CN1056125A

CN1056125A - 截短的可溶性γ-干扰素受体

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Publication number: CN1056125A
Application number: CN91102639A
Authority: CN
Inventors: P·J·扎沃尼; S·K·纳鲁拉; M·E·彼得罗; D·J·伦德尔; J·D·福塞塔
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 1990-04-24
Filing date: 1991-04-24
Publication date: 1991-11-13
Also published as: NZ237916A; PT97445B; ATE112312T1; PT97445A; CA2081309A1; ES2061240T3; DE69104356T2; JPH05502037A; ZA913043B; IE911355A1; AU657683B2; EP0528847B1; WO1991016431A1; DE69104356D1; AU7778991A; EP0528847A1; HUT62936A; IL97927A0

Abstract

提供了截短的可溶性γ-干扰素受体，尤其是人 γ-干扰素受体的可溶性细胞外区，以及编码这些受体的DNA顺序和产生这些受体的转化细胞系，还提供了用这些受体抑制γ-干扰素与其细胞受体结合作用的方法。

Description

本发明涉及截短的可溶性γ-干扰素受体，具体地说，涉及γ-干扰素受体的可溶性细胞外部分。

γ-干扰素（本文中有时称作IFN-γ）是由激活的辅助T细胞产生的一种细胞素，它对许多类型的细胞，如B细胞、巨噬细胞和T细胞，具有直接的效应。它具有多重效应（Trinchieri等，Immunology Today，6∶131-136，1985），它的最显著的活性之一是它诱导主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类和Ⅱ类基因的表达（Kelley等，J.Immunol.，132∶240-245，1984;Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81∶4917-4921，1984;Cooper等，J.Immunol.，141∶1958-1962，1988;Amaldi等，J.Immunol.，142∶999-1004，1989）。MHCⅡ类基因的表达是抗原处理细胞（antigen-presenting cell）的标志。Ⅱ类抗原的表达见于巨噬细胞和成熟的B细胞和T细胞，已知γ-干扰素可正调控这种表达。此外，已知γ-干扰素在那些并非是主要抗原处理细胞的细胞中，例如上皮细胞、成纤维细胞、星形细胞、内皮细胞及平滑肌细胞中，诱导Ⅱ类抗原编码基因的表达。这些类型的细胞是否确实处理抗原尚未搞清，但已证明这些类型的细胞中Ⅱ类抗原的诱导与自身免疫疾病的发病相关（Massa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84∶4219-4213，1987）。由于γ-干扰素是Ⅱ类抗原的主要刺激剂，它可能在疾病的表现中起重要作用。因此，γ-干扰素或其各种效应的抑制剂，例如在受体界面水平上起作用的抑制剂，在自身免疫疾病的治疗中将有巨大的潜在价值和用途。

曾有人尝试给予小鼠γ-干扰素的单克隆抗体以抑制γ-干扰素在小鼠体内的效应（Grau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86∶5572-5574，1989）。然而，在给人做这种处理时，必须记住，单克隆抗体本身有可能会诱发中和免疫反应，从而降低这种处理的效果。

现在已经有了表达γ-干扰素受体的重组克隆（参见例外“人γ-干扰素受体的分子克隆和表达”，Aguet，G.等，Cell，55∶273-280，1988），但这些克隆产生的是完整受体，包括胞质（细胞内）区和跨膜区。胞质区可能负责细胞内的信号转换，因此，如果寻找IFN-γ拮抗剂的目的是为了找到血流或其他体液（如关节液）中的IFN-γ并选择性地与之结合，那么胞质区就是多余的。此外，胞质区在正常情况下隐藏在细胞内，因此不能到达免疫系统，所以，全长IFN-γ受体肯定会由于其胞质区而起到抗原的作用，从而被中和掉。如果发生中和，它在引入上述体液中时就会被除去而迅速丧失其效应。因此需要有一种在竞争IFN-γ的同时没有诱发与之相关的副作用的危险的IFN-γ拮抗剂。

IFN-γ受体的编码DNA和所预测的氨基酸顺序已由Aguet等人（同上）公开，他们猜测，先导顺序从氨基酸（残基）1延伸至氨基酸14，跨膜顺序从氨基酸246延伸至氨基酸266（这是其编号）。因此，猜测所预测的IFN-γ受体的细胞外部分是从氨基酸15延伸至氨基酸245;其猜测结构，包括由氨基酸残基1-14组成的先导顺序以及DNA编码顺序，示于附图1A和1B，其中先导顺序的编号为-14至-1，预测的细胞外部分的编号为1-231。

