようにガラスを用いる場合も、先に述べた表面加工や、光拡散性物質の混合分散などによって光拡散性を持たせることができる。また、光拡散部材１６は複層構造とされてもよい。

以上説明した実施形態の測定装置１００は、標識抗体２０を構成する蛍光標識２２が励起光Ｌ₀により励起されたときに発する蛍光Ｌｆを検出するものであるが、本発明の測定装置はそのような蛍光標識２２に限らず、その他の標識物質や被検出物質が測定光と相互作用したときに発せられる光を検出するものとして構成することも可能である。そして、そのようにして発せられる光も、特に蛍光に限られるものではないが、本発明の測定装置は、蛍光や散乱光を検出するものとして構成されるのが好ましい。また、上記の蛍光標識２２等を励起するためには、上記実施形態におけるようにエバネッセント光を利用するのが望ましく、さらに望ましくは、これも上記実施形態で採用した表面プラズモンによる電場増強を利用する。

また、光反応系や被検出物質の種類も、本発明における本質的な事項ではなく、公知のあらゆるものが適用可能である。好ましい被検出物質としては例えば、ＤＮＡや抗原、抗体などのバイオ分野で有用な測定対象物質が挙げられる。

次に図４を参照して、本発明の第２の実施形態による測定装置１４０について説明する。なおこの図４において、図１〜３中の要素と同等の要素には同番号を付してあり、それらについての説明は特に必要のない限り省略する（以下、同様）。本実施形態においてセンサチップ４０を構成する基板１２は、導波路構造になっている。つまりこの構造においては、励起光Ｌ₀が基板１２に入射してその一面１２ｂで全反射した後、励起光Ｌ₀は基板１２と上蓋１５との界面および、基板１２の下面と空気との界面で全反射を繰り返すようになっている。

この図４においても、励起光Ｌ₀が散乱し易い部分に円を付して示してあるが、上述のように全反射を繰り返す分、図３に示した構造と比べて散乱光がより発生し易くなっている。またこの場合は、上述のような散乱光の他に、励起光Ｌ₀が基板１２と上蓋１５との界面で全反射したときに上蓋１５側に洩れ出た光が迷光となることもある。

そこで、本実施形態においても前述と同様の光拡散部材１６が設けられており、それにより、上記散乱光が光検出器３１に入射することによるノイズ発生を極めて効果的に防止可能となる。特に、励起光Ｌ₀と測定対象物質との反応が短時間で複数回起きるように、反応槽１１を微小流路（マイクロ流路）とした構成においては、装置サイズの小型化に伴って上記全反射の回数がより多くなり、ひいては散乱光や洩れ光がより多く発生しやすいので、光拡散部材１６によるノイズ防止の効果がより顕著になる。

なおこの図４に示した第２の実施形態においては、前述した表面プラズモンによる電場増強は行なわず、よって図３に示したような金属膜Ｍも形成されていない。そのような構造においては、図５に示すように、反応槽１１の底面を通過した散乱光Ｌｓが光検出器３１に到達しやすくなる。

図６は、上記の不具合を防止できるようにした、本発明の第３の実施形態による測定装置１５０を示すものである。つまりこの測定装置１５０においては、センサチップ５０を構成する基板１２の一面１２ｂ上に、図３の測定装置１００に適用されたものと同様の金属膜Ｍが形成されている。そこで、図５に示したような散乱光Ｌｓはこの金属膜Ｍに吸収されるか、あるいはそこで反射するようになるので、散乱光Ｌｓが光検出器３１に入射してノイズ源となることが効果的に防止される。なお、このような金属膜Ｍによる散乱光Ｌｓの吸収については、後にさらに詳しく説明する。

次に図７を参照して、本発明の第４の実施形態による測定装置１６０について説明する。本実施形態においてセンサチップ６０を構成する基板１２には、前述と同様の光拡散部材１６に加えて、さらに別の光拡散部材６６が設けられている。すなわちこの光拡散部材６６は、反応槽１１の側壁となる部分において基板１２に取り付けられている。したがって本実施形態の測定装置１６０においては、基板１２中で発生して反応槽１１の側壁部分に入射した散乱光は、該側壁部分で拡散するようになる。そこで、散乱光が反応槽１１の側壁部分を通過して光検出器３１に入射してしまうことが防止される。

