CN1793178A - 破伤风毒素t细胞表位多肽与人b淋巴细胞刺激因子融合蛋白及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了破伤风毒素T细胞表位肽与人B淋巴细胞刺激及因子融合蛋白及制备方法，TT表位肽－QYIKANSKFIGITE－(谷氨酰胺－酪氨酸－异亮氨酸－赖氨酸－丙氨酸－天冬酰胺－丝氨酸－赖氨酸－苯丙氨酸－异亮氨酸－甘氨酸－异亮氨酸－苏氨酸－谷氨酸)可以刺激机体的CD4⁺T细胞反应，促进机体的体液免疫水平。采用分步克隆，构建TT与BLyS的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。通过TT与BLyS融合，克服了机体的免疫耐受，使得机体发生高水平的体液免疫反应，产生的BLyS多克隆中和抗体可以中和体内的高水平的天然BLyS的B淋巴细胞刺激活性，从而发挥抗自身免疫性疾病的作用。

Description

破伤风毒素T细胞表位多肽与人B淋巴细胞刺激因子融合蛋白及其制备

                              技术领域

本发明属于医药生物技术领域的基因克隆、基因重组、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白的纯化、重组蛋白质疫苗的体外活性测定及理化性质鉴定等技术，涉及一种抗自身免疫性疾病药物及其制备方法，特别涉及破伤风毒素T细胞表位多肽与人B淋巴细胞刺激因子融合蛋白(TT-BLyS)构成的B淋巴细胞刺激因子重组蛋白质疫苗及其制备方法。

                              背景技术

1.1B淋巴细胞刺激因子的相关研究

B淋巴细胞刺激因子是1999年由瑞士和美国科学家发现的肿瘤坏死因子(TumorNecrosis Factor，TNF)家族的一个新成员。该分子被多个不同的研究小组同时发现，并分别被命名为BAFF、THANK、TALL-1、zTNF4、TNFRSF19等，其命名至今还没有被统一。

与TNF家族大部分成员不同的是，BLyS并不是表达在活化的免疫细胞中，其在单核细胞和巨噬细胞中具有组成性的表达，主要由髓系来源的细胞分泌。IFN-γ对其表达有很强的上调作用，IL-10的上调作用稍弱。

1.1.1干扰素的生物学活性

同TNF家族其他分子类似，BLyS的活性形式是也是同源三聚体，改分子在机体的免疫功能调节中起着重要的作用。

B淋巴细胞调节：BLyS具有很强的B细胞趋向性，作为一种淋巴细胞的共刺激因子，它对活化的B细胞具有强烈的促进增殖和分化的刺激作用，并与CD40L的效应颇为相似。体外试验表明，对正常的B细胞，利用anti-IgM预活化后，BLyS能诱导其大量增殖并分泌各类型免疫球蛋白，其中IgM和IgA比例较高，而BLyS对静息的细胞效果不明显。在体外，BLyS对囊外B细胞的活化以及抗原特异性IgM的分泌；免疫球蛋白的类别转换及脾脏生发中心的形成具有重要作用。

T淋巴细胞调节：有研究报道，在BLyS转基因小鼠中，脾脏内T细胞总数虽然没有明显上升，但是CD4⁺和CD8⁺细胞都呈现活化状态；而且这些细胞表面的CD44水平上升而LECAM-1水平下降，另外，流式细胞仪分析表明BLyS能与少量活化的T细胞结合(亲和力约为B细胞的5％)，且活化T细胞有TACI的表达，这些都提示BLyS能够间接地对T细胞作用。另一项研究发现小鼠的T细胞总数增加了两倍，在不进行免疫的情况下生发中心增多增大，淋巴器官增大，还发现了风湿因子。这些细节上的不同可能是由于BLyS的表达调控不同所造成的。

