PT97445B - Processo para a preparacao de receptores do interferao gama truncados e soluveis - Google Patents

Description

^Si PROCESSO PARA A PREPARAçSO DE RECEPTORES DQ IWTERFERSD SAHA TRUNCADOS E SOLÚVEIS³’

MatóRiikDSsCRruvâ

Resumo

O presente invento diz respeito a um processo para a preparação de receptores do interfsrão gansa truncados e solúveis, espeeialmente o domínio extrscslular solúvel do receptor humano, juntamente com sequências de DNA os codificam e linhas celulares transformadas que os produzem»

referido processe? consiste na construção de um vector que compreende uma sequência de nueleotídeos codificadora do referido receptor solúvel, em que a. sequência de nueleotídeos é capaz de ssr expressa por um hospedeiro contendo o vector, na incorporação do vector no hospedeiro» e na manutenção do- hospedeiro contendo o vector sob condições adequadas para a expressão da sequência de nueleotídeos no receptor solúvel»

São também referidos os métodos para usar tais receptores para inibir a ligação do interferia gama ao seu receptor celular»

CâMKLJéÇNICO

Este invento está relacionado com receptores do interferão gama truncados e solúveis e em particular com fracções extracelulares solúveis do receptor de Interferão gama,

EyNfiâMaáTQ_DQ_lNVlMTO

Interferão gama, até agora por vezes referido como IFM-gsms, é uma citocina produzida por células T auxiliares activadass ele tem efeitos directos sobre vários tipos celulares tais como células B, macrófagos e células T= Ele tem múltiplas efeitos CTrinchieri et al», Immuno1oy Today, 6s131-136 (1985)? uma das suas actividades mais distintas é induzir a expressão de genes do complexo major de histocompatibilidade (MHC) classe I e classe II (Kelley et al,, J.»_I mmuno 1, , í 52 s 240-245 <1984 5 ?

ColUns et al,, Proc, Natl, Acad, Sei» USA, Sis4917-4921 (1984)? Cooper et al», J» Immunol», í 4 í s í959-1962 (1988); e Amaldi et al», 3. ImmunoI,, 142s999-1004 (1989)), A expressão degenes de MHC classe Ué uma marca das células apresentadoras ds antigénio» A expressão de antigénios da classe II é observada em macrófagos e am células B s T maduras? e sabe-se que o interferão gama regula de forma positiva esta expressão» Em adição, sabe-se gue o interferão gama induz a expressão de genes codificadores de antigénios da ciasse II em células que não são células apresentadoras da antigénio primárias, tais como células epiteliais, fibroblastos, astrócitos, células endoteliais e células do músculo liso» Não se sabe ao certo se estes tipos celulares apresentam de facto antigénios, mas mostrou—se que a indução que· os antigénios classe II nestes tipos celulares está correlacionado com o desenvolvimento de doenças auto-imunes (Massa et al,, Proc, Natl. Acad, Sei, USA, 84s4219-4215 (1987)), Uma vez que o Interferão gama ê o estimulador primário dos antigénios da classe x>

II, ele poderá desempenhar um papel importante na expressão da do interferSo gama ou dos seus actus ao nivel da. interface do tratamento doença» Portanto, um inibido efeitos, por exemplo um que receptor, teria grande valor potencial e utilidade no de doenças auto-imunes»

Foram feitas tentativas para inibir os efeitos dc interferSo gama em murganhos através da administração de anticorpos monoclonais contra ele (Grau et al

Proc» Natl» Acad,

USA, 36:5572-55./4 (Í9S9))» No entanto, para se aplicar este tratamento a humanos deve-se ter ? í~^£ em conta possibilidade ds os próprios anticorpos monoclonais poderem induzir uma resposta imune neutralizante que pudesse reduzir a eficácia do tratamento»

São conhecidos ciones recombinantes expressando receptores de interferão gama Cver, por exemplo» Molecular Cloning and Expression of the Human Interferon-Gama Receptor, Aguet, G», et al», Cell, 55s273~280 C198€U^!)? mas estes proporcionam todo o receptor celular, incluindo o domínio citoplasmático (intracelular) s o domínio transmembranar= □ domínio cxtoplasmático pode ser responsável para a transdução do sinal na célula e é portanto dispensável quando se procura uma antagonista de IFM-gama para seleccionar e ligar selectivamente IFN-gama ca corrente sanguínea ou noutros fluídos do corpo Ce»g» fluido sinovial), Ainda, o domínio citoplasmático é normalmente escondido dentro da célula onde ê inacessível ao sistema· imune? o receptor de IFN-gama de tamanho completo poderá pois actuar como um antigênio devido ao seu domínio citoplasmático e ser neutralizado» Se isto acontecer ele pode ser removido e rapidamente perdido o seu efeito se introduzido em tais fluídos do corpo» Existe portanto a necessidade de um antagonista do IFN-gama que vá competir com o IFN-gama sem o risco de induzir os efeitos secundários que lhe estão associados»

