KR20100020037A - 개 파보바이러스의 유전자 변이체를 포함하는 백신 - Google Patents

개 파보바이러스의 유전자 변이체를 포함하는 백신 Download PDF

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Abstract

개 파보바이러스 백신, 진단제 및 이의 이용 방법을 제공한다. 백신은 새로이 출현하는 우성의 개 파보바이러스 변이체에 대해 효과적이다.

Description

개 파보바이러스의 유전자 변이체를 포함하는 백신{VACCINES CONTAINING CANINE PARVOVIRUS GENETIC VARIANTS}
본 발명은 일반적으로 개선된 개 파보바이러스(CPV) 백신 제형 및 진단 테스트에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 개 집단에서 현재 유행하고 있으며 새롭게 출현하고 있는 우성(dominant) CPV 변이체를 포함하는 개선된 CPV 백신 제형 및 진단 테스트를 제공한다.
개 파보바이러스(CPV)는 대부분 개, 특히 강아지를 감염시키는 장내 병원체이다. 파보바이러스 감염은 개와 4 내지 5주령이 지난 강아지에서는 급성 설사, 열 및 백혈구 감소증을, 보다 어린 강아지에서는 심근 질환을 발생시키는 것이 특징이다. 백신 접종을 하지 않은 개의 경우, 이 질환으로 인한 사망률이 매우 높다. CPV에 대한 백신을 이용할 수는 있지만, CPV는 단일 가닥 DNA 바이러스이고 돌연변이력이 매우 높기 때문에, 바이러스는 항원 측면에서 상당한 변형 능력을 나타내며, 따라서 백신에 의해서는 면역 예방이 되지 않는다. 따라서, 원인 물질에 대한 항원 타입과 유전자형에 대한 꾸준한 모니터링이 필요하다.
CPV는 1978년에 처음으로 분리되었으며, 파보바이러스 개 미니트 바이러스(CMV 또는 CPV-1)과 구분하여 "CPV-2"로 명명되었다. CPV-2는 일반적으로 고양이 범백혈구 감소증 바이러스(feline panleukopenia viru: FPV)나 밍크 장 바이러스(mink enteric virus: MEV)의 유전자 변이체인 것으로 생각되었으며, 밍크, 여우, 라쿤 및 그외 육식 동물을 감염시키는 파보바이러스와 유전자 및 항원 측면에서 매우 가까운 관계이다. CPV 캡시드는 대안적인 mRNA 스플라이싱으로 인해 4개 이상의 단백질이 코딩되지만 단지 2개의 오픈 리딩 프래임을 가진 약 5200개의 염기로 구성된 단일 가닥의 DNA 게놈을 포함하고 있다. 파보바이러스의 캡시드는 2종의 바이러스 단백질(VP) VP1과 VP2로 구성되어 있으며, 이중 VP2가 주요 면역원성 파보바이러스 캡시드 단백질이다. 오리지날 CPV 분리물에 대한 유전자 변이체들은 1979-1980년에 동정되었으며, 이는 CPV 타입 2a로 명명되었다. 1980년대 중반에는, 또다른 변이체인 타입 2b가 동정되었으며, 이후 타입 2a 및 타입 2b가 오리지날 CPV-2를 완전히 대체한 것으로 보인다. 현재 백신은 단지 2a 및 2b 변이체에 대한 것이지만, 2a 변이체는 미국에서 더 이상 검출되지 않고 있다. CPV 발견과 진화에 대해서는 Parrish and Kawaoka, 2005를 참조한다.
CPV-2b는 CPV-2a와 2곳의 아미노산 위치만 다른데, 2a의 Asn-426(AAT로 코딩)은 2b에서 Asp(GAT로 코딩)이고, 2a의 Ile-555는 2b에서 Val이다. Ile-555에서 Val으로의 변이는 실제 오리지날 타입 2 서열로의 복원이다. CPV-2a 및 2b의 항원 타입은 다년간 비교적 안정적인 것으로 나타났다. 그러나, 2000년에, 426번 위치가 GAA로 코딩된 Glu인 변이체 "2c"(555번 위치는 Val을 유지)가 나타났다. 2c 변이체는 이탈리아(Buonavoglia et al., 2001), 베트남(Nakamura et al., 2001) 및 그외 스페인(Nakamura et al., 2004; Decaro et al., 2006) 등의 국가들에서 보고되었으나, 지금까지 미국에서는 2c 변이체는 보고되지 않고 있으며, CPV 백신은 이러한 변이체를 포함하도록 갱신되지 않고 있다. 이런 점은, 주로 강아지를 감염시키는 전술한 변이체들과는 달리, CPV 2c가 성체 개를 감염시킬 수 있는 능력이 있기 때문에, 특히 중요하다. 또한, 494번과 572번 위치에 코돈 변이가 있는 2b 변이체의 서열은 2003년에 유전자 은행(gi: 54646340)에 등재되었으며, Shackelton 등이 2005년( Proceedings National Academy Sciences 102:379-384)에 발표하였으나, 이러한 서열을 기초로 한 CPV 백신 또는 진단 조성물의 수정은 제시되지 않았다.
백신이 갱신되지 않을 경우에 몇가지 문제들이 발생한다. 우선, 백신 접종받은 개도 백신에 포함되어 있지 않은 CPV 변이체에 감염되기 쉽다. 두번째로, 백신을 접종받은 개가 아프기 시작하면, 백신내 바이러스 균주가 질병을 야기한 것이라는 개 주인의 불만이 자주 제기될 수 있다. 백신 회사가 이를 반박할 수 있는 증거를 제시할 수 있는 실질적인 방법이 없기 때문에, 개 주인에 대한 보상금 지급이 자주 발생한다.
몇가지 CPV 백신 조제물들이 제안되어 있다:
Appel 등의 미국 특허 4,193,990 및 4,193,991에는, 오리지날 CPV에 대한 예방을 부여하는, 이종형의 불활성화된("사멸") 바이러스 백신들이 개시되어 있다.
Carmichael 등의 미국 특허 4,303,645에는 비종양 세포주에서 바이러스를 장기간 연속 계대 배양하여 제조한 약독화된 CPV를 포함하는 백신이 개시되어 있다. 또한, 예시된 백신은 오리지날 CPV 분리물에 대한 예방도 제공한다.
Wood 등의 미국 특허 4,971,793과 Valdes 등의 미국 특허 5,882,652 모두, 재조합 베큘로바이러스에 의해 생산된 CPV VP-2 단백질을 포함하는 재조합 서브유닛 백신을 개시하고 있다. VP-2 단백질은 특이적인 타입 또는 서브타입이 아니다.
Parrish 등의 미국 특허 5,885,585에는 2b 변이체의 약독화된 형태를 포함하는 CPV 백신이 개시되어 있다.
CPV 바이러스는 돌연변이되어 새로운 항원성을 가진 변이체로 변이될 수 있기 때문에, CPV 변이체의 유전자 구성을 살펴 현재의 CPV 변이체를 반영하는 백신 및 진단 테스트의 개발이 필요한 실정이다.
발명의 개요
본 발명은 CPV 감염을 예방하기 위한 갱신된 백신과 새롭게 출현하는 CPV 변이체를 검출하기 위한 진단 방법을 제공한다. 상기 백신과 진단 방법은, 이전에는 알려져 있지도 않고 인지되지 않았던 CPV 변이체의 발견을 토대로 하며, 종래의 백신 제형과 진단제로는 부적절한, 바이러스 돌연변이 형태의 출현을 고려한다. 본 발명의 백신은 신생 CPV 형태에 대한 예방을 제공하고자 하며, 상기 진단제는 바이러스의 신생 출현 형태를 검출할 수 있는 능력을 제공하는데, 이러한 점들은 모두 종래에는 제공되지 않았었다. 특히, 신규한 희귀 변이체는 백신에서 "마커" 변이체로서 유용하다. 마커 변이체의 사용으로, 마커 변이체로 백신 접종받은 동물에서 나타나는 질병 증상이 상기 백신이나 다른 CPV 균주로 인해 발생된 것인지의 여부를, 법의학적으로 조사할 수 있다.
신생 백신 제형은 하기 특징들 중 한가지 이상을 가진 단일 가닥 DNA를 포함하는 약독화된 CPV 전체(whole attenuated CPV)를 포함한다:
2bΔ494Δ572는 다음과 같은 한가지 이상의 변이를 포함하는 2b CPV 변이체이다: VP2 단백질의 494번을 코딩하는 코돈은 TGT가 아닌 TGC이며, VP2 단백질의 572번을 코딩하는 코돈은 GTA가 아닌 GTC이다. 이러한 변이는 아미노산을 바꾸진 않는다(TGC와 TGT 둘다 시스테인을 코딩하며, GTC와 GTA 둘다 발린을 코딩함). 그럼에도 불구하고, 상기 변이체는 현재 상업적으로 이용가능한 백신으로 미리 백신 접종 받은 동물에게서 질병을 유발시키므로, 상기 변이체는 새로운 백신 제형에 병합되어야 한다. 494번 및 572번 위치에서의 변이는 종래에 언급되기는 했었지만, 가치를 인정받지 못했었다. 또한, 미국에서 분리된 이 균주에는 다른 돌연변이도 있을 수 있다.
2bΔ431은 VP2 단백질의 431번을 코딩하는 코돈이 CTA가 아닌 CTG인, 새롭게 발견된 희귀한 2b CPV 변이체(예, 2bΔ494Δ572의 변이체)이다. 이 변이 역시 아미노산의 변이는 발생시키지 않지만, 이 변이체도 백신 접종받은 동물에게서 질병을 유발하므로 신규한 백신 제형으로 병합될 수 있다. 중요한 점은, 2bΔ431이 그 희소성으로 인해 이상적인 백신 "마커" 서열이라는 것이다.
American(또는 US) 2c는 미국에서 처음으로 분리된 2c 변이체로서, 주류(81%) 2c 변이체이다. 이 변이체는 또한 "주류 2c 변이체(major 2c variant)"로도 언급된다.
2cΔ440은 VP2 단백질의 440번 위치를 코딩하는 코돈이 ACA가 아닌 GCA인, 새롭게 발견된 2c CPV 변이체로서, 상기 위치의 아미노산 서열은 트레오닌(ACA)에서 알라닌(GCA)으로 바뀐다. 이 변이체는 백신 접종받은 동물에게서 질병을 유발시키므로, 새로운 백신 제형에 병합되어야 한다. 이 변이체는 현재 비주류(19%) 변이체이며, "비주류 2c 변이체"라고도 언급한다.