1.1.2B淋巴细胞刺激因子的临床应用现状

2.1.2.1普通易变免疫缺陷病

虽然BLyS分子发现仅有数年，分子生物学研究却在很短的时间内证明其在免疫系统中具有不可替代的重要作用。缘于此，美国人类基因组科学公司(Human GenomeSciences，HGS)制定了BLyS治疗蛋白计划，决定利用基因工程手段研制BLyS相关制剂用于免疫缺陷病治疗。该公司宣布美国FDA已批准其治疗普通易变免疫缺陷病(commonvariable immunodeficiency，CVID)的药物-BLyS为罕见病治疗药。

CVID是相当常见而未明确了解的一组综合征。男女均可受累，发病年龄在15～35岁不等，可为先天性或获得性。其免疫缺陷累及范围可随病期而变化，起病时表现为低丙种球蛋白血症，随着病情进展可并发细胞免疫缺陷。其特点是：①低丙种球蛋白血症，免疫球蛋白总量和IgG均减少；②2/3患者血循环中B细胞数量正常，但不能分化为浆细胞，淋巴结、脾、消化管淋巴组织中B细胞增生明显，但缺乏浆细胞。③患者主要表现为呼吸道、消化道的持续慢性炎症，如肺炎、支气管炎以及副鼻窦炎等，自身免疫病的发病率也较高。

该公司研究人员发现BLyS重组蛋白可以促进一些分离自CVID患者的B细胞产生免疫球蛋白，从而增强了机体的抗感染能力。BLyS现正处于I期临床试验的评估当中。

1.1.2.2甲型免疫球蛋白缺陷病

甲型免疫球蛋白低下患者不能够产生正常数量的IgA，IgA为机体内的粘膜组织(肺、小肠、口腔、泌尿生殖道)提供了抵御异物的第一道防线，是机体防御感染的重要因素之一。IgA水平低下是机体抗体系统最常见疾病之一，其原因之一是体内的浆细胞水平低下。患者的主要症状是反复发作的严重感染，可以波及胃肠道、肺以及瘘管，也可有过敏症和肿瘤。

目前对于该疾病的治疗还没有有效方法，主要是注射异体抗体。BLyS可以刺激B细胞分泌多种抗体，其用于治疗该疾病可能会帮助病人产生自己的抗体，从而从根本上改变患者的症状。临床前试验表明BLyS可以使得部分IgA低下患者产生高于正常水平的IgA。该研究也处于I期临床。

1.1.2.3B细胞恶性肿瘤

放射性核素标记的BLyS有用于治疗恶性B细胞肿瘤的潜在可能性。因为目前对于一些对放射线有反应性的肿瘤，放射疗法还是比较传统且有效的方法。如果制成一种由BLyS分子和放射源组成的药物，该药物由于BLyS受体的选择性分布将会特异性的结合B细胞，于是选择性结合的结果造成药物的富集，从而使得药物杀伤肿瘤细胞的有效剂量降低，减少放射线带来的副作用。目前HGS公司正在评估这种技术的可行性。

在如非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)等一些特定的肿瘤中，B淋巴细胞发生恶化，并以一种失控的方式生长。这些肿瘤对人类的威胁极大。非何杰金氏淋巴瘤在美国常见肿瘤中位居第五，也是很常见的一种儿童癌症；CLL是最常见的白血病；多发性骨髓瘤是一种致命的B细胞肿瘤，5年存活率只有28％。所以对于这一类肿瘤，还需要新的疗法来提高患者存活率和治愈率。

由于B细胞瘤对放射疗法比较敏感，I¹³¹有被用于治疗甲状腺癌的先例。HGS公司将BLyS用放射性的I¹³¹标记以后用于多发性骨髓瘤、CLL、非何杰金氏淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、滤泡型B淋巴瘤(follicular B-cell lymphomas)以及勃克氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)的治疗。临床前试验结果表明，该蛋白质可以特异性的与B细胞发生结合而富集，然后利用碘的放射性来杀死肿瘤细胞。该药被命名为LymphoRad¹³¹，目前，已经被批准进入I期临床。