Α sequência de DNA codificadora e a sequência de aminoácidos prevista do receptor do IFN-gama foram divulgados por Aguet et al, (supra), que postularam que a sequência líder vai desde o aminoâcido (resíduo) í até ao aminoâcido 14 e que a sequência transmembranar se estende desde o amínoácido 246 até ao aminoâcido 266 (esta é a sua numeração)„ Postulou-se pois que a fracção extracelular prevista do receptor do IFN-gama se estende desde o aminoâcido 15 até ao aminoâcido 245y a sua estrutura postulada, incluindo a sequência líder consistindo nos resíduos de aminoácidos 1-14 e sequência de DNA codificadora estão apresentados na Figura. 1 partes A e B dos desenhos juntos, onde a sequência líder é portadora da numeração -14 a -1 e a fracção extracelular prevista é portadora da numeração 1 a 231»

Na discussão que se segue toda a numeração será dada de acorda com a da Figura 1 dos desenhos juntos, mesmo que possa diferir das publicações aqui referidas.

Não se sabe ao certo quanto desta sequência é necessário para um receptor de IFN-gama. eficaz que possa ligar-se espeeificamente a IFN-gama, No entanto, sabe-se ÍStueber et al», Abstract A3-15, 3, Interferon Res», Vol» 9 Supl» 2 COct» 1989)) que os resíduos de aminoácidos 1-198 não proporcionam um receptor eficaz enquanto que os resíduos de aminoácidos 12-231 (incluindo as sequências que começam antes da posição 12) proporcionam um receptor eficaz produzido em E. coli de acordo com aquele resumo, i.e», com seis resíduos histidina no resíduos de histidina poderão alterar propriedades do receptor, tais como a sua imunogenicidade e altamente indesejáveis quando o receptor solúvel usar como produto farmacêutico» Q nosso trabalho indica que o resíduos de aminoácidos 6-221 proporcionam um receptor eficaz ma que outras sequências poderão ser também eficazes» extremo N ou C» Estes fun damentais são portanto se destina a.

* S í C '

SUMARIO DO INVENTO invento

proporciona pois um receptor solúvel do interferão gama, o qual consiste na fraeção extracslulsr glicosilada ou não glicosilada do receptor do interferão gama humano natural substancialmente livre de outras proteínas e suas variações funcionalmente equivalentes» As variações funcionalmente equivalentes incluem não só formas alélicás naturais como também variações produzidas por substituição» deleção ou adição de um ou mais íe.g» até três) residuos de aminoácidos mas retendo substancialmente a mesma actividade de ligação» Este receptor solúvel de IFN-gama tem preferencialmente a fórmula apresentada na Figura 2 dos desenhos juntos, em ques

Y è uma sequência de um ou mais residuos de aminoácidos começando no extremo carboxilo (Pro) da sequências

Arg Ala Glu Met Tre Ala Asp Leu Gli Pro;

Z é uma subsequência de um ou mais resíduos ds eidos começando no extremo amina (Ile) da sequências aminoí

Ile Tre Ile Fen Asn Ssr Ssr Ile Lis SI is e m, n e p são Índependentemente ® ou 1,

Este receptor solúvel è portanto a fraeção extraeelular do receptor do IFN-gama ε vai competir num ensaio de ligação a receptores com o IFN-gama e é um antagonista

IFN—gama aos seus receptores celulares; i.e, receptores de IFN-gama para IFN-qama» Ainda, ele pode ser

ta	da ligação	do
ele	compete com	oe
ele	pode ser us	ado

λ ; i ·' num ensaio de ligação para medir IFM-gamas o processo do Exemplo 4D abaixo pode ser adaptado a um formato de fase sólida para uma detecçâo de antagonistas de ÍFN-qama.