2cΔ440의 다른 변이체인 2cΔ430Δ440은, 440번 위치의 코돈이 GCA일 뿐만 아니라 430번 위치에 TTG가 아닌 TTA로 코딩되는 루신을 가지고 있어서 공지된 2c 서열과는 다르다.
이러한 CPV 변이체들 모두 중합효소 연쇄 반응(PCR)로 검출되었으며, 기존의 상업적인 백신으로 CPV에 대해 이미 백신 접종 받았을 수 있는, CPV 감염된 개 및/또는 이의 자손으로부터 세포 배양을 통해 분리되었다. 따라서, 이들 신생 변이체들은, 그 변이가 지정된 위치에서 VP2 단백질의 아미노산 서열을 변화시키거나(일부 2cΔ440 및 2cΔ430Δ440) 또는 변화시키지 않던(2bΔ494Δ572 및 2bΔ431) 간에, 현 프로토콜에 따라 백신 접종받은 개의 면역 감시망으로부터 벗어날 수 있다. 또한, 현재 이용할 수 있는 현장에서 사용되는 진단 기법들은 신생 CPV 변이체를 검출하지 못하거나 충분하게 반응하지 않아, 감도가 낮다. 본 발명은 신생 변이체를 고려한 백신과 진단제를 제공함으로써, 이러한 문제들을 해결한다.
또한, 본 발명은 CRFK 세포만으로 배양하였을 때, 세포 병리학적 효과(CPE: cytopathic effect)를 발생시키지 않거나 또는 가벼운 CPE만 발생시키는, 개 파보바이러스, 특히 본원에 기술된 변이체의 증식 방법을 제공한다. 상기 방법은 적정 배지 중에 CRFK(Crandall Reese feline kidney) 세포와 Vero 세포의 혼합물에서 개 파보바이러스를 배양하는 단계를 포함한다. 배양 단계는 CPV를 CRFK 세포에서 단독 배양하였을 때 달성되는 역가 보다 높은 역가로 개 파보바이러스가 증식되게 하는 조건 하에서 수행된다.
또한, 본 발명은 1종 이상의 CPV 변이체를 포함하는 파보바이러스 백신을 제공한다. 1종 이상의 CPV 변이체의 중화율은, CPV-2, CPV-2a, CPV-2b 및 CPV-2c 중 1종 이상의 CPV 변이체를 포함하는 백신을 접종 받은 동물의 혈청을 이용하여 결정된 바에 따르면, CPV-2, CPV-2a, CPV-2b 및 CPV-2c로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 CPV의 중화율 보다 적어도 4배 낮다.
도 1. 494번 위치의 코돈이 TGC이고 572번 위치의 코돈이 GTC인, 2bΔ494Δ572 서열(핵산 서열은 서열번호 1로 나타냄)의 예. VP2 단백질의 426번에서 572번의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다.
도 2. 431번 위치의 코돈이 CTG인, 2bΔ431 서열(핵산 서열은 서열번호 2로 나타냄)의 예. VP2 단백질의 426번에서 572번의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다.
도 3. 주류 American 2c VP2 단백질의 아미노산 426번에서 572번을 코딩하는 핵산 서열(핵산 서열은 서열번호 3으로 나타냄)을 나타냄.
도 4. 440번 위치의 코돈이 트레오닌 대신 알라닌을 코딩하는 ACA이 아닌 GCA인, 2bΔ440(비주류 American 2c) 서열(핵산 서열은 서열번호 4로 나타냄)의 예. VP2 단백질의 426번에서 572번의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다.
도 5. 2cΔ430Δ440 서열(핵산 서열은 서열번호 5로 나타냄)의 예.
도 6. 2c 변이체의 추정되는 접힌 구조(folded structure).
도 7. 2bΔ431 변이체의 추정되는 접힌 구조.
도 8. 2cΔ430Δ440 변이체의 추정되는 접힌 구조.
발명의 바람직한 구현예에 대한 상세한 설명
본 발명은 CPV의 진화 경향을 반영하는 새롭게 발견되는 변이체를 포함하는 CPV 백신 및 진단제 조성물을 제공한다. 각 변이체들은 이미 CPV에 대한 백신을 접종 받았음에도 불구하고 CPV에 접촉되면 질병이 발병하는 개로부터 분리되었다. 따라서, CPV의 전파를 중지 또는 억제시키기 위해, 이러한 신생 변이체들을 백신 프로토콜에 병합시킬 수 있다. 또한, 하기에서 상세히 논의된 바와 같이, 이들 변이체들의 동정은 CPV 게놈내 고가변성(hypervariable) 부위의 발견으로 이어진다.
본원에 기술된 변이체의 발견은 CPV 게놈의 중요한 고가변성(HPV) 영역의 동정으로 이어졌다. 과거에는, 1276번에서 1277번 위치의 뉴클레오티드만 중요한 것으로 간주되었다. 그러나, 본원에 기술된 유행병학적 발견을 통해, 결정적인 HPV 영역이 전체 VP2 유전자 중 1275-1326 위치인 CPV 게놈의 거의 중간 부분에 실제 해당하는 것으로 확인되었다. 이러한 HPV 영역은 적어도 2개의 결정적인 고가변성 코돈, VP2 유전자의 426 및 440 코돈을 포함한다. 바람직하게는, 고가변성 영역은 코돈 426의 앞에 있는 하나의 뉴클레오티드에서부터 코돈 440까지의 영역을 포함한다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니나, 이 HPV 영역의 생물학적 의미는 하기에서 보다 충분히 논의된 바와 같이, 서열에 의해 형성되는 구조의 열역학적 안정성과 관련있을 수 있다.
변이체는 다음과 같다:
2bΔ494Δ572는 VP2 단백질의 494번 코돈이 TGT가 아닌 TGC이며, VP2 단백질의 572번 코돈이 GTA가 아닌 GTC인 2b CPV 변이체이다. 이러한 변이는 코딩된 아미노산을 바꾸지 않으며(494번에 Cys이고 572번에 Val임), 이들 서열은 종래에 공지되었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 변이가 본원에 언급된 바와 같이 현재 이용가능한 백신으로 백신 접종받은 숙주에서 바이러스의 면역적 제거를 피할 수 있게 한다는 것을, 기존에는 인식하지 못하였다. 이러한 변이는 도 1에 나타내었으며, 아미노산 426에서 572를 코딩하는 2b(즉, 426 = GAT) VP2 유전자 부분이 표시되어 있다. 2개의 돌연변이 코돈(494 및 572)은 굵은 글씨체와 밑줄로 표시되어 있다.
2) 2bΔ431은 VP2 단백질의 431번을 코딩하는 코돈이 CTA에서 CTG로 변이된 희귀한 2b CPV 변이체이다. 오리지날 2bΔ431 분리물에도 2bΔ494Δ572 돌연변이가 포함되어 있으며, 그래서 이것은 2bΔ431Δ494Δ572이다. 그러나, 본 발명은 VP2 단백질의 431번 위치를 코딩하는 코돈에 CTG가 포함된 임의의 모든 CPV 서열(2a, 2b 또는 2c)을 포함한다. 이러한 변이는 아미노산 변이를 발생시키지 않지만(CTA와 CTG 둘다 Leu를 코딩함), 이의 희소성으로 인해 법의학적인 목적에서 이상적인 백신 "마커" 서열이다. 본 발명의 이러한 측면은 아래에서 상세하게 논의된다. 이 변이체는 도 2에 기술되어 있으며, 아미노산 426번에서부터 572를 코딩하는 2b(즉 426 = GAT) VP2 유전자 부분을 도시한다. 3개의 돌연변이 코돈(431, 494 및 572)은 굵은 글씨체와 밑줄로 표시되어 있다.
3) American 2c는 미국에서 분리된 최초의 2c 변이체이다. 이 변이체의 유의한 출현은 기존에는 감지하지 못하였다(도 3 참조).
4) 2cΔ440은 VP2 단백질의 440번 코돈이 ACA가 아닌 GCA인 2c CPV 변이체이다. 이러한 변이로 440번 위치의 아미노산이 Thr에서 Ala로 바뀐다. 또한, 이러한 변이는 미리 백신 접종 받았지만 CPV로 인해 병에 걸린 개에게서 분리되었다. 따라서, 이 변이체의 서열은 신규한 CPV 백신 및 진단 조제물에 병합되어야 한다. 이 변이체는 도 4에 나타내며, 아미노산 426에서 572를 코딩하는 2c(즉 426 = GAA) VP2 유전자 부분을 도시한다. 돌연변이 코돈(440)은 굵은 글씨체와 밑줄로 표시되어 있다. 코돈 494 및 572는 참조로 밑줄 표시되어 있다.
2cΔ440의 다른 변이체인 2cΔ430Δ440은, 440번 위치의 코돈이 GCA일 뿐만 아니라 430번 위치에 TTG가 아닌 TTA로 코딩되는 루신을 가지고 있어 공지된 2c 서열과 상이하다. 이 변이체는 도 5에 나타낸다.
표 1은 이들 변이체의 서열 변화를 요약하여 나타낸 것이다.
최근 미국 CPV 변이체들에서 VP2 단백질의 중요 아미노산 및 관련된 코돈들
변이체 아미노산 위치 및 관련 코돈
426 430 431 440 494 572
2bΔ494Δ572 GAT TTG CTA ACA TGC* GTC*
2bΔ431Δ494Δ572 GAT TTG CTG* ACA TGC* GTC*
American 2c "주류 American 2c" GAA TTG CAT ACA TGT GTA
2cΔ440 "비주류 American 2c" GAA TTG CAT GCA* TGT GTA
2cΔ430Δ440 GAA TTA* CAT GCA* TGT GTA
*은 돌연변이 코돈을 표시함
494 및 572번 위치의 변이는 기존에 공지되었지만, 이 변이체의 출현 우위성과 특징들은 기존에 인식되지 못하였다. 본원에 언급된 모든 변이체들은 CPV에 대해 미리 백신 접종 받았지만 CPV로 병에 걸려 죽은 개(또는 그 자손)로부터 분리되었다. 변이체들은 미국 중남부에서 먼저 동정되었지만, 미국의 다른 지역에서 나타나는 개의 백신-내성 파보바이러스 질환에 대한 단발성 보고 사례의 원인일 것으로 생각된다. 변이체 2c는 과거 호주와 아프리카를 제외한 모든 대륙들에서 검출되었으며, 현재에는 14개의 주(알라바마, 아리조나, 아칸소, 캘리포니아, 델라웨어, 플로리다, 일리노이, 캔사스, 뉴저지, 미주리, 오레곤, 오클라호마, 남부 캘리포니아 및 텍사스)에서 검출되고 있다. 종래에 공지된 CPV 변이체들의 빠른 전파 이력을 고려하면, 이러한 가장 최근의 바이러스 반복 전파를 멈추기 위해서는, 전세계적으로 이들 한가지 이상의 바이러스를 백신에 즉시 포함시켜야 한다. 또한, CPV 진단 테스트와 방법도 이들 신생 변이체를 고려하여 제형을 바꾸어야 한다.