初步的药代动力学数据表明初次注射的LymphoRad¹³¹其半衰期只有18～23小时，比用标记的CD20抗体研究所报道的时间短。体内分解试验和放射性测定结果表明正常组织(如肝、肺、肾)只受到低剂量的处于可接受范围之内的辐射。况且，由于pre-B细胞不会与LymphoRad¹³¹发生结合而存活下来可以用于补充被杀死的非正常B细胞，这也减轻了LymphoRad¹³¹的副作用。

1.1.2.4BLyS颉抗剂用于治疗自身免疫性疾病

正常情况下，人体免疫系统在发育过程中具备了对自身组织和外来病原体分别进行耐受或者免疫攻击的能力。如果自身耐受性发生了异常，免疫系统就会攻击自身的组织系统从而发生自身免疫性疾病。在很多自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮(systemiclupus erythematosus，SLE)和类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)中，B细胞都起着重要作用。

由于BLyS对B细胞具有强烈的刺激作用，因此，在很多实验中发现，高表达的BLyS与自身免疫性疾病有相关性。有鉴于此，抑制BLyS的作用将可能是一条治疗自身免疫性疾病的有效途径。HGS公司的科学家获得了人BLyS的单克隆抗体LymphoStat-B，该药物处于I期临床研究。

                              发明内容

本发明的目的在于，提供一种破伤风毒素T细胞表位多肽与人B淋巴细胞刺激因子融合蛋白(TT-BLyS)及其制备方法。本发明制备的破伤风毒素T细胞表位多肽与人B淋巴细胞刺激因子融合蛋白，能够克服单克隆抗体的局限性，减少用药量和用药次数。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是，破伤风毒素T细胞表位多肽与人B淋巴细胞刺激因子融合蛋白，其特征在于，选择破伤风毒素表位肽Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-(谷氨酰胺-酪氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-谷氨酸)与人B淋巴细胞刺激因子构建TT与B淋巴细胞刺激因子的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到TT-BLyS融合蛋白。

本发明的其TT-BLyS融合蛋白能刺激机体CD4⁺细胞反应，有助于引发高水平的体液免疫反应。该疫苗接种小鼠以后可以预防EAE的发生，对模型小鼠具有良好的保护作用。

表达产物经溶菌酶裂解、包涵体洗涤、S-300凝胶过滤层析柱的纯化，蛋白纯度可达95％以上。经皮下注射TT-BLyS免疫动物，发现该重组疫苗对新西兰兔、大鼠和小鼠具有良好的免疫原性，可以诱发高滴度的抗体反应，产生的多克隆抗体可以中和天然BlyS分子对小鼠B淋巴细胞的刺激增殖活性。

本发明的破伤风毒素T细胞表位多肽与人B淋巴细胞刺激因子融合蛋白，其制备方法是，分步克隆法构建了重组质粒pGEM-3zf(-)-TT-BLyS，包括TT基因的克隆和BLyS与TT融合基因克隆载体的构建；原核表达载体的构建及重组蛋白表达；表达产物的鉴定；重组蛋白的纯化；TT-BLyS在不同类别动物中诱导多克隆中和抗体的研究以及TT-BLyS对EAE和RA模型小鼠的保护作用研究。

本发明的TT表位多肽与人B淋巴细胞刺激因子融合蛋白(TT-BLyS)，通过多肽与BLyS的融合，克服了BLyS分子自体耐受的限制，同时也可以将免疫反应引向CD4⁺T细胞而不是CD8⁺T细胞。该分子有别于单克隆抗体，小剂量作用于自身免疫性疾病患者可以将免疫系统引向产生高滴度的BlyS中和抗体，中和抗体可以反向负反馈调节免疫水平，最终使机体达到平衡。从而为进一步降低临床用药量，降低毒副作用奠定基础。