Os resíduos Ser e Arg nas posições 1 e 2 são codificados por um sítio potencial de ligação ao ribossoma ASCASS (geralmente ASOAOSs cf= Shine e Dalgarno, Proc,

71.5 1342) (19743 (ver Figura 13 e existe um codão de inicação de

7-9 pares de bases a jusante» Para eliminar a possibilidade de uma iniciação falsa na maior parte dos procariotas, e.g» bactérias tais como coli, preferimos começar no resíduo 611 na posição 6 ou numa posição mais à frente até ã posição 12» Desta forma» pode ser proporcionado um receptor solúvel e eficaz de IFN-gama compreendendo os resíduos de aminoácidos 12-221 ou em particular sequâncias mais longas, por exemplo desde o resíduo de aminoáoido 1 e/ou até ao resíduo de aminoácido 231»

Um clone de cDNA de tamanho completo codificador do receptor do interferão gama (ver. por exemplo» Aguet et al», Cel1» 55 s 275—2S0 (19883 (referido atrás)) foi directamente isolada por meio da reacção em cadeia com polimerase (Friedman et al», Nucl. Acids Res. 1fe s 8716 C198833 de uma biblioteca de cDNA de placenta em lambda gtll» A fracção -do cDNA codificador da fracção solúvel do receptor do IFN-gama foi isolada a partir dela e incorporada no plasmídeo que a expressa»

Numa realização preferida do invento, o receptor i solúvel de IFN—gama é como definido atrás» em gue n é 1 e a sbsequãncia em Y representas i Tre Ala Asp Leu Gli Pro

Numa outra realização particularmente preferida do o receptor solúvel de IFN-gama é como definido atrás, em

invento que ffl, n e p são todos 1 e as sequências representadas por Y e Z estão totalmente presentes; i.e», o receptor do IFN—gama solúvel tem a sequência de resíduos de aminoácidos 1-231»

Ainda numa outra realização particularmente preferida do invento, o receptor solúvel ds IFN-gama é como definido atrás, em que m e n são 1 e p é 0 e a sequência representada por Y está totalmente presente; i»e», o receptor de IFN-gama solúvel tem a sequência de resíduos de aminoácidos 1-221»

Numa outra realização do invento particularmente preferida, o receptor solúvel do IFN-gama ê como definido atrás, esi que m é ©, n é 1 e p é 0 e a sequência representada por ¥ está presente a partir de * 'Sli, i»e„, o receptor solúvel de,IFN-gama tem a sequência dos resíduos de aminoãcidos 6—221»

Numa outra realização particularmente preferida do invento o receptor solúvel de IFN-gama do invento é como definido atrás, em que m é 0 e n e ρ são ambos 1, a sequência representada í A) por Y está presente desde

Sli e a sequência representada por Z ·>

está completamente presente; i»e»= o receptor solúvel de IFN-gama tem a sequência de resíduos de aminoácidos 6-231»

Ainda em realizações particularmente preferidas do invento, o receptor solúvel de IFN—gama é como definido nos dois parágrafos precedentes excepto m ser 1, de tal forma que a sequência inclui adicionalments um resíduo serina inicial» tí -

, -· Λ < V·

BREVE DESCRIçSO DAS FISURASss

A Figura (nas Partes A e B) mostra as sequências de tamanha campista da receptor solúvel de IFN-gama ε do seu DNA codificador como divulgado po-r Aguet et al», Cell, 55 s 273-280 (1988), excepto a numeração ter sido alterada como atrás.

indicada

A Figurai 2 mostra a fórmula preferida do solúvel de IFN-gama do presente invento» receptor

A Figura 3 mostra o plasmídeo ptíSRS no qual a sequência de DNA codificadora do receptor solúvel de IFN-gama foi inserida»

A Figura 4 mostra esquematicamente como foi construído um plasmídeo de expressão em E» coli para o receptor solúvel do I FN-gama,,

A Figura 5 descreve a competição da proteína receptor solúvel ds IFN-gama produzida era E» coli com ligação a IFN-gama em células U937s os ensaios de ligação foram realizados como descrito no Exemplo 4D=

DESCRIçaQ DO INVENTO

Todas as referências aqui citadas são incluídas na sua totalidade como referência»

Vectores de expressão codificadores e capazes de produzir o domínio extracelular do DNA do receptor de IFN-gama em procariotas foram usados para obtenção de clones procarióticos que produtores da fracção solúvel (extracelular) do receptor de IFN-gama» As células procariõticas que podem ser usadas incluem

bactérias, especialmente E, coli; muitas estirpes de E. coli podem ser usadas na realização do presente invento. No entanto, a estirpe de E, co1i preferida é um mutante ^Mleaky que permite que o receptor solúvel de IFN-gama saia do espaço periplasmático para o meio de cultura, de onde poderá ser facilmente isolado sem as complicações causadas pela presença da maiorparte de outras produção de tais bactérias e a sua he teró1oqas recombi nan tes utilização na obtenção de proteínaí está descrita no pedido de patente copendente n9 07/429,588, entregue em 31 de Outubro, 1989, o qual é aqui incluido como referência.