在下面的讨论中，所有编号均按附图1的编号给出，但有可能与本文所提到的出版物中的编号不同。

尚不确定这个顺序中有多少对能与IFN-γ特异结合的有效IFN-γ受体是必需的。但是，已知（Stueber等，文摘A3-15，J.Interferon Res.，9∶Suppl.2，1989年10月）氨基酸残基1-198不构成有效的受体，但据该文摘报道，氨基酸残基12-231（包括早于12位起始的顺序）构成如大肠杆菌中所产生的有效受体，即在N端或C端有六个组氨酸残基。这些组氨酸残基肯定会改变受体的根本性质，例如其免疫原性，因此在要把可溶性受体作为药物使用时，这些残基是非常不希望有的。我们自己的工作表明，氨基酸残基6-221确实构成有效的受体，但其他顺序也可能是有效的。

因此，本发明提供一种可溶性γ-干扰素受体及其功能等价变异体，该受体由基本不含其他蛋白的天然人γ-干扰素受体的糖基化或未糖基化细胞外部分组成。功能等价变异体不仅包括天然存在的等位基因形式，而且包括由一个或更多个（例如至多3个）氨基酸残基的置换、缺失或加入而产生的仍基本保留了原有结合活性的变异体。这种可溶性IFN-γ受体最好具有附图2中给出的化学式，其中：

Y为从以下顺序的羧基末端（Pro）起始的一个或更多个氨基酸残基的亚顺序：

Arg Ala Glu Met Gly Thr Ala Asp Leu Gly Pro；

Z为从以下顺序的氨基末端（Ile）起始的一个或更多个氨基酸残基的亚顺序：

Ile Thr Ile Phe Asn Ser Ser Ile Lys Gly；

m、n和p彼此独立地为0或1。

因此，这种可溶性受体是IFN-γ受体的细胞外部分，它在受体结合测试中竞争IFN-γ，因而是IFN-γ与其细胞受体结合作用的拮抗剂，即它与IFN-γ受体竞争IFN-γ。此外，它可用于在受体结合测试中测定IFN-γ，可以把后面实施例4D的方法改用固相进行，以进行IFN-γ拮抗剂的高容量筛选。

1位和2位的Ser和Arg残基由一个潜在的核糖体结合位点AGCAGG（通常为AGGAGG，参见Shine和Dalgarno，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71∶1342，1974）编码（见图1），其下游7-9碱基对处有一个起始密码子。为避免在大多数原核细胞（如细菌，例如大肠杆菌）中错误起始的可能性，我们优选在第6位的Gly残基处起始，或者在更后的位置起始，最远为12位。以这种方式可以提供一种有效的可溶性IFN-γ受体，该受体包含氨基酸残基12-221，特别是更长的顺序，例如从氨基酸残基1直到氨基酸残基231。

有人曾利用聚合酶链反应（Friedman等，Nucl.Acids Res.16∶8718，1988），从λgtll胎盘cDNA文库中直接分离编码γ-干扰素受体的全长cDNA克隆（参见例如Aguet等，Cell.55∶273-280，1988.同上），从其中分离出编码IFN-γ受体可溶性部分的那部分cDNA，并把它掺入能够表达它的质粒中。

在本发明的一个优选实施方案中，可溶性IFN-γ受体如上所限定，其中n为1，Y中的亚顺序代表：

Gly Thr Ala Asp Leu Gly Pro.

在本发明的另一个特别优选的实施方案中，可溶性IFN-γ受体如上所限定，其中m、n和p均为1，由Y和Z所代表的顺序完整存在，即，可溶性IFN-γ受体具有氨基酸残基1-231的顺序。

在本发明的另一个特别优选的实施方案中，可溶性IFN-γ受体如上所限定，其中m和n为1，p为0，由Y代表的顺序完整存在，即，可溶性IFN-γ受体具有氨基酸残基1-221的顺序。

在本发明的另一个特别优选的实施方案中，可溶性IFN-γ受体如上所限定，其中m为0，n为1，p为0，由Y代表的顺序从（6）Gly开始出现，即，可溶性IFN-γ受体具有氨基酸残基6-221的顺序。

在本发明的又一个特别优选的实施方案中，可溶性IFN-γ受体如上所限定，其中m为0，n和p均为1，由Y代表的顺序从^（6）Gly开始出现，由Z代表的顺序完整存在，即，可溶性IFN-γ受体具有氨基酸残基6-231的顺序。

在本发明的又一个特别优选的实施方案中，可溶性IFN-γ受体如前两个自然段中所限定，不同的是m为1，因此该顺序还包括一个起始的丝氨酸残基。

图1（分为A和B两部分）给出了如Aguet等（Cell，55∶273-280，1988）所公开的全长可溶性IFN-γ受体及其编码DNA的顺序，不同的是其编号已象前面所指出的那样做了变动。

