CN103071315A - 微型高效沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微型高效沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱制备及应用，本发明所提供的免疫亲和纯化富集柱包括偶联有沙丁胺醇特异性抗体的活化琼脂糖填料和装载该亲和填料的塑料柱。所述的亲和填料偶联的沙丁胺醇特异性抗体是用免疫亲和法提取得到的，所述的免疫亲和纯化富集柱是将免疫亲和填料装载入特制的塑料柱得到的。该免疫亲和纯化富集柱装载填料体积小、富集沙丁胺醇能力强，与色谱法、胶体金试纸条联合使用，可高效、准确检测沙丁胺醇的含量。

Description

微型高效沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱制备及应用

 

技术领域

本发明涉及一种生物分离、纯化富集装置，尤其是一种微型高效沙丁胺醇免疫亲和层析柱的制备方法及其应用。

背景技术

沙丁胺醇（Sal）属于β-兴奋剂，可以提高瘦肉率、促进动物生长。因其经济效益明显，利益驱使养殖户或养殖企业大量使用，导致畜产品中沙丁胺醇大量残留，人食用这类畜产品后，可引发肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心等中毒症状，特别是对血压、心脏病患者危害更大，长期使用可能导致染色体畸变，诱发恶性肿瘤。沙丁胺醇在许多国家，特别是欧盟和中国，被禁止用做家畜促生长剂。所以，对动物来源的食品中沙丁胺醇残留进行严格地检测是非常重要。

    由于生物样本成分复杂，待测物浓度低，大多数取样量少，而我国明确规定禁止沙丁胺醇及其衍生物在动物的饲养过程中使用。这就对分析方法的灵敏度、准确度有更高的要求。采用免疫亲和色谱柱提取样品中沙丁胺醇，再与高效液相色谱法（HPLC-UV）、气-质联机法（GC-UV）、胶体金快速试纸条检测法确证是必然的趋势。但是，现有的提取沙丁胺醇免疫亲和色谱柱的技术与工艺存在活化后填料不稳定、非亲和法提纯的抗体特异性差、抗体和填料偶联不稳定，造成偶联在填料上的抗体脱落、装柱体积偏大（装柱体积1毫升以上），提取沙丁胺醇时造成洗脱体积大、富集效率低，减低了确证的准确度和灵敏度。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效、准确纯化富集沙丁胺醇的免疫亲和纯化富集柱及其制备方法和用途。

发明釆取的技术方案：

为达上述目的，本发明2次采用抗原抗体的特异性反应和可离解的特性Ag + Ab (固相)  ó Ag-Ab （固相）原理，具体如下：

首先利用这一原理将沙丁胺醇乙酰酯偶联到活化琼脂糖（Agarose）上制得Sal - Agarose亲和柱，用于提取沙丁胺醇特异性多克隆抗体。

再利用这一原理将提取所得的抗沙丁胺醇特异性抗体（Anti-Sal）偶联到Agarose上制得Anti-Sal- Agarose免疫亲和纯化富集柱，用于分离纯化、富集待检样品中的沙丁胺醇。

根据上述机理，本发明采用如下技术步骤：

一种沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱的制备，其特征在于：    

1）将经免疫亲和纯化的沙丁胺醇特异性多克隆抗体和过碘酸活化的琼脂糖Agarose混匀，在摇床上室温反应30分钟，然后在4℃冰箱静置30分钟后加入硼氢化钠还原，用蒸馏水清洗未结合的抗体，用磷酸缓冲液（PBS）清洗填料，10倍填料体积/次，洗4次，滴干PBS后加入等体积甘油，混匀，得到沙丁胺醇免疫亲和填料；

2）在特制的塑料柱内下端装上过滤膜，将沙丁胺醇免疫亲和填料装入柱中，25μL/柱，填料上层盖上过滤膜，即得所述的沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱。

所述的沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱，包括偶联有免疫亲和纯化的沙丁胺醇特异性多克隆抗体的琼脂糖填料及装载该填料的特制塑料柱。

所述的免疫亲和纯化的沙丁胺醇特异性多克隆抗体是用沙丁胺醇与溴乙酰氯反应得到衍生物沙丁胺醇溴乙酰酯溶液，用反向高效液相色谱HPLC纯化该溶液，得到纯化后的沙丁胺醇溴乙酰酯，将纯化后的沙丁胺醇溴乙酰酯与载体蛋白偶联，得到该偶联物作为免疫原免疫动物，得到抗血清，同时用该纯化后的沙丁胺醇溴乙酰酯与经活化的琼脂糖珠反应制备纯化抗体用的免疫亲和柱，用该亲和柱一步提取抗血清得到沙丁胺醇特异性多克隆抗体。