なお、上述のような光拡散部材６６を設ける代わりに光反射部材を設けて、そこで散乱光を反射させるようにしてもよい。そのような光反射部材としては、特に金属膜からなるものが好適であり、その理由は以下の２点である。
一つの理由は、図７に示すように表面プラズモンによる電場増強作用を得るために金属膜Ｍを形成する場合は、それを形成するプロセスを利用して、同時に反応槽側壁部分に光反射部材を形成することが可能であるという点である。
また別の理由は、実際上適用できる光反射部材は殆どが光吸収作用も有するものであるが、金属膜は迷光吸収による発熱を防止する上でより効果的であるという点である。以下、その点について詳しく説明する。先に説明した特許文献２等に示された光吸収部材はカーボンなどから形成されるものであるが、金属膜の熱拡散率はカーボンのそれに比べて１〜２桁以上大きい。この熱拡散率は部材の熱伝導率、密度、比熱容量から算出することができ、カーボンには物性の異なる種々の材料があるが、それらの熱拡散率はおおよそ１×１０^―７ 〜５×１０^―６ｍ^２／ｓ程度である。それに対して金や銀ではそれぞれ、１．３×１０^―４ ｍ^２／ｓ、１．８×１０^―４ｍ^２／ｓである。以上の値を用いて、０．１ｓ間に熱拡散できる距離を計算すると、カーボンでは０．１〜０．７ｍｍ程度であるのに対し、金、銀ではそれぞれ３．６ｍｍ、４．２ｍｍである。つまり、同じ吸収熱量であっても、金、銀などの金属の方がカーボンよりも速く熱拡散することができ、そのために、局所的な温度上昇を低減することができる。
また、元より金属膜は、一般に用いられる励起光Ｌ₀の波長範囲の光を良好に反射させるので、特許文献１、２に示されるような遮光部と比べて吸収エネルギーそのものをより低減可能であり、よって、この金属膜の迷光吸収による温度上昇はより効果的に防止される。
以上説明したように、金属膜は迷光吸収による発熱をより低く抑えることができるという点は、表面プラズモンを励起させるために形成される金属膜Ｍ（図１、７等参照）に関しても同様に言えることである。

なお、本発明の測定装置が対象とする被検出物質（アナライト）は抗原や抗体の他、遺伝子、細胞などの固層化して観察できる生体由来物質であれば、特に制限がない。遺伝子、細胞を検出する場合は、それらに特異的に吸着する物質を微小流路の内壁に固定しておけばよい。反対に、遺伝子、細胞に特異的に吸着する物質を本発明の測定装置によって検出することも可能であり、その場合は遺伝子、細胞を微小流路の内壁に固定しておけばよい。

また、被検出物質、あるいは試料中で被検出物質と競合する競合物質と特異的に結合する物質は、センサ表面に直接固定されている必要はなく、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）、ＳｉＯ_２等の誘電体膜、カルボキシメチルデキストラン等の高分子膜などを介して固定されていてもよい。

また、被検出物質、あるいはこの被検出物質と試料液中で競合する競合物質と、それと特異的に結合する物質との組合せも、上述した抗原と抗体に限られるものではなく、その他、アビジン・ビオチン反応、酵素・基質反応など、バイオアッセイに使われる反応により結合する物質の組合せが用いられる場合にも、本発明は同様に適用可能である。

さらに、免疫アッセイを適用する場合は、先に説明したサンドイッチアッセイだけではなく、競合法を適用することも可能である。

また標識物質は蛍光分子に限らず、蛍光ビーズ、金属微粒子など光応答性があるその他の物質からなるものも適用可能である。

ここで、本発明に用いられる光拡散部材に関してさらに詳細に説明する。まず、特に好ましい結果が得られる光拡散部材の異方性について、図８を参照して説明する。なおこの図８の例では先に説明した各実施形態とは異なって、光拡散部材１６が上蓋１５の表面ではなく、上蓋１５と基板１２との間に配設されている。

散乱光Ｌｓが光拡散部材１６のＦ点に入射して、図示のように等方的に拡散した場合、その散乱光Ｌｓが反応槽１１側に進行すると、反応槽１１内の物質と光学的に相互作用して誤信号を発生させたり、あるいは熱エネルギーに変換されて発熱して反応系に悪影響を与えたりする問題が発生する。

このことを考慮すると、拡散した散乱光Ｌｓが反応槽１１側には進行しないように、異方性をもって反応槽以外の方向（検出器側も含めて）に拡散させるのがより効果的である。定量的には、光拡散部材１６の拡散点Ｆから反応槽１１を臨む立体角α内に照射される散乱光強度が、拡散点Ｆを囲む全立体角に照射される散乱光強度の１％以下であることが好ましい。さらに好ましくは０．１％以下である。

次に、拡散透過と拡散反射について説明する。図３のＢ部におけるように、異物等によって励起光Ｌ₀が散乱されたとき、多くの場合、等方的ではない散乱角分布を持つ（強い前方散乱、強い後方散乱など）。このため、その散乱光は想定していない、つまり制御されていない方向に伝搬し、等方的に散乱する場合よりも強い光強度になる。本発明では、このような「異方的な角度分布を持つ」散乱光がノイズ要因とならないように、光拡散部材を設けるものである。

光拡散部材で光を拡散させるとき、拡散透過光、拡散反射光、内部反射光などの形で光を拡散させることができる。図３のＣ部に示すように、光拡散部材１６に散乱光が入射するとき、反射光としては鏡面反射光、拡散反射光が発生し、透過光としては正透過光、拡散透過光が発生する。光拡散部材１６は「異方的な角度分布を持つ」散乱光の異方性を解消することが目的なので、反射光に関しては、鏡面反射光が少なく、拡散反射光が多いほど好ましく、透過光に関しては、正透過光が少なく、拡散透過光が多いほど好ましい。