图2给出了本发明的可溶性IFN-γ受体的优选化学式。

图3给出了质粒pDSRS，其中插入了编码可溶性IFN-γ受体的DNA顺序。

图4图示了可溶性IFN-γ受体的大肠杆菌表达质粒是如何构建的。

图5画出了在大肠杆菌中产生的可溶性IFN-γ受体蛋白与结合在U937细胞上的IFN-γ的竞争作用。结合测试如实施例4D所述进行。

这里引用的所有参考文献的全部内容均在此列为参考。

使用编码并能够在原核细胞内产生IFN-γ受体cDNA细胞外区的表达载体，以得到产生IFN-γ受体可溶性（细胞外）部分的原核细胞克隆。可以使用的原核细胞包括细菌，尤其是大肠杆菌。可以用许多大肠杆菌株来实施本发明。但优选的大肠杆菌株是一种渗漏突变株，它能使可溶性IFN-γ受体从周质间隙渗漏到培养基中，从培养基中很容易分离出可溶性IFN-γ受体，而没有由于大多数其他大肠杆菌蛋白的存在而引起的复杂因素。这些细菌的生产方法及其在制备重组异源蛋白中的应用，公开于1989年10月31日提交的共同未决申请07/429，588中，该申请在此列为参考。

在本发明的实施中可以使用若干不同的大肠杆菌启动子，如Trp、lac、lpp、λpL等。这些启动子指导异源蛋白在细胞质中的表达。为能有效地分泌到周质间隙中，可以使用一个信号肽顺序，例如得自大肠杆菌OmpA、大肠杆菌碱性磷酸酯酶、大肠杆菌脂蛋白等的信号肽顺序。供在大肠杆菌中进行原核细胞表达的表达质粒含有一个强启动子，特别是串联的双重启动子如lpp-lac，其后是一个编码信号顺序的DNA顺序，该信号顺序能将异源蛋白转运到周质间隙中。这最后一个DNA顺序最好是得自大肠杆菌外膜蛋白OmpA的信号顺序。该信号顺序之后是IFN-γ受体cDNA的编码顺序。

用于制备这种质粒的构建方案（示于图4）将另一个残基即丝氨酸引入成熟编码顺序的起点处。在编码预期可溶性IFN-γ受体的顺序的末端引入了一个转译终止密码子。含有这些成分的质粒在用于转化一个大肠杆菌突变株（例如可从ATCC以登记号53956得到的菌株）时，产生一种融合蛋白，此蛋白由OmpA信号顺序后接可溶性IFN-γ受体顺序组成。该融合蛋白在周质中进行进一步加工，产生成熟的可溶性IFN-γ受体，它渗漏到培养基中。

可用的真核细胞系包括哺乳动物细胞系，如COS7、NS-1和CHO细胞，以及酵母细胞。此外也可以使用昆虫表达系统，如家蚕或草地夜蛾。

为阐述本发明，用U937细胞作为γ-干扰素受体的方便来源，但本文所述的可溶性受体当然将抑制IFN-γ与带有这些受体的任何细胞的结合作用。这些细胞包括，例如B细胞、T细胞、嗜酸细胞、平滑肌细胞、前髓细胞、巨噬细胞、红细胞、单核细胞、粒细胞等。

纯化

下面的实施例3描述了来自大肠杆菌的可溶性IFN-γ受体的纯化过程，但其方法也可用来纯化其他来源如真核细胞（特别是哺乳动物细胞和酵母细胞）的受体。

材料和方法

1.试剂

限制酶购自New England Biolabs公司（Beverly，MA）。水生栖热菌DNA聚合酶和10X缓冲液购自Stratagene公司（LaJolla，CA）。双链质粒DNA的顺序测定用United States Biochemical公司（Cleveland，OH）的Sequenase Version 2.0进行。λgtll人胎盘cDNA文库购自Clontech公司（Palo Alto，CA）。

2.合成寡核苷酸

用Applied Biosystems 380A型DNA合成仪按标准方法合成下列合成寡核苷酸：

AB697:

5′- CAGACTGGTTACTACTTAAAGGT - 3′

AB758:

5′- CAGCGACCGTCGGTAGCAGC - 3′

AB759:

5′- CTTCAAAGTTGGTGCAACTT - 3′

AB812:

5′- CTATCTGCAGCGACCGTCGGTAGCAGC - 3′

AB813:

5′- GTATGTCGACTTCCAAAGTTGGTGCAACTT - 3′

AB870JF:

5′- GCGCAAGCTTCTGGCACCGCGGATCTGGGGCCGTCCTCA - 3′

AB871JF:

5′- GGCGGATCCTTAACCTTTTATACTGCTATTGAAAATGAA - 3′

3.聚合酶链反应（PCR）如前人所述进行（Friedmann等，Nucleic Acids Res.，16∶8718，1988）。

4.人IFN-γ可按实施例4A的方法纯化，也可以买到，还可以买到其抗体。例如，Genzyme公司（Boston，MA）以代码HG-IFN供应重组人IFN-γ（纯度为99%），还以代码IP-500供应兔多克隆抗人IFN-γ供进行Western吸印。

实施例1

全长IFN-γ受体克隆的分离和短暂表达

寡核苷酸AB758和AB759与IFN-γ受体cDNA顺序的5′和3′非转译区相同，用这两个寡核苷酸基本按前人所述（Friedmann等，Nucl.Acids Res.，16∶8718，1988）用胎盘cDNA文库噬菌体溶解液进行PCR。PCR用Techne可编程序的Dri-Block（GRI，Essex，UK）在下列条件下进行：于95℃变性2分钟，引物退火在50℃下进行2分钟，链延长反应在72℃下进行2分钟，所有这些操作都进行30次循环，最后一次循环的延长反应于72℃下进行9分钟。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，用溴化乙锭染色显现出一个约1.5kb的主带，它相应于全长的IFN-γ受体编码区，用电洗脱法分离出这个主带。用寡聚物AB758作5′引物，用AB697作相应于IFN-γ受体细胞内区顺序的内引物，进行另一个PCR，产生一个约1.2kb的片段，以此来验证上述约1.5kb片段的真实性。

用寡聚物AB812和AB813进行如上所述的PCR，从而在1.5kb全长IFN-γ受体片段上引入PstI（5′）和SalI（3′）的限制位点。分离出所得到的片段，用PstI和SalI消化，并连入已用PstI/SalI消化的供在COS7细胞中表达的pDSRS质粒（ATCC登记号68232）（图3）。用得到的连接混合物转化感受态大肠杆菌294（易从耶鲁大学生物学系大肠杆菌遗传学保藏中心（P.O.Box6666，New Haven，CT 06511-7444）得到）。

对用碱溶法（Birnboim和Doly，“一种用于筛选重组质粒DNA的快速碱提取法”，Nucl.Acids.Res.，7∶1513，1978）从14个所得克隆中分离出的质粒DNA进行分析，并用限制分析和PCR法进行检验。有7个克隆含有1.5kb IFN-γ受体片段。用氯化铯/溴化乙锭梯度离心法（Maniatis等：“分子克隆-实验室操作指南”，纽约州冷泉港实验室）从这7个克隆中的6个中纯化出DNA，用基本上如文献所述的DEAE-葡聚糖法（McCutchan和Pagano，“用二乙氨基乙基葡聚糖增强猿病毒40脱氧核糖核酸的感染性”，J.Natl.Cancer Inst.，41∶351-356，1968）将该DNA短暂转染到COS7细胞中（5μg DNA/100mm培养皿）。在37℃下培养60-72小时后，用温和胰酶水解法收集细胞，并再悬浮于含0.02%叠氮钠的RPMI培养基中达1×10⁷个细胞/ml，于4℃下保存。然后用下面实施例4所述的技术进行¹²⁵I标记的IFN-γ的特异结合试验，以检验上述细胞是否能表达IFN-γ受体。

有三个克隆呈现出¹²⁵I标记的γ-干扰素的特异性结合显著增加（见后面的表1）。用双脱氧链终止法（Sanger等，“用链终止性抑制剂进行DNA顺序测定”，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，74∶5463-6567，1977）测定所有3个克隆的质粒DNA的顺序，细胞外区的顺序与已发表的顺序相同（Aguet等，同上）。

实施例2

供在大肠杆菌中表达可溶性IFN-γ

受体编码基因的pJFR105-6的构建

利用从一个cDNA文库中分离出的编码γ-干扰素受体的DNA片段制备引物，以将两个用于克隆可溶性区的位点引入原核细胞表达质粒。制备引物AB870JF以引入紧靠DNA氨基末端（它将是20位的Gly）的HindⅢ限制位点;制备引物AB871JF以引入一个BamHI限制位点和一个终止密码子。这两个引物将用来只分离和确定分子的可溶性区。（这些引物分离和限定除去其自身的先导顺序之外的IFN-γ受体可溶性区，即先导顺序和跨膜区之间的多肽顺序。）利用PCR技术，将DNA片段（编码全长受体）和引物合并在如下的反应混合物中：100微微摩尔引物、25ng DNA、10mM dNTP、10μl TAQ聚合酶缓冲液、2单位TAQ聚合酶。使该体系进行30次退火、变性和合成的循环，反应液总体积为100μl。PCR之后，用1%琼脂糖凝胶分离DNA，用溴化乙锭染色显现出编码γ-干扰素受体的800bp片段，并从琼脂糖中分离出该片段。