所述的沙丁胺醇溴乙酰酯制备方法是将沙丁胺醇标准品在三乙胺催化下与溴乙酰氯反应得到衍生物沙丁胺醇溴乙酰酯溶液。将此沙丁胺醇溴乙酰氯酯溶液用制备型高效液相色谱仪反向柱色谱分离纯化出相对于沙丁胺醇标准品峰后移，且具有沙丁胺醇紫外光吸收光谱特征的单一主峰组分，收集该主峰组分得到纯化的沙丁胺醇溴乙酰酯。

所述的沙丁胺醇溴乙酰酯与载体蛋白偶联制备免疫原，是用十二烷基硫酸钠SDS变性牛血清蛋白BSA或卵清蛋白OVA等常用载体蛋白，再与碘乙酸-羟基琥珀酰亚胺酯即NHS-碘乙酸反应，再用二硫苏糖醇DTT还原，得到巯基化的BSA或OVA ；通过葡聚糖凝胶G25 Sephadex脱盐去掉多余的二硫苏糖醇后，将沙丁胺醇溴乙酰酯与巯基化的BSA或OVA混合，调pH=8.5，在室温摇动反应60分钟，经G25 Sephadex脱盐后得到的为免疫原。

所述的用纯化后的沙丁胺醇溴乙酰酯与经活化的琼脂糖反应制备纯化抗体用的免疫亲和柱，是将经活化的琼脂糖与赖氨酸反应得到氨基花的琼脂糖，再将氨基化的琼脂糖与NHS-碘乙酸反应后，再用DTT还原，得到巯基化的琼脂糖，将巯基化的琼脂糖和沙丁胺醇溴乙酰酯快速混匀，室温反应60分钟，得到化学共价键复合体沙丁胺醇溴乙酰-琼脂糖填料，将填料装柱，洗去多余的DTT，得到提纯沙丁胺醇特异性抗体用的免疫亲和柱。

所述的沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱和沙丁胺醇胶体金试纸条联用的技术。

本发明的优点：

1）本亲和纯化富集柱所用偶联的抗体为经过免疫亲和一步法提纯的，抗体特异性高；采用高密度、大容量将特异性抗体偶联于活化的琼脂糖填料，使得本发明亲和纯化富集柱抗体和填料结合稳定，柱容量、回收率明显优于当前同类产品，达到排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性。

2）本亲和纯化富集柱装载填料的微型化，填料装柱体积仅需25μL/柱，能使洗脱体积缩小，非常明显地提高检测的灵敏度。

3）本发明转载填料的塑料柱为特制的，能达到灵活掌握上样体积、提高过柱效率的效果。

附图说明

图1为经制备型高效液相色谱分离纯化的沙丁胺醇色谱图及主要衍生组分收集峰图。

图2为沙丁胺醇多克隆抗体间接竞争ELISA的IC50图。

图3为沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱和沙丁胺醇胶体金试纸条联用效果图，图中的1、2为用胶体金试纸条测试沙丁胺醇猪阴性尿液；2、3为用胶体金试纸条检测在沙丁胺醇阴性尿液中加入沙丁胺醇标准品使浓度是0.01ng/mL；5、6为用胶体金试纸条检测在沙丁胺醇阴性尿液中加入沙丁胺醇标准品使浓度为0.01ng/mL经过沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱富集后的洗脱液。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。

实施例1  沙丁胺醇特异性多克隆抗体的制备。

1.1 沙丁胺醇溴乙酰脂的制备：

1.1.1取50 mg的沙丁胺醇溶于500 μL的富马酸二甲酯（DMF）溶液中，充分溶解冰冻10分钟，再与40 μL的溴乙酰氯摇匀冰冻2 分钟后加入25 μL三乙胺摇匀，在60℃反应30 分钟；加入500 μL的50%甲醇。

1.1.2 离心，取上清用制备型高效液相色谱仪（C-18 HPLC）反向柱色谱分离纯化。分别收集相对于沙丁胺醇标准品峰后移的峰，且有沙丁胺醇紫外光（UV）吸收光谱特征的主要组分（大约20 mg），冻干。

