CN101285056A

CN101285056A - 猪瘟重组腺病毒及其在制备猪瘟基因工程疫苗中的用途

Info

Publication number: CN101285056A
Application number: CNA2008100932157A
Authority: CN
Inventors: 仇华吉; 孙元; 祁巧芬; 梁冰冰; 李娜; 于墨阳; 王宇飞; 成丹; 朱庆虎; 涂长春
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2008-04-23
Filing date: 2008-04-23
Publication date: 2008-10-15

Abstract

本发明公开了一株重组腺病毒rAdV－E2，其微生物保藏号是：CGMCC No.2429。本发明应用复制缺陷型腺病毒载体系统，构建了含有猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒rAdV－E2，并以家兔作为模型，评价了rAdV－E2的免疫效力，试验结果显示，免疫后2周免疫兔产生了猪瘟特异性抗体，在免疫后5周抗体滴度达到峰值，免疫兔可以抵抗猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)的攻击，表明本发明rAdV－E2具有良好的免疫效力，可用于制备猪瘟基因工程疫苗。

Description

猪瘟重组腺病毒及其在制备猪瘟基因工程疫苗中的用途

技术领域

本发明涉及重组病毒，尤其涉及一株猪瘟重组腺病毒，本方面还涉及该重组腺病毒在制备猪瘟基因工程疫苗中的用途，属于生物技术领域。

背景技术

猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(classical swinefever virus，CSFV)引起的一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。该病死亡率高达80-90％，世界动物卫生组织(OIE)将其列入OIE疾病名录，我国也将其列为一类传染病。CSFV为有囊膜的正链RNA病毒(Moennig V.Introduction toclassical swine fever virus，disease and control policy.Vet Microbiol，2000，73(2-3)：93-102.)，其基因组大小约为12.3kb，含有一个大的开放阅读框架(ORF)，编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，此多聚蛋白经病毒和宿主细胞酶的作用，形成4个成熟的结构蛋白(C、E^rns、E1和E2)以及至少7个非结构蛋白。E^rns和E2糖蛋白是CSFV的主要保护性抗原，均能独自诱导机体产生中和性抗体，保护机体免受强毒的攻击(Meyers G，Tautz N，Stark R，et al.Rearrangement of viral sequences in cytopathogenic pestiviruses.Virology，1992，91(1)：368-386.)。E2蛋白由ORF编码的⁶⁹⁰Arg至¹⁰⁶⁰Leu之间的370个氨基酸残基组成，位于病毒囊膜表面，参与病毒的感染过程。在猪瘟病毒编码的蛋白中，E2是最不保守的一种蛋白，但又是猪瘟病毒的主要保护性抗原，能诱导机体产生中和抗体，成为近年来研制新型疫苗和血清学诊断抗原的主要靶蛋白。

随着分子生物学技术的迅速发展，特别是重组DNA技术的建立，使得各种病毒用作载体成为可能。目前比较成熟的病毒载体主要有逆转录病毒、腺病毒及痘苗病毒等载体。其中，腺病毒载体以其安全、高效、宿主范围广、转移和表达外源基因能力强的特点，成为继逆转录病毒载体后在基因治疗、基因免疫等方面应用较广的一种基因载体(Adam E，Nasz I.Significance of recombinantadenovirus in experimental gene therapy.Orv Hetil，1995，136(15)：755-761.)，尤其是复制缺陷型人血清5型腺病毒载体，近年来在重组病毒活载体疫苗的构建上得到了广泛的应用，这种载体到目前为止已经发展到了第三代，由于缺失了病毒非必要基因区(E1/E3)，使得能够携带大片段的外源基因，而且只能够在特定的细胞系中繁殖。另外，该载体系统还引入了CMV启动子，使得外源基因可以高水平的表达(

A，Adam M，Monteil M，et al.Efficacy ofreplication-defective adenovirus-vectored vaccines：protection followingintramuscular injection is linked to promoter efficiency in muscle representativecells.Virology，1997，238(2)327-335.)。