실시예 항목에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 CPV 변이체가 분리되어 나온, 백신 접종 받은 개에서의 질병의 증상 개시 및 사망은 매우 급속하게 이루어졌는데, 이는 현재의 백신에 포함된 CPV 타입들에 대한 면역 시스템 반응으로는 방어되지 않는 강건한 도피 돌연변이가 존재함을 의미한다. 이는, VP 단백질의 일차 서열에 변화를 야기한 2cΔ440와, 조사한 영역에는 아미노산의 변화가 없는 2cΔ431, 2bΔ494Δ572의 경우에서도, 마찬가지였다. 지금까지, 2bΔ494Δ572 코돈의 변이의 의미를 인지하지 못하였으며, 본 발명자들이 알고 있는 한, 본원에 기술된 바와 같이, 이들 신생 변이체를 고려하거나 포함하도록 CPV 백신 및 진단제의 조성물을 조절하기 위한 제안은 지금까지 행해지지 않았다. 또한, 2cΔ440 및 2bΔ431은 종래에는 언급된 적이 없는 새로운 돌연변이이다.
이들 변이체들은 바이러스에 생존 이점을 제공하는 것으로 보인다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니나, 돌연변이 서열은 바이러스 생활 주기의 일부 단계에서 비리온이나 DNA 자체에 이점을 제공할 수 있다(예, 숙주의 뉴클레아제에 대한 보호; 신속하거나 보다 효율적인 전사 및/또는 번역, 예컨대 여러가지 단백질 폴딩(folding) 패턴을 초래함; 보다 비리온으로의 보다 신속하거나 보다 효율적인 패키징 등). 예컨대, 돌연변이 서열들은 DNA 중합효소가 CPV DNA를 복제할 때 언폴딩(unfolding)의 열역학 측면에서 이점을 부여할 수 있다. 도 6-8에는 실시예 3에 추가적으로 기술된 CPV2c, CPV2bΔ431 및 CPV2cΔ430Δ440 각각의 고가변성 영역의 폴딩 구조를 도시한다.
본 발명의 일 예에서, CPV2cΔ430Δ440과 같은 출현하는 CPV 변이체들을 챌린지 바이러스로 사용하여 실험 조건에서 상업적인 백신 조제물의 유용성을 체크할 수 있다. 대부분의 CPV2a 및 CPV2b 올드 버전들은 개에 대해 고병원성이 아니며, 신생 CPV 2c는 조사되지 않았다. 고병독성의 챌린지 모델이 부족하여, 지금까지 백신 회사에서는 백신 접종받은 동물에게 예방력을 부여하는 백신 조제물의 능력을 적절히 분석할 수 없었다. 따라서, 본 발명은 백신 접종한 동물을 고병독성의 변이체 CPV2cΔ430Δ440에 노출시키고, 질병에 대한 백신 예방 여부를 평가함으로써 이를 수행하는 방법을 또한 제공한다.
본원에 기술된 각 변이체들에 대해, 본 발명은 하나 이상의 변이체를 포함하는 백신 조제물과 진단제, 및 이를 이용하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 상기 조제물과 진단제는 2cΔ440 또는 2bΔ431 중 어느 하나 또는 둘다를 포함한다. 상기 조제물 및 진단제는 추가로 2bΔ494Δ572 및/또는 American 2c, 및/또는 공지된 다른 CPV 서열, 예컨대 현재의 백신에 이미 포함된 서열을 포함한다. 아울러, 새롭게 분리된 새로운 서열, 특히 신규한 아미노산 서열을 가진 다른 바이러스를 신규 백신에 포함시키는 것이 적합하거나 적합하지 않을 수 있다. 일반적으로, 신규한 현장 분리물의 포함 여부를 결정하는 것은, 백신 접종한 동물에게서 기존 백신이 현장 분리물에 대해 중화 반응을 일으키는 능력, 부분적으로는 변이체의 유행성을 토대로 한다. 만일 신생 변이체가 편재되어 있는 경우, 이의 항원적 유의성이 결정되어야 한다. 이의 측정중 한가지는 항원 거리(antigenic distance)이다. 특정 CPV 분리물의 총 항원 거리는 분리물에 대해 혈청 중화 역가 및/또는 헴어글루틴화 분석 및/또는 비간접 형광 항체 테스트와 같은 기능적 분석을 이용한 평가로 결정할 수 있다. 만일, 한가지 이상의 분석에서, 분리물이 백신에 이미 포함된 바이러스 변이체에 비해 중화력이 불량하다면(즉, 이종의 신생 분리물의 중화 수준이 백신에 이미 포함된 변이체의 중화 수준 보다 4배 이상 낮은 경우), 새로운 분리물을 포함하는 새로운 백신을 개발하는 것이 정당화될 수 있다. 예컨대, 신생 CPV 변이체가 분리되면, 총 항원 거리는 혈청 중화 분석으로 계측할 수 있으며, 그 결과는 중화 역가로 표시한다. 중화 역가는, 세포 병리학적 효과(CPE) 결핍 또는 바이러스 존재의 결핍에 의해 입증된 바에 따라, 백신 접종받은 동물에서 중화가 완전히 이루어진 혈청의 최대 희석의 역수이다. 기존 CPV 백신을 접종 받은 개의 혈청이 예컨대 동종 바이러스에 대한 SN 역가가 1:4000이고, 이종의 신생 CPV 분리물에 대한 역가가 1:200인 경우, 상기 신생 분리물은 CPV 백신에 틀림없이 포함시켜야 할 것이다. 다시 말해, 현재의 백신이 현재의 백신에는 존재하지 않는 일반적인 편재 변이체에 대해 예방 효과를 나타내지 못한다면, 그 변이체를 신생 백신 조제물에 신중히 포함시킬 수 있다. 분리물이 국소 지리적 영역에 국한된 경우에는, 보급형으로 개발된 상업 백신 보다는 맞춤형(custom) 또는 자생형 백신(autogenous vaccine)이 더 적합할 수 있다. 또한, 그 결과는 챌린지 예방 실험으로 검증하여야 한다. 챌린지 예방 실험에서, 동물에게 백신 접종한 다음 챌린지 바이러스로서 사용되는 변이체에 적당한 수준(예, 10,000 TCID 50, 즉 조직 배양 감염량 중앙값)으로 노출시킨다. 만일 백신이 그 변이체에 대해 예방 효과를 나타낸다면, 상기 변이체를 백신 조제물에 포함시킬 필요가 없다. 그러나, 백신 접종받은 동물을 상기 변이체로부터 예방하지 못한다면, 상기 변이체를 백신 조제물에 포함시킬 수 있다. 추가적으로, 백신화 과정 중에, 균주 또는 변이체는 모두 동일한 주입물에 포함시킬 필요는 없다. 예컨대, 하나의 변이체를 포함하는 강아지용 주사를 3주령에 투여하고, 여러가지 변이체를 포함하는 주사를 7주령에 투여하고, 또다른 변이체를 포함하는 주사를 10주령에 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이런 방법은 동일한 변이체들을 모두 3번의 강아지용 주사로 투여하는 현행 실무와는 대치된다. 이러한 현행 절차는, 조기 백신 접종 반응으로 형성된 기존 면역성이 후기 백신 접종으로 전달되는 후기 CPV 바이러스를 중화시켜 후기 백신 접종이 거의 또는 전혀 무용지물이 되게 할 수 있다는 문제점을 가지고 있다. 일부 바이러스 병원체는 여러 종들을 감염시킬 수 있는 것으로 특히 잘 알려져 있다. CPV의 경우, 고양이 및 밍크 바이러스 역시 개를 감염시키는 것으로 알려져 있다. 개 CPV 백신에 이러한 바이러스들을 포함시키는 것이 바람직하진 않지만, 이들 고양이 및 밍크 바이러스는 백신 접종받은 동물의 챌린지 실험에는 포함시켜야 한다.
특히, 변이체 2bΔ431은 법의학적 추적 및 검출에 적합한 백신을 제조하는데에 유용하다. 전술한 바와 같이, 현재의 백신들은 놀랍게도 백신 접종받은 동물들을 신생 CPV에 대해 예방하지 못한다. 백신 접종을 받은 후 병에 걸린 동물의 소유자는 질병의 요인을 백신 자체에 전가하는 경향이 있다. 현행 진단 방법들은 백신 균주들과 신생 균주들을 구분하는데에는 부적절하기 때문에, 백신 제조사들은 이러한 비난에 대한 실질적인 방안 없어 동물 소유자에게 변상함으로써 이러한 불만들을 흔히 진정시키고 있다. 이러한 과정은 백신 제조사들에게 매우 많은 비용을 지출시킨다. 또한, 코돈 431의 코돈 426에 대한 근접성과 CPV 게놈의 고가변성 영역내 이의 위치는, 오로지 제한된 서열분석을 통해, 병든 개에서 원인이 되는 CPV 물질의 소스를 확인할 수 있게 한다. 이런 방법은 백신을 제형화하는데 사용되는 한가지 이상의 백신 균주에 2bΔ431 돌연변이를 병합시키는 것을 방지할 수 있다. 2bΔ431은 매우 드물며, 예컨대 이 변이체는 지금까지 조사한 변이체들에 약 1.2%에 해당한다. 따라서, 2bΔ431에 대한 백신을 접종받은 병든 동물의 조직을 CPV 테스트하였을 때, 2bΔ431 이외의 다른 임의의 CPV 균주가 검출된다면, 이 백신이 질병을 유발하지 않는다는 것을 명확하게 결론내릴 수 있다. 오히려, 검출된 다른 균주가 요인일 가능성이 있다. 또한, Δ431 돌연변이는 광범위한 서열 분석없이도 검출할 수 있었다. 이러한 유형의 법의학적 조사는 백신 회사들에게 상당한 이익을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4 및/또는 5로 표시되는 분리된 핵산 서열, 및또는 상기 서열에 의해 코딩되는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하는 백신 조제물, 및 이의 이용 방법을 제공한다. 또한, 이들 서열에 대한 특정 변이 서열을 가진 백신도 포함한다. 서열은 단일 가닥(ss) DNA로 나타내지만, 본 발명은 또한 해당되는 이중 가닥(ds) DNA, 상보적인 DNA 및 이들 서열을 기초로 하거나 이들 서열로부터 유래되거나 또는 이들 서열을 상보하는 임의 형태의 RNA(예, mRNA, RNA/DNA 하이브리드 등)도 포함한다. 그러한 서열들은 센스 또는 안티센스 서열일 수 있다. 또한, 서열번호 1, 2, 3, 4 및 5에 대해 적어도 약 50%, 바람직하게는 약 60%, 더 바람직하게는 70, 80 또는 90%, 또는 심지어 약 95, 96, 97, 98, 99 또는 그 이상의 상동성을 보이는 서열도 백신에 사용되는 것으로 고려된다. 이러한 서열들은 예컨대 하나 이상의 위치에서 동일한 아미노산을 코딩하는 선택적인 코돈을 포함한다는 점에서 상이할 수 있다. 또한, CPV VP2 단백질의 항원성 영역을 코딩하는 이들 서열의 부분들도, 그러한 아미노산 서열에 대해 70%, 또는 더 바람직하게는 약 80, 90 또는 95%나 그 이상의 동일성(예, 96, 97, 98 또는 99% 동일성)을 보이는 서열이 그렇듯 본 발명에서 고려된다. 이러한 서열들은, 예컨대, 제조되는 단백질/펩타이드가 본원에 기술된 바와 같이 항원성인 한에서, 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환 또는 결손(특히 아미노 또는 카르복시 말단 결손), 또는 다양한 삽입 등을 포함한다는 점에서 다양할 수 있다. 이러한 항원성 영역은 바람직하게는 약 10개 이상의 아미노산 길이이고, VP 단백질의 426, 431, 440, 494, 555 및 572번 위치 중 한 곳 이상의 위치를 포함한다. 그러나, 항원성 영역은 전체 VP2 유전자를 포함할 수도 있다.
