CN110317794A - 一种重组杆状病毒、貉细小病毒重组亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种重组杆状病毒、貉细小病毒重组亚单位疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种重组杆状病毒、貉细小病毒重组亚单位疫苗及其制备方法，涉及兽用生物制品及生物领域。本发明的一种重组杆状病毒，已于2019年4月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17486，命名为重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒ACMPV‑VP2。本发明首先构建了能够表达RDPV VP2蛋白的重组杆状病毒，将其接入昆虫细胞生产RDPV亚单位疫苗。所制备的疫苗含有重组RDPV衣壳蛋白，而不含有RDPV病毒基因组成分，从而避免了病毒扩散和基因组释放的风险。本发明避免了传统疫苗制备工艺存在的成本高的缺点，填补了目前没有貉子专用细小病毒疫苗的空白。

Description

一种重组杆状病毒、貉细小病毒重组亚单位疫苗及其制备 方法
技术领域
本发明涉及兽用生物制品及生物技术领域，具体涉及一种重组杆状病毒、貉细小病毒重组亚单位疫苗及其制备方法。
背景技术
貉细小病毒性肠炎(raccoon dog viral enteritis，RDVE)是由貉细小病毒(Raccoon dog Parvovirus，RDPV)引起的一种急性、高度接触性传染疾病，该病以腹泻为主要特征，具有较高的发病率和死亡率。
RDPV在分类上隶属于细小病毒科(Parvoviridae)，细小病毒属(Parvovirus)，为无囊膜单链DNA病毒。RDPV主要编码两种结构蛋白：VPl和VP2，VP2位于VPl的C端，VP2蛋白的N端氨基酸序列和VPl蛋白的C端氨基酸序列相互重叠，且二者终止于同一密码子(ParrishCR，1999)。VP1蛋白包含727个氨基酸，其中含有584个氨基酸的VP2蛋白和143个氨基酸的独特区。
RDPV粒子为直径20～24nm的轴对称的二十面体结构，无囊膜，不含糖类和脂质，结构坚实紧密，粒子内含有单股负链DNA。RDPV的基因组大约为5kb，分子量约为1.5～2.0×106kD。在其基因组中有两个主要的开放阅读框架，它们分别编码结构蛋白(VP1和VP2)和非结构蛋白(NSl和NS2)。
RDPV感染貉子后，可引起貉子的肠黏膜炎症、坏死，继而引发貉子的剧烈腹泻，该病发病急、致死率高。RDPV可感染各年龄段的貉子，对幼貉的感染性极强。1984年，貉细小病毒性肠炎在我国黑龙江省首次报道。1988年，夏咸柱等从不同地区肠炎病貉分离出3株貉细小病毒，从而首次证实了貉细小病毒在我国的存在。貉子细小病毒性肠炎的防治也主要以预防为主。
目前用于貉子细小病毒性肠炎的疫苗主要是MEV灭活疫苗。该灭活疫苗在灭活过程中使用的灭活剂-甲醛会在一定程度上破坏病毒的蛋白，并且灭活不彻底还会有散毒的风险，灭活疫苗还具有只能刺激机体产生体液免疫、抗体持续期短等缺点。另外，传统的转瓶培养需要使用含血清的培养基培养，而目前血清价格居高不下，并且转瓶培养使用的人力较多，直接造成转瓶培养成本高。
目前还没有供貉子防治RDPV的专用疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种貉细小病毒重组亚单位疫苗及其制备方法，用于生产安全、高效的貉子细小病毒性肠炎(RDPV)疫苗。本发明的制备方法避免了传统疫苗制备工艺存在的成本高的缺点，填补了目前没有貉子专用细小病毒疫苗的空白。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种重组杆状病毒，该毒株已于2019年4月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17486，命名为：表达貉细小病毒VP2基因的杆状病毒。
本发明的一种重组杆状病毒的构建方法，包括以下步骤：
步骤一、构建貉细小病毒结构蛋白VP2基因；
步骤二、构建含有貉细小病毒结构蛋白VP2基因的穿梭载体；
步骤三、构建含有貉细小病毒结构蛋白VP2基因的昆虫杆状病毒重组表达质粒；
步骤四、重组表达质粒转染sf9昆虫细胞；
步骤五、制备病毒贮液，获得重组杆状病毒，即表达貉细小病毒VP2基因的杆状病毒。
作为优选的实施方式，步骤一的具体过程如下：
根据RDPV LN株的基因序列设计引物VP2-U/引物VP2-L，引物VP2-U的序列如SEQID NO:1所示，引物VP2-L的序列如SEQ ID NO:2所示，利用PCR 方法扩增VP2基因，PCR扩增条件为：
作为优选的实施方式，步骤二的具体过程如下：