                              附图说明

图1是pGEM-3Zf(-)-TT-BLyS的测序结果图；

图2是PCR产物琼脂糖电泳图，图中1：DNA marker；2：目的基因；

图3是pKKH-TT-BLyS重组质粒的酶切鉴定结果图；图中1：DNA marker；2-4：pKKH-TT-BlyS。

图4是TT-BLyS融合蛋白的诱导表达以及Western-blot鉴定；图中1：未诱导菌体蛋白质；2：IPTG诱导以后菌体蛋白质；

图5是TT-BLyS的纯化结果；图中A：TT-BLyS纯化色谱图；B-C：纯化产物的SDS-PAGE鉴定；

图6是TT-BLyS用于免疫动物后的BLyS多克隆抗体滴度检测；图中A：新西兰兔；B：大鼠；C：小鼠；

图7是EAE模型大鼠的临床表现评分；

图8是TT-BLyS对EAE模型小鼠脊髓的保护作用；图中A-C：正常组；D-F：TT-BLyS组；G-I：EAE模型组；A，D，G：×40；B，E，H：×100；C，F，I：×200；

图9是TT-BLyS对EAE模型小鼠小脑的HE染色图；图中A：正常组；B：TT-BLyS组；C：模型组；1，2：×100；3，4：×200；1，3：HE染色；2，4：坚牢蓝染色；

图10是TT-BLyS对RA模型小鼠膝关节的X-光成像图，图中A：正常组；B：TT-BLyS组；C：RA模型组。

为了更清楚的理解本发明，以下结合发明人完成的实施例对本发明作进一步的详细描述。

                              具体实施方式

依本发明的技术方案，破伤风毒素的T细胞表位多肽与人B淋巴细胞刺激因子融合蛋白，选择破伤风毒素的T细胞表位多肽-Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-(谷氨酰胺-酪氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-谷氨酸)，它能刺激机体的CD4⁺细胞反应。采用分步基因克隆，构建TT-BLyS的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物经溶菌酶裂解、包涵体洗涤以及凝胶过滤层析柱的纯化，蛋白纯度可达95％以上。皮下注射TT-BLyS以后，在新西兰兔、大鼠以经济小鼠中均诱导出了高水平的抗体反应，该多克隆抗体可以中和天然BLyS对小鼠B淋巴细胞的刺激增殖作用。该疫苗接种小鼠以后可以预防EAE的发生，对模型小鼠具有良好的保护作用。

实现上述破伤风毒素的T细胞表位多肽与人B淋巴细胞刺激因子融合蛋白(TT-BLyS)，其制备方法按以下步骤进行：

3.1分步克隆，重组质粒pGEM-3zf(-)-TT-BLyS的构建

3.1.1TT表位肽基因的克隆

编码TT的寡核苷酸片段的设计如下，在这对寡核苷酸片段的5’端引入了EcoRI酶切位点，3’端引入了BamHI酶切位点：

S1(51nt)5’-AAT TCA TGC AGT ACA TCA AAG CTA ACT CCA AAT TCA TCG GTA TCACTG AAG-3’

S2(51nt)5’-GAT CCT TCA GTG ATA CCG ATG AAT TTG GAG TTA GCT TTG ATG TACTGC ATG-3’

取等量S1和S2，煮沸5分钟，自然冷却至室温，进行退火。克隆载体pGEM-3Zf(-)经EcoRI和BamHI双酶切并回收大片段。TT的退火产物与载体酶切后回收的大片段经T4连接酶进行连接反应。连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定，获得预期大小的插入片段，进行测序(图1)。测序正确的质粒命名为pGEM-3Zf(-)-TT

3.1.2BLyS与TT肽融合基因克隆载体的构建

PCR反应引物设计如下，将翻译起始码ATG和BamHI酶切位点引入5’端引物，将终止密码子TGA和PstI酶切位点引入3’端引物：

P1(5’端引物31nt)5’-GCG GGA TCC ATG GCC GTT CAG GGT CCA GAA G-3’

P2(3’端引物31nt)5’-GCG CTG CAG TCA CAG CAG TTT CAA TGC ACC A-3’