더불어, 엄격한 조건(특히, 고엄격 조건) 하에서 본원에 기술된 서열(또는 그 서열의 일부분)에 혼성하는 핵산 서열도 고려된다. 엄격한 조건은 핵산 서열이 특정 서열에 혼성되도록 하는 혼성화 조건을 의미한다. 통상, 고엄격 조건은, 약 1 M 염을 포함하는 용액, 바람직하게는 6 x SSC, 또는 비슷한 이온 세기를 가진 임의의 다른 용액 중에서 약 65 ℃에서, 50개 이상, 바람직하게는 약 200개 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 핵산 서열이 특정 서열에 혼성되게 하고, 약 0.1 M 이나 그 미만의 염을 포함하는 용액, 바람직하게는 0.2 x SSC, 또는 비슷한 이온 세기를 가진 임의의 다른 용액 중에서 65 ℃에서 세정하는, 혼성화 조건을 의미한다. 이러한 조건들은 약 90% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진 서열을 검출할 수 있게 해준다. 통상, 저엄격 조건은, 약 1 M 염을 포함하는 용액, 바람직하게는 6 x SSC, 또는 비슷한 이온 세기를 가진 임의의 다른 용액 중에서 약 45 ℃에서, 50개 이상, 바람직하게는 약 200개 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 핵산 서열이 특정 서열에 혼성되게 하고, 약 1 M 염을 포함하는 용액, 바람직하게는 6x SSC, 또는 비슷한 이온 세기를 가진 임의의 다른 용액 중에서 실온에서 세정하는, 혼성화 조건을 의미한다. 이러한 조건들은 최대 50%의 서열 동일성을 가진 서열을 검출할 수 있게 해준다. 당해 기술분야의 당업자는 동일성이 50% 내지 90%인 서열을 동정하기 위해 이러한 혼성화 조건을 수정할 수 있을 것이다.
본 발명은 또한 본원이 기술된 핵산 서열(또는 항원 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드를 코딩하는 그것의 일부분)을 포함하고 발현하는, 다양한 유형의 재조합 벡터 및/또는 발현 시스템을 제공한다. 이러한 벡터 및 발현 시스템의 예로는, 다양한 박테리아(예, Escherichia coli) 또는 프로바이오틱-계(예, Lactobacillus) 발현 벡터; 아데노바이러스 벡터, 베큘로바이러스, 피키아 및 효모 발현 시스템 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이러한 재조합 벡터 및 발현 시스템들은, 예컨대 백신 조제물에, 또는 다른 예로 서열의 실험 조작과 같은 다른 목적이나 연구 또는 진단 목적에 활용할 수도 있다.
본 발명은 개 파보바이러스에 대한 면역원성 및/또는 백신 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 서열번호 1, 2, 3, 4 및 5의 핵산 서열들 중 하나 이상, 또는 항원성 펩타이드나 폴리펩타이드를 코딩하는 그 서열의 일부분(항원성 영역), 예컨대 426, 430, 431, 440, 494, 555 및 572번 위치 각각에 대한 코돈들 중 하나 이상을 포함하는 서열의 일부분을 포함한다. 바람직하게는, 적어도 서열번호 2, 4 또는 5를 포함하는 서열, 또는 항원성 영역을 코딩하는 그것의 일부분이 포함될 것이다.
당해 기술 분야의 당업자는 계획한 용도에 따라 백신 조성을 바꿀 수도 있다는 것을 인지할 것이다. 즉, 백신에 포함되는 특정 성분들(변이체들)은 특별히 고안된 백신 조제물을 제조하기 위해 임의의 몇가지 매개변수에 따라 변경될 수도 있다. 예컨대, 백신은 특정 지리적 위치에서 검출되는 변이체만을 포함하도록 될 수 있다. 예로, 2a 변이체는 미국에서는 더 이상 검출되지 않으므로, 백신 제조사는 미국에서 사용할 백신 제형에는 이 변이체가 포함되지 않도록 선택할 수 있다. 미국의 백신에는 예컨대 CPV 2c 및 CPV 2b 변이체만 포함될 수 있다. 반대로, 현재 2a는 호주에서 발견되는 유일한 CPV 변이체이다. 따라서, 호주에서 사용될 백신 조성물에는 2a 변이체만 포함될 수 있다. 유럽에서 권고되는 백신에는, 예컨대 2c 및 2b 변이체가 포함될 수 있지만, 아시아 백신 조성물에는 2a 및 2b가 포함될 수 있다. 이렇듯 지리적으로 조정되는 백신들 모두 본 발명에 포함되며, 변이체 분포 변화 양상에 따라 경시적으로 변경될 수 있다. 이러한 지리학적 특이적인 백신에서 추가적으로 고려되어야하는 사항은, 변형된 생바이러스 백신에 백신 바이러스의 항원이 다량 포함되어 있다는 것이다. 따라서, 변이체에 대해 백신 접종받은 개를 변이체가 존재하지 않는 지역으로 이동시키는 경우, 새로운 환경에 방사하기 전에 적어도 약 1달 동안 동물을 격리시키는 것이 바람직하다. 그렇게 하지 않으면, 변이체가 새로운 지역으로 방출될 수 있다. 예로, 2c 변이체에 대해 백신 접종받은 개는 예컨대 호주에 방사하기 전에 격리시켜야 한다. 한달 후, 바이러스 발산(viral shedding)은 중지될 것이다. 설사 발산된 바이러스가 약독화되었더라도, 이의 존재는 바이러스 역학을 모니터링하는 시도에 혼란을 야기할 수 있으며, 천연 바이러스가 발산된 바이러스와 재조합될 수 있는 기회를 제공하여, 보다 병독성인 돌연변이를 그 지역의 집단에 도입시킬 수 있다.
또한, 백신 조성물은 특정 숙주에 이용하도록 맞춤 제조할 수 있다. 예컨대, 일부 개 품종은 어떤 변이체에 대해 다른 것 보다 더 약할 수 있거나, 또는 동물의 인생 단계(예, 강아지 대 성체)에 따라 동물은 하나 이상의 변이체에 쉽게 감염될 수도 있으며, 또는 개 이외의 숙주에 백신 접종하였을 때(예, 야생 동물, 동물원 동물 또는 금렵구 동물 등), 백신 조성물은 백신을 접종 받는 특정 숙주 동물의 감염 취약성을 고려하도록 조정할 수 있다. 예컨대, 챌린지 모델의 개발에 있어, 치와와와 래브라도 리트리버 품종은 CPV에 감염되기 쉬운 경향이 있다. 따라서, 고병독성 CPV-2c 변이체의 약 4 log가 통제된 조건(controlled setting)에서 설사 및 구토를 유도하는데 적합하다. 이러한 숙주-특이적인 또는 숙주-선택적인 백신들 모두 본 발명에 포함된다.
다른 예에서, 백신 조성물은 백신 수용체의 지역 환경에 따라 조정할 수 있다. 예를 들어, 전염으로 인한 감염 위험성이 높은, 개 100마리 이상을 사육하는 일반적인 개 사육장의 경우, 변이체 2bΔ431Δ494Δ572를 주류 및 비주류 CPV 2c 변이체 둘 다와 조합하여 포함하는 비교적 비싼 조제물로 백신 접종하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 노출 위험성이 낮은, 소규모 사육장(예, 개 25마리 미만)이나 개 한마리나 수 마리만 키우는 가정의 경우에는, 2bΔ431Δ494Δ572 또는 2bΔ494Δ572 중 어느 하나와 주류 American 2c 변이체만을 포함하는 저렴한 백신을 접종하는 것이 충분할 수 있다. 사용할 백신 조성물을 결정할 때, 동물이 질병에 접촉될 위험성을, 향후 CPV 변이체의 존재를 분자적인 측면에서 살피고 분석하는 비용 및 노력과, 비교 검토하여야 한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 강아지에게서 백신의 면역 유도를 막는 모계 항체 방해를 회피하기 위한 백신 전략을 제공한다. 다 큰 개와 강아지에 대해 하나의 백신 조제물을 사용하기 보다는, 강아지에게는 항원이 상이한 일련의 백신들을 백신 접종할 수 있다. 즉, 최초 강아지 백신에는 모계에 투여된 적 있는 것과는 상이할 수 있는 변이체가 포함되고, 후속적인 강아지 부스터 접종에는 상기 백신의 또다른 반복을 포함한다. 이런 방식으로, 다양한 스펙트럼의 항체가 증진적으로 구축될 것이다. 백신 접종 경로는 비경구 면역화 이후에 바이러스 발산과 같은 일부 백신 접종의 문제점을 극복하도록 변경시킬 수 있다. 예로, 주사 바늘을 사용하지 않는 기술을 활용하는 설상(supra-lingual) 백신 접종을 이용함으로써, 면역성은 도입시키고 배설물을 통한 발산은 방지할 수 있다.