将PCR产物用限制性内切酶XholⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切产物在1％琼脂糖凝胶中电泳；电泳后分离酶切产物，切去含有目的片段的凝胶进行称重；回收酶切产物，将其连接在穿梭载体pFastbac1上，构建出重组穿梭载体 pFastbac-VP2。
作为优选的实施方式，步骤三的具体过程如下：
(1)取重组穿梭载体pFastbac-VP2加入100μl DH10Bac感受态细胞中，混匀，将微量离心管放入事先准备好的含冰的烧杯中，冰浴30min；将离心管放入 42℃水浴锅中热激90秒，再放入加冰的烧杯中静置5min；加入LB培养基900μl， 37℃摇床220rpm培养4h；6000rpm离心30sec，弃掉上清900μl，用余下的LB 重悬菌体，准备10倍稀释的细菌培养物，每板加入100μl的稀释菌液，涂布于含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml的庆大霉素、10μg/ml四环素、100μg/ml X-gal 及40μg/ml IPTG的LB平板上，室温放置40min，在37℃温箱内倒置培养48h；用接种环挑取10个克隆于新鲜配制的含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml的庆大霉素及10μg/ml四环素的LB平板中，划线，37℃倒置培养过夜；挑取单菌落接入含10ml抗性LB的试管中，试管中含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml的庆大霉素及10μg/ml四环素，37℃、250rpm摇床培养过夜，获得含有貉细小病毒结构蛋白VP2基因的昆虫杆状病毒重组表达质粒；
(2)昆虫杆状病毒重组表达质粒DNA的提取
①柱平衡：加入2ml平衡液到柱中，静置直到柱中液体由于重力作用全部滴完；收集1.5ml上述过夜培养的菌液于1.5ml离心管中，12000rpm离心1min；
②弃上清液，用0.4ml重悬溶液重悬，直至菌液完全均匀；
③加入0.4ml细胞裂解液，反复颠倒混合5次；
④加入0.4ml中和液颠倒混合5次，12000rpm离心10min；
⑤吸取上清，将上清转移到平衡好的柱子内，重力作用滴干；
⑥用2.5ml洗涤液冲洗柱子2次；
⑦加入0.9ml洗脱液，保留洗脱液于5ml离心管中；
⑧加入0.63ml异丙醇于洗脱液中，混匀，冰浴10min，12000rpm室温离心 20min，弃上清，用1ml预冷的70％乙醇溶液重悬沉淀，室温晾干；
⑨用灭菌水溶解沉淀DNA，-20℃保存。
作为优选的实施方式，步骤四的具体过程如下：
(1)sf9昆虫细胞的转染：sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9 ×105个细胞，其中一孔设为正常对照，并以全培培养至少1h，使细胞贴壁；
(2)准备重组表达质粒和细胞转染试剂的混合物：
a、溶解1μg纯化的重组表达质粒于100μl无添加成分的Grace’s Medium； b、将细胞转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl无添加成分的Grace’sMedium，混匀；
c、将上述稀释好的重组表达质粒及稀释好的细胞转染试剂混匀，室温孵育20min。
(3)在重组表达质粒与细胞转染试剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液；
(4)取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入重组表达质粒与细胞转染试剂混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml；加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h；
(5)移除重组表达质粒与细胞转染试剂混合液，加入2ml全培；
(6)27℃培养，直到病变现象产生；如果看到上述的细胞病变，取2ml的细胞收集于灭菌的1.5ml的离心管中，500×g离心5min除去细胞及碎片，将上清转移至新的灭菌1.5ml离心管中，加入2％的胎牛血清，4℃避光保存，即为P1病毒。
作为优选的实施方式，步骤五的具体过程如下：
在感染当天，准备sf9细胞，铺在6孔板中，每孔铺2×106个细胞，室温培养1h；倒置显微镜观察细胞，确认已经贴壁；加入P1病毒；加入量计算方法为：转入病毒的量＝MOI×细胞数量/病毒滴度，P1病毒的滴度范围在1×106-1 ×107pfu/ml，MOI为0.05-0.1pfu/cell；27℃培养箱中培养48h；48h后，收集病毒于灭菌的1.5ml离心管中；500×g离心5min；将上清收集于新的1.5ml离心管中，即为P2病毒；4℃，避光保存；重复上述步骤即为P3病毒；将收获的 P3病毒即重组杆状病毒命名为表达貉细小病毒VP2基因的杆状病毒。
