CN104388437A - 表达o型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损型腺病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了表达O型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损型腺病毒及其构建方法和应用。本发明在保证3C蛋白酶对口蹄疫病毒衣壳蛋白的剪切及正确组装和形成的前提下，对O型FMDV的3C基因进行改造或突变，构建3C蛋白酶活性改变的表达O型FMDV P1、2A和3C亚基因组或其突变体的重组腺病毒表达载体，将其转染293细胞筛选获得两株稳定表达O型或O型突变株亚基因组且能正确形成空衣壳的重组腺病毒。两株重组腺病毒的3C蛋白酶活性呈明显下调，对细胞的毒力得以显著降低，有效提升了在动物体内的免疫原性和免疫保护效力的指标。本发明构建的两株重组腺病毒还可组合作为二价口蹄疫候选疫苗覆盖当前中国O型FMDV流行株的抗原谱。

Description

表达O型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损型腺病毒及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及重组缺损型腺病毒，尤其涉及稳定表达O型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损型腺病毒株，本发明还涉及所述重组缺损型腺病毒株的构建方法及其在制备预防或治疗口蹄疫的药物或试剂中的应用，属于口蹄疫的防治领域。

背景技术

口蹄疫(FMD)是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，其病原为口蹄疫病毒(FMDV)。鉴于口蹄疫对世界经济造成的严重危害，国际兽疫局(OIE)和联合国粮农组织(FAO)将其列为必须通报的疾病，中国也将其列为一类动物传染病的第一位。疫苗接种是特异性预防FMD的有效手段，安全有效的疫苗是成功预防、控制乃至最终消灭FMD的先决条件。

研究表明，口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1包含FMDV的主要抗原决定簇，并在3C蛋白酶的裂解作用下参与病毒衣壳的组装，组装的FMDV空衣壳与FMDV感染细胞所产生的早期未成熟病毒颗粒十分相似，可诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答，从而保护动物免受FMDV的攻击。FMDV 3C蛋白是一种丝氨酸蛋白酶，负责FMDV多聚蛋白前体的裂解与成熟。在多聚蛋白前体的裂解过程中，除了前导蛋白可自行从与P1连接处断裂成熟以及2A负责将P1区与P2区自动裂解以外，其余多聚蛋白前体成分都依靠3C蛋白酶的剪切加工而形成具有生物活性的病毒蛋白。FMDV基因组编码的3C蛋白酶不仅在多聚蛋白的裂解成熟过程中发挥着重要作用，而且有证据表明它可以破坏宿主细胞中维持正常生理活动的蛋白复合物。3C蛋白酶可以切割eIF4A，而eIF4A是细胞合成自身蛋白所需的一种重要的翻译起始因子，并且对于mRNA的解旋起重要作用。因此，FMDV 3C蛋白酶又是一个诱导宿主细胞凋亡的毒力因子。

鉴于FMDV 3C蛋白酶的这种双重的矛盾角色，在保证3C蛋白酶对口蹄疫病毒衣壳蛋白的剪切作用以及空衣壳的组装和形成的前提下，通过对3C基因的改造改变3C蛋白酶的活性，减低3C蛋白酶活性及其对细胞的毒性作用，从而增强表达空衣壳重组腺病毒在动物体内的免疫原性，对于有效预防和控制FMD均具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是通过对O型口蹄疫病毒3C基因的改造改变3C蛋白酶的活性，在保证3C蛋白酶对口蹄疫病毒衣壳蛋白的剪切作用以及空衣壳的组装和形成的前提下，减低3C蛋白酶活性，增强表达空衣壳重组缺损型腺病毒在动物体内的免疫原性，最终筛选获得两株稳定表达O型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损型腺病毒株。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先拼接获得了编码O型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明在含有O型FMDV O/YS/CHA/05株P12A基因的重组质粒pOK-P12A上利用引物引入耐酸突变位点，获得质粒pOK-P12A-N17D；在含有3C基因的重组质粒pOK-3C上利用引物引入艾滋病病毒HIV-1frameshift基因序列和突变位点C142T，获得质粒pOK-3C-FS-142；将上述构建的重组质粒分别酶切、目的片段连接获得重组质粒pOK-O-FS-P12A3C，实现3C蛋白酶活性改变的O型FMDV基因组P1、2A和3C基因的拼接，得到SEQ ID No.1所示的编码O型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C。

本发明进一步根据质粒pOK-O-FS-P12A3C的基因序列设计突变引物，用于扩增pOK-O-FS-P12A3C质粒上的P12A3C基因，构建质粒pOK-Om-FS-P12A3C，进一步获得编码O型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C的突变体，其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

研究表明，近年来中国流行的O型FMDV毒株在VP1的G-H loop小产生两个氨基酸残基的变异造成了一个优势中和表位的明显改变，导致抗原变异株的产生(中国发明专利授权公告号：CN101838658B)。本发明在上述构建的质粒pOK-O-FS-P12A3C的基础上，设计突变引物进行定点诱变，构建了3C蛋白酶活性改变的表达O型FMDV变异株P1-2A-3C基因的重组腺病毒rAdV-Om-FS-P12A3C，此O型突变体重组腺病毒(rAdV-Om-FS-P12A3C)与重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C比较，只是在于上述两个氨基酸的不同，其余的基因及其氨基酸序列均未发生任何变化。

本发明还公开了含有所述的亚基因组P1-2A-3C或亚基因组P1-2A-3C的突变体的重组表达载体和含有所述的重组表达载体的宿主细胞。

本发明将编码O型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C或其突变体导入到腺病毒中，最终筛选获得两株稳定表达O型口蹄疫病毒空衣壳的重组腺病毒，其3C蛋白酶活性明显下降，明显提高了表达口蹄疫病毒空衣壳的重组腺病毒在鼠体内诱导产生病毒特异性IgG抗体和中和抗体的水平。