CPV 백신 접종에 적합한 백신을 제조하는 몇 가지 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 예로, Appel 등의 미국 특허 4,193,990 및 4,193,991, Carmichael 등의 미국 특허 4,303,645, Wood 등의 미국 특허 4,971,793, Valdes 등의 미국 특허 5,882,652, Parrish 등의 5,885,585를 참조하며, 이들 문헌 각각은 적합한 백신-제형화 전략에 대한 다양한 방법을 제공한다. 상기 특허들 각각의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일반적으로, 백신을 제조하기 위해, 바이러스 내부에서 자연적으로 형성되는 기술된 핵산 서열(예, ssDNA), 또는 비천연 바이러스 벡터에 유전자 조작된 ssDNA 또는 다른 등가의 형태(예, dsDNA, ssRNA, dsRNA, RNA-DNA 하이브리드 등)가 사용될 것이다. 예로는, 투여받은 동물에게서 심각한 질병 증상을 야기하지 않도록 "사멸된", 불활성화된 또는 약독화된 CPV(또는 다른) 바이러스와, 적합한 생리학적 담체를 포함한다. 바람직하게는, 투여한 결과 질병의 증상이 나타나지 않을 것이다. 그러나, 당해 분야의 당업자는 유효한 다수의 백신 조성물들이 투여시 또는 투여 후 일부 불쾌감이나 비교적 약한 통증을 발생시킨다는 것을 알고 있을 것이다. 그러나, 최대로 발현되는 질환을 예방하는 이점이, 그러한 가능성 보다 훨씬 중요하다. 다른 예로서, 자연적으로는 감염되지 않거나 또는 백신 접종받은 동물에서 정상적으로는 질병을 유발하지 않는 이종 타입의 바이러스를 이용할 수도 있다.
약독화된 바이러스는 본래 핵산 서열(들)을 포함하는 CPV일 수 있거나, 또는 바이러스(CPV 또는 다른 바이러스)는 핵산 서열이 유전자 공학에 의해 바이러스에 삽입된 재조합일 수 있다. 재조합 백신의 경우, 핵산 서열은 CPV 이외의 다른 바이러스에 병합되어 이종의 재조합 백신을 형성할 수 있다. 이러한 바이러스의 예로는, FPV, 다양한 헤르페스바이러스, 비병원성의 "고아 바이러스(orphan viruse)", 엔테로바이러스와 같은 장 바이러스 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 바람직한 예에서, 바이러스는 살아있는 약독화된(변형된) 고역가의 CPV이며, 핵산은 ssDNA이다.
바람직하게는, 이러한 조제물은 또한 다른 CPV 변이체, 예컨대 2, 2a, 2b 및/또는 2c 변이체, 및 이후에 동정되어 유용한 것으로 간주될 수 있는 임의의 다른 CPV 변이체의, 항원성 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 것이다. 그러나, 단지 2a 및 2b 변이체만 포함하는 백신 조성물의 광범위한 유통을 고려하면, 공지의 2a-2b 백신과 함께 사용하여 그 효과를 보완하기 위해, 본원에 기술된 1종 이상의 변이체만을 포함하는 백신 조성물을 제조하는 것이 더 유익할 수 있다. 나아가, 이러한 백신은 개별 조성물이나 또는 단일 조성물 형태로 함께, 장염을 유발하는 다른 질환에 대한 백신과 더불어 투여할 수 있다.
백신의 실제 형태는 다양할 수 있다. 일 예로, 백신은 본원에 언급된 핵산 서열들을 포함하는 약독화된 CPV 바이러스로 구성된다. 바람직하게는, 백신은 다가(multivalent)이며, 또한 약독화된 CPV 2, 2a, 2b, 및/또는 2c 타입의 바이러스를 포함한다. 다른 예로, 단일 바이러스는 2종 이상의 변이체 타입들로부터 유래된 단백질(예, VP2 단백질 또는 그것의 항원성 영역)을 코딩하는 핵산을 포함하도록 유전자 조작될 수 있으며, 즉, VP2의 2곳 이상의 영역으로부터 유래된 게놈 영역을 갖는 재조합 키메라 CPV를, 당해 분야의 당업자에게 공지된 바와 같이, 2종 이상의 CPV로부터 유래된 DNA 영역들을 치환함으로써 재조합 기법에 의해 구축할 수 있다.
또한, 바이러스의 다른 형태도 고려된다. 예를 들면, 항원성 비리온이나 캡시드에 조립되지 않는 다른 CPV 단백질을 포함하는 백신과 같은, "빈(empty)" 비리온 입자 백신(핵산이 없음)도 고려된다. 이러한 경우, 백신 조제물내 단백질은 서열번호 2 및/또는 4, 또는 이들 모두에 의해 코딩되거나, 다른 예로, 보다 짧은 항원성 영역이 서열번호 2, 4 및/또는 5의 일부분에 의해 코딩된다. 서열번호 1 및/또는 3으로 코딩되는 단백질, 및/또는 서열번호 1 및/또는 3의 일부분에 의해 코딩되는 항원성 영역도 포함될 수 있다.
그외 적합한 백신 성분, 예컨대 약학적으로 허용가능한 담체는 백신으로서 사용하기 위한 조성물의 제조에서와 같이, 당해 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액이나 현탁물로서 제조되지만, 정제, 환제, 분말제 등의 고형 형태도 고려된다. 또한, 투여하기 전에 액체 중의 용액, 또는 현탁물로서 적합한 고형 형태로 제조될 수도 있다. 또한, 조제물은 유화될 수 있다. 활성 성분을 약학적으로 허용가능하며 활성 성분과 상용가능한 부형제와 혼합할 수 있다. 적합한 부형제로는, 예컨대, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이나 이의 조합이 있다. 또한, 조성물은 습윤제, 유화제, pH 완충제 등과 같은 보조 물질들을 최소량 포함할 수도 있다. 경구 형태의 조성물 투여가 바람직한 경우, 다양한 점증제, 향료, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제 등을 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물은 투여에 적합한 형태로 조성물을 제공하기 위해 그러한 임의의 추가적인 성분들을 포함할 수 있다. 제형내 번역가능한 핵산의 최종 함량은 다양할 수 있다. 그러나, 통상적으로 그 함량은 약 1-99%일 것이다. 조성물은 추가로 보강제를 포함할 수 있으며, 이의 적정 예로는 Seppic, Quil A, Alhydrogel 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 면역원성/백신 조제물은, 주입, 경구, 코내, 항원 등을 포함하는 식품의 섭취 등의, 당해 분야의 당업자에게 잘 알려져 있는 수많은 적합한 수단으로 투여할 수 있다. 그러나, 바람직한 예에서, 투여 방식은 주입이다. 또한, 조성물은 단독으로 또는 예컨대 다성분 백신의 일부분으로서 다른 약제나 면역원성 조성물과 조합하여 투여할 수도 있다. 나아가, 투여는 1회일 수 있거나, 또는 여러번의 부스터 투약으로 다양한 시간 간격으로 실시하여 면역 반응을 증대시킬 수도 있다. 또한, 투여는 예방적일 수 있으며, 즉 바이러스에 노출되기 전이나 노출된 것으로 의심되기 전이거나 또는 사후, 예컨대 노출을 인지한 후나 노출로 의심된 후일 수 있으며, 또는 치료적, 예컨대 바이러스 감염과 관련있는 질병 증상들이 나타난 후일 수 있다.
조제물의 투여시, 본 발명의 핵산 서열은 백신을 투여받은 숙주 동물내에서 발현되며, 숙주 동물은 핵산에 의해 코딩되는 항원성 단백질(또는 그것의 일부분)에 대한 면역 반응을 갖추게 된다. 바람직하게는, 발생되는 면역 반응은 예방적 면역 반응이다. 일부 예들에서, 약독화된 바이러스는 엄밀히 필수적인 것은 아니지만, 숙주내에서 복제할 수 있는 능력을 보유하고 있다.
본 발명은 CPV 감염 증상을 이를 필요로하는 포유류에서 예방하는 방법을 제공한다. 일반적으로, CPV 백신은 강아지 및/또는 성체 개에게 활성 면역성을 제공하기 위해 투여된다. 상기 방법은 서열번호 2, 4 및 5 중 하나 이상으로 표시되는 서열, 또는 VP2의 항원성 영역을 코딩하는 이의 일부분을 포함하는 핵산, 바람직하게는 서열번호 1, 2, 3, 4 및 5 중 하나 이상으로 표시되는 서열 또는 VP2의 항원성 영역을 코딩하는 이의 일부분을 포함하는, 면역원성 및/또는 백신 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 예에서, 상기 조제물은 그외 임상적으로 관련있는 CPV 변이체, 바람직하게는 2a 및 2b 변이체와 선택적으로 오리지날 CPV2를 코딩하는 핵산을 포함한다. 조성물의 투여로 수용체에서는 면역 반응이 발생된다. 바람직하게는, 상기 면역 반응은 향후 CPV 노출에 대해 예방적이며, 질병의 증상을 완전히 소거시키거나 또는 백신 접종하지 않았을 때 나타나는 것 보다 약한 수준으로 질병의 증상을 완화시킨다.
본 발명의 바람직한 예에서, 본 발명의 백신으로 백신 접종받는 동물은 성체 개 및 강아지 등의 사육 개이다. 그러나, 다른 잠재적인 CPV 숙주의 백신 접종도 고려된다. 다른 잠재적인 숙주로는 야생 갯과 동물(예, 늑대, 야생 개 종 등)와 같은 다른 갯과 동물, 고양이과 동물(사육 고양이와 새끼 고양이, 야생이거나 사육되는 좀더 큰 종의 고양이과 동물), 밍크, 레드 팬더, 여우, 사자 및 호랑이 등이 있다. 백신은 물론 사육 동물에 사용될 것이지만, 야생형 또는 부분적으로 사육되는 동물, 예컨대 동물원이나 보호 구역, 공원, 연구 시설 등의 동물도 이러한 백신 접종의 혜택을 받을 수 있다. CPV 및 CPV 변이체가 기생할 수 있는 임의의 동물은, 바이러스가 숙주에서 질병 증상을 유발하던지 유발하지 않든지 간에, 본원에 제공되는 백신 조제물에 의한 백신 접종이 유익할 수 있다. 보다 감수성인 집단으로 바이러스가 전파되는 것을 억제하기 위해, 바이러스(즉, 사일런트 캐리어) 감염시 무증상인 동물에게 백신을 접종하는 것이 좋을 것이다.