近年来，E1和E3区缺失的腺病毒载体越来越得到研究者的青睐，因为这种载体有诸多优势：易于制备，操作方便，可携带较大的外源片段，可感染的宿主细胞多，导入效率高，理化性质稳定，易于分离纯化，不整合到宿主细胞的基因组(Randrianarison-Jewtoukoff V，Perricaudet M.Recombinant adenovirusesas vaccines.Biologicals，1995，23(2)：145-157.)。另外，重组腺病毒可同时表达多个基因，而且还可以对表达产物进行正确的翻译后修饰，应用这种腺病毒载体构建的活载体疫苗在诱导体液免疫上较DNA疫苗及灭活疫苗效果好，而且在动物体内不存在人腺病毒抗体，不用考虑母源抗体的干扰问题(Bangari DS，MittalSK.Development of nonhuman adenoviruses as vaccine vectors.Vaccine，2006，24(7)：849-862.)。

诸多研究证实，利用腺病毒载体构建重组病毒疫苗有很好的免疫效果。Wang等(2006)构建了表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组腺病毒，将此重组病毒免疫猪后，能够检测到高水平的特异性抗体，攻毒后免疫猪得到完全保护(Wang X，Jiang P，Li Y，et al.Protection of pigs against post-weaning multisystemicwasting syndrome by a recombinant adenovirus expressing the capsid protein ofporcine circovirus type 2.Vet Microbiol，2007，121(3-4)：215-224.)。Zhou等(2007)构建了鸡源鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因的重组腺病毒，用重组腺病毒免疫SPF雏鸡，然后用强毒菌株攻击，90％的雏鸡获得了保护(Zhou J，Qiu C，Cao XA，et al.Construction and immunogenicity of recombinant adenovirusexpressing the major outer membrane protein(MOMP)of Chlamydophila psittaciin chicks.Vaccine，2007，25(34)：6367-6372.)。Wes ley等(2004)将表达H3N2亚型猪流感病毒核蛋白和血凝素蛋白的重组腺病毒免疫了猪，4w后就产生了病毒特异性的HI抗体，并对强毒的攻击产生了完全的保护作用(Wesley RD，Tang M，Lager KM.Protection of weaned pigs by vaccination with human adenovirus 5recombinant viruses expressing the hemagglutinin and the nucleoprotein of H3N2swine influenza virus.Vaccine，2004，22(25-26)：3427-3434.)。

迄今为止，尚缺乏一种含有猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒，该重组腺病毒具有良好的免疫效力，可用于制备猪瘟疫苗。

发明内容

本发明目的是提供一株重组腺病毒，该重组腺病毒含有猪瘟病毒E2基因，具有良好的免疫效力，可用于制备猪瘟疫苗。

本发明目的是通过以下技术方案来实现的：

一株重组腺病毒，命名为rAdV-E2，其微生物保藏号是：CGMCC No.2429；分类命名：猪瘟重组腺病毒；保藏时间：2008年4月1日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。

本发明为了明确腺病毒是否可以作为猪瘟基因工程疫苗的载体，构建了表达CSFV E2基因的重组腺病毒，并在家兔上评价了其免疫效力。

本发明应用复制缺陷型人血清5型腺病毒载体系统，构建了含有猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒rAdV-E2，应用Western blot及间接免疫荧光试验均能检测到猪瘟病毒E2蛋白的表达。通过比较rAdV-E2与其亲本病毒的一步生长曲线，发现二者在增殖特点上没有明显区别。为了分析rAdV-E2是否具有免疫效力，本发明在兔体上进行了免疫攻毒试验。实验结果显示，免疫后2周即可检测到猪瘟特异性抗体的产生，在免疫后5周抗体滴度达到峰值(部分家兔抗体阻断率达到80％以上)，这说明本发明所构建的重组腺病毒rAdV-E2具有较好的免疫原性。

猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)是在家兔上反复传代致弱而得到的一株猪瘟弱毒疫苗，对猪只有良好的安全性和免疫效力。尽管C株对各种年龄猪没有致病性，但对家兔(特别是大白兔)有一定的致病性，通过耳静脉接种家兔可以产生定型热(体温升高1℃以上，持续12h以上)，并且疫苗病毒在体内淋巴组织内广泛复制，其中脾脏中病毒含量最高。因此，通常采用耳静脉接种家兔，在其发热后期取其脾脏来制备C株疫苗种毒。接种过C株的家兔(获得免疫保护)再次接种C株时则不再出现定型热。利用C株在家兔上的这一特点，可以评价疫苗的免疫效力。鉴于此，本发明以家兔作为模型评价了所构建的重组腺病毒rAdV-E2的免疫效力。首先用rAdV-E2接种家兔，然后用C株进行攻击，实验结果显示，接种rAdV-E2的家兔与接种C株的家兔一样，攻毒后均未出现定型热，并且用实时荧光定量RT-PCR从其脾脏中均未检出C株的病毒RNA，而接种野生型腺病毒的对照家兔在攻毒后全部出现定型热，并且在其脾脏中可检出大量拷贝的C株病毒RNA(10³拷贝数/μL以上)，这表明，本发明所构建的rAdV-E2可以保护家兔免于C株的攻击，具有良好的免疫效力，可用于制备猪瘟基因工程疫苗。

附图说明

图1重组腺病毒rAdV-E2感染293细胞后引起的细胞病变；A：正常293细胞；B：rAdV-E2感染的293细胞。

图2重组腺病毒rAdV-E2的PCR鉴定；M：DL 2000分子量标准；1-3：第6、8和10代rAdV-E2；4：水对照。

图3用间接免疫荧光试验检测E2蛋白在重组腺病毒rAdV-E2感染293细胞中的表达；A：rAdV-E2感染的293细胞；B：正常293细胞。

图4用Western blot分析E2蛋白在重组腺病毒rAdV-E2感染293细胞的表达；1：蛋白质分子量标准；2：rAdV-E2细胞裂解上清；3：杆状病毒表达的重组E2蛋白；4：正常293培养液上清；5：野生型腺病毒。

图5重组腺病毒rAdV-E2的一步生长曲线。

图6重组腺病毒rAdV-E2免疫兔后产生的抗体滴度。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验材料

质粒、载体和生化试剂：腺病毒载体系统包括腺病毒骨架载体pAdEasy-1和腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV、以及大肠杆菌BJ5183感受态菌均购自Stratagene公司；质粒pCDST(含有CSFV E2基因的质粒)可按照文献所公开的方法进行构建(Yu X，Tu C，Li H，et al.DNA-mediated protection against classicalswine fever virus.Vaccine，2001Jan 8；19(11-12)：1520-5.)；大肠杆菌JM109、DH5α感受态细胞和293T细胞由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点试验室保存；PmeI和PacI均为NEB BioLabs产品。

实施例1重组腺病毒rAdV-E2的构建及鉴定

1.1重组腺病毒穿梭载体的构建

用限制性内切酶BGlII和EcoRV双酶切腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV，纯化回收酶切后的载体；用BamHI和EcoRV双酶切pCDST，纯化回收酶切后的E2基因；将目的基因E2与穿梭载体连接，按常规方法转化至JM109感受态菌，经卡那霉素抗性筛选，挑取单个抗性菌落接种至5mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养过夜，提取质粒，进行PCR、酶切和测序鉴定，测序正确的命名为pSC-E2。

1.2重组腺病毒质粒的获得

将pSC-E2用限制性内切酶PmeI线性化，电转化至含有腺病毒骨架载体AdEasy-1的BJ5183感受态菌(AdEasy-1-BJ5183)中。经卡那霉素抗性筛选，提取质粒，用PacI酶切鉴定，将阳性重组腺病毒质粒进行测序，正确的命名为pAdV-E2。

1.3转染

将pAdV-E2转化DH5α感受态菌，以大量增殖重组质粒。用质粒中量提取试剂盒提取重组腺病毒质粒，用PacI酶切，乙醇沉淀灭菌，超净工作台无菌吹干，用无菌超纯水溶解沉淀，保证质粒的浓度约为1-2μg/μL，用Lipofectamine2000转染试剂进行转染，具体操作按说明书进行。