对人白细胞cDNA文库按下述条件进行PCR扩增。

PCR扩增反应管组成：

CDNA模板                                   1μl

2.5mM dNTPs                                4μl

25mM MgCl₂                                3μl

50μM P1                                   1μl

50μM P2                                   1μl

5.0U/μl Taq酶                             1μl

10×PCR Buffer                             5μl

H₂O                                       34μl

总计                                       50μl。

反应管的配制均在冰浴中进行，配制过程中，先加水、模板DNA及其他反应组分，95℃反应5min，再加入Taq酶，然后进行PCR反应，

PCR扩增的循环参数为：94℃1min，52℃45s，72℃1min，共30次循环；最后，再于72℃延伸10min；PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，可见预期大小的DNA片段(图2)。

质粒pGEM-3Zf(-)-TT经BamHI和PstI双酶切后回收大片段，回收的片段与上述的PCR产物经同样双酶切的回收产物进行连接反应。连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段，进行测序(图1)。测序正确的质粒命名为pGEM-3Zf(-)-TT-BLyS。

3.1.2原核表达载体的构建及重组蛋白表达

质粒pGEM-3Zf(-)-TT-BLyS经EcoRI和PstI双酶切后回收小片段，原核非融合表达载体pKKH也经上述同样的双酶切后回收大片段，两者进行连接反应。连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定正确的质粒命名为pKKH-TT-BLyS。将含有重组质粒pKKH-TT-BLyS的大肠杆菌DH5α于37℃于LB培养基中活化振摇培养过夜，次日清晨，按1∶100的比例接种于LB培养基中后，继续37℃培养3小时至对数生长后期，OD_650nm＝0.4时，加入1mM IPTG，培养4小时，收集菌体。经溶菌酶裂解，离心收集沉淀。

3.1.3表达产物的鉴定

对表达产物进行Western-blot鉴定。细菌蛋白样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，按照Bio-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、硝酸纤维素(NC)膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液中100V恒压1小时电泳，将蛋白转移至NC膜上。电泳结束后，取出NC膜，洗涤液TBST清洗后浸入封闭液(含2％BSA的TBST)中37℃1小时，TBST室温洗3次(5min/次)，加入羊抗人BLyS抗体(Santa Cruz：sc-5743)，37℃孵育1小时，TBST洗3次，加入兔抗羊IgG-AP，37℃孵育1小时，TBST洗3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入显色液中，室温避光显色适当时间，蒸馏水冲洗终止反应。

需用试剂有转移缓冲液(25mmol/L Tris，192mmol/L Glycine，20％methanol)、TBS(20mmol/L Tris-HCl pH7.5，150mmol/L NaCl)和TBST(TBS contain 0.05％Tween20)

3.1.4重组蛋白的纯化

按1克菌体加5ml裂菌缓冲液(0.1mol/L Tris，pH7.0；1mmol/L EDTA)的比例将菌体重悬(体积为V)，加入1.5mg/mL的溶菌酶，室温下搅拌30分钟；然后加入10μg/mL的DNaseI和20mmol/L的MgCl2，继续作用30分钟；加入终浓度为1.5mol/L NaCl、2％Triton X-100和20mmol/L EDTA(3V)，4℃搅拌30分钟，4℃条件下离心，12000rpm，20min，收集沉淀用4mol/L Urea、2％Triton X-100、20mol/L EDTA、0.1mol/L TrispH 8.0(3V)室温洗涤30分钟，沉淀再用20mol/L EDTA，0.1mol/L Tris pH7.0(8V)室温洗涤30分钟，离心收集包涵体；包涵体用7M盐酸胍、10mg/L DTT进行溶解，离心后上清用Sephacryl 300进行凝胶过滤层析，洗脱液为7M盐酸胍，收集洗脱液，分别对4M尿素、2M尿素和水进行透析复性，并对纯化产物进行质量鉴定。