质粒p830-1（pINⅢ，OmpA先导顺序）（D.Lundell等，“一种高碱性蛋白-人白细胞介素4在大肠杆菌中的胞质表达和周质表达”，J.Indust.Microbiol.，4，1989，可以请分子和细胞生物学公司DNAX研究所的R.Kastelein（901 California Avenue，Palo Alto，CA 94304-1104）提供）含有HindⅢ和BamHI限制位点，用这两个位点将IFN-γ受体片段克隆在OmpA先导顺序下游的码内，方法如下：先用50单位HindⅢ限制核酸酶，然后用40单位BamHI限制核酸酶消化20μg质粒DNA。消化后，限制片段的混合物在0.65%琼脂糖凝胶上进行电泳，分离出构成质粒骨架的7.5kb片段。也可以使用编码合适分泌信号的任何其他适当质粒。

在含有ATP、T4 DNA连接酶（100单位）、二硫苏糖醇的40μl混合物中，使构成质粒骨架的7.5kb片段（0.1μg）和1μg编码γ-干扰素受体的800kb片段连接起来，连接反应在16℃下进行14小时。然后用一半产物来转化用CaCl₂制备的大肠杆菌（K12）294（易从耶鲁大学生物学系的大肠杆菌遗传学保藏中心（P.O.Box 6666，New Haven.CT 06511-7444）得到）。将由转化得到的混合物铺在氨苄青霉素平皿上，于30℃下培养16-24小时。然后挑出若干克隆进行发酵，分离出DNA，并通过用前面提到的酶（HindⅢ，BamHI）消化进行分析，选择出克隆pJFR105-6。

pJFR105-6克隆含有插在OmpA下游并处于lpp/lac启动子控制下的片段。该质粒衍生自pBR322，并携有LAC-I基因，因而可用异丙基-硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导表达。

实施例3

从大肠杆菌中纯化可溶性人γ-干扰素受体

从携有质粒pJFR105-6的大肠杆菌中纯化人IFN-γ受体的细胞外区。在M9-酪蛋白氨基酸培养基〔1×M9基本盐（Gibco BRL NO.M29800B）、3%（W/V）酪蛋白氨基酸、2g/l葡萄糖、0.1g/l硫胺素、0.2g/l硫酸镁〕中，在30℃下将细胞培养至A₆₆₀＝1.0。加入IPTG至0.5mM，于30℃下继续发酵过夜（培养物最终的A₆₆₀＝3.5）。从12升培养液中收集条件培养基，然后离心澄清。将澄清的上清液调至5%（W/V）三氯乙酸（TCA），使蛋白在4℃下沉淀60分钟。以10，000xg离心收集不溶部分，并再悬浮于200mM Tris（pH8）中达120ml使其重新溶解。于4℃下保温60分钟后，离心收集重新溶解部分的残余物。将上清液调至4M脲、20mM Tris（pH8），于4℃下保温30分钟，然后加到DEAE Sephadex Fast Flow柱（Pharmacia No.17-0709-01）上，该柱已用20mM Tris（pH8）、4M脲缓冲液平衡。然后将该柱用同一Tris/脲缓冲液中的0-0.3M氯化钠线性梯度洗脱。人IFN-γ受体的可溶性细胞外区在约0.18M NaCl处洗脱出。将可溶性受体合并液对20mM Tris（pH8）透析，再加到已用20mM Tris平衡的5ml IFN-γ-Affigel 10柱上。（按制造厂家推荐的方法使人IFN-γ与Affigel 10（Biorad Catalog No.153-6046）共价偶合。这种亲和树脂含有4mg IFN-γ/ml载体树脂。〕用10ml含0.2M NaCl的200mM Tris（pH8），洗柱，然后用10ml含0.5M NaCl的200mM Tris（pH8）洗柱。然后用200mM碳酸钠缓冲液（pH10.3）、0.6M NaCl洗脱出可溶性受体。将各部分中和后合并，然后对20mM磷酸钠（pH7.5）透析。

此方法由每次12升发酵得到0.7-1mg可溶性IFN-γ受体。但约有50%可溶性IFN-γ受体留在TCA不溶部分中。这一物料可进行变性处理，然后重新折叠而产的更多的活性蛋白。