또한, 본 발명은 타입 2bΔ494Δ572, 2bΔ431, 2cΔ440 및/또는 American 2c 변이체 CPV들의 단백질의 항원 결정부위나 항원성 영역에 특이적으로 또는 선택적으로 결합하는 항체들을 제공한다. 그러한 여러가지 항체들은, 단일클론 항체가 일반적으로 바람직하지만, 다클론 또는 단일클론일 수 있다. 단일클론 항체들은 마우스에 변이체(단백질 형태나 단백질을 코딩하는 핵산 중 어느 하나)를 주입함으로써 제조될 것이다. 3번의 부스터를 실시한 후, 비장을 수거하여 골수종 세포와 융합시킨다. 단일클론 항체를 생산하는 클론들은 ELISA, HA-HI 및 비간접 형광 항체 테스트로 스크리닝한다. 2bΔ494Δ572, 2bΔ431, 2cΔ440 및/또는 American 2c 유전자형과 반응하는 클론들을, CPV 진단 분석법을 개발하기 위해 수득한다. 다클론 항체는 2bΔ494Δ572, 2bΔ431, 2cΔ440 및/또는 American 2c 변이체들의 바람직한 항원성 타겟인 아미노산 코돈을 포함하는 한가지 이상의 펩타이드를 예컨대 토끼에 주사하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 CP 변이체, 및 선택적으로 물론 그외 CPV 변이체(예, CPV2, 2a 및 2b)를 검출하기 위한 진단 키트를 제공한다. 이러한 키트에는 본원에 언급된 핵산 서열을 증폭(예, 중합효소 연쇄 반응에 의해)하기 위한 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머가 포함된다. 다른 예로, 상기 키트에는, 상기 변이체, 및 선택적으로 물론 다른 변이체(예, CPV2, 2a 및 2b)에 의해 제시되는 독특한 항원성 결정부위에 선택적으로 또는 특이적으로 결합하는 항체(예, 단일클론 또는 다클론)가 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, CPV의 시험관내 배양하는 새로운 방법을 제공한다. 상기 방법은 적합한 배지 중에, 1) CPV에 감염되기 쉬운 것으로 알려져 있는 세포 및 2) Vero 세포의 혼합 세포 배양물에서 바이러스를 배양하는 것을 포함한다. 바람직한 예에서, CPV에 감염되기 쉬운 세포는 CRFK 세포이다. 그러나, 이러한 세포 이외의 타입의 세포도 사용할 수 있으며, 그 예로는 하기의 세포들이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다: A72 갯과 동물의 섬유종-유래 세포; NLFK(Nordisk Laboratory feline kidney) 세포 등의 CRFK 유래 세포; Fe3Tg 세포 등의 고양이과 동물의 혀 세포; AK-D 세포 등의 고양이과 동물의 폐 세포; 3201 등의 고양이과 동물의 림프종 세포주; CT 45-S 등의 갯과 동물의 T-세포주; Cf2Th 등의 갯과 동물의 흉선 상피 세포 등. 더욱이, 다양한 고양이과 동물 및 갯과 동물의 세포주와 이의 배양 지침서는 미국 버지니아주 마나사스의 American Type Culture Collection으로부터 구할 수 있다.
이들 세포주들은 당해 분야의 당업자들에게 공지된 다양한 배지 중에서 Vero 세포와 함께 증식시킬 수 있다. 예로, CT 45-S 세포는 RPMI 1640 배지에서 배양할 수 있으며, AK-D, Fe2lu 및 Cf2Ths 세포는 10% 소태아 혈청(FBS)이 첨가된 둘베코의 최소 필수 배지(MEM)에서 배양할 수 있으며, 3201, NLFK, CRFL, A72 및 Fc3 Tg 세포는 5% FCS가 첨가된 McCoy's 5A 및 L15에서 배양할 수 있다. 통상적으로, 세포주들은 37 ℃에서 4-5일간 동시에 배양한다.
실시예
개요
개 파보바이러스(CPV) 감염은 가장 심각하고 만연된 개 질병으로, 강아지에서 설사를 야기하는 가장 흔한 요인이다. CPV에 대한 백신을 이용할 수 있어 널리 사용되고 있지만, 근래 몇 년간 백신 접종받은 개에게서 CPV가 발병되고 있다. 예컨대, 미국 중남부 지역에서 개를 사육하는 소유자들은 백신을 접종하였음에도 불구하고 CPV 감염으로 인한 강아지 사망율이 높다는 것을 확인하였다.
CPV는 이의 숙주 범위 및 향성(tropism) 변화 능력과 높은 수준의 돌연변이율을 보유한 단일 가닥의 DNA 바이러스이다. 현재 이용가능한 상업적인 백신에는 전형적으로 CPV2, CPV2a 및 CPV2b 변이체들만 포함되어 있다. CPV 백신을 접종하였지만 명백한 파보바이러스 감염 증상을 나타내는 개의 샘플을 분석하던 중, 본 발명자들은 현재의 CPV 진단 테스트에 의한 CPV 검출에 기능적 차이가 있으며, 현재의 키트로는 현장 바이러스를 검출할 수 없음을 알게 되었는데, 이는 CPV가 2a 및 2b 서브 타입 이외의 타입으로 진화되었을 수 있음을 의미한다. 추가적인 연구를 통해, 2가지 CPV 변이체, 즉 2bΔ494Δ572와 American 2c를 동정하였다. 분리물들은 강하된 병독성과 지금까지 배양한 CPV 분리물에서 관찰되는 것 보다 광범위한 조직 향성을 수반하였다. 또한, 새로운 CPV 분리물들은 과거 CPV-2 유전자형에 의해 유발되는 출혈성 설사가 아닌 황색 점액성 설사를 유발하는 것으로 보인다. 다른 보고들과 일관되게, 2bΔ494Δ572 변이체에는 2개의 코돈 변화가 있다. American 2c 변이체는 이전에 이태리, 스페인 및 베트남에서 검출되었으며, 미국에서는 이전에는 발견되지 않았다.
재료 및 방법
배설물 샘플을 오클라호마 동물 질병 진단 실험실로부터 아이스 포장(약 4-5 ℃) 상태로 페더럴 익스프레스로 제공받았다. 배설물 최소 2-5 g 또는 설사 액체변 2-5 ml을 제공받았다. 배설물 샘플은 일반적으로 상업적으로 이용가능한 CPV 효소 연계성 면역흡착 분석(ELISA)(들)으로 같은 날 테스트한다. 본 발명자들은 형광 항체 테스트(FAT) 또는 면역조직화학(IHC)를 위해 장의 여러 곳으로부터 창자고리(intestinal loop)(약 2-3 피스)를 수득한다. 때로는, FAT 또는 IHC나 CPV 실험을 위한 중합효소 연쇄 반응(PCR)용으로 혀에서 단편들을 회수한다. 이들 피검물은 FedExp를 통해 아이스 포장의 냉각 상태로 제공받는다. 많은 CPV 사례들은 현장 진단 키트(Assure, Synbiotics, CA; or IDEXX, Bar Harbor, Maine)에서 CPV 음성으로 평가된 병력을 가지고 있다.
CPV의 존재 병력을 가진 강아지와 성체 개의 장을 대상으로, 조직 병리학 검사를 수행하였다. 병력에는 출혈성 또는 점액성 설사와 사망이 포함된다. 포르말린-고정시킨 신선한 장 조직에서, CPV 공존성 상해 부분; 소낭선 확장(crypt dilatation)과 괴사, 장 융모의 감소를 검사하였다.
형광 항체(FAT) 테스트를 실시하여 장에서 CPV 항원을 스크리닝하였다. 6-8 ㎛ 두께의 장 단편을 아세톤으로 고정한 다음 공기 중에 건조시켰다. FITC로 표지된 항-CPV 접합체를 첨가한 다음, 단편을 30분간 37 ℃에 인큐베이션하였다. 세정 후, 단편을 트립판 블루로 대조염색하였다. 그 후, 단편들은 형광 현미경으로 검경하였다: FAT 테스트에서, CPV 양성 세포는 애플 그린으로 염색되고, CPV 음성 세포는 벽돌빛 레드로 염색된다.
조직 병리학 검사에 사용한 포르말린-고정시킨 단편들에 대해 CPV 항원에 대한 면역-조직화학법을 실시하였다.
배설물 샘플과 CPV 양성이거나 의심되는 장의 긁어낸 샘플에 대해, Desario et al., 2005에 기술된 바와 같이, PCR 후 서열분석을 실시하였다. 바이러스 단백질 유전자 부분을 PCR로 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물은 아가로스 젤 전기영동으로 확인하고, 서열분석을 위해 겔로부터 분리시켰다.
서열은 유전자은행에 등재되어 있는 막대한 수집 서열들과 비교하는 BLAST 프로그램으로 분석하였다. 서열들 모두 개 파보바이러스와 유사한 것으로 동정되었다.
실시예 1. 현행 CPV 진단 테스트의 문제점
배설물 샘플들을 상기와 같이 분석하였는 바, 샘플들 모두 조직병리학, 형광 항체 테스트 결과 및 면역-조직화학 결과로 결정된 특징적인 상해의 표준 기준에서는 양성이었다. 그렇지만, 상업적인 진단 테스트를 이용하여 동일 샘플들을 테스트한 결과, 테스트를 통한 이들 샘플에 대한 CPV 현장 진단 결과를 신뢰할 수 없었으며, CPV 양성 사례의 33-50%는 검출하지 못하였다.
이들 CPV 분리물 대부분은, 백신 라벨에 따라 상업적인 CPV 백신을 현재 사용하고 있지만 여전히 CPV가 발병되고 있으며 사망이 나타나고 있는 사육 시설로부터 수득하였다. 이러한 예방 부족은 CPV 신생 출현 분리물의 항원 변이로 인한 것일 수 있다. 이러한 많은 CPV 사례(n ~500)에 대한 현장 유행병 관찰 결과는 이러한 새로운 CPV 변이체의 상업적인 CPV 백신내 통합 필요성을 의미한다.