本发明公开了一种构建所述rAdV-O-FS-P12A3C重组腺病毒的方法，包括以下步骤：将SEQ ID No.1所示的亚基因组和腺病毒穿梭质粒可操作的连接，得到重组腺病毒穿梭表达载体；将重组腺病毒穿梭表达载体与腺病毒骨架载体质粒共转化大肠杆菌，通过细菌内同源重组获得以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组；将克隆化重组腺病毒基因组线型化后转染293细胞，获得重组缺损型腺病毒。

本发明还公开了一种构建所述rAdV-Om-FS-P12A3C重组腺病毒的方法，包括以下步骤：将SEQ ID No.2所示的亚基因组P1-2A-3C的突变体和腺病毒穿梭质粒可操作的连接，得到重组腺病毒穿梭表达载体；将重组腺病毒穿梭表达载体与腺病毒骨架载体质粒共转化大肠杆菌，通过细菌内同源重组获得以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组；将克隆化重组腺病毒基因组线性化后转染293细胞，获得重组缺损型腺病毒。

本发明从构建的众多重组病毒中筛选获得遗传性能最稳定、免疫保护效力最高的两株稳定表达O型口蹄疫病毒空衣壳的重组腺病毒，其中一株是携带SEQ ID No.1所示的编码O型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C的重组缺损型腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C；另一株是携带SEQID No.2所示的编码O型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C的突变体的重组缺损型腺病毒rAdV-Om-FS-P12A3C。

本发明将能够稳定传代的重组缺损型腺病毒毒株rAdV-O-FS-P12A3C提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9570；分类命名为：人腺病毒5型。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2014年08月04日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明将另外一株能够稳定传代的重组缺损型腺病毒毒株rAdV-Om-FS-P12A3C提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9569；分类命名为：人腺病毒5型。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2014年08月04日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明采用间接免疫荧光试验和Western blot检测重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C中的外源基因在293细胞中的表达，同时测定其一步生长曲线；用PCBP1蛋白检测系统检测3C蛋白酶切割活性的变化情况，确定FMDV 3C基因的改造对3C蛋白酶活性的影响；最后，用rAdV-O-FS-P12A3C免疫BALB/c小鼠，检测该重组腺病毒在鼠体内诱导的体液免疫应答的变化。结果显示：外源基因在病毒传代过程中稳定表达，并能够形成FMDV衣壳蛋白；该重组腺病毒传至第8代时，毒价可达3.2×10⁸TCID₅₀/ml；3C基因的改造导致重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C的3C蛋白酶活性下降；用rAdV-O-FS-P12A3C及其亲本病毒接种BALB/c小鼠后，通过对免疫鼠抗体水平的检测发现，FMDV 3C蛋白酶活性下降的重组腺病毒，其表达的口蹄疫病毒空衣壳在鼠体内所诱导产生的抗体水平明显提高：从低免疫接种剂量组可以看出，3C蛋白酶活性降低的rAdV-O-FS-P12A3C接种组(A2/1×10^6.5TCID₅₀)和3C蛋白酶活性未改变的rAdV-O-P12A3C对照组(C2/1×10^6.5TCID₅₀)在鼠体内诱导的中和抗体水平在高峰期(1免后6周)相差4倍(A2/1：256，C2/1：64)，并且在抗体检测结束时(1免后14周)还有2倍以上(A2/1:45、C2/1:16)的差异。

本发明对重组腺病毒rAdV-Om-FS-P12A3C进行鉴定，免疫荧光检测呈阳性，Western blot检测呈现中等强度的阳性反应，表明口蹄疫病毒衣壳蛋白在293细胞中实现了高效表达；绘制一步生长曲线测定了重组腺病毒在293细胞中的复制能力；用PCBP1蛋白检测系统测定3C蛋白酶的切割活性，确定FMDV变异株3C基因的改造对3C蛋白酶活性的影响；同时，在BALB/c小鼠体内评价其诱导的中和抗体水平。结果表明，当重组腺病毒传至第8代时，毒价可达到3.2×10⁸TCID₅₀/ml；病毒在复制过程中能够形成FMDV病毒衣壳蛋白，并在病毒传代过程中稳定地表达；3C基因的改造导致了重组腺病毒rAdV-Om-FS-P12A3C的3C蛋白酶活性下降；rAdV-Om-FS-P12A3C接种BALB/c小鼠后，通过对免疫鼠抗体水平的检测发现，FMDV 3C蛋白酶活性的改变明显提高了表达口蹄疫病毒空衣壳的重组腺病毒在鼠体内所诱导产生的抗体水平，从低免疫接种剂量组可以看出，3C蛋白酶活性改变的rAdV-Om-FS-P12A3C接种组(B2/1×10^6.5TCID₅₀)和3C蛋白酶活性未改变rAdV-O-P12A3C对照组(D2/1×10^6.5TCID₅₀)在鼠体内诱导的中和抗体水平，在高峰期(1免后6周)相差4倍(B2/1：256，D2/1：64)，并且在抗体检测结束时(1免后14周)，还有2倍(B2/1:32，D2/1:16)的差异。

本发明所述的亚基因组P1-2A-3C或亚基因组P1-2A-3C的突变体能够应用于制备预防或治疗口蹄疫的药物或试剂。

现有技术中，有大量关于在痘苗病毒表达系统、腺病毒表达系统、大肠杆菌表达系统、转基因植物和杆状病毒表达系统中表达重组FMDV空衣壳的报道。在某些报道中，证实能产生足够的FMDV空衣壳对牲畜产生免疫保护作用；但是在多数情况下，P1和3C编码基因的配置和衣壳的装配效率具有高度变异性，尤其是在昆虫细胞中。例如，利用双启动子表达载体，O型FMDV的P1和3C编码基因分别由杆状病毒多角体蛋白启动子和p10启动子驱动，结果多聚蛋白前体裂解不完全。又例如，在家蚕杆状病毒系统中，编码FMDV Asia1的P1-2A-3C序列作为一个转录单元由多角体蛋白启动子驱动，结果从家蚕淋巴血中收获的空衣壳对牲畜具有免疫原性，产生中和抗体。迄今为止，还没有统一的标准和方法可以运用到FMDV不同血清型、不同的宿主细胞。例如，在昆虫细胞中利用人肠道病毒71表达空衣壳，空衣壳产量的提高仅限于Sf9细胞，当感染另一种通常具有高表达水平的昆虫细胞系--T.ni细胞时，由于T.ni细胞中具有低水平的启动子特异转录因子，FMDV衣壳的表达量很低(Efficientproduction of foot-and-mouth disease virus empty capsids in insect cellsfollowing down regulation of 3C protease activity,Claudine Porta,et al.Journal of virological Methods,187(2013)406-412.)。