实施例4

可溶性γ-干扰素受体的测试

A.人γ-干扰素的纯化

在经过改良的GC培养基（20g/l甘油、30g/l酪蛋白氨基酸（Difco）、20g/l酵母提取物（Difco）、5g/l KH₂PO₄、1g/l MgSO₄·7H₂O）中，于37℃下培养携有质粒pGIF4-137（一种以pBR322为基础的表达载体，它带有细菌脂蛋白（lpp）启动子并编码人γ-干扰素基因（成熟蛋白质的氨基酸4-137））的大肠杆菌。在A₆₆₀＝7-10时收集细胞并用超声破碎法使其溶解。然后离心分离无细胞的不溶部分，再悬浮于20mM Tris（pH8）、6M盐酸胍和5mM二硫苏糖醇中，并在56℃下加热30分钟使其重新溶解。

然后把这个重新溶解的部分加到已在室温下用20mM Tris（pH8）、6mM盐酸胍平衡的3×90cm Sepracyl 200-SF柱（Pharmacia AB）上。分级分离后，合并含γ-干扰素（例如用Western印迹分析法检测）的部分，用10mM NH₄OAc（pH7）稀释120倍，于4℃下混合过夜。在该样品中加入SP-Sephadex树脂（Sigma化学公司）（10ml，为树脂在20mM Tris，pH8中的1∶1浆液），并于4℃下混合60分钟。滤出树脂，用10mM NH₄OAc（pH7）洗涤，用1mM NaCl洗脱出纯化的γ-干扰素。由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法表明这个γ-干扰素部分的纯度大于95%。

B.人γ-干扰素的标记

用Bolton Hunter试剂（New England Nuclear）按供货商所述方法制备¹²⁵I标记的人γ-干扰素（反应液中含70μg/ml γ-干扰素和20mM磷酸钠，pH8）。最终的反应混合物用透析法脱盐，并加到已用PBS和0.2%明胶平衡的1×24cm Sephadex G75柱上，将多聚γ-干扰素与二聚体蛋白分开。已标记至50居里/mM的γ-干扰素合并液于4℃下贮存备用。

C.用大肠杆菌制备样品

于37℃下，在营养培养基中将已用质粒pJFR105-6转化的大肠杆菌732I（ATCC登记号53956）培养至A₆₆₀＝1。然后用0.1mM IPTG诱导该培养物，于37℃下继续培养3小时。取诱导后培养物的上清液，利用下述结合测试法检验可溶性IFN-γ受体的表达。

D.结合测试

从5%二甲亚砜、95%胎牛血清冰冻贮液取U-937细胞（ATCC目录号为CRL1593）接种到已预热的RPMI 1640培养基（Hazelton Biologics公司）中，然后于37℃下培养并传代至细胞密度不超过1×10⁶个细胞/ml。即将使用前，离心收集细胞，在含0.02%叠氮钠的RPMI 1640培养基中重新悬浮至1.25×10⁷个细胞/ml，于冰上贮存。所有后续步骤均在4℃下进行。

如下进行受体结合测试：

每次测试用1.25×10⁶个U937细胞。（每次测试得到图5中的的一个点。）以相当于10，000cpm的量加入¹²⁵I-IFN-γ。加入用质粒T892-5B（表达可溶性受体的基因）转染的细胞培养上清液，加入的体积从0-100ml逐渐增加。测试液中有三个成分：U-937细胞、¹²⁵I标记的IFN-γ及含有可溶性IFN-γ受体的样品。将含有这三个成分之中两个成分的混合液于4℃下保温30分钟。然后加入第三个成分，于4℃下继续保温120分钟。将细胞置于油〔150μl邻苯二甲酸二辛酯（Aldrich化学公司）和邻苯二甲酸二丁酯（伊斯曼柯达公司）的1∶1混合物〕中离心。然后将离心管快速冷冻，从每个离心管的底部切下细胞沉淀，用γ-计数器测定沉淀上结合的放射性。

举例来说，进行上述步骤的一种方式如下：

用50μl RPMI培养基对可能含有可溶性受体的条件培养基作各种稀释，然后将不同稀释倍数的培养基加到96孔微量滴定板的各小孔中。在每个小孔中加入标记的γ-干扰素（约50，000cpm，体积为50μl），然后加入100μl U-937细胞悬浮液（1.25×10⁷个细胞/ml）。于4℃下培养2小时后，将每个反应混合物吸入装有150μl邻苯二甲酸二辛酯∶邻苯二甲酸二丁酯（1∶1）的0.4ml小试管（Bio-Rad）中。将测试管置摆动筒型转子中离心，在液氮中冷冻，切下管底（其中所含的冰冻细胞沉淀和反应液被油层隔开），用γ计数器分析其放射性。鉴定出培养基中能够抑制γ-干扰素与U-937细胞结合的各部分中含有可溶性IFN-γ受体。