3.2疫苗的免疫原性测定

3.2.1.实验材料

3.2.1.1药物

TT-BLyS，由第四军医大学生物技术中心提供，80μg/支，-20℃保存，使用前加生理盐水溶解。

3.2.1.2对照药物

注射用生理盐水

3.2.1.3BLyS抗体检测用试剂

BLyS标准品(20ug)：使用时用包被缓冲液溶解

酶标抗体1支(120μl)：使用时用稀释液作100倍稀释

阴性对照血清1支(200μl)；

ABTS底物1支。

3.2.2动物及分组：

①新西兰兔5只，♂，2.5kg。一只给予生理盐水，4只进行疫苗(1mg/只)免疫。

②SD大鼠，15只，♀，250g，随机分为3组，分别为正常对照组、生理盐水组以及TT-BLyS免疫组。

③Balb/c小鼠(18g左右)70只，♂，随机分为7组。TT-BLyS^{low，high，low+adjuvant， high+adjuvant}，GST-BLyS^low，high和生理盐水对照组。其中高剂量为80μg/只，低剂量为8μg/只。

3.2.3实验方法

各类别动物均背部多点注射免疫，对于新西兰兔，使用了弗氏免疫佐剂，其中第一次免疫使用完全佐剂，第二次为不完全佐剂；SD大鼠不使用免疫佐剂；Balb/c小鼠按照分组进行免疫。每组动物免疫4次，每两周一次，最后一次为腹腔注射，10天后眼球采血，4℃凝固，低温离心(10000rpm，4℃)30min，分离血清，4℃保存，按照ELISA方法进行BLyS多克隆抗体效价的检测。

3.2.4抗体效价的检测

3.2.4.1包被

将稀释好的BLyS标准品加入ELISA板，100μl/孔，4℃放置36-48h。

3.2.4.2加待检血清

用洗涤液冲洗ELISA板3次，加1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000梯度稀释的待测血清样品、阴性对照及空白对照，100μl/孔，37℃，1h。

3.2.4.3加酶标抗体

用洗涤液洗板3次，加入稀释好的酶标抗体，100μl/孔，37℃，45min。

3.2.4.4显色

洗涤液洗板3次，加入配好的ABTS显色液，100μl/孔，室温显色15-30min。

3.2.4.5ELISA读数仪测410nm处OD值，如图6所示。

3.3TT-BlyS对EAE和RA模型大鼠的保护作用

3.3.1EAE模型

3.3.1.1动物及分组

六周龄SD大鼠，250g，♀，随机分为3组：正常对照组、模型组以及治疗组。

3.3.1.2实验方法

3.3.1.2.1模型诱导

治疗组预先用TT-BLyS免疫诱导出中和性抗体，测定效价后进行疾病模型的诱导。MS疾病模型的建立采用脊髓诱导。取正常大鼠的脊髓制备50％(重量/体积)的生理盐水匀浆，与等体积完全弗氏佐剂混合，制成乳剂；然后于大鼠每足跖真皮内注射乳剂0.1mL，每只共注射0.4mL。两周后用0.1mL背部皮下注射进行加强免疫。免疫过程中观察临床指征，完成后取模型动物的脑和脊髓组织切片观察损伤。

3.3.1.2.2行为学评价

临床评分参照Weiner等的修正标准：0级为未发病；1级为尾部活动能力下降；2级为尾部瘫痪；3级为一侧或两侧后肢活动受到影响；4级为两侧后肢瘫痪；5级为前后肢均瘫痪或濒死状态或死亡。

3.3.1.2.3形态学观察

1)SD大鼠用4％多聚甲醛灌注，脑和脊髓在甲醛磷酸缓冲固定液(含4％甲醛的PBS，0.05mol/L，pH7.15)中固定6h-8h，温度4℃。

2)用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH7.28)冲洗2次，时间为每次40min-60min，温度4℃。

