CN105349556A

CN105349556A - 一种猪瘟病毒基因重组腺病毒及其生产方法

Info

Publication number: CN105349556A
Application number: CN201510939239.XA
Authority: CN
Inventors: 张小苗; 张恒; 范根成; 孙永科
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2015-12-15
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2016-02-24

Abstract

本发明的目的是提供一种猪瘟病毒基因重组腺病毒及其生产方法，本发明用于制备猪瘟病毒基因重组腺病毒的基因片段，其氨基酸序列为SEQ？ID？NO:2，其一种编码的核苷酸序列为SEQ？ID？NO:1。将上述的基因片段同源重组到人5型复制缺陷型腺病毒基因组的多克隆位点制备出猪瘟病毒基因重组腺病毒。本发明的贴壁培养HEK？293细胞生产猪瘟病毒E0-E2基因重组腺病毒的最佳工艺是：20％W-DMEM复苏HEK？293细胞，48h后，用10％W-DMEM扩传细胞，24h后按3％接毒，IFU最大，随着病毒多次复壮，1％接毒比例，感染48h收毒，能够收获到高病毒滴度的病毒。为此，将收获的病毒液进行及时冻干，建立起不同代次的冻干种毒批，为悬浮培养大量制备高水平病毒滴度提供可靠的种毒。

Description

一种猪瘟病毒基因重组腺病毒及其生产方法

技术领域

本发明属于病毒疫苗制备技术领域，具体涉及一种猪瘟病毒基因重组腺病毒及其生产方法。

背景技术

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirμs，CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病，死亡率极高，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。猪瘟已被世界动物卫生组织(OIE)列为家畜A类传染病，我国也将其列为一类动物疫病。临床以稽留高烧、皮肤和黏膜出现大量出血点为特征。多年的实践经验证明，疫苗接种是预防和控制动物疫病的主要手段。20世纪60年代，我国研制出经人工诱变获得的猪瘟兔化弱毒株(又称C株)疫苗在CSFV防控中起到了决定性作用，有效的控制了猪瘟在我国乃至世界范围内大规模的流行。猪瘟C株弱毒疫苗是目前国内外广泛使用的疫苗，其安全性和免疫效力已被社会认可。但其受母源抗体干扰，导致免疫失败的现象时有报道，接种此弱毒疫苗产生的抗体无法与野毒感染产生的抗体相区分，给免疫的制订和国家猪瘟防控净化也带来了巨大的挑战，制约着我国生猪及猪肉制品在非免疫国家和地区的贸易发展。

目前广泛使用的猪瘟疫苗(猪瘟脾淋苗、猪瘟乳兔苗)都需要用活体动物生产，组织毒生产工艺繁琐，人员工作量大，疫苗生产厂家能否严格做到使用未曾接种过兔瘟疫苗的兔子来做疫苗，也是一个值得怀疑的问题。随着生物安全、动物福利越来越被人们重视，国际上不再提倡用活体动物组织制备疫苗。以活病毒表达载体为基础的基因工程载体疫苗的研制是当今病毒病防治与发明的热点之一。腺病毒具有应用方便、表达效率高、使用安全及重组病毒遗传特性稳定等特点，受到了各国学者的重视，目前已应用于新型减毒活疫苗和基因治疗的发明中。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪瘟病毒基因重组腺病毒及其生产方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种能用于制备猪瘟病毒基因重组腺病毒的基因片段，其氨基酸序列为SEQIDNO:2，其一种编码的核苷酸序列为SEQIDNO:1；

本发明还提供一种猪瘟病毒基因重组腺病毒，是将上述的基因片段同源重组到人5型复制缺陷型腺病毒基因组的多克隆位点制备的。

本发明制备的猪瘟病毒基因重组腺病毒用于制备疫苗；

本发明另一方面提供了一种猪瘟病毒基因重组腺病毒疫苗的生产方法，具体是利用贴壁培养HEK293细胞生产猪瘟病毒基因重组腺病毒。

上述方法的一种具体操作如下：用20％浓度的W-DMEM培养基复苏HEK293细胞，在复苏48h后，用10％浓度的W-DMEM培养基进行HEK293细胞的扩大培养，培养24h后接种上述的重组腺病毒，感染48h后收获到高病毒滴度的病毒，再制备成疫苗。