本发明在保证3C蛋白酶对口蹄疫病毒衣壳蛋白的剪切作用以及空衣壳的组装和形成的前提下，对3C基因进行改造，减低3C蛋白酶活性及其对细胞的毒性作用，从而增强表达空衣壳的重组缺损型腺病毒在动物体内的免疫原性。本发明通过使用O型FMDV，采用腺病毒表达系统以及使用293细胞为宿主细胞这一特定表达体系，有效下调重组腺病毒中3C蛋白酶的活性，明显提高了所表达的空衣壳在小鼠体内的免疫原性。

实验证实，本发明构建的重组缺损型腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-Om-FS-P12A3C的3C蛋白酶活性明显下降，明显提高了在鼠体内诱导产生病毒特异性IgG抗体和中和抗体的水平，且传代稳定，与野生型腺病毒具有相似的生长趋势和病毒滴度，能够应用于制备预防或治疗口蹄疫的药物或试剂；此外，本发明所构建的重组缺损型腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-Om-FS-P12A3C能够组合作为二价候选疫苗覆盖当前中国O型FMDV流行株的抗原谱。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明构建的重组腺病毒毒株rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-Om-FS-P12A3C能够稳定传代；其3C蛋白酶的修饰及其活性的下降，明显提高了重组腺病毒表达的空衣壳在小鼠体内的免疫原性，可减少使用剂量、降低使用成本，产业化开发价值显著提升；重组腺病毒毒株rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-Om-FS-P12A3C组合作为二价候选疫苗可覆盖当前中国O型FMDV流行株的抗原谱。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“核苷酸序列”意指DNA或RNA中碱基的排列顺序。

术语“疫苗”意指将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。

术语“转染”意指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。

术语“病毒滴度”意指病毒的毒力或毒价，衡量病毒滴度的单位有最小致死量(MLD)、最小感染量(MID)和半数致死量(LD₅₀)。

术语“免疫”意指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。

术语“中和抗体”意指当病原微生物侵入机体时会产生相应的抗体，能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止侵入细胞。

术语“传代”意指当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液的过程，否则将影响细胞的继续生存。

附图说明

图1为3C基因修饰改造的FMDV P1-2A-3C亚基因组构建示意图；

图2为3C基因被改造的P1-2A-3C亚基因组重组pOK质粒的酶切鉴定；其中，1：pOK-O-FS-P12A3C质粒经HindIII和EcoRV双酶切；2：pOK-Om-FS-P12A3C质粒经HindIII和EcoRV双酶切；3：DL 15000DNALadder；

图3为3C基因被改造的P1-2A-3C亚基因组重组pShuttle质粒的酶切鉴定；其中，1：DL 15000DNA Ladder；2：pShuttle-O-FS-P12A3C质粒经HindIII和EcoRV双酶切；3：pShuttle-Om-FS-P12A3C质粒经HindIII和EcoRV双酶切；

图4为重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C-2、rAdV-O-FS-P12A3C-3、rAdV-O-FS-P12A3C、rAdV-Om-FS-P12A3C-1、rAdV-Om-FS-P12A3C和野生型腺病毒的一步生长曲线；

图5为重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C感染293细胞引起的细胞病变；其中，A为正常293细胞；B为感染rAdV-O-FS-P12A3C的293细胞；

图6为重组腺病毒rAdV-Om-FS-P12A3C感染293细胞引起的细胞病变；其中，A为正常293细胞；B为感染rAdV-Om-FS-P12A3C的293细胞；

图7为用间接免疫荧光试验检测重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C感染的293细胞；其中，A为rAdV-O-FS-P12A3C感染的293细胞；B为wtAdV感染的293细胞作为阴性对照；

图8为用间接免疫荧光试验检测重组腺病毒rAdV-Om-FS-P12A3C感染的293细胞；其中，A为rAdV-Om-FS-P12A3C感染的293细胞；B为wtAdV感染的293细胞作为阴性对照；

图9为用Western blot分析FMDV衣壳蛋白在重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C感染细胞中的表达；其中，1：3C基因未修饰改造的重组腺病毒rAdV-O-P12A3C感染的293细胞对照；2：预染的蛋白Marker；3～5：第4、6和8代rAdV-O-FS-P12A3C感染的293细胞；

图10为Western blot分析FMDV衣壳蛋白在重组腺病毒rAdV-Om-FS-P12A3C感染细胞中的表达；其中，1～3：第4、6和8代rAdV-Om-FS-P12A3C感染的293细胞；4：3C基因未修饰改造的重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C感染的293细胞作为对照；5：预染的蛋白Marker；

图11为载体pCAGGS-HA的图谱；

图12为重组质粒pHA-O-3C和pHA-Om-3C的酶切鉴定；其中，1：DL 15000DNA Ladder；2：pHA-O-3C质粒经EcoR I和Bgl Ⅱ双酶切；3：pHA-Om-3C质粒经EcoR I和Bgl Ⅱ双酶切；

图13为FMDV 3C蛋白酶的修饰改造导致的3C蛋白酶活性变化；其中，1：1μg质粒pFlag-PCBP1与1μg pHA-3C-H46Y共转染293细胞；2：1μg质粒pFlag-PCBP1与1μg pHA-O-3Cpro共转染293细胞；3：1μg质粒pFlag-PCBP1与1μg pHA-O-3C共转染293细胞；4：1μg质粒pFlag-PCBP1与1μg pHA-Om-3C共转染293细胞；其中，WB：Flag-PCBP1是以兔抗Flag MAb(1:1000)为一抗，羊抗兔IgG-HRP(1:2000)作为二抗；WB:HA-3c是以鼠抗FMDV-3ABC多抗(1:500)为一抗，羊抗鼠IgG-HRP(1:2000)作为二抗；WB:Tubulin为系统内参；