3)在5％蔗糖-PBS液中过夜，温度4℃。

4)50％丙酮固定30-45min。

5)入纯丙酮，更换2次，时间4h，温度4℃，最后1h-2h可在室温下进行，入二甲苯中，更换3次，每次20min。

6)透蜡

入已熔化的蜡杯中，换2次，浸90min，温度54℃-56℃，石蜡包埋。

7)修块后切片，厚度为5μm，将切片放入盛有40℃左右的温水槽中展开，贴在载玻片上(有助粘剂)。

8)贴片后，以滤纸吸干，放37℃温箱内干燥，12h后，按常规脱蜡处理后，进行组织孵育反应。

9)用磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)冲洗3次，每次5min。

10)进行HE染色观察脊髓和小脑炎性细胞浸润情况；或者坚牢蓝(Fast Luxol Blue)-焦油紫髓鞘染色，观察髓鞘完整性。

11)图像分析仪显微摄像。

3.3.2RA模型

3.3.2.1动物及分组

六周龄SD大鼠，250g，♀，随机分为3组：正常对照组、模型组以及治疗组。

3.3.2.2实验方法

治疗组预先用TT-BLyS免疫诱导出中和性抗体，测定效价后进行疾病模型的诱导。RA疾病模型的建立采用佐剂诱导。完全弗氏佐剂(CFA)临用前充分混匀，取0.1mL注射于SD大鼠右后足跖皮内诱导关节炎发生，再取0.125mL(2u/mL)TNF-α分别于大鼠右足踝关节和髌骨下脂肪垫注射加强免疫。模型诱导成功后对后肢拍摄X-光片，观察关节的炎症情况。

3.4本发明的效果

1)通过分步克隆法，将人工合成的编码TT的寡核苷酸片段与BLyS的5’端连接，构建了TT-BLyS融合基因的克隆载体pGEM-3Zf(-)-TT-BLyS，DNA序列测定证实完全正确。

2)构建了TT-BLyS融合基因的原核表达载体pKKH-TT-BLyS，经IPTG诱导，SDS-PAGE和Western-blot证实在大肠杆菌中获得表达。

3)纯化了TT-BLyS融合蛋白。纯度大于95％(参见图5)。

4)TT-BLyS免疫动物可以在不同类别动物(新西兰兔、大鼠和小鼠)体内诱导出高滴度的BLyS多克隆中和抗体。该疫苗对EAE和RA模型大鼠均具有良好的保护作用。

5)用相似的方法克隆的另三种融合蛋白即：PADRE-BLyS、BLyS-TT和BLyS-PADRE取得了相似的结果(参见图6)。

Claims (3)

1.破伤风毒素T细胞表位多肽与人B淋巴细胞刺激因子融合蛋白，其特征在于，选择破伤风毒素表位肽Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-与人B淋巴细胞刺激因子构建TT与B淋巴细胞刺激因子的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到TT-BLyS融合蛋白。

2.如权利要求1所述的破伤风毒素T细胞表位多肽与人B淋巴细胞刺激因子融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述TT-BLyS融合蛋白的制备按以下步骤进行：

1)重组质粒的构建

①TT表位肽基因的克隆

编码TT_830-843的在这对寡核苷酸片段的5’端引入了EcoRI酶切位点，3’端引入了BamHI酶切位点：

S1  5’-AAT TCA TGC AGT ACA TCA AAG CTA ACT CCA AAT TCA TCG GTA TCA CTG AAG-3’

S2  5’-GAT CCT TCA GTG ATA CCG ATG AAT TTG GAG TTA GCT TTG ATG TAC TGC ATG-3’

取等量S1和S2，煮沸5分钟，自然冷却至室温，进行退火；克隆载体pGEM-3Zf(-)经EcoRI和BamHI双酶切并回收大片段；TT的退火产物与载体酶切后回收的大片段经T4连接酶进行连接反应；连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，进行双酶切和DNA序列测定进行鉴定；

②人B淋巴细胞刺激因子和TT融合基因克隆载体的构建

通过PCR反应获得人BLyS基因，同时将BamHI酶切位点引入5’端引物，PstI酶切位点引入3’端引物；对人白细胞cDNA文库进行PCR扩增；PCR扩增反应管的配制均在冰浴中进行，PCR反应体系为：10×PCR buffer(Mg2+ free)5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，引物各1μL，25mmol/L MgCl2 3μL，cDNA模板1μL，Taq DNA聚合酶1μL，加水至总体积50μL；PCR反应条件：94℃ 1min，52℃ 45s，72℃ 1min，共30次循环；最后，72℃延伸10min；PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，可见预期大小的DNA片段；