1.1.3收集冻干后的衍生物立即用1 mL甲醇复溶，用0.1 mol/L Na₂CO₃调PH>8 。

1.2沙丁胺醇免疫原、配对检测抗原制备

1.2.1沙丁胺醇免疫原

取250 mg BSA,加入 5 mL 0.1 mol/L Na₂CO₃、0.5 mL 10%的SDS混匀后煮沸5 分钟变性后冷却至室温，加入100 mg现制的NHS-碘乙酸活性酯(碘乙酸-NHS)，4℃避光反应30 分钟，立即脱盐，收集10 mL，然后加入50 mg 的DTT保持pH>8.5下室温避光反应60 分钟, 再加入50 mg DTT煮沸5 分钟还原。冷却至室温，还原后的BSA经过脱盐柱G25 Sephadex去掉多余的DTT后加入上述1.1.3 的经HPLC纯化的沙丁胺醇溴乙酰酯400 μL ，用0.1 mol/L Na₂CO₃调pH=8.5， 室温避光反应60 分钟后生成沙丁胺醇溴乙酰-BSA共价键复合体，经G25 Sephadex脱盐、分装保存待用。

1.2.2配对检测抗原

取10 mg卵清蛋白OVA，溶解于400 μL含0.1 mol/L EDTA的0.1 mol/L  Na₂CO₃溶液，充分溶解后，加入40 μL 10%的SDS混匀后煮沸5 分钟变性，然后加入6 mg 的DTT 煮沸10 分钟还原。冷却至室温，还原后的OVA经脱盐柱G25 Sephadex去掉多余的DTT后加入上述经HPLC纯化的沙丁胺醇溴乙酰酯200 μL ，用0.1 mol/L Na₂CO₃调pH=8.5，室温避光反应60 分钟后,生成沙丁胺醇溴乙酰-OV共价键复合体，经G25 Sephadex脱盐后得到的为配对检测抗原。

    1.3沙丁胺醇多克隆抗血清制备

用新西兰大白兔为免疫动物，疫苗浓度为1 mg/mL,首次免疫用0.5 mL疫苗加0.5 mL PBS加1 mL完全佐剂混匀多点注射，加强免疫用0.25 mL疫苗加0.75 mLPBS加1 mL不完全佐剂混匀分2点注射，首次免疫后，每间隔2周加强免疫一次，35-40天采集0.5 mL血清检测滴度，用配对检测抗原包被做血清的间接ELISA检测，血清滴度达到1：6400后进行大量血清制备。

 

1.4 提取抗体用的亲和柱制备

1.4.1 称取赖氨酸（Lysine） 2 g 溶解于10 mL 0.1 mol/L Na₂CO₃中，加入到20 mL 活化的Agarose混匀，60℃反应5 分钟，摇匀再次反应10 分钟，转4℃静置20 分钟，冷却后加入硼氢化钠 100 mg，摇床摇动过夜，次日用5倍填料体积蒸馏水洗，得到Lysine-Agarose 20 mL。排干水分备用。

1.4.2 将 20 mL Lysine-Agarose加入2 mL 饱和Na₂CO₃ ，PH>8，振荡器上逐滴加入15 mL 丙酮。

1.4.3 加入100 mg 活化碘乙酸（现配现用），PH>8.5 下摇动避光反应30 分钟

1.4.4 抽干经碘乙酸活化的Lysine-Agarose，用10倍Lysine-Agarose体积的蒸馏水洗，把填料排出到小烧杯，加入用0.1  mol/L Na₂CO₃ 配制的DTT溶液（200 mg/10 mL）10 mL，瞬间将二者混匀，室温避光反应60分钟 。

1.4.5 用5倍填料体积水洗，去掉残余DTT，得到巯基化填料（-SH Agarose）

1.4.6将1.1.3的经HPLC纯化的沙丁胺醇溴乙酰酯400μl滴入填料中，加入0.1 mol/L Na₂CO₃ 5 mL，室温避光反应过夜，装柱，用PBSt充分清洗后，再用PBS中和至PH=7。

1.5抗沙丁胺醇特异性抗体制备

将150 mL的免疫血清流过步骤1.4.6所制的亲和柱。依次用10倍填料体积的PBSt、10倍填料体积的1 mol/L氯化钠清洗掉杂质后，柱上的特异性抗沙丁胺醇抗体用2%乙酸洗脱。 洗脱的抗体用透析袋透析去掉乙酸， 冻干备用。

    经间接ELISA及间接竞争ELISA检测，结果表明本发明所制的多克隆抗体效价很高，特异性很高。

实施例2  高密度高特异性沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱制备。

2.1取经过碘酸钠活化的 Agarose 12 mL转入柱子中，用400 mL蒸馏水洗，滴干，再过Agarose的2倍体积的0.1 mol/L Na₂CO₃，滴干备用； 