图14为重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-O-P12A3C接种BALB/c小鼠的FMDV特异性IgG抗体动态；

图15为重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-O-P12A3C接种BALB/c鼠的中和抗体动态；

图16为重组腺病毒rAdV-Om-FS-P12A3C和rAdV-Om-P12A3C接种BALB/c小鼠的FMDV特异性IgG抗体动态；

图17为重组腺病毒rAdV-Om-FS-P12A3C和rAdV-Om-P12A3C接种BALB/c鼠的中和抗体动态。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、质粒、载体和生化试剂

腺病毒骨架载体pAdEasy-1、腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV、大肠杆菌BJ5183感受态菌以及AD-293细胞均购自美国Stratagene公司。大肠杆菌JM109、DH5α感受态细胞和pOK-12质粒均由本发明人实验室保存。Pme I和Pac I均为NEB公司产品。转染试剂Effectene Transfection Reagent购自QIAGEN公司。口蹄疫病毒VP2单克隆抗体4B2(于力等，抗口蹄疫病毒血清型共享单克隆抗体及其识别的抗原表位，中国发明专利授权公告号：CN101838658B)由本发明人实验室制备和保存。无外源基因表达的野生型腺病毒(wtAd)由本发明人实验室保存。3C基因未改造的重组腺病毒rAdV-O-P12A3C和rAdV-Om-P12A3C(于力等，表达O型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损腺病毒及其应用，中国发明专利申请公布号：CN102747092 A)由本发明人实验室构建并保存。

实施例1 3C基因改造的重组腺病毒的构建及鉴定

1、实验方法

1.1 3C蛋白酶活性改变的O型FMDV基因组P1、2A和3C基因的拼接

以本发明人实验室保存的含有O型FMDV O/YS/CHA/05株P12A基因的重组质粒pOK-P12A和含有3C基因的重组质粒pOK-3C作为基础(于力等，表达O型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损腺病毒及其应用，中国发明专利申请公布号：CN 102747092 A)。

在质粒pOK-P12A上利用引物(N17D-UP-5'GTA ACT GCC ACC GTTGAG GAC TAC GGT GGT GAG ACA CAG GTC CAG AG 3'，N17D-Low-5'ACC TGT GTC TCA CCA CCG TAG TCC TCA ACG GTG GCA GTT ACGGGG TCA GC 3')(表1)，引入耐酸突变位点(于力等，O型口蹄疫病毒耐酸突变株、其携带的衣壳蛋白及其编码基因和应用，中国发明专利申请公布号CN 103849637A)，获得的质粒命名为pOK-P12A-N17D。

在质粒pOK-3C上利用引物(FS-1-5'CCT ACA AGG GAA GGC CAGGGA ATT TTC TCG TCA AAA ACC TCT GAA AGT GAG AGC 3'，FS-2-5'CCACTCGAG TTTT TTA GGG AAG ATC TGG CCT TCC TAC AAG GGAAGG CCA GGG AAT TT 3'和通用下游引物L3C-5'CTCGATATCTTACTCGTGGTGTGGTTCGGGATC 3')(表1)，通过2轮PCR引入艾滋病病毒HIV-1frameshift基因序列(TTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTTCCTACAAGGGAAGGCCAGGGAATTTTCT)，获得的质粒命名为pOK-3C-FS。

在质粒pOK-3C-FS上利用引物(142-UP-5'ACC TAC AAG GAC ATTGTA GTG ACC ATG GAC GGA GAC ACC ATG CCC GGT C 3'，142-Low-5'GACCGGGCATGGTGTCTCCGTCCATGGTCACTACAATGTCCTTGTAGGT 3')(表1)，引入能够导致3C蛋白酶活性改变的突变位点C142T，获得的质粒命名为pOK-3C-FS-142。

将上述构建的重组质粒pOK-P12A-N17D和pOK-3C-FS-142分别进行XhoI和EcoRV酶切后，将含有HIV-1frameshift基因序列，FMDV部分3B基因序列和含有基因突变位点C142T的全长3C基因序列连接至质粒pOK-P12A-N17D上，转化并且筛选阳性克隆，进行酶切和测序鉴定，测序正确的重组质粒命名为pOK-O-FS-P12A3C。

根据质粒pOK-O-FS-P12A3C(O型)的基因序列设计O型FMDV突变株的突变引物P1和P2(表1)，用于扩增pOK-O-FS-P12A3C(O型)质粒上的P12A3C基因，构建质粒pOK-Om-FS-P12A3C，其构建方法同质粒pOK-O-FS-P12A3C的构建方法，并转化至JM109感受态菌，经卡那霉素抗性筛选，挑取菌落接种至5mL含有卡那霉素的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒进行酶切、PCR扩增和序列测定。测序正确的质粒命名为pOK-Om-FS-P12A3C。

表1引物序列

1.2 重组腺病毒穿梭载体的构建

对质粒pOK-O-FS-P12A3C、pOK-Om-FS-P12A3C和腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV分别进行HindIII和EcoRV双酶切，胶回收纯化酶切后的产物，与穿梭载体连接，并转化至JM109感受态菌，经卡那霉素抗性筛选，挑取菌落接种至5mL含有卡那霉素的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒进行酶切、PCR和序列测定。测序正确的质粒命名pShuttle-O-FS-P12A3C和pShuttle-Om-FS-P12A3C。

1.3 重组腺病毒质粒的获得

将pShuttle-O-FS-P12A3C和pShuttle-Om-FS-P12A3C用限制性内切酶Pme I线性化，电转化至含有腺病毒骨架载体AdEasy-1的BJ5183感受态菌(AdEasy-1-BJ5183)中。经卡那霉素抗性筛选，提取质粒，用Pac I酶切鉴定，将阳性重组腺病毒质粒进行测序，测序正确的质粒命名为pAdV-O-FS-P12A3C和pAdV-Om-FS-P12A3C。