本发明的一种采用上述重组杆状病毒制备的貉细小病毒重组亚单位疫苗。
本发明的貉细小病毒重组亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、利用三角摇瓶无血清全悬浮培养high Five细胞制备种子细胞；
步骤二、将种子细胞直接接种入生物反应器全悬浮培养high Five细胞，将生物反应器的培养规模放大至30L细胞罐；
步骤三、利用三角摇瓶无血清全悬浮培养重组杆状病毒，将其以感染复数为0.5～5.0接种入以上30L生物反应器的培养的细胞中，培养72～140h；
步骤四、收获上述培养液上清，经灭活、加入氢氧化铝胶混合后制成疫苗，即貉细小病毒重组亚单位疫苗。
作为优选的实施方式，步骤一和步骤二的具体过程如下：
(1)复苏冻存high five昆虫细胞的种子细胞1ml于100ml无血清培养基中，置于500ml螺口玻璃三角摇瓶中培养，摇床温度27℃，转速110r/min；培养48h 后补加200ml无血清培养基，稀释传代于3000ml螺口玻璃三角摇瓶中；培养48h 后补加400ml无血清培养基；按照每48h，1∶2稀释比例传代至3000ml种子细胞，细胞密度达到3.0×106cells/ml；
(2)上述3000ml种子细胞接种入30L搅拌式生物反应器，培养72～96h 后，通过流加培养添加营养浓缩液，继续培养72h，细胞密度达到4.0×106～8.0 ×106cells/ml。
本发明的有益效果是：本发明基于灭活疫苗的弊端，采取利用基因工程方法表达亚单位疫苗来制备貉细小病毒重组亚单位疫苗。基因工程亚单位疫苗是利用基因工程技术，构建连有保护性抗原编码基因的表达载体，在细胞或菌体中表达目的蛋白，经提纯加工抗原蛋白制成的疫苗。
昆虫杆状病毒表达载体系统已成为生产与研究各种原核和真核蛋白有力而普及的工具。昆虫细胞能对翻译后蛋白进行磷酸化、糖基化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等加工修饰。杆状病毒表达载体系统具备在同一细胞内同时表达多个基因的能力，既可采用不同的重组病毒同时感染细胞，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白。杆状病毒对脊椎动物无感染性，其启动子在动物细胞中没有活性，生产疫苗安全性高。
本发明首先构建了能够表达RDPVVP2蛋白的重组杆状病毒，将其接入昆虫细胞生产RDPV亚单位疫苗。所制备的疫苗含有重组RDPV衣壳蛋白，而不含有RDPV病毒基因组成分，从而避免了病毒扩散和基因组释放的风险。
细小病毒的衣壳蛋白的三级结构是相似的，其病毒粒子表面由60个结构蛋白亚单位装配而成，其中VPl占5～6个；VP2占54～55个，是构成衣壳蛋白的主要结构蛋白。经研究证实，在细小病毒上至少有三个抗原表位区：1.Loopl 和Loop3近区域；2.二折叠下陷和三折叠突起区之间；3.临近三折叠中心区。这些抗原表位区可诱导机体产生中和抗体，区域中的氨基酸变化使得细小病毒可以逃避机体预先免疫产生的抗体。本发明所生产的亚单位蛋白为病毒样颗粒 (VLPs)，它与病毒粒子的结构相近，却不含有病毒的遗传物质。由于其成分单一，并且未被灭活剂破坏，所以免疫原性要高于同种类灭活疫苗，并且除了它们能激发B细胞介导的体液免疫反应，也已被证明能有效的刺激CD4增殖反应和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)响应，可以形成细胞免疫。
本发明涉及疫苗的生产毒株是表达貉细小病毒VP2基因的杆状病毒，该毒株系表达的蛋白为RDPVVP2蛋白，该蛋白在昆虫细胞内表达，可以自动装配成病毒样粒子，即可以在sf9细胞中产生病毒样颗粒，用其作为生产毒株生产貉子肠炎病毒重组亚单位疫苗，该疫苗不含病毒基因组，无动物安全危害和散毒风险，表达的蛋白结构与天然病毒相近，成分单一，免疫针对性强，能激发免疫动物产生足量的免疫抗体，并产生长久保护力。按照本发明提供的技术生产 RDPV病毒样颗粒，30L生物反应器中收获的病毒液效价达到血凝价 1:2048-1:6144，成颗粒蛋白表达量约45mg/L，每升病毒液半成品可以制成标准貉子疫苗6000头份；该重组亚单位疫苗添加了佐剂，有效的提高了疫苗的免疫效果和免疫效价该疫苗安全、有效，质量稳定、可控，是一种明显优于现有技术生产的灭活组织疫苗的新疫苗。
附图说明
图1为人工合成的VP2基因经PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳。图中，1：空白对照；2：VP2基因PCR扩增产物；M：DL2000DNA分子量标准。
图2为重组穿梭载体质粒示意图。
图3为重组杆状病毒侵染昆虫细胞(sf9)表达RDPV-VP2蛋白表达的SDS凝胶电泳图。图中，1：蛋白Marker；2：sf9正常细胞对照，3：未插入VP2基因杆状病毒接毒细胞对照；4.ACMPV-VP2接毒后细胞培养液。