2.2 将1200 mg经免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体用0.1 mol/L Na₂CO₃溶解使浓度达20 mg/mL，完全溶解后离心取上清；

2.3上清加入步骤2.1的亲和纯化富集柱中，收集流出液再次过柱，反复3-5次； 

2.4用80 mL蒸馏水把未结合的抗体洗出来，收集在一起； 

2.5用蒸馏水配制浓度为10 mg/mL的硼氢化钠溶液4.8 mL，加入柱子中，振荡混匀，4℃反应30分钟；

2.6用10倍填料体积的PBS洗填料，滴干PBS，将填料移入干净的试管中，加入与填料体积相等的甘油，即得沙丁胺醇免疫亲和纯化富集填料。

2.7在特制塑料柱内下端装上过滤膜，将沙丁胺醇免疫亲和纯化富集填料装载入柱中，25μl/柱，然后填料上层盖上过滤膜，即得所述的沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱。

    2.8该免疫亲和纯化富集柱保存条件为：-20℃。

实施例3  沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱容量测定

3.1 将已知空白（已经检测确定为沙丁胺醇阴性）尿液2 mL。加入沙丁胺醇标准品使浓度为2.5μg/mL，5000转/分离心10分钟，取上清待用。

3.2从-20℃冰箱取出本发明的沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱，室温平衡20分钟，滴干储存缓冲液，依次用1 mL PBST过柱清洗填料、0.05%吐温20和1 mg/mL BSA的3%乙酸水溶液500 μl过柱清洗，再用PBS过柱中和填料至中性PH=7.0±0.5，滴干PBS，待用；

3.2 将处理好的样品2 mL过柱，接流出液重复过柱1次。

3.3 用 2 mL PBST过柱清洗，再用1.5 mL PBS过柱清洗。

3.4 用含80%甲醇3%乙酸的水溶液100 μL洗脱，收集所有洗脱液；再用含1%乙酸水溶液300 μL洗脱，收集所有洗脱液。整个洗脱过程共收集400 μL洗脱液。

3.5用高效液相色谱检测洗脱液中沙丁胺醇的含量。

 

检测结果说明沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱的容量达到40000 ng/mL。如此高的容量对沙丁胺醇具有很好的富集功效。

实施例4  沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱回收率测定

4.1 将已知空白（已经检测确定为沙丁胺醇阴性）尿液5 mL。加入沙丁胺醇标准品使浓度为100 ng/mL，5000转/分离心10分钟，取上清待用。

4.2 从-20℃冰箱取出沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱，室温平衡20分钟，滴干储存缓冲液，依次用用1 mL PBST过柱清洗、0.05%吐温20和1 mg/mL BSA的3%乙酸水溶液500 μL过柱清洗，再用PBS过柱中和填料至中性PH=7.0±0.5，滴干PBS，待用；

4.3 将处理好的样品5 mL过亲和纯化富集柱，接流出液重复过柱1次。

4.4 用1 mL PBST过柱清洗，再用1 mL PBS过柱清洗。

4.5 先用80%甲醇+3%乙酸+蒸馏水的洗脱液洗脱100 uL，然后用3%乙酸洗300 uL。总量为400 uL。

4.6 用高效液相色谱检测加了标准品但未过柱的样品及洗脱液中沙丁胺醇的含量。

 

测定结果说明亲和填料回收率为大于95%。

实施例5  沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱和沙丁胺醇胶体金试纸条联用

5.1 取沙丁胺醇阴性尿液各25μL点2片胶体金试纸条，确定其为阴性尿液（如图3中的1、2）。

5.2 取该阴性尿液100 mL，加入沙丁胺醇标准品使浓度是0.01 ng/mL，各取25μL点2片胶体金试纸条，结果试纸条仍显示为阴性（如图3中的3、4）。

5.3 从-20℃冰箱取出沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱，室温平衡20分钟，滴干储存缓冲液，依次用1 mL PBST、 0.05%吐温20和1mg/mL BSA的3%乙酸水溶液200μL过柱清洗，再用PBS过柱中和填料至中性PH=7.0±0.5，滴干PBS，待用；

5.4 将处理好的样品100 mL过亲和纯化富集柱，接流出液重复过柱1次。                                                                                                                                                        

5.5 用1 mL PBST过柱清洗，再用1 mL PBS过柱清洗。

5.6 用含0.05%吐温20和1 mg/mL BSA的3%乙酸水溶液150μL洗脱，收集洗脱液。

5.7 用饱和三羟甲基氨基甲烷Tris调洗脱液PH=7.0±0.5.