附图说明

图1：不同培养基下HEK293细胞的生长曲线图，

图2：不同储存条件病毒滴度结果图，

图3：不同接毒比例病毒滴度结果图；

图4：不同收毒时间病毒滴度结果图，

图5：细胞病变与间接免疫荧光检测图(200X)；其中，A：HEK293细胞病变；B：HEK293正常细胞；C：rAd-E0-E2感染HEK293细胞IFA检测；D：rAd-E0-E2未感染HEK293细胞阴性对照。

具体实施方式

申请人在猪瘟活疫苗的研究基础上，利用人5型腺病毒基因组作为骨架构建了感染性分子克隆，在其基因组的多克隆位点区插入所筛选出CSFV的基因抗原优势区(共585个氨基酸)。获得的重组病毒在细胞上连续传了60代，插入的外源基因片段没有发生任何突变或丢失，而且通过免疫荧光检测到外源基因稳定表达，提供的保护性相比于脾淋苗效果更好，并且具有腺病毒特征性基因，能够和疫苗毒与野毒感染相区分，同时能区分CSFV和脾淋苗(包括野毒)。用该重组病毒制备的疫苗不但可以通过抗体鉴别技术区分疫苗免疫动物和野毒感染动物，极大地促进CSFV的净化或根除，可提高猪的存活率，增加猪的存栏量和出栏量，对猪肉市场上相关畜产品的供应和稳定物价具有重要的意义。

本发明通过不同培养基培养HEK293细胞，选择最适宜HEK293细胞生长的培养基；再用同代次不同储存条件的病毒感染HEK293细胞、同病毒不同接毒比例感染细胞、同病毒同比例感染细胞，不同收毒时间，比较病毒滴度IFU的大小。本发明利用贴壁培养HEK293细胞生产猪瘟病毒基因重组腺病毒，进行了不同培养基、病毒不同储存条件、不同接毒比例、不同收毒时间摸索试验。

下面对本发明的一种猪瘟病毒基因重组腺病毒疫苗的HEK293细胞贴壁生产工艺方法进行详细的描述。

实施例1：猪瘟病毒E0-E2基因重组腺病毒的制备

1.1通过对猪瘟石门系强毒(CSFV)的基因组序列进行分析，得到了具有抗原性的核苷酸片段，并对其序列进行改造，改造后的核苷酸序列为SEQIDNO:1，编码的氨基酸序列为SEQIDNO:2。上述片段制成的疫苗，相比于已报道的疫苗，其免疫性能更好。将改造后的基因克隆入PET32a(+)多克隆酶切位点，转化DH5a大肠杆菌，涂氨苄抗性平板，挑取单克隆，测序鉴定。选择测序正确的阳性菌落，挑取单克隆，测序鉴定。

1.2将目的基因定向克隆于穿梭质粒载体pAdTrack-CMV中，采用“两步转化法”在细菌内同源重组，构建出携带目的基因的重组腺病毒转移载体质粒pAdEasy-E02，经PacI酶切线性化后转染人胚胎肾细胞(HEK293),成功包装出猪瘟病毒目的基因的重组腺病毒。

1.3将此猪瘟病毒目的基因重组腺病毒颈部肌肉注射免疫3～5周龄断奶健康仔猪5头，取5头作为空白对照，分别于免后28日采集血清，检测猪瘟病毒抗体水平，并对10头猪进行攻毒，攻毒前检测猪瘟抗体水平，攻毒后采用PCR检测方法检测有无猪瘟病毒残留，以此来确定该疫苗的免疫和保护效果。经检测结果如下表1，说明该重组腺病毒疫苗免疫效果良好。

表1猪瘟病毒目的基因重组腺病毒免疫猪28天抗体检测结果

实施例2：不同培养基HEK293细胞贴壁培养生长工艺

2.1HEK293细胞培养从液氮罐中取出3支同一批次HEK293冻存细胞，快速将其放在37℃水浴中，轻轻摇晃，使之迅速融化。吸出溶有细胞的冻存液，分别加到事先装有培养液(37℃预热，6～8mL)的离心管内，轻柔吹打混匀，1000g/min离心5min，弃上清，分别加入10mL含20％血清(WeikeshengFBS、GibcoFBS、GibcoNCS)的DMEM培养基，轻柔吹打成细胞悬液，分别于10mL培养瓶内，37℃、5％CO₂培养箱下培养。