1.4 转染

将质粒pAdV-O-FS-P12A3C和pAdV-Om-FS-P12A3C转化DH5α感受态菌，大量增殖重组质粒。用中量质粒提取试剂盒提取重组腺病毒质粒，用Pac I酶切，乙醇沉淀灭菌，超净工作台无菌吹干，用无菌超纯水溶解沉淀，使质粒的终浓度为1～2mg/uL。用QIAGEN公司转染试剂EffecteneTransfection Reagent进行转染293细胞，具体操作按说明书进行。

1.5 重组腺病毒的纯化与鉴定

将获得的初代重组腺病毒反复冻融后，8000转离心5分钟后取上清，接种293细胞，连续传8代，观察细胞CPE变化；取第4、6和8代重组腺病毒感染的293细胞，用口蹄疫病毒VP2单克隆抗体4B2进行间接免疫荧光检测及Western blot分析，检测目的基因的表达情况。

1.5.1 间接免疫荧光试验

将293细胞种入96孔板，当长到90％单层时分别接种15MOI(Multiplicities of infection)本发明构建获得的重组腺病毒，24h后弃去培养基，用PBS洗涤细胞3次，将病毒感染的293细胞用预冷的无水乙醇固定15min，加入单抗4B2于37℃作用1h，用PBST洗涤后，加入荧光标记羊抗鼠IgG(Sigma)于37℃作用40min，PBST洗涤后自然干燥，加入缓冲甘油于荧光显微镜下观察。

1.5.2 Western blot

将感染本发明构建的重组腺病毒的293细胞进行SDS-PAGE分析，同时设立rAdV-O-P12A3C或rAdV-Om-P12A3C感染的293细胞作为阴性对照，之后转印到硝酸纤维素膜上，用脱脂牛奶封闭后，加入抗VP2的单抗4B2(1:1000稀释)于37℃作用1h，用PBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG(Sigma，1:10000稀释)，37℃作用1h，洗涤后加入DAB溶液显色。

1.6 重组腺病毒生长滴度的测定

分别用10MOI剂量的本发明构建获得的第8代重组腺病毒和野生型腺病毒(wtAdV)接种293细胞，在接种后12、24、36、48、60和72h分别收获病毒并进行毒价测定，建立重组腺病毒与野生型腺病毒的一步生长曲线。

2、实验结果

2.1 3C基因改造的重组腺病毒质粒的获得

3C基因被改造的FMDV P1-2A-3C亚基因组构建示意图见图1。首先在pOK-12载体上构建O型FMDV O/YS/CHA/05株和变异株的P1-2A-3C亚基因组。同时，将O型FMDV的耐酸突变位点N17D，3C蛋白酶活性改变的突变位点C142T和HIV-1frameshift基因序列分别引入至P1-2A-3C亚基因组的VP1、3C基因处的相应位置。本发明的设计中，O型FMDV P1-2A基因序列的后面不是直接跟随3C序列，而是保留有部分的3B核酸序列(195bp)，即3B’3C。因此，本发明中HIV-1frameshift基因序列插入的具体核苷酸位点是在3B核酸序列N端的第18/19位碱基处。获得的重组质粒命名为pOK-O-FS-P12A3C和pOK-Om-FS-P12A3C(图2)。再利用HindIII和EcoRV酶切位点将此3C基因被改造的O型FMDV O/YS/CHA/05株和变异株的P1-2A-3C亚基因组克隆至pShuttle-CMV，获得重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-O-FS-P12A3C和pShuttle-Om-FS-P12A3C(图3)。将Pme I线性化的重组腺病毒穿梭质粒电转化至含有腺病毒骨架载体AdEasy-1的BJ5183感受态菌中，获得重组腺病毒质粒pAdV-O-FS-P12A3C和pAdV-Om-FS-P12A3C，各选取了5个克隆用于下一步的病毒拯救。

2.2 3C蛋白酶被修饰的FMDV P1-2A-3C亚基因组重组腺病毒的产生

将pAdV-O-FS-P12A3C和pAdV-Om-FS-P12A3C转化DH5α感受态菌，将低拷贝的重组质粒转化为高拷贝的重组质粒。用质粒提取试剂盒大量制备重组质粒，用PacI酶切，乙醇沉淀，用QIAGEN公司转染试剂Effectene Transfection Reagent转染293细胞。pAdV-O-FS-P12A3C质粒转染293细胞获得5株重组腺病毒，分别命名为rAdV-O-FS-P12A3C-1、rAdV-O-FS-P12A3C-2、rAdV-O-FS-P12A3C-3、rAdV-O-FS-P12A3C-4和rAdV-O-FS-P12A3C；pAdV-Om-FS-P12A3C质粒转染293细胞获得3株重组腺病毒，分别命名为rAdV-Om-FS-P12A3C-1、rAdV-Om-FS-P12A3C-2和rAdV-Om-FS-P12A3C。

pAdV-Om-FS-P12A3C-3和pAdV-Om-FS-P12A3C-4质粒转染293细胞后没有产生病变。其余重组腺病毒质粒转染后6天细胞开始出现病变，细胞变圆、变大、脱落，第8天收获病毒在293细胞上连续传代。其中rAdV-O-FS-P12A3C-1、rAdV-O-FS-P12A3C-4和rAdV-Om-FS-P12A3C-2不能够稳定的传代，分别传至2代，2代和3代时就没有细胞病变的产生。重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C-2、rAdV-O-FS-P12A3C-3、rAdV-O-FS-P12A3C、rAdV-Om-FS-P12A3C-1和rAdV-Om-FS-P12A3C能够稳定传代。

经病毒滴度测定，绘制出能够稳定传代的第8代重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C-2、rAdV-O-FS-P12A3C-3、rAdV-O-FS-P12A3C、rAdV-Om-FS-P12A3C-1、rAdV-Om-FS-P12A3C和野生型腺病毒的一步生长曲线，即病毒增殖滴度与生长时间的相关性曲线，反映病毒生长繁殖的规律(图4)。结果表明，随着重组腺病毒感染293细胞时间的延长，病毒滴度逐渐升高，在48h时，病毒的滴度达到峰值，随后开始下降。重组腺病毒和野生型腺病毒具有相似的生长趋势和病毒滴度，说明它们具有相似的复制能力，其中重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-Om-FS-P12A3C的病毒增殖滴度最高，并且与生长时间呈现良好的相关性。说明，FMDV 3C基因的改造不影响rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-Om-FS-P12A3C的体外复制能力。