실시예 2. CPV 분리물의 서열분석: 2bΔ494Δ572 변이체 및 CPV2c 분리물의 동정
백신과 진단 키트의 문제점은 일반적으로 바이러스 진화에 대한 유행병학적 증거인 것으로 생각된다. 따라서, 연구 중인 샘플내에 새로운 CPV 변이체의 존재가 의심되었다. 이를 확인하기 위해, 바이러스 단백질 VP2의 일부분에 대한 PCR-서열분석을 배설물 샘플로부터 수득한 바이러스를 대상으로 수행하였고, 그 결과는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램 및/또는 매뉴얼 정렬을 이용하여 공지된 VP2 서열과 비교하였다.
그 결과들은 샘플내 신생 출현주 CPV 타입 2종의 존재를 확인시켰다: 1) 2bΔ494Δ572로 표시되는 2b의 변이체; 및 2) 미국에서 지금까지 보고된 바 없었던 American 2c. 이들 2종의 변이체의 VP2 단백질의 일부분을 코딩하는 DNA 서열들은 도 1(2bΔ494Δ572, 서열번호 1) 및 도 3(American 2c, 서열번호 3)에 나타낸다. 이들 서열을 공지의 CPV2 기준 서열과 비교한 결과, 2bΔ494Δ572에서는 494 및 572 코돈에 변화가 있는 것으로 확인되었다. 일반적인 CPV2는 494 코돈이 TGT인데, 2bΔ494Δ572의 494 코돈은 TGC이다. 이와 유사하게, CPV2 분리물에서의 572번 위치의 일반적인 코돈은 GTA인데, 2bΔ494Δ572의 경우에는 GTC이다. 이러한 차이는 VP2 단백질의 아미노산 서열에 변화를 일으키진 않는다. 그러나, 이러한 차이는 바이러스의 생활 주기 중 한 단계 이상에서, 예컨대 복제, 전사 또는 번역 효율 측면에서 2bΔ494Δ572 변이체에 이점을 부여할 가능성이 있다. 중요한 점은, 샘플내 American 2c의 존재 확인은 미국에서 이 CPV 변이체에 대한 최초 보고라는 것이며, 이는 주류 변이체로서의 이의 출현의 전조일 수 있다. 백신 실패 경우의 약 50%는 CPV2bΔ494Δ572의 존재로 인한 것이었고, 50%는 CPV2c 또는 CPV2cΔ430Δ440이 원인이었다.
이러한 사실들은, 주류 CPV 변이체로서의 2bΔ494Δ572 및 American 2c의 출현을 의미하며, CPV 백신 조제물내 이들 변이체의 병합 필요성을 시사한다.
다른 변이체들도 유사한 방식으로 동정하였다.
실시예 3. 변이체의 이차 구조와 관련 에너지의 결정
바이러스 병원체의 병독성은 바이러스 게놈의 이차 구조 요소들과 관련있는 것으로 알려져 있다(Pellerin et al., 1994. Virology 203: 260-268). 2c, 2bΔ431 및 2cΔ430Δ440 변이체들의 고가변성 영역의 폴딩 양상을 월드 와이드 웹 상의 웹사이트: mfold.burnet.edu.au에 있는 "mfold" DNA 폴딩 프로그램을 이용하여 분석하였다. 그 결과는 도 6-8에 나타내며, 여기에는 각 변이체의 폴딩 양상과 관련 에너지가 도시되어 있다. 도에서 볼 수 있는 바와 같이, 이차 구조 영역은 유지되며, 언폴딩(unfolding)의 에너지 수준은 바뀔 수 있다.
실시예 4. CPV에 대한 새로운 다가 백신의 개발 및 테스트
새롭게 출현하는 CPV 변이체를 예방하는 새로운 다가 백신을 개발한다. 이 백신에는 CPV2a, 2bΔ494Δ572, 2bΔ431, American 2c, 2cΔ440 타입들 중 한가지 이상의 약독화된 CPV 바이러스와, 선택적으로 CPV2가 포함된다. 즉, 이 신생 백신에서, CPV 2b는 주류 유전자형으로서 나타나는 것으로 새롭게 확인되고 있는 2bΔ494Δ572로 교체된다. 더 이상 위협적이지 않은 것으로 보이는 CPV2의 포함 여부는 선택사항이다.
다가 백신으로 백신 접종받은 동물은 백신 제조에 사용된 변이체에 의한 파보바이러스 감염 증상의 발현을 예방한다.
실시예 5. CPV 증식에 대한 신규한 혼성 세포 배양 방법
CPV는 통상적으로 CRFK(Crandall feline kidney) 세포주 등의 단일 세포 타입만을 포함하는 세포 배양물에서 배양한다.
개선된 CPV 배양 방법을 개발하였다. 신규 방법에 따라, CPV는 CRFK와 Vero 세포의 동량 혼합물에서 최소 필수 배지(MEM) 중에 배양한다. 이들 2가지 세포주들을 파종한 다음, 1시간 후에 샘플을 접종한다. 이 단계에서, 세포는 부착되지만 여전히 세포 분열 초기 단계에 머무른다. 새로운 세포 배양 방법은, CPV를 CRFK 세포 단독으로 배양하였을 때 보다 보다 신속하게 검출할 수 있는 세포 병리학적 효과를 발생시킨다. 또한, 혼성 세포 배양물에서 3세대 연속 계대 배양에서 고역가의 CPV 생산이 유지되었다.
본 발명은 이의 바람직한 구현예 측면에서 설명되었지만, 당업자라면 본 발명이 첨부된 청구항의 사상 및 범위내에서 변형된 형태로 실시할 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명은 전술한 구현예로 한정되지 않아야 하며, 본원에 제공된 내용의 사상 및 범위내의 모든 변형 및 등가를 더욱 포함하여야 한다. 본원에 인용된 모든 미국 특허, 특허 출원 및 그외 참고문헌들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
참고문헌
Buonavoglia, Canio, V. Martella, A. Pratelli, M. Tempesta, A. Cavalli, D. Buonavoglia, G. Bozzo, G. Elia, N. Decaro and L. Carmichael, J. Gen . Virol. (2001) 82, 3021-3025.
Decaro, Nicola, V. Martella, G. Elia, C. Desario, M. Compolo, E. Lorusso, M. L. Colaianni, A. Lorusso, and C. Buonavoglia, Vet . Micro. 121 (2007) 39-44.
Desario, Constantina, N. Decaro, M. Campolo, A. Cavalli, F. Cirone, G. Elia, V. Martella, E. Lorusso, M. Camero and C. Buonavoglia. J. Virol . Methods 126 (2005) 179-185.
Nakamura, Kazuya, M. Sakamoto, Y. Ikeda, E., Sato, K. Kawakami, T. Miyazawa, Y. Tohya, E. Takahashi, E. Mikami, T. Mikami and M. Mochizuki. Clin . Diag . Lab . Immuno. (2001) 663-668.
Nakamura M., Tohya, Y., Miyazawa, T., Mochizuki, M., Phung, H. T., Nguyen, N. H., Huynh, L. M., Nguyen, L. T., P. N. Nguyen, P. N., Nguyen, P. V., Akashi, H. (2004) Arch . Virol. 149, 2261-2269.
Parrish, Colin R. And and Yoshihiro Kawaoka, Annu . Rev . Microbiol. (2005) 59, 553-86.
Truyen, Uwe. Veterinary Microbiology (2006) 117, 9-13.
SEQUENCE LISTING <110> THE BOARD OF REGENTS FOR OKLAHOMA STATE UNIVERSITY Kapil, Sanjay Cooper, Emily <120> VACCINES CONTAINING CANINE PARVOVIRUS GENETIC VARIANTS <130> 08-440 WO <150> US 60/943,947 <151> 2007-06-14 <150> US 61/027,618 <151> 2008-02-11 <160> 5 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 441 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 1 gatgataatg tattgctacc aacagatcca attggaggta aaacaggaat taactatact 60 aatatattta atacttatgg tcctttaact gcattaaata atgtaccacc agtttatcca 120 aatggtcaaa tttgggataa agaatttgat actgacttaa aaccaagact tcatgtaaat 180 gcaccatttg tttgtcaaaa taattgccct ggtcaattat ttgtaaaagt tgcgcctaat 240 ttaacaaatg aatatgatcc tgatgcatct gctaatatgt caagaattgt aacttactca 300 gatttttggt ggaaaggtaa attagtattt aaagctaaac taagagcctc tcatacttgg 360 aatccaattc aacaaatgag tattaatgta gataaccaat ttaactatgt accaagtaat 420 attggaggta tgaaaattgt c 441 <210> 2 <211> 441 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 2 gatgataatg tattgctgcc aacagatcca attggaggta aaacaggaat taactatact 60 aatatattta atacttatgg tcctttaact gcattaaata atgtaccacc agtttatcca 120 aatggtcaaa tttgggataa agaatttgat actgacttaa aaccaagact tcatgtaaat 180 gcaccatttg tttgtcaaaa taattgccct ggtcaattat ttgtaaaagt tgcgcctaat 240 ttaacaaatg aatatgatcc tgatgcatct gctaatatgt caagaattgt aacttactca 300 gatttttggt ggaaaggtaa attagtattt aaagctaaac taagagcctc tcatacttgg 360 aatccaattc aacaaatgag tattaatgta gataaccaat ttaactatgt accaagtaat 420 attggaggta tgaaaattgt c 441 <210> 3 <211> 441 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 3 gaagataatg tattgctacc aacagatcca attggaggta aaacaggaat taactatact 60 aatatattta atacttatgg tcctttaact gcattaaata atgtaccacc agtttatcca 120 aatggtcaaa tttgggataa agaatttgat actgacttaa aaccaagact tcatgtaaat 180 gcaccatttg tttgtcaaaa taattgtcct ggtcaattat ttgtaaaagt tgcgcctaat 240 ttaacaaatg aatatgatcc tgatgcatct gctaatatgt caagaattgt aacttactca 300 gatttttggt ggaaaggtaa attagtattt aaagctaaac taagagcctc tcatacttgg 360 aatccaattc aacaaatgag tattaatgta gataaccaat ttaactatgt accaagtaat 420 attggaggta tgaaaattgt a 441 <210> 4 <211> 441 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 4 gaagataatg tattgctacc aacagatcca attggaggta aagcaggaat taactatact 60 aatatattta atacttatgg tcctttaact gcattaaata atgtaccacc agtttatcca 120 aatggtcaaa tttgggataa agaatttgat actgacttaa aaccaagact tcatgtaaat 180 gcaccatttg tttgtcaaaa taattgtcct ggtcaattat ttgtaaaagt tgcgcctaat 240 ttaacaaatg aatatgatcc tgatgcatct gctaatatgt caagaattgt aacttactca 300 gatttttggt ggaaaggtaa attagtattt aaagctaaac taagagcctc tcatacttgg 360 aatccaattc aacaaatgag tattaatgta gataaccaat ttaactatgt accaagtaat 420 attggaggta tgaaaattgt a 441 <210> 5 <211> 441 <212> DNA <213> Canine parvovirus <400> 5 gaagataatg tattactacc aacagatcca attggaggta aagcaggaat taactatact 60 aatatattta atacttatgg tcctttaact gcattaaata atgtaccacc agtttatcca 120 aatggtcaaa tttgggataa agaatttgat actgacttaa aaccaagact tcatgtaaat 180 gcaccatttg tttgtcaaaa taattgtcct ggtcaattat ttgtaaaagt tgcgcctaat 240 ttaacaaatg aatatgatcc tgatgcatct gctaatatgt caagaattgt aacttactca 300 gatttttggt ggaaaggtaa attagtattt aaagctaaac taagagcctc tcatacttgg 360 aatccaattc aacaaatgag tattaatgta gataaccaat ttaactatgt accaagtaat 420 attggaggta tgaaaattgt a 441

Claims (15)

  1. 서열번호 2 또는 항원 영역을 코딩하는 서열번호 2의 일부분; 및
    서열번호 4 또는 항원 영역을 코딩하는 서열번호 4의 일부분 중 하나 이상을 포함하는 파보바이러스 백신(parvovirus vaccine).