2.2不同培养基的摸索复苏细胞48h后换液1次，待细胞的融合度约90％时，用PBS清洗一次，加入少许胰酶覆盖细胞面，静止消化1min。分别加入10％(W、G、N)的培养基，温和吹打混匀，以2.5×10⁵/mL密度于24孔板，每种培养基分8组，每组3孔，37℃、5％CO₂培养箱下培养，每24h计数一次，每次计3孔，连续计数8天，将所得数据以培养时间为横坐标，细胞数目为纵坐标绘制曲线，即可得到细胞生长曲线，观察不同血清培养基条件下细胞生长情况及其细胞数目。

2.3不同培养基HEK293细胞生长结果HEK293细胞的生长曲线可以看出(图1)，同一时间细胞计数，10％W-DMEM培养条件下的细胞数目比10％N-DMEM和10％G-DMEM培养条件下的细胞数目均多，细胞活力、细胞生长状态也优于后两种培养基，因此，本次试验采用W-DMEM培养HEK293细胞。

实施例3：猪瘟病毒基因重组腺病毒不同储存条件的工艺

3.1不同储存条件操作方法细胞传代24h后，当贴壁细胞汇合达70％～80％单层细胞时，用1％培养基替换10％培养基。将重组腺病毒分别按1％、3％的比例感染HEK293细胞，根据病变情况适时收毒。

3.2不同储存条件IFU结果

重组腺病毒分别按1％、3％的比例感染HEK293细胞，结果显示(图2)，冻干毒感染细胞其IFU大于相同比例湿毒感染细胞；同时，无论是湿毒还是冻干毒，3％接毒比例的IFU大于1％接毒比例的IFU。

实施例4：猪瘟病毒基因重组腺病毒不同接毒比例的工艺

4.1不同接毒比例的操作方法细胞传代24h后，当贴壁细胞汇合达70％～80％单层细胞时，用1％培养基替换10％培养基。将1.2.3重组腺病毒(冻干毒、湿毒)所收获病毒液，IFU较大者分别按0.5％、1％、2％、3％、5％的比例感染HEK293细胞，根据病变情况适时收毒，比较复壮一代后IFU的大小变化。

4.2不同接毒比例IFU结果将1.2.3复壮一代所收获病毒IFU较大者(3％)再分别按0.5％、1％、2％、3％、5％接毒比例感染同等长势的HEK293细胞，结果显示(图3)，湿毒和冻干毒1％接毒比例感染细胞的IFU比其它接毒比例感染细胞的IFU大；同时,经过复壮一代后，IFU由原来的10⁷上升到10⁸(图2-3)。

实施例5：猪瘟病毒基因重组腺病毒不同收毒时间的工艺

5.1不同收毒时间的操作方法细胞传代24h后，当贴壁细胞汇合达70％～80％单层细胞时，用1％培养基替换10％培养基。将1.2.4重组腺病毒(冻干毒、湿毒)1％接毒所收获病毒液再按1％的比例感染HEK293细胞，在病毒感染细胞24h、48h、72h、96h、120h、144h分别收毒，比较不同收毒时间IFU的大小变化。

5.2不同收毒时间IFU结果将1.2.4重组腺病毒(冻干毒、湿毒)1％接毒所收获病毒液再按1％的比例感染HEK293细胞，在病毒感染细胞24h、48h、72h、96h、120h、144h分别收毒，结果(图4)，冻干毒和湿毒都显示48h收毒的IFU大于其它时间收毒的IFU。

实施例6：猪瘟病毒基因重组腺病毒致HEK293细胞病变与间接免疫荧光(IFA)特异性检测

6.1猪瘟病毒基因重组腺病毒间接免疫荧光(IFA)操作方法

①选取状态良好的HEK293细胞，胰酶消化后用10％培养基重悬后制成2.5×10⁵/mL的细胞悬液，24孔板每孔1mL,37℃、5％CO₂培养箱下培养2～3h；②将所收获病毒分别按照10^-3、10^-4稀释接种于含HEK293细胞的24孔板，每孔100uL，37℃、5％CO₂培养箱下培养48h；③轻轻弃培养液，用PBS洗涤一次，沿24孔板侧壁缓缓加入-20℃预冷的无水甲醇固定液，每孔0.5mL，-20℃固定20min；④弃固定液，用PBS洗涤一次，加入含1％BSA的PBS，每孔0.3mL，37℃、5％CO₂培养箱下封闭1h，不弃液；⑤每孔加入0.2mL1:300稀释的一抗(猪瘟病毒特异性抗体)，37℃、5％CO₂培养箱下孵育1h；⑥弃一抗，用PBS洗涤三次，每孔加入0.2mL1:500稀释的二抗(FITC标记的兔抗猪IgG)，37℃、5％CO₂培养箱下孵育1h；⑦弃二抗，用PBS洗涤三次，在倒置显微镜下用蓝色激发光(波长490nm)放大100×～200×观察。