综合上述的研究，本发明最终选取了重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-Om-FS-P12A3C作为病毒株进行后续的研究；细胞在接种第八代的病毒毒株rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-Om-FS-P12A3C后24-48h完全出现CPE(图5B和图6B)。

本发明将能够稳定传代的、病毒增殖滴度最高的重组腺病毒毒株rAdV-O-FS-P12A3C提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9570。

本发明将另外一株能够稳定传代的且病毒增殖滴度最高的重组腺病毒毒株rAdV-Om-FS-P12A3C提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9569。

2.3 间接免疫荧光试验

用针对FMDV VP2蛋白的单克隆抗体4B2进行IFA检测，重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-Om-FS-P12A3C感染的细胞均出现明亮的荧光，而wtAdV感染的293细胞作为阴性对照组则检测不到荧光(图7和图8)，表明rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-Om-FS-P12A3C能正确地表达包含VP2在内的FMDV衣壳蛋白。

2.4 Western blot分析

对第4代、6代和8代的重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-Om-FS-P12A3C分别进行Western blot分析(图9和图10)，结果表明，这2株重组腺病毒在感染的293细胞中复制产生了病毒衣壳蛋白，并且得到稳定地表达。与单克隆抗体4B2发生免疫反应的条带与FMDV衣壳蛋白VP0、VP3和VP1的分子量大小相当，表明rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-Om-FS-P12A3C感染293细胞后产生并形成FMDV多聚蛋白，3C蛋白酶能够正确切割多聚蛋白并组装成FMDV衣壳蛋白。同时，用3C蛋白酶基因未经过改造的rAdV-O-P12A3C和rAdV-Om-P12A3C感染的293细胞作为对照，结果显示3C蛋白酶基因改造和未改造的重组腺病毒感染293细胞后形成的VP0、VP3和VP1条带浓度没有明显差别。但是，rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-Om-FS-P12A3C感染的293细胞在90KDa左右有1个条带，与FMDV衣壳蛋白前体P1-2A的分子量大小相当，而对照组没有此条带。这与Gullberg和Porta等(Gullberg et al.,2013；Porta etal.,2013)的结果有相同之处，他们的研究发现3C蛋白酶基因经过修饰的表达FMDV P1-2A-3C基因的重组痘苗病毒和重组杆状病毒所生成VP0、VP3和VP1条带浓度会有所提高，同时P1-2A条带浓度也有明显的提高，而3C蛋白酶基因未修饰的重组病毒则没有P1-2A条带的生成。研究者认为这是由于3C蛋白酶基因的修饰导致3C蛋白酶活性的下降，增强了FMDV衣壳蛋白生成量的积累。本发明中，3C蛋白酶被修饰的表达FMDV空衣壳的重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-Om-FS-P12A3C感染293细胞，虽然其VP0、VP3和VP1条带浓度没有明显增强，但P1-2A条带浓度却得到了明显的提高。

实施例2 FMDV 3C基因被修饰后的3C蛋白酶活性的分析

1、实验方法

取本发明实施例1获得的F8代重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C(微生物保藏编号为：CGMCC No.9570)和rAdV-Om-FS-P12A3C(微生物保藏编号为：CGMCC No.9569)感染HEK293细胞后的病毒悬液，用上海华舜生物的柱离式细胞基因组DNA快速抽提试剂盒提取重组腺病毒DNA。以F8代重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-Om-FS-P12A3C的基因组为模板，用引物3C1/3C2(表1)扩增包含HIV-1frameshift基因序列，FMDV部分3B基因序列和含有基因突变位点C142T的全长3C基因序列。将PCR产物和pCAGGS-HA载体分别进行EcoR I和Bgl Ⅱ酶切后，将含有HIV-1frameshift基因序列，FMDV部分3B基因序列和含有基因突变位点C142T的全长3C基因序列连接至质粒pCAGGS-HA(载体pCAGGS-HA”的图谱见图11)上，转化并且筛选阳性克隆，进行酶切和测序鉴定，测序正确的重组质粒命名为pHA-O-3C和pHA-Om-3C。重组质粒pHA-O-3C和pHA-Om-3C的酶切鉴定结果见图12。

将1μg质粒pFlag-PCBP1、pHA-O-3Cpro、pHA-3C-H46Y、pHA-O-3C和pHA-Om-3C单独或共转染293细胞；收集细胞样品经SDS-PAGE分离后，转至PVDF膜上；5％脱脂乳室温封闭1小时，WB：Flag-PCBP1以兔抗Flag MAb(1:1000)为一抗，羊抗兔IgG-HRP(1:2000)作为二抗。WB:HA-3c是以鼠抗FMDV-3ABC多抗(1:500)为一抗，羊抗鼠IgG-HRP(1:2000)作为二抗。使用ECL发光系统检测蛋白的水平。

2、实验结果

为检测FMDV 3C基因的修饰改造对3C蛋白酶活性所产生的影响，本发明将1μg质粒pFlag-PCBP1与1μg pHA-O-3Cpro、pHA-3C-H46Y、pHA-O-3C和pHA-Om-3C单独或共转染293细胞，收集细胞样品进行Western blot分析，结果如图13所示。3C基因未改造的具有天然3C蛋白酶活性的重组质粒pHA-O-3Cpro能够切割PCBP1，并在PCBP1蛋白条带下部产生了1条高浓度的蛋白条带。3C蛋白酶活性完全丧失的重组质粒pHA-3C-H46Y不能切割PCBP1，在其蛋白条带下部也无任何蛋白条带生成。而本发明中3C基因改造的重组质粒pHA-O-3C和pHA-Om-3C切割PCBP1蛋白后，在其下部所生成的蛋白条带浓度则明显减弱，明显低于pHA-O-3Cpro切割PCBP1后在PCBP1蛋白条带下部产生的蛋白条带的浓度(图13)。