1.4重组腺病毒的纯化与鉴定

将包装的初代重组腺病毒(命名为rAdV-E2)反复冻融后，离心取上清，接种293细胞，连续传10代，观察细胞病变情况；取6、8和10代病毒，用蛋白酶K处理后，通过PCR检测目的基因。同时取6、8和10代重组腺病毒感染的293细胞，用猪瘟病毒E2单抗6E10(彭伍平.利用噬菌体展示技术鉴定猪瘟病毒E2蛋白抗原表位.中国农业科学院研究生院硕士论文，2007)和HQ06(侯强，彭伍平，孙元等.猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的原核表达及其单克隆抗体的制备.中国兽医科学，2008，38(1)：1-5)进行间接免疫荧光试验及Western blot分析，以检测目的基因的表达情况。

实验结果：重组腺病毒传至第5代后，于24-48h内细胞病变完全(细胞变大、变圆、聚集成葡萄串样)(图1)。取第6、8和10代重组病毒，用PCR均能检测到目的基因(1.2kb)(图2)。用间接免疫荧光试验及Western blot均能检测到目的基因的表达(图3和图4)。

1.5重组病毒增殖滴度测定

分别用10³TCID₅₀重组腺病毒(rAdV-E2)和其亲本病毒(野生型腺病毒，wtAdV)接种293细胞，分别于接毒后12、24、36、48、60和72h收取病毒并进行毒价测定，建立重组腺病毒与野生型病毒的一步生长曲线，分析两者在生长动力学上是否存在差异。

实验结果：通过病毒滴度测定，发现重组腺病毒rAdV-E2与其亲本病毒生长曲线没有明显差异(图5)。电镜观察显示，重组病毒感染293细胞后24h，可观察到少量完整病毒粒子，大部分没有核酸；在感染后48h病毒粒子几乎全部组装完全，病毒滴度达到峰值，随后逐渐减少。

试验例1 重组病毒rAdV-E2的免疫效力试验

一、实验方法

选取猪瘟抗体阴性的长耳白兔15只(购自黑龙江省生物制品一厂)随机分成3组，每组5只，第一组经后腿肌肉注射接种10⁸TCID₅₀(1mL)的重组腺病毒rAdV-E2，第二组经同样途径接种同样剂量的野生型腺病毒(wtAdV)，第三组通过耳静脉注射100RID₅₀的猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)。免疫后每周对所有家兔通过耳静脉采血，收集血清，应用阻断ELISA试剂盒(IDEXX公司)按说明书检测猪瘟抗体。免疫后6周，用100RID₅₀C株通过耳静脉接种对所有试验兔进行攻击，攻毒后每隔6小时测定家兔直肠温度，连续测定3天，确定家兔是否存在定型热反应。攻毒后3天，剖杀所有试验兔，采集脾脏，应用已报到的实时荧光定量RT-PCR^[10]检测其中C株病毒RNA含量。

二、实验结果

1、重组病毒rAdV-E2诱导的免疫应答

rAdV-E2免疫兔于免疫后2周开始产生猪瘟特异性抗体(抗体阻断率达到40％以上)，随后抗体水平逐渐升高，于免疫后5周抗体达到峰值，而wtAdV免疫兔一直没有产生猪瘟特异性抗体(图6)。

2、重组病毒rAdV-E2对家兔的保护作用

攻毒后rAdV-E2免疫兔和C株免疫兔均未出现定型热反应，而对照组家兔全部出现了定型热反应(表1)，实时荧光定量RT-PCR检测表明，从rAdV-E2免疫兔均没有检测到C株病毒RNA，而从对照兔均能检测到，且病毒RNA含量达到了10³拷贝/μL(表2)。说明免疫rAdV-E2后诱导机体产生了针对猪瘟的特异性抗体，该抗体对猪瘟病毒的攻击具有保护作用。

表1 用C株攻毒后免疫兔产生的定型热反应

注：连续3次测温体温升高1℃以上，判定为有定型热反应。

表2 用实时荧光定量RT-PCR检测攻毒后免疫兔脾脏内猪瘟病毒RNA含量

注：“-”：未检出。

Claims

1、一株表达猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒rAdV-E2，其微生物保藏号是：CGMCC No.2429。

2、由权利要求1所述的重组腺病毒rAdV-E2衍生的其它重组腺病毒。

3、一种猪瘟基因工程疫苗，其特征在于：含有权利要求1所述的重组腺病毒rAdV-E2。

4、权利要求1所述的重组腺病毒rAdV-E2在制备猪瘟疫苗中的用途。