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1 또는 항원 영역을 코딩하는 서열번호 1의 일부분; 서열번호 3 또는 항원 영역을 코딩하는 서열번호 3의 일부분, 및 타입 VP-2b 단백질을 코딩하는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 파보바이러스 백신.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 2 또는 서열번호 2의 일부분과 서열번호 4 또는 서열번호 4의 일부분이 약독화된 파보바이러스에 존재하는 것을 특징으로 하는 파보바이러스 백신.
  4. 파보바이러스 감염에 대해 동물에게 백신 접종(vaccinating)하는 방법으로서,
    상기 동물에게,
    서열번호 2 또는 항원 영역을 코딩하는 서열번호 2의 일부분; 및
    서열번호 4 또는 항원 영역을 코딩하는 서열번호 4의 일부분을 포함하는 파보바이러스 백신을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 파보바이러스 백신은 서열번호 1 또는 항원 영역을 코딩하는 서열번호 1의 일부분; 서열번호 3 또는 항원 영역을 코딩하는 서열번호 3의 일부분, 및 타입 VP-2b 단백질을 코딩하는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 서열번호 2 또는 서열번호 2의 일부분과 서열번호 4 또는 서열번호 4의 일부분이 약독화된 파보바이러스에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 생물학적 샘플에서 CPV의 존재를 검출하는 방법으로서,
    상기 샘플을, a) 서열번호 1, 2, 3, 및 4 중 하나 이상의 핵산 서열이나, b) 서열번호 1, 2, 3 및 4 중 하나 이상의 핵산 서열로 코딩되는 아미노산 서열에, 특이적으로 또는 선택적으로 결합하는 분자에 노출시키는 단계; 및
    상기 분자들, 상기 핵산 서열들 또는 상기 하나 이상의 아미노산 서열들 간의 결합 발생을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 분자는 올리고뉴클레오티드 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 분자는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 진단 키트로서,
    a) 서열번호 1, 2, 3, 및 4 중 하나 이상의 핵산 서열이나, b) 서열번호 1, 2, 3 및 4 중 하나 이상의 핵산 서열로 코딩되는 아미노산 서열을 검출하기 위한 특이적인 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 분자는 올리고뉴클레오티드 프라이머인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  12. 제10항에 있어서, 상기 분자는 항체인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  13. 개 파보바이러스의 증식 방법으로서,
    적합한 배지 중의 CRFK(Crandall feline kidney) 세포와 Vero 세포의 혼합물에서 상기 개 파보바이러스를 배양하는 단계를 포함하며,
    상기 배양 단계는, CPV를 CRFK 단독 세포에서 배양하였을 때 달성되는 역가로 상기 개 파보바이러스를 증식시키는 조건하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 1종 이상의 CPV 변이체를 포함하는 파보바이러스 백신으로서,
    상기 1종 이상의 CPV 변이체의 중화율이 CPV-2, CPV-2a, CPV-2b 및 CPV 2c로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 CPV 변이체의 중화율 보다 적어도 4배 낮은 것을 특징으로 하는 파보바이러스 백신.
  15. 제14항에 있어서, 상기 중화율은 혈청 중화 분석으로 결정되며 중화 역가로서 표시되는 것을 특징으로 하는 파보바이러스 백신.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020256419A1 (ko) * 2019-06-18 2020-12-24 주식회사 바이오앱 개 파보바이러스 감염증 치료를 위한 항체 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006027698A1 (en) 2004-09-09 2006-03-16 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co Kg. Decreasing potential iatrogenic risks associated with influenza vaccines
MX2009013628A (es) 2007-06-14 2010-02-22 Univ Oklahoma State Vacunas que contienen variantes geneticas de parvovirus canino.
US8227583B2 (en) * 2007-06-14 2012-07-24 The Board Of Regents For Oklahoma State University Vaccines containing canine parvovirus genetic variants
JP2012533557A (ja) * 2009-07-17 2012-12-27 ザ・ボード・オブ・リージェンツ・フォー・オクラホマ・ステート・ユニバーシティ 舌上ワクチン及びアプリケーター
EP2488634A4 (en) 2009-10-14 2013-04-03 Univ Oklahoma State ISOLATION OF A VIRUS RELATED TO DOG PARVOVIRUS 2 IN A WASHBASIN
WO2011107534A1 (en) * 2010-03-05 2011-09-09 Intervet International B.V. Recombinant attenuated parvovirus
US9186398B2 (en) * 2010-07-16 2015-11-17 Intervet Inc. Live attenuated parvovirus
US9314519B2 (en) 2012-08-21 2016-04-19 Intervet Inc. Liquid stable virus vaccines
US9480739B2 (en) 2013-03-15 2016-11-01 Intervet Inc. Bovine virus vaccines that are liquid stable
US9393298B2 (en) 2013-03-15 2016-07-19 Intervet Inc. Liquid stable bovine virus vaccines
AR097762A1 (es) 2013-09-27 2016-04-13 Intervet Int Bv Formulaciones secas de vacunas que son estables a temperatura ambiente
AR099470A1 (es) 2014-02-17 2016-07-27 Intervet Int Bv Vacunas de virus de aves de corral líquidas
TWI670085B (zh) 2014-02-19 2019-09-01 荷蘭商英特威國際公司 液體穩定之豬病毒疫苗
KR101622554B1 (ko) 2014-07-16 2016-05-19 (주)양성그린바이오 면역항체를 이용한 강아지질병의 치료용 조성물의 제조방법
US10233509B2 (en) 2016-12-07 2019-03-19 Credo Biomedical Pte Ltd. Method for detection CPV 2a, 2b, and 2c and for discrimination wild type from vaccine type
CN107827958B (zh) * 2017-11-11 2020-08-25 中牧实业股份有限公司 犬细小病毒合成肽疫苗及其制备方法和应用
CN110819735A (zh) * 2018-08-13 2020-02-21 北京美莱博医学科技有限公司 鉴定犬细小病毒的成套试剂和试剂盒
CN110157687A (zh) * 2019-05-25 2019-08-23 青岛易邦生物工程有限公司 一种犬细小病毒三价亚单位疫苗

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4193991A (en) * 1978-12-20 1980-03-18 Cornell Research Foundation, Inc. Canine parvovirus vaccine
US4193990A (en) * 1979-02-16 1980-03-18 Cornell Research Foundation, Inc. Heterotypic canine parvovirus vaccine
US4303645A (en) * 1980-04-18 1981-12-01 Cornell Research Foundation, Inc. Modified living canine parvovirus vaccine
GB8502399D0 (en) * 1985-01-31 1985-03-06 Akzo Nv Canine parvovirus vaccines
US5077195A (en) * 1985-03-01 1991-12-31 Board Of Reagents, The University Of Texas System Polypeptides complementary to peptides or proteins having an amino acid sequence or nucleotide coding sequence at least partially known and methods of design therefor
WO1988002026A1 (en) * 1986-09-08 1988-03-24 Applied Biotechnology, Inc. Empty viral capsid vaccines
US4971793A (en) * 1988-05-09 1990-11-20 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Subunit canine parvovirus vaccine
ES2026826A6 (es) * 1991-03-26 1992-05-01 Ercros Sa Procedimiento para la produccion de una vacuna subunidad contra el parvovirus canino y otros virus relacionados.
US5449608A (en) * 1993-03-22 1995-09-12 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Parvovirus B19 receptor and parvovirus B19 detection
US5885585A (en) * 1994-11-08 1999-03-23 Cornell Research Foundation, Inc. Attenuated canine parvovirus vaccine
US5814510A (en) * 1994-11-08 1998-09-29 Cornell Research Foundation, Inc. Attenuated canine parvovirus vaccine
CA2223029A1 (en) * 1997-02-12 1998-08-12 Akzo Nobel Nv Canine parvovirus dna vaccines
EP1303613A2 (en) 2000-06-23 2003-04-23 American Cyanamid Company Rescue of canine distemper virus from cdna
WO2003002753A2 (en) * 2001-06-28 2003-01-09 Chiron Corporation Diagnostic assays for parvovirus b19
WO2004098391A2 (en) * 2003-05-05 2004-11-18 Tamar Smith-Norowitz Methods for detecting parvovirous infections
RU2242994C1 (ru) * 2003-08-05 2004-12-27 Федеральное государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных Штамм № r-72 вниизж парвовируса собак для изготовления диагностических и вакцинных препаратов
US7598071B2 (en) * 2004-07-09 2009-10-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Infectious clone of human parvovirus B19 and methods
JPWO2008032796A1 (ja) 2006-09-13 2010-01-28 日本全薬工業株式会社 新規イヌ用ワクチン
MX2009013628A (es) 2007-06-14 2010-02-22 Univ Oklahoma State Vacunas que contienen variantes geneticas de parvovirus canino.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020256419A1 (ko) * 2019-06-18 2020-12-24 주식회사 바이오앱 개 파보바이러스 감염증 치료를 위한 항체 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CA2690668C (en) 2014-08-19
CO6290703A2 (es) 2011-06-20
AU2008266120A2 (en) 2010-11-11
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