上述结果表明，通过对重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-Om-FS-P12A3C中3C蛋白酶的修饰改造，其切割PCBP1的能力明显下降，进一步说明了3C蛋白酶活性的明显下降。

实验例1 重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C或rAdV-Om-FS-P12A3C接种鼠的体液免疫应答实验

1、实验方法

1.1 BALB/c鼠的免疫接种

7周龄BALB/c鼠135只，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心，用免疫荧光方法检测人腺病毒5型抗体为阴性。本发明实施例1构建的重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9570；重组腺病毒rAdV-Om-FS-P12A3C，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9569。

实验动物随机分成9组，每组15只。A1组接种1×10^7.5TCID₅₀重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C，A2组接种1×10^6.5TCID₅₀重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C；B1组接种1×10^7.5TCID₅₀重组腺病毒rAdV-Om-FS-P12A3C，B2组接种1×10^6.5TCID₅₀重组腺病毒rAdV-Om-FS-P12A3C；C1组接种1×10^7.5TCID₅₀重组腺病毒rAdV-O-P12A3C，C2组接种1×10^6.5TCID₅₀重组腺病毒rAdV-O-P12A3C；D1组接种1×10^7.5TCID₅₀重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C，D2组接种1×10^6.5TCID₅₀重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C。E组为Ad5野生型腺病毒免疫对照组。各组鼠均在第一次免疫后第4周以相同剂量加强免疫。重组腺病毒用PBS稀释，免疫途径均为后腿肌肉注射。上述各组均在接种后14周内采集血清，分别用ELISA和微量中和试验检测鼠血清抗体的动态水平。

1.2 间接ELISA检测

用包被液将FMDV 146S抗原稀释至20μg/mL，每孔100μL，加入酶标板，4℃过夜包被。用PBS洗3次，5％脱脂乳封闭，37℃孵育1h。PBS洗3次，加入待检小鼠血清，同时设立鼠阳性和鼠阴性血清为对照，于37℃孵育1h。洗涤后加入1:5000稀释的HRP标记羊抗鼠二抗，OPD显色，于492nm波长读取OD值。

1.3 微量细胞中和试验

将待检血清于56℃灭活30分钟，2倍倍比稀释后(1:16～1:2048)加入96孔细胞培养板中，每孔50μL，然后加入等体积的重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C或rAdV-Om-FS-P12A3C病毒液(200TCID₅₀/100μL)混合，于37℃孵育1h后，接种已长满单层BHK-21细胞的96孔培养板，每个稀释度4孔，同时设细胞对照和病毒对照孔，在37℃于5％CO₂培养4～5d，逐日观察细胞病变(CPE)。根据CPE计算中和滴度，以能保护50％的BHK-21细胞不出现CPE的最高血清稀释度作为中和抗体的滴度。

2、实验结果

2.1 重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C接种鼠的体液免疫应答

实验结果见图14和图15。从图14可见，重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C(A1和A2)免疫组和重组腺病毒rAdV-O-P12A3C(C1和C2)免疫对照组在接种后4周均出现口蹄疫特异性IgG抗体，随后抗体水平逐渐升高，第8周IgG抗体水平达到高峰，之后逐渐下降。而wtAdV对照组(E组)一直没有口蹄疫特异性抗体的产生。如图14所示，A1、A2和C1组免疫鼠的口蹄疫特异性IgG抗体动态水平，在整个抗体检测期内趋于一致，而与A2组免疫剂量相同的C2组免疫接种鼠的口蹄疫特异性IgG抗体水平则明显低于A2组免疫接种鼠，这种差异在1免后8周、10周和14周表现的尤其明显。同时，A2组免疫鼠的接种剂量(1×10^6.5TCID₅₀)比A1组(1×10^7.5TCID₅₀)和C1组(1×10^7.5TCID₅₀)免疫鼠低10倍，但A2组免疫接种鼠的特异性IgG抗体水平却与A1和C1组相近。

用ELISA方法检测特异性IgG抗体，可以反映重组腺病毒rAdV-O-FS-P12A3C在免疫接种鼠体内诱导免疫应答的整体水平，而更直观的保护性免疫指标是中和抗体水平。因此，在检测血清特异性IgG抗体的同时，本发明也测定了上述各实验组的中和抗体水平及其动态，结果见图15。rAdV-O-FS-P12A3C和rAdV-O-P12A3C免疫接种鼠，A1、A2、C1和C2组在1免后4周出现口蹄疫中和抗体，其中A1、A2和C1组免疫鼠在1免后6周中和抗体达到高峰(1：256)，C2组鼠在第10周中和抗体才达到峰值(1：89)，之后中和抗体水平逐渐下降，而wtAdV免疫对照组(E组)一直没有口蹄疫病毒中和抗体的产生。对图14中显示的各免疫组中和抗体水平进行比较表明，A2组鼠的免疫剂量(1×10^6.5TCID₅₀)比A1组(1×10^7.5TCID₅₀)和C1组(1×10^7.5TCID₅₀)免疫鼠低10倍，但在整个抗体检测期内其口蹄疫病毒中和抗体水平却与A1和C1组趋于一致。A2组与C2组免疫鼠接种相同剂量的重组腺病毒(1×10^6.5TCID₅₀)，但所诱导的中和抗体水平存在明显的差异。A2组鼠在抗体高峰期(1免后6周)产生的中和抗体滴度为1:256，而C2组鼠在抗体高峰期(1免后10周)的中和抗体滴度为1:89。A2组鼠在1免后8周和10周的中和抗体滴度均为1:128，而C2组在1免后8周和10周的中和抗体滴度分别为1:64和1:89。甚至在抗体检测结束(1免后14周)时，A2和C2组免疫鼠的中和抗体滴度仍存在明显的差异，分别为1:45和1:16。