结果示于表1。

表1

筛选克隆的全长γ-干

扰素受体在COS7细胞中的表达

实验号质粒号本底结合本底结合特异结合

（1）（2）（3）

1 T884-5 1832.8 129.8 1703.0

1′ T884-5 1560.5 77.8 1482.7

2 T886-5 1985.0 150.4 1834.6

2′ T886-5 2404.6 197.6 2207.0

3 T886-6 2525.9 230.9 2295.0

3′ T886-6 2092.8 69.8 2023.0

4 无插段 110.7 136.8 0

4′ 无插段 159.4 160.0 0

5 无DNA 125.4 184.4 0

5′ 无DNA 158.1 178.3 0

无氯奎

（1）在未标记IFN-γ的浓度为0.1μg/ml时结合的¹²⁵I-IFN-γcpm。

（2）在未标记IFN-γ的浓度为10μg/ml时结合的¹²⁵I-IFN-γcpm。

（3）特异结合＝（1）-（2）。

图5给出了实验结果，其中将U937细胞上的完整γ-干扰素受体与γ-干扰素的结合作用与本发明的可溶性γ-干扰素受体与γ-干扰素的结合作用作了比较。在这个受体结合测试中，由大肠杆菌产生的可溶性γ-干扰素受体，以依赖剂量的方式竞争性地抑制¹²⁵I标记的γ-干扰素与其在U937细胞上的受体的结合作用。

这些数据表明，可溶性受体是γ-干扰素与其细胞受体结合作用的竞争性抑制剂。在利用这种竞争性抑制作用进行的实验室试验方法（如筛选测试）中，可以用能产生信号的标记物标记IFN-γ或其可溶性受体，这种标记物可以是放射标记或化学标记，尤其是荧光标记。此外，借助这种竞争性抑制作用，本发明的可溶性γ-干扰素受体也可能可用于治疗自身免疫疾病，如风湿性关节炎、多发性硬化、斯耶格伦综合症和盘状红斑狼疮。

本发明的可溶性IFN-γ受体可以以药物组合物形式施用。这类组合物含有治疗有效量的本发明可溶性受体及一种药物载体或赋形剂。药物载体可以是适于将本发明的可溶性IFN-γ受体释放给患者的任何可配伍的无毒物质。例如，载体中可包含无菌水、乙醇、脂肪、蜡及惰性固体，还可以加入药用助剂（如缓冲剂、分散剂）。一般来说，用于肠胃外给予这类药物的组合物是公知的，例如参见Remington′s Pharmaceutical Sciences第14版（Mack出版公司，Easton，PA1980）。另外，也可利用可埋植药物释放系统把本发明组合物引入患者体内，参见例如Urquhart等，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，24∶199-236，1984。

本发明的可溶性IFN-γ受体一般是肠胃外给药，优选静脉给药。虽然预计可溶性IFN-γ受体不具有免疫原性，但最好缓慢给药，或者用常规的静脉给药，或者通过皮下埋植给药。

肠胃外给药时，可溶性IFN-γ受体一般是用药用肠胃外载体配制成适于注射的单位剂型（例如溶液、悬浮液或乳液）。这种载体本质上是无毒和无治疗作用的。这些载体的例子有生理盐水、林格溶液、葡萄糖溶液和Hank氏溶液。也可以使用非水性载体如固定油和油酸乙酯。优选的载体是5%葡萄糖/生理盐水。载体中可含有少量添加剂，例如那些能提高等渗性和化学稳定性的物质，如缓冲剂和防腐剂。可溶性IFN-γ受体最好以基本不含团聚体、降解产物和污染蛋白的纯化形式进行配制，使其浓度为约5-500μg/ml，优选20-250μg/ml。

可溶性IFN-γ受体给药方案的选择取决于多种因素，包括可溶性IFN-γ受体的血清代谢率、与自身免疫疾病相关的IFN-γ的血清水平、可溶性IFN-γ受体的任何可能的免疫原性、靶IFN-γ的易接近性、IFN-γ与其细胞受体相对于IFN-γ与可溶性IFN-γ受体的亲和性、等等。

确定本发明化合物对特定情况的适当剂量属本领域的技能。通常是以低于最适剂量的剂量开始治疗。以后渐渐提高剂量，直到达到各种情况下的最佳效果。为方便起见，需要时可把总日剂量在一天内分次服用。