图4为重组杆状病毒侵染昆虫细胞(sf9)表达RDPV-VP2蛋白表达的 Westernblot分析。
图5为噬斑法测重组杆状病毒的滴度。图中，1：空白对照；2：10-4稀释； 3：10-5稀释；4：10-6稀释；5：10-7稀释；6：10-8稀释。
图6为病毒样颗粒电镜照片。
具体实施方式
本发明的一种重组杆状病毒，该毒株已于2019年4月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17486，命名为：表达貉细小病毒VP2基因的杆状病毒。
本发明的一种重组杆状病毒的构建方法，包括以下步骤：
步骤一、构建貉细小病毒结构蛋白VP2基因；
步骤二、构建含有貉细小病毒结构蛋白VP2基因的穿梭载体；
步骤三、构建含有貉细小病毒结构蛋白VP2基因的昆虫杆状病毒重组表达质粒；该重组表达质粒在多克隆位点插入RDPV结构蛋白VP2基因。
步骤四、重组表达质粒转染sf9昆虫细胞；
步骤五、制备病毒贮液，获得重组杆状病毒，即表达貉细小病毒VP2基因的杆状病毒；该表达貉细小病毒VP2基因的杆状病毒能够感染昆虫细胞系，并高效表达重组VP2蛋白，上述重组VP2蛋白在功能上等同于貉子肠炎病毒VP2 蛋白并能够进一步自组装成貉子肠炎病毒衣壳蛋白。
本发明的貉细小病毒重组亚单位疫苗的制备方法，是一种全悬浮、无血清培养方法，主要包括以下步骤：
步骤一、利用三角摇瓶无血清全悬浮培养high Five细胞制备种子细胞；
步骤二、将种子细胞直接接种入生物反应器全悬浮培养high Five细胞，将生物反应器的培养规模放大至30L细胞罐；
步骤三、利用三角摇瓶无血清全悬浮培养重组杆状病毒，将其以感染复数为0.5～5.0接种入以上30L生物反应器的培养的细胞中，培养72～140h；
步骤四、收获上述培养液上清，经灭活、加入氢氧化铝胶混合后制成疫苗，即貉细小病毒重组亚单位疫苗。
本发明的貉细小病毒重组亚单位疫苗为肌肉注射剂型且含有佐剂。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1重组杆状病毒的构建
1、貉细小病毒(RDPV)结构蛋白VP2基因的获得
根据本公司保存的RDPV LN株基因序列设计引物(由上海生工合成)VP2-U(序列1)/VP2-L(序列2)，使用PCR方法扩增VP2基因，扩增结果如图1所示，扩增片段和目的片段大小一致。
VP2-U：5’GGATCCACCATGGGTGATGGAG 3’(SEQ ID NO:1)
VP2-L：5’CCGCTCGAGTCAATATAATTTTCTAGG 3’(SEQ ID NO:2)
PCR扩增条件为：
由图可以看出，扩增片段与VP2基因大小一致。
2、构建含有貉细小病毒(RDPV)结构蛋白VP2基因的穿梭载体
将上述所得PCR产物用限制性内切酶XholⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切产物在1％琼脂糖凝胶中电泳；在电泳后分离的酶切产物中，用洁净的手术刀片切下含有目的片段的凝胶，称重；按DNA凝胶纯化试剂盒操作说明回收酶切产物，并将其连接在穿梭载体pFastbac1上，构建出重组穿梭载体pFastbac-VP2。
3、构建含有貉细小病毒(RDPV)结构蛋白VP2基因的昆虫杆状病毒重组表达质粒
3.1取重组穿梭载体pFastbac-VP2加入100μl DH10Bac感受态细胞中，手指轻弹管壁混匀，将微量离心管放入事先准备好的含冰的烧杯中，冰浴30min；迅速将离心管放入42℃水浴锅中热激90秒，再快速放入加冰的烧杯中静置5min；加入LB培养基900μl，37℃摇床220rpm培养4h；6000rpm离心30sec，弃掉上清900μl，用余下的LB重悬菌体，准备一系列10倍稀释的细菌培养物(10-1、 10-2、10-3)，每板加入100μl的稀释菌液，涂布于LB平板(含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml的庆大霉素、10μg/ml四环素、100μg/ml X-gal及40μg/ml IPTG) 上，室温放置40min，在37℃温箱内倒置培养48h；用接种环挑取10个克隆于新鲜配制的LB平板(含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml的庆大霉素及10μg/ml 四环素)中，划线，37℃倒置培养过夜；挑取单菌落接入含10ml抗性LB的试管中(50μg/ml卡那霉素、7μg/ml的庆大霉素及10μg/ml四环素)，37℃、250rpm 摇床培养过夜，获得含有貉细小病毒(RDPV)结构蛋白VP2基因的昆虫杆状病毒重组表达质粒，构建过程如图2所示。
3.2昆虫杆状病毒重组表达质粒DNA的提取
其提取过程参照试剂盒说明书进行。具体提取方法如下：