5.8 各取中和后的洗脱液25μL点2片胶体金试纸条，结果试纸条显示为阳性（如图3中的5、6）。说明经亲和纯化富集柱的富集，可将检测下限降低至0.01ng/mL.和单独用胶体金试纸条直接检测的检测下限5 ng/mL相比，检测敏感度提高了500倍。

Claims (8)

1.一种微型高效沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱的制备，其特征在于：    

1）将经免疫亲和纯化的沙丁胺醇特异性多克隆抗体和过碘酸活化的琼脂糖混匀，在摇床上室温反应30 分钟，然后在4℃冰箱静置30分钟后加入硼氢化钠还原，用蒸馏水清洗未结合的抗体，用磷酸缓冲液清洗填料，10倍填料体积/次，洗4次，滴干磷酸缓冲液后加入等体积甘油，混匀，得到沙丁胺醇免疫亲和填料；

2）在特制的塑料柱内下端装上过滤膜，将沙丁胺醇免疫亲和填料装入柱中，25μL/柱，填料上层盖上过滤膜，即得所述的沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱。

2.根据权利要求1所述的方法制备的沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱，包括偶联有免疫亲和纯化的沙丁胺醇特异性多克隆抗体的琼脂糖填料及装载该填料的特制塑料柱。

3.根据权利要求1或2所述的沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱的制备，其特征在于：所述的免疫亲和纯化的沙丁胺醇特异性多克隆抗体是用沙丁胺醇与溴乙酰氯反应得到衍生物沙丁胺醇溴乙酰酯溶液，用反向高效液相色谱HPLC纯化该溶液得到纯化后的沙丁胺醇溴乙酰酯，将纯化后的沙丁胺醇溴乙酰酯与载体蛋白偶联，得到的偶联物作为免疫原免疫动物，得到抗血清，同时用该纯化后的沙丁胺醇溴乙酰酯与经活化的琼脂糖反应制备纯化抗体用的免疫亲和柱，用该亲和柱一步提取抗血清得到沙丁胺醇特异性多克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱的制备，其特征在于：所述的沙丁胺醇溴乙酰酯是将沙丁胺醇标准品在三乙胺催化下与溴乙酰氯反应得到衍生物沙丁胺醇溴乙酰酯溶液。

5.将此沙丁胺醇溴乙酰氯酯溶液用制备型高效液相色谱仪反向柱色谱分离纯化出相对于沙丁胺醇标准品峰后移，且具有沙丁胺醇紫外光吸收光谱特征的单一主峰组分，收集该主峰组分得到纯化的沙丁胺醇溴乙酰酯。

6.根据权利要求3所述的沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱的制备，其特征在于：所述的沙丁胺醇溴乙酰酯与载体蛋白偶联制备免疫原，是用十二烷基硫酸钠SDS变性牛血清蛋白BSA或卵清蛋白OVA等常用载体蛋白，再与碘乙酸-羟基琥珀酰亚胺酯即NHS-碘乙酸反应，再用二硫苏糖醇DTT还原，得到巯基化的BSA或OVA ；通过葡聚糖凝胶G25 Sephadex脱盐去掉多余的二硫苏糖醇后，将沙丁胺醇溴乙酰酯与巯基化的BSA或OVA混合，调pH=8.5，在室温摇动反应60分钟，经G25 Sephadex脱盐后得到的为免疫原。

7.根据权利要求3所述的沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱的制备，其特征在于：所述的用纯化后的沙丁胺醇溴乙酰酯与经活化的琼脂糖反应制备纯化抗体用的免疫亲和柱，是将经活化的琼脂糖与赖氨酸反应得到氨基化的琼脂糖，再将氨基化的琼脂糖与NHS-碘乙酸反应后，再用DTT还原，得到巯基化的琼脂糖，将巯基化的琼脂糖和沙丁胺醇溴乙酰酯快速混匀，室温反应60分钟，得到化学共价键复合体沙丁胺醇溴乙酰-琼脂糖填料，将填料装柱，洗去多余的DTT，得到提纯沙丁胺醇特异性抗体用的免疫亲和柱。

8.根据权利要求1或2所述的沙丁胺醇免疫亲和纯化富集柱和沙丁胺醇胶体金试纸条联用。

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