6.2猪瘟病毒基因重组腺病毒滴度(IFU)的换算

①计算显微镜下10^-4稀释视野中阳性细胞的平均个数，此梯度视野中有5-50个阳性细胞，随机选择至少5个区域计数。②计算24孔板中每孔视野的个数：对于多数显微镜，标准10×目镜与10×物镜所观察到的视野直径为1.8mm，因此：每个视野的面积＝3.14×(D/2)²＝3.14×0.9²＝2.54mm²；对于一个标准24孔板，培养面积为2.0cm²，因此：每孔视野数＝2.0cm²/2.54mm²＝2.0cm²/2.54×10^-2cm²＝79；③疫苗病毒滴度(IFU/ml)＝(平均阳性细胞数)×79×(稀释比例)/(0.1ml)。

6.3细胞病变与间接免疫荧光检测

重组腺病毒按1％的比例感染HEK293细胞，48h出现细胞圆缩病变(图5-A),而未接毒的细胞形态正常(图5-B)；接毒细胞收获后以10^-4倍稀释经间接免疫荧光(IFA)检测出现特异性绿色荧光(图5-C),而未接毒细胞收获后以10^-4倍稀释经IFA检测未出现特异性绿色荧光(图5-D)。

冻干毒感染HEK293细胞病毒滴度比相同接毒比例下湿毒感染HEK293细胞病毒滴度高，可见，毒种冻干保存比湿毒保存能更好地保护毒种的滴度。冻干保存毒种可以避免因科学试验所需、-80℃冰箱突然断电、故障、损坏导致的反复冻融而降低了毒种的保存质量。同时，本发明还发现毒种不论是湿毒还是冻干毒，3％接毒的IFU高于1％接毒的IFU，说明接毒量的多少确实会影响病毒滴度的高低，但是，病毒经过复壮一代以后，冻干毒和湿毒用IFU较大者(3％)所收获毒分别按0.5％、1％、2％、3％、5％比例再次感染HEK293细胞，病毒滴度不与接毒比例成正相关，试验结果显示，病毒经过一代复壮后，1％接毒比例能够收获高病毒滴度的病毒液。不同时间收毒中发现，病毒感染细胞48h收毒能够收获到高病毒滴度的病毒液，说明病毒感染细胞需要一定的时间，当时间过短或过长都不利于病毒的繁殖。

HEK293细胞是贴壁依赖性上皮样细胞,表现出典型的腺病毒转化细胞的表型,该细胞允许腺病毒和其他血清型腺病毒在其内增殖,是最常用的腺病毒载体包装细胞。贴壁细胞方式生产病毒有效地避免或降低了由动物组织及原代细胞可能带来的生物安全风险，但是，贴壁细胞大量制备病毒在空间上也受到了限制，本发明旨在提供一种猪瘟病毒:基因重组腺病毒疫苗的HEK293细胞贴壁生产工艺方法，为后期悬浮培养大量制备更高滴度水平病毒提供科学依据。

Claims

1.一种基因，其特征在于，所述基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2。

2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1。

3.权利要求1所述的基因在制备基因工程疫苗中的应用。

4.权利要求1所述的基因在制备基因重组腺病毒中的应用。

5.一种猪瘟病毒基因重组腺病毒，其特征在于，所述的猪瘟病毒基因重组腺病毒是将权利要求1所述的基因同源重组到人5型复制缺陷型腺病毒基因组的多克隆位点制备的。

6.权利要求5所述的猪瘟病毒基因重组腺病毒在制备疫苗中的应用。

7.权利要求5所述的猪瘟病毒基因重组腺病毒的生产方法，其特征在于，所述的生产方法是使用贴壁培养HEK293细胞来生产猪瘟病毒基因重组腺病毒。

8.如权利要求7所述的生产方法，其特征在于，所述的方法是用20％浓度的W-DMEM培养基复苏HEK293细胞，在复苏48h后，用10％浓度的W-DMEM培养基进行HEK293细胞的扩大培养，培养24h后接种上述的重组腺病毒，感染48h后收获到高病毒滴度的病毒。