根据主治医生考虑患者年龄、身体状况和体重以及所治疗症状的严重程度等因素后所做出的判断，调整可溶性IFN-γ受体的服用剂量和次数。

按照该服用方案，最好尽可能加大给予患者的可溶性IFN-γ受体的剂量，使其与可接受水平的副作用相协调。因此所给予的剂量部分地取决于所治疗疾病的严重程度。该剂量优选在每天约0.1-500μg/kg的范围，更优选的是每天约1-50μg/kg。

推荐的典型剂量方案是，肠胃外服用剂量1μg/天至5mg/天，优选20μg/天至1mg/天，以2-4个分次剂量服用，以使自身免疫症状得到缓解。

对本发明的上述方案所做的叙述目的在于说明和描述，而不是要详尽无遗或把本发明限制于所公开的具体形式，显然可根据以上叙述做出各种修改和变动。选择和叙述这些实施方案是为了解释本发明的原理及其实际应用，以使本领域技术人员能够适当地采用和实施这些实施方案以及适于所设想的特定用途的本发明修改形式。发明范围打算用所附的权利要求书来限定。

Claims

1、一种制备可溶性γ-干扰素(IFN-γ)受体及其功能等价变异体的方法，该受体由基本不含其他蛋白的天然人IFN-γ跨膜细胞受体的糖基化或未糖基化细胞外部分组成；其特征在于该方法包括以下步骤：

构建一个含有编码所述可溶性受体的核苷酸顺序的载体，其中该核苷酸顺序能够由含有该载体的宿主表达；

将载体引入宿主；

使含载体的宿主保持在适于使所述核苷酸顺序表达出可溶性受体的条件下。

2、如权利要求1所述的方法，其中可溶性受体具有下式：

其中：

Y为从下列顺序的羧基末端起始的一个或更多个氨基酸的亚顺序：

Arg Ala Glu Met Gly Thr Ala Asp Leu Gly Pro；

Z为从下列顺序的氨基末端起始的一个或更多个氨基酸的亚顺序：

Ile Thr Ile Phe Asn Ser Ser Ile Lys Gly；

m、n和p彼此独立地为0或1。

3、如权利要求2所述的方法，其中m和n均为，1，Y中的亚顺序为：

Gly Thr Ala Asp Leu Gly Pro.

4、如权利要求2所述的方法，其中：

m、n和p均为1，Y和Z所代表的顺序完整存在，即，可溶性IFN-γ受体具有氨基酸1-231的顺序;或

m为1，n为1，p为0，Y所代表的顺序完整存在，即，可溶性IFN-γ受体具有氨基酸1-221的顺序;或

m为0，n为1，p为0，Y所代表的顺序以^（6）Gly开始，即，可溶性IFN-γ受体具有氨基酸6-221的顺序;或

m为0，n和p均为1，Y所代表的顺序以^（6）Gly开始，Z所代表的顺序完整存在，即，可溶性IFN-γ受体具有氨基酸6-231的顺序。

5、如权利要求1所述的方法，其中m为1，所述顺序包括一个起始丝氨酸残基。

6、如权利要求1所述的方法，其中m为1，n为1，p为0，Y所代表的顺序以^（6）Gly开始，即，可溶性IFN-γ受体具有氨基酸Ser+6-221的顺序。

7、如权利要求1所述的方法，其中m为1，n和p均为1，Y所代表的顺序以^（6）Gly开始，Z所代表的顺序完整存在，即，可溶性IFN-γ受体具有氨基酸Ser+6-231的顺序。

8、如权利要求1所述的方法，其中权利要求1的可溶性受体以未糖基化形式产生。

9、制备一种药物组合物的方法，该组合物包含有效量的权利要求1所限定的可溶性受体和一种药用载体或赋形剂，该方法包括将权利要求1限定的可溶性受体与一种药用载体或赋形剂混合。

10、制备一种药物组合物的方法，该组合物包含有效量的权利要求2所限定的可溶性受体和一种药用载体或赋形剂，该方法包括将权利要求2限定的可溶性受体与一种药用载体或赋形剂混合。

11、一种抑制IFN-γ与带IFN-γ受体细胞的结合作用的方法，该方法包括如下步骤：

在含有带IFN-γ受体细胞的培养基中，加入有效量的权利要求1所限定的可溶性IFN-γ受体;

使所述可溶性受体与细胞受体竞争。

12、一种抑制IFN-γ与带IFN-γ受体细胞的结合作用的方法，该方法包括如下步骤：

在含有带IFN-γ受体细胞的培养基中，加入有效量的权利要求2所限定的可溶性IFN-γ受体;

使所述可溶性受体与细胞受体竞争。