3.2.1柱平衡：加入2ml平衡液(E4)到柱中，静置直到柱中液体由于重力作用全部滴完；收集1.5ml过夜培养的菌液于1.5ml离心管中，12000rpm离心 1min。
3.2.2弃上清液，用0.4ml重悬溶液重悬，直至菌液完全均匀。
3.2.3加入0.4ml细胞裂解液，轻柔反复颠倒混合5次。
3.2.4加入0.4ml中和液立即颠倒混合5次；12000rpm离心10min。
3.2.5吸取上清，将上清转移到平衡好的柱子内，重力作用慢慢滴干。
3.2.6用2.5ml洗涤液冲洗柱子2次。
3.2.7加入0.9ml洗脱液，保留洗脱液于5ml离心管中。
3.2.8加入0.63ml异丙醇于洗脱液中，混匀，冰浴10min；12000rpm室温离心20min，弃上清，用1ml预冷的70％乙醇溶液重悬沉淀，室温晾干。
3.2.9用灭菌水溶解沉淀DNA，-20℃保存。用于后面转染细胞，表达蛋白。
4、重组表达质粒转染sf9昆虫细胞
4.1 sf9昆虫细胞的转染：sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9× 105个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1h，使细胞贴壁。
4.2准备重组表达质粒和细胞转染试剂的混合物：
a、溶解1μg纯化的重组表达质粒于100μl无添加成分的Grace’s Medium。
b、将细胞转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl无添加成分的Grace’ sMedium，混匀。
c、将上述稀释好的重组表达质粒及稀释好的细胞转染试剂混匀，室温孵育20min。
4.3在重组表达质粒与细胞转染试剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。
4.4取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入重组表达质粒与细胞转染试剂混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml；加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。
4.5移除重组表达质粒与细胞转染试剂混合液，加入2ml全培。
4.6 27℃培养，直到病变现象产生；如果看到上述的细胞病变，取2ml的细胞收集于灭菌的1.5ml的离心管中，500×g离心5min除去细胞及碎片。将上清转移至新的灭菌1.5ml离心管中，加入2％的胎牛血清，4℃避光保存，即为P1 病毒。
5、病毒贮液的制备
在感染当天，准备sf9细胞，铺在6孔板中，每孔铺2×106个细胞，室温培养1h；倒置显微镜观察细胞，确认已经贴壁；加入适当量的P1病毒；加入量计算方法为：转入病毒的量＝MOI(pfu/cell)×细胞数量/病毒滴度(pfu/ml)； P1病毒的滴度的范围在1×106-1×107pfu/ml，MOI一般取0.05-0.1；27℃培养箱中培养48h；48h后，收集病毒于灭菌的1.5ml离心管中；500xg离心5min；将上清收集于新的1.5ml离心管中，即为P2病毒；4℃，避光保存；重复上述步骤即为P3病毒。
将收获的P3病毒即重组杆状病毒命名为表达貉细小病毒VP2基因的杆状病毒。该毒株已于2019年4月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17486，地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所。
6、重组杆状病毒滴度的测定
6.1重组杆状病毒感染蚀斑测定
6.1.1在感染当天，收获sf9细胞，并准备30ml细胞悬液，调整细胞密度为 5×105/ml，于6孔板中每孔铺2ml细胞。
6.1.2室温放置1h，让细胞贴壁。
6.1.3 1h后，用倒置显微镜观察细胞是否贴壁。
6.1.4在Grace’s培养基中将病毒稀释8个浓度梯度(10-1-10-8)；取0.5ml 病毒放入4.5ml培养基中，稀释为10-1，然后从10-1浓度的病毒中取0.5ml病毒放入4.5ml培养基中，稀释为10-2，依此类推。
6.1.5将6孔板中的培养基移去，马上加入1ml病毒稀释液。
6.1.6培养1h后，马上将放在40℃水浴的平板培养基放入超净台。
6.1.7将病毒液取出，马上将2ml的平板培养基放入。
6.1.8室温放置10-20min。
6.1.9将培养基放于27℃培养箱中培养。
6.1.10在转染第四天时，用Grace’s培养基配制1mg/ml的中性红溶液，抽滤除菌。
6.1.11将1.5ml的1mg/ml的中性红溶液加入16.5ml的Grace’s培养基中配制中性红溶液，混匀，然后放入40℃水浴中。