そこで、光拡散反射率、光拡散透過率を下記のように定義すると、それぞれの値が高いほど好ましい。

光拡散反射率（％）＝拡散光線反射率／全光線反射率×１００
光拡散透過率（％）＝拡散光線透過率／全光線透過率×１００
ただし、両者とも高い必要はなく、少なくともどちらか一方が高ければ良好なノイズ抑制効果が得られる。例えば、光拡散透過率がほぼゼロで、光拡散反射率が高い場合や、反対に光拡散反射率がほぼゼロで、光拡散透過率が高い場合であっても本発明の目的が達成できる。光拡散反射率および光拡散透過率の値はそれぞれ７０％以上が好ましく、９０％以上が特に好ましい。

次に、蓋部材の表面に直接光拡散部を設けて、それを光拡散部材とする場合の効果等について説明する。前述した特許文献２に示されるように、迷光遮断のために遮光部材を用いる場合は、それを蓋部材の内側に設けても、蓋部材の表面に設けても、ノイズ低減効果は変わらない。それに対して、本発明で利用される光拡散部材、特にホーニング加工やエンボスロール加工などにより表面に凹凸を形成してなる光拡散部材は、図９（１）に示すように、加工される材料９６の凹凸部に空気層が入ることにより屈折率の微細なムラが形成され、光がそのムラによって散乱されるという拡散の原理を使っている。そのため、空気層と加工される材料との屈折率差が大きいほど、光はその“粗さ”を強く感じるので、強く散乱されるようになる。

他方、図９（２）に示すように、蓋部材９７の内側に対向する基板（流路基材：加工される材料）９６の表面に光拡散部を加工し、それと蓋部材９７とを接着剤９８で接着するのであれば、接着剤９８と加工される材料９６との屈折率差は一般に、空気と加工される材料９６との屈折率差より小さいことから、光を拡散させる効率が落ちる。他方、接着時に空気層を噛むように蓋部材と基板を接着すれば、拡散効率は上がるが、接着力が落ちてしまう。

以上説明の通り、表面凹凸形成による光拡散部材を適用する場合は、蓋部材の表面に光拡散部を加工してそれを光拡散部材とすることにより、良好な光拡散効果が得られ、そして蓋部材と基板（流路基材）との接着力が落ちるといった問題とも無縁になる。また、表面凹凸形成による光拡散部材を適用する場合は、コストを追加して新たに拡散部材を用意することなく、表面を加工するだけでノイズ抑制効果が得られるという利点もある。

１０、４０、５０、６０ センサチップ
１１ 反応槽
１２ 基板
１３ 抗体
１４ センサ部
１５ 上蓋
１６、６６ 光拡散部材
１６ａ 光拡散部材の開口
２０ 標識抗体
２２ 標識
２３ 抗体
３０ 光源
３１ 光検出器
３２ フィルタ
１００、１４０、１５０、１６０ 測定装置
Ａ 抗原
Ｌ₀ 励起光
Ｌｆ 蛍光
Ｓ 試料液

Claims (7)

1. 試料液を保持する反応槽および、この反応槽のセンサ部となる底面を構成する導光性基板を有するセンサと、
   前記導光性基板を通して前記底面に全反射角以上の入射角で測定光を入射させる光照射手段と、
   前記測定光が前記底面に照射されたとき、該底面から滲み出したエバネッセント光と試料液中の物質との相互作用により生じた光を検出する光検出器とからなる測定装置において、
   前記センサに、前記相互作用により生じた光の少なくとも一部を光検出器側に通過させる開口を有し、その開口の周囲部分が光検出器側と前記導光性基板側とを隔絶して、そこに入射した光を拡散させる光拡散部材が取り付けられていることを特徴とする測定装置。
2. 前記センサに、前記反応槽を閉じる蓋体が設けられ、この蓋体の前記光検出器側を向く表面に前記光拡散部材が取り付けられていることを特徴とする請求項１記載の測定装置。
3. 前記測定光が前記導光性基板において複数回全反射を繰り返す構成となっていることを特徴とする請求項１または２記載の測定装置。
4. 前記反応槽の底面に、表面プラズモンを励起させる金属膜が形成されていることを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の測定装置。
5. 前記反応槽の側壁部分に、光拡散部材あるいは光反射部材が形成されていることを特徴とする請求項１から４いずれか１項記載の測定装置。
6. 前記側壁部分に、金属膜からなる光反射部材が形成されていることを特徴とする請求項５載の測定装置。
7. 試料液を保持する反応槽および、この反応槽のセンサ部となる底面を構成する導光性基板を有するセンサチップであって、
   前記導光性基板を通して前記底面に全反射角以上の入射角で測定光を入射させる光照射手段と、
   前記測定光が前記底面に照射されたとき、該底面から滲み出したエバネッセント光と試料液中の物質との相互作用により生じた光を検出する光検出器とを有する測定装置において用いられるセンサチップにおいて、
   前記相互作用により生じた光の少なくとも一部を光検出器側に通過させる開口を有し、その開口の周囲部分が光検出器側と前記導光性基板側とを隔絶して、そこに入射した光を拡散させる光拡散部材が取り付けられていることを特徴とするセンサチップ。

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