质粒pGEM-3Zf(-)-TT经BamHI和PstI双酶切后回收大片段，回收的片段与上述的PCR产物经同样双酶切的回收产物进行连接反应；连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段，进行测序，结果与预期一致；

2)原核表达载体的构建及重组蛋白表达

质粒pGEM-3Zf(-)-TT-BLyS经EcoRI和PstI双酶切后回收小片段，原核非融合表达载体pKKH也经上述同样的双酶切后回收大片段，两者进行连接反应；连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，酶切鉴定正确的质粒命名为pKKH-TT-BLyS，将含有重组质粒pKKH-TT-BLyS的大肠杆菌DH5α于37℃置入LB培养基中活化振摇培养过夜，次日清晨，按1∶100的比例接种于LB培养基中后，继续37℃培养3h至对数生长后期，OD_650nm＝0.4时，加入1mM IPTG，培养4h，收集菌体；超声裂菌后，离心收集包涵体；

3)表达产物的鉴定

对表达产物的鉴定采用Western blot鉴定，检测其与BLyS单抗的反应特异性，步骤如下：

①pKKH-TT-BLyS/DH5α诱导后裂菌产物进行SDS-PAGE；

②电泳分离后，按照Bio-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、硝酸纤维素膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液中100V恒压1小时电泳，将蛋白转移至NC膜上；

③电泳结束后，取出NC膜，洗涤液TBST清洗后浸入封闭液(含2％BSA的TBST)中37℃1小时，TBST室温洗3次(5min/次)，加入羊抗人BLyS抗体(Santa Cruz：sc-5743)，37℃孵育1小时，TBST洗3次，加入兔抗羊IgG-AP，37℃孵育1小时，TBST洗3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入显色液中，室温避光显色适当时间，蒸馏水冲洗终止反应；观察诱导产物与BLyS抗体的特异性反应；

同时，对纯化产物进行N-末端氨基酸测序，方法为：纯化的蛋白质SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，R-250染色，脱色后用Edman降解法在492型Procise^TMcLC(ABI公司)蛋白测序仪上分析N端氨基酸序列；

4)重组蛋白的纯化

按1克菌体加5ml裂菌缓冲液的比例将体积为V的菌体重悬，其缓冲液的配方为：0.1mol/L Tris，pH 7.0；1mmol/L EDTA，并加入1.5mg/mL的溶菌酶，室温下搅拌30分钟；然后加入10μg/mL的DNase I和20mmol/L的MgCl₂，继续作用30分钟；加入终浓度为1.5mol/L NaCl、2％ Triton X-100和3倍体积的20mmol/L EDTA，4℃搅拌30分钟，4℃条件下离心，12000rpm，20min，收集沉淀用4mol/L Urea、2％ Triton X-100、20mol/LEDTA、0.1mol/L Tris pH 8.0(3V)室温洗涤30分钟，沉淀再用8倍体积的pH 7.0、20mol/L EDTA、0.1mol/L Tris，室温洗涤30分钟，离心收集包涵体；包涵体用7M盐酸胍、10mg/L DTT进行溶解，离心后上清用Sephacryl 300进行凝胶过滤层析，洗脱液为7M盐酸胍，收集洗脱液，分别对4M尿素、2M尿素和水进行透析复性，并对纯化产物进行质量鉴定。

3.如权利要求2所述的破伤风毒素表位肽与人B淋巴细胞刺激因子融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增反应管组成为：

cDNA                                       1μl

2.5mM dNTPs                                4μl

25mM MgCl₂                                3μl

50μM P1                                   1μl

50μM P2                                   1μl

5.0U/μl Taq酶                             1μl

10×PCR Buffer                             5μl

H₂O                                       34μl

总计                                       50μl。

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