6.1.12将4％的低熔点琼脂溶解，放入40℃水浴中，5min。
6.1.13取6ml 4％的低熔点琼脂加入中性红溶液中，40℃水浴保存。
6.1.14迅速将配好的低熔点琼脂中性红溶液，按每孔1ml，加入6孔平板培养基中。
6.1.15待凝固后，于27℃培养箱中继续培养3-6天。
6.1.16在转染后第7-10天时，配制1mg/ml的中性红溶液。
6.1.17每孔加入0.5ml的1mg/ml的中性红溶液，室温培养1-2h。
6.1.18小心用移液器取出多余的染液，计数。
结果如图5所示，Titer(pfu/ml)＝2×107pfu/ml)；MOI(pfu/cell)＝10pfu/cell。
7、生产RDPV病毒样颗粒的检测和鉴定
7.1生产RDPV病毒样颗粒
200ml sf9细胞悬液培养于1L螺口三角摇瓶中，细胞培养基为无血清培养基 SF-SFM(苏州市沃美生物技术有限公司)，摇床转速为110r/min，温度恒定于 27℃；当细胞密度达到2×106cells/ml时，用重组杆状病毒以MOI＝0.5接种；培养96h后，收集上清，4℃3000r/min离心10min，收集上清液，-20℃冷冻保存。该重组RDPV病毒样颗粒在抗原性和免疫原性上与天然的貉子肠炎病毒近似，是一种能够诱导貉子产生针对貉子细小病毒感染免疫应答的蛋白。
7.2凝胶蛋白电泳检测VP2蛋白的表达
取上述培养重组杆状病毒的细胞悬液，4℃离心(9000r/min)5min，收集上清液，进行SDS凝胶电泳；设置电泳条件为恒定电压100V，时间为2h；结束后，凝胶置于0.1％R型考马斯亮蓝染色液中，水平摇摆染色1h，然后用脱色液脱色，并拍照，见图3，表达的蛋白与RDPVVP2蛋白大小一致。
7.3Westernblot检测分析VP2蛋白的表达
取上述培养重组杆状病毒的细胞悬液，4℃离心(9000r/min)5min，收集上清液，取10μl上清液与10μl的2倍浓缩的SDS上样缓冲液混合，99℃处理5min 后，将样品加入12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的点样孔中，进行电泳；转膜时，恒定电流300mA，4℃下转移1.5h，取出硝酸纤维素膜放于5％脱脂奶粉中封闭3h，结果见图4，表达的蛋白可以与细小病毒抗体特异性结合，证明其具有良好的免疫原性。孵育时，一抗采用抗6个组氨酸的兔源抗体(1∶500)，二抗采用的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(1∶1000)。
7.4RDPV病毒样颗粒的HA滴度检测
将96孔血凝板的连续18个孔标记，每孔加入25μl生理盐水，再向第一个孔加入25μl的病毒样颗粒，将样品依次进行1∶2的倍比稀释，设置6～8个孔的空白对照，只添加生理盐水；向每一孔加入25μl、1％的猪红血球，混匀后37℃放置40min后查看并记录血凝结果。
7.5电镜拍片检测
将少量的浓缩后的RDPV病毒样颗粒样品固定处理后，置于新制备的无负荷塑胶/碳包被网格上，用数滴蒸馏水轻轻冲洗几次后，加上2％磷钨酸钠溶液进行负染色，电子显微镜下观察并拍片，见图6，电镜下可以观察到，表达的蛋白可以组装成VLPs，形态与病毒粒子相同。
实施例2生产种毒批的制备和保存
重组杆状病毒制备工艺主要包含重组杆状病毒(P1病毒)。生产用种毒是在第一代毒中加入10％胎牛血清分装保存在-80℃中。制备生产用种毒批通常是将分装保存的P1病毒感染sf9细胞制备P2病毒，依次类推制备P3病毒。
实施例3疫苗生产
1、复苏冻存sf9昆虫细胞的种子细胞1ml于100ml无血清培养基中，置于 500ml螺口玻璃三角摇瓶中培养，摇床温度27℃，转速110r/min；培养48h后补加200ml无血清培养基，稀释传代于3000ml螺口玻璃三角摇瓶中；培养48h 后补加400ml无血清培养基；按照每48h，1∶2稀释比例传代至3000ml种子细胞，细胞密度达到3.0×106cells/ml。
2、上述3000ml种子细胞接种入30L搅拌式生物反应器，培养72～96h后，通过流加培养添加营养浓缩液，继续培养72h，细胞密度达到4.0×106～8.0× 106cells/ml。
3、利用三角摇瓶无血清全悬浮培养重组杆状病毒，将其以感染复数为0.5～ 5.0接种入以上30L生物反应器的培养的细胞中，培养72～140h。
4、收获上述培养液上清，经灭活、加入氢氧化铝胶混合后制成疫苗，即貉细小病毒重组亚单位疫苗。
实施例4疫苗检测
1、性状检验：静置后，上层为澄清液体，下层为白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。
2、无菌检验；按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
3、装量检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，100ml/瓶应不少于100ml。