2.2 重组腺病毒rAdV-Om-FS-P12A3C接种鼠的体液免疫应答

从图16可见，重组腺病毒rAdV-Om-FS-P12A3C(B1和B2)免疫组和重组腺病毒rAdV-Om-P12A3C(D1和D2)免疫对照组在接种后4周均出现口蹄疫特异性IgG抗体，随后抗体水平逐渐升高，第8周IgG抗体水平达到高峰，之后逐渐下降。而wtAdV对照组(E组)一直没有口蹄疫特异性抗体的产生。如图16所示，B1、B2和D1组免疫鼠的口蹄疫特异性IgG抗体动态水平，在整个抗体检测期内趋于一致，而与B2组免疫剂量相同的D2组免疫接种鼠的口蹄疫特异性IgG抗体水平则明显低于B2组免疫接种鼠，这种差异在1免后6周、8周和10周表现的尤其明显。同时，B2组免疫鼠的接种剂量(1×10^6.5TCID₅₀)比B1组(1×10^7.5TCID₅₀)和D1组(1×10^7.5TCID₅₀)免疫鼠低10倍，但B2组免疫接种鼠的特异性IgG抗体水平却与B1和D1组相近。

用ELISA方法检测特异性IgG抗体，可以反映重组腺病毒rAdV-Om-FS-P12A3C在免疫接种鼠体内诱导免疫应答的整体水平，而更直观的保护性免疫指标是中和抗体水平。因此，在检测血清特异性IgG抗体的同时，本发明也测定了上述各实验组的中和抗体水平及其动态，结果见图17。rAdV-Om-FS-P12A3C和rAdV-Om-P12A3C免疫接种鼠，B1、B2、D1和D2组在1免后4周出现口蹄疫病毒中和抗体，其中B1、B2、D1组鼠在1免后6周中和抗体达到高峰(1：256)，D2组鼠在第8周和10周中和抗体水平才达到峰值(1：89)，之后逐渐下降，而wtAdV免疫对照组(E组)一直没有口蹄疫病毒中和抗体的产生。对图16中显示的各免疫组中和抗体水平进行比较表明，B2组免疫鼠的免疫剂量(1×10^6.5TCID₅₀)比B1组(1×10^7.5TCID₅₀)和D1组免疫鼠(1×10^7.5TCID₅₀)低10倍，但在整个抗体检测期内，其口蹄疫病毒中和抗体的动态水平却与B1和D1组免疫鼠趋于一致。B2组与D2组免疫鼠接种相同剂量的重组腺病毒(1×10^6.5TCID₅₀)，但其诱导的中和抗体水平存在明显的差异。B2组在抗体高峰期(1免后6周)的中和抗体滴度为1:256，而D2组在抗体高峰期(1免后8周和10周)的中和抗体滴度为1:89；B2组在1免后8周和10周的中和抗体滴度分别为1:128和1:256，而D2组在1免后8周和10周的中和抗体滴度均为1:89。甚至在抗体检测结束时(1免后14周)，B2和D2组鼠的中和抗体滴度仍存在明显的差异，分别为1:32和1:16。

综上所述，通过对各组免疫鼠整个周期抗体水平的检测发现，FMDV3C蛋白酶活性的下降对于表达口蹄疫病毒空衣壳的重组腺病毒在小鼠体内的免疫原性产生了显著的影响。3C蛋白酶活性的下降，明显提高了表达口蹄疫病毒空衣壳的重组腺病毒在鼠体内诱导产生病毒特异性IgG抗体和中和抗体的水平。在O型FMDV O/YS/CHA/05株和Om/YS/CHA/05株的空衣壳中，通过3C蛋白酶的定点修饰，均产生了这种效果。尤其在低免疫接种剂量(1×10^6.5TCID₅₀)的A2/rAdV-O-FS-P12A3C、C2/rAdV-O-P12A3C、B2/rAdV-Om-FS-P12A3C和D2/rAdV-Om-P12A3C免疫组，通过诱导鼠体产生中和抗体动态水平的比较可以看出，3C蛋白酶活性下降和未改变的表达口蹄疫病毒空衣壳的重组腺病毒，其诱导小鼠产生中和抗体的水平在高峰期相差4倍(A2/1:256、C2/1:89)，甚至在抗体检测结束时(1免后14周)仍有2倍(B2/1:32、D2/1:16)甚至2倍以上(A2/1:45、C2/1:16)的差异。

Claims (10)

1.编码O型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.编码O型口蹄疫病毒空衣壳的亚基因组P1-2A-3C的突变体，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

3.含有权利要求1所述亚基因组P1-2A-3C或权利要求2所述亚基因组P1-2A-3C的突变体的重组表达载体。

4.含有权利要求3所述重组表达载体的宿主细胞。

5.稳定表达权利要求1所述亚基因组P1-2A-3C的重组缺损型腺病毒，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCC No.9570。

6.稳定表达权利要求2所述的亚基因组P1-2A-3C的突变体的重组缺损型腺病毒，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCC No.9569。

7.一种构建权利要求5所述的重组缺损型腺病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：将SEQ ID No.1所示的亚基因组和腺病毒穿梭质粒可操作的连接，得到重组腺病毒穿梭表达载体；将重组腺病毒穿梭表达载体与腺病毒骨架载体质粒共转化大肠杆菌，通过细菌内同源重组获得以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组；将克隆化重组腺病毒基因组线型化后转染293细胞，获得重组缺损型腺病毒。

8.一种构建权利要求6所述的重组缺损型腺病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：将SEQ ID No.2所示的亚基因组的突变体和腺病毒穿梭质粒可操作的连接，得到重组腺病毒穿梭表达载体；将重组腺病毒穿梭表达载体与腺病毒骨架载体质粒共转化大肠杆菌，通过细菌内同源重组获得以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组；将克隆化重组腺病毒基因组线性化后转染293细胞，获得重组缺损型腺病毒。

9.权利要求1所述的亚基因组P1-2A-3C或权利要求2所述的亚基因组P1-2A-3C的突变体在制备预防或治疗口蹄疫的药物或试剂中的应用。

10.权利要求5或权利要求6所述的重组缺损型腺病毒在制备预防或治疗口蹄疫的药物或试剂中的应用。