4、安全检测：将肠炎VLP灭活疫苗皮下免疫健康易感貉子(抗RDPV-HI值≤1：4)5只，3ml/只，连续观察10日，所有貉子应全部健活。
5、效力检测：采用血清学检测方法，首先将肠炎VLP灭活疫苗皮下免疫2～ 12月龄健康易感貉子(抗RDPV-HI值≤1:4)5只，1ml/只，同时设置不接种对照貉子5只；免疫后14天采血，分离血清，分别测定抗RDPV-HI抗体值；免疫貉子HI抗体效价均应不低于1:32，对照貉子HI抗体效价均应不高于1:4。
6、汞类防腐剂残留量测定：分别按现行《中国兽药典》附录进行测定，汞类防腐剂残留量为0.01％。
本发明公开了一种重组杆状病毒、貉细小病毒重组亚单位疫苗及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
序列表
<110> 吉林特研生物技术有限责任公司
<120> 一种重组杆状病毒、貉细小病毒重组亚单位疫苗及其制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 0
<212> DNA
<213> 人工(DNA)
<400> 1
<210> 2
<211> 0
<212> DNA
<213> 人工(DNA)
<400> 2

Claims (10)

1.一种重组杆状病毒，其特征在于，该毒株已于2019年4月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17486，命名为：表达貉细小病毒VP2基因的杆状病毒。
2.如权利要求1所述的一种重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、构建貉细小病毒结构蛋白VP2基因；
步骤二、构建含有貉细小病毒结构蛋白VP2基因的穿梭载体；
步骤三、构建含有貉细小病毒结构蛋白VP2基因的昆虫杆状病毒重组表达质粒；
步骤四、重组表达质粒转染sf9昆虫细胞；
步骤五、制备病毒贮液，获得重组杆状病毒，即表达貉细小病毒VP2基因的杆状病毒。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤一的具体过程如下：
根据RDPV LN株的基因序列设计引物VP2-U/引物VP2-L，引物VP2-U的序列如SEQ IDNO:1所示，引物VP2-L的序列如SEQ ID NO:2所示，利用PCR方法扩增VP2基因，PCR扩增条件为：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤二的具体过程如下：
将PCR产物用限制性内切酶Xhol Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，酶切产物在1％琼脂糖凝胶中电泳；电泳后分离酶切产物，切去含有目的片段的凝胶进行称重；回收酶切产物，将其连接在穿梭载体pFastbac1上，构建出重组穿梭载体pFastbac-VP2。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤三的具体过程如下：
(1)取重组穿梭载体pFastbac-VP2加入100μl DH10Bac感受态细胞中，混匀，将微量离心管放入事先准备好的含冰的烧杯中，冰浴30min；将离心管放入42℃水浴锅中热激90秒，再放入加冰的烧杯中静置5min；加入LB培养基900μl，37℃摇床220rpm培养4h；6000rpm离心30sec，弃掉上清900μl，用余下的LB重悬菌体，准备10倍稀释的细菌培养物，每板加入100μl的稀释菌液，涂布于含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml的庆大霉素、10μg/ml四环素、100μg/mlX-gal及40μg/ml IPTG的LB平板上，室温放置40min，在37℃温箱内倒置培养48h；用接种环挑取10个克隆于新鲜配制的含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml的庆大霉素及10μg/ml四环素的LB平板中，划线，37℃倒置培养过夜；挑取单菌落接入含10ml抗性LB的试管中，试管中含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml的庆大霉素及10μg/ml四环素，37℃、250rpm摇床培养过夜，获得含有貉细小病毒结构蛋白VP2基因的昆虫杆状病毒重组表达质粒；
(2)昆虫杆状病毒重组表达质粒DNA的提取
①柱平衡：加入2ml平衡液到柱中，静置直到柱中液体由于重力作用全部滴完；收集1.5ml上述过夜培养的菌液于1.5ml离心管中，12000rpm离心1min；
②弃上清液，用0.4ml重悬溶液重悬，直至菌液完全均匀；
③加入0.4ml细胞裂解液，反复颠倒混合5次；
④加入0.4ml中和液颠倒混合5次，12000rpm离心10min；
⑤吸取上清，将上清转移到平衡好的柱子内，重力作用滴干；
⑥用2.5ml洗涤液冲洗柱子2次；
⑦加入0.9ml洗脱液，保留洗脱液于5ml离心管中；
⑧加入0.63ml异丙醇于洗脱液中，混匀，冰浴10min，12000rpm室温离心20min，弃上清，用1ml预冷的70％乙醇溶液重悬沉淀，室温晾干；
⑨用灭菌水溶解沉淀DNA，-20℃保存。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤四的具体过程如下：
(1)sf9昆虫细胞的转染：sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9 ×105个细胞，其中一孔设为正常对照，并以全培培养至少1h，使细胞贴壁；
(2)准备重组表达质粒和细胞转染试剂的混合物：
a、溶解1μg纯化的重组表达质粒于100μl无添加成分的Grace’s Medium；
b、将细胞转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl无添加成分的Grace’sMedium，混匀；
c、将上述稀释好的重组表达质粒及稀释好的细胞转染试剂混匀，室温孵育20min。
(3)在重组表达质粒与细胞转染试剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’sMedium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液；
(4)取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入重组表达质粒与细胞转染试剂混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml；加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h；
(5)移除重组表达质粒与细胞转染试剂混合液，加入2ml全培；
(6)27℃培养，直到病变现象产生；如果看到上述的细胞病变，取2ml的细胞收集于灭菌的1.5ml的离心管中，500×g离心5min除去细胞及碎片，将上清转移至新的灭菌1.5ml离心管中，加入2％的胎牛血清，4℃避光保存，即为P1病毒。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤五的具体过程如下：在感染当天，准备sf9细胞，铺在6孔板中，每孔铺2×106个细胞，室温培养1h；倒置显微镜观察细胞，确认已经贴壁；加入P1病毒；加入量计算方法为：转入病毒的量＝MOI×细胞数量/病毒滴度，P1病毒的滴度范围在1×106-1×107pfu/ml，MOI为0.05-0.1pfu/cell；27℃培养箱中培养48h；48h后，收集病毒于灭菌的1.5ml离心管中；500×g离心5min；将上清收集于新的1.5ml离心管中，即为P2病毒；4℃，避光保存；重复上述步骤即为P3病毒；将收获的P3病毒即重组杆状病毒命名为表达貉细小病毒VP2基因的杆状病毒。
8.采用权利要求1至7中任意一项所述的一种重组杆状病毒制备的貉细小病毒重组亚单位疫苗。
9.如权利要求8所述的貉细小病毒重组亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、利用三角摇瓶无血清全悬浮培养high Five细胞制备种子细胞；
步骤二、将种子细胞直接接种入生物反应器全悬浮培养high Five细胞，将生物反应器的培养规模放大至30L细胞罐；
步骤三、利用三角摇瓶无血清全悬浮培养重组杆状病毒，将其以感染复数为0.5～5.0接种入以上30L生物反应器的培养的细胞中，培养72～140h；
步骤四、收获上述培养液上清，经灭活、加入氢氧化铝胶混合后制成疫苗，即貉细小病毒重组亚单位疫苗。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤一和步骤二的具体过程如下：
(1)复苏冻存high five昆虫细胞的种子细胞1ml于100ml无血清培养基中，置于500ml螺口玻璃三角摇瓶中培养，摇床温度27℃，转速110r/min；培养48h后补加200ml无血清培养基，稀释传代于3000ml螺口玻璃三角摇瓶中；培养48h后补加400ml无血清培养基；按照每48h，1:2稀释比例传代至3000ml种子细胞，细胞密度达到3.0×106cells/ml；
(2)上述3000ml种子细胞接种入30L搅拌式生物反应器，培养72～96h后，通过流加培养添加营养浓缩液，继续培养72h，细胞密度达到4.0×106～8.0×106cells/ml。
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