Na realização do presente invento podem ser usados vários promotores diferentes de E. coli, tais como Trp, lac, pll, lambda pL, etc.. Estes promotores dirigem a expressão de proteínas heterólogas no citoplasma,, Para uma espaço periplasmático pode ser usada, uma sinal como seja a derivada de OmpA d ecreção eficaz para o sequência de peptideo E. coli. fosfatase alcalina de E.coli, lipoproteina de E. coli. etc», 0 plasmídeo de expressão para a expressão procariótica em E» co1i contem um promotor forte, especialmente um duplo promotor em tandem como seja Ιρρ-lac, seguido de uma sequência sinal que pode transportar a proteina heteróloga para o espaço periplasmático. Esta última sequência de DNA é de preferência a sequência sinal derivada de uma proteína de membrana externa de E. coil, OmpA. A sequência sinal é seguida da sequência codificadora do cDNA do receptor de LFN-qama.

esquema ds construção (mostrado na Figura 4) usado na obtenção deste plasmídeo introduziu um resíduo adicional, viz serina, no inicio da sequência codificadora madura, dm codão de paragem da tradução foi introduzido no fim da sequência codificadora do receptor solúvel ds IFN-gama previsto, Um plasmídeo

I •τ

contendo estes atributos, quando usado para transformar uma estirpe mutante de E» coli Ce.g», a estirpe disponível na ATCC com α Νϊ! de Acesso 53956), produz uam proteína de fusão que é composta pela sequência sinal OmpA seguido da sequência do receptor solúvel de IFN-gama. A proteína de fusão foi ainda processada no periplasma para dar o receptor solúvel de IFN-gama maduro, o qual sai para o meio ds cultura.

Linhas celulares

incluem linhas celulares de CHO e células de levedura5 expressão de insectos, e.g.

eucarióticas que podem ser usadas (RSíiixTsros, e.g. células L-c-ó/, MS 1 e podem ainda ser usados sistemas de

Bombyx aori ou Spodoptera fruqiperda.

Para demonstrar este invento, células U937 foram usadas como uma fonte adequada de receptores de interferão gamas no entanto, os receptores solúveis aqui descritos inibirão certamen— te a ligação de IFN-gama a quaisquer células portadoras daqueles receptores. Tais células incluem, por exemplo, células B, células T, eosinófilos, células do músculo liso, promielócitos, macrófagos, células eritróides, monócitos, granulócitos, etc.

PURIFICAÇÃO

□ Exemplo 3 abaixo descreve a purificação do receptor solúvel de IFN-gama a partir de E. coli. mas o seu processo pode ser adaptado è. purificação do receptor a partir de outras fontes tais como células eucarióticas, especialmente células de mamífero e células de levedura.

REAGENTES

MATERIAIS E MÉTODOS

As enzimas de restrição- foram adquiridas â New England Biolabs», Beverly, MA» DNA-polimerase de Thermus aquaticus e tampão ÍBx foram adquiridos à Stratagene, LaJolla, CA» A sequenciação do DNA de plasmídeo de cadeia dupla foi feita usando Sequenase Version 2«0 da United States Biochemical, Cleveland, OH» Uma biblioteca de cDNA de placenta humana em lambda gtll foi adquirida è. Clontech, Ralo Alto, CA»

2» QLIQQNUCLEÓTIDOS SINTéTICOS

Os oligonucleótidos sintéticos- que se seguem foram sintetizados por métodos convecnionais com uma sintetisador de DNA Applied Biosystems Model 3Q0As \>

ABó97s

5⁵-CAGACTGGTTACTACTTAAAGGT~3* AB75Ss

5⁵-CAGCSACCSTCGSTASCAGC-3⁵

AB759s ^?-CTTCAAASTTSGTSCAACTT-3 ’ ABSÍ2?

5⁵-CTATCTGCAGCGACCGTCGGTAGCAGCAB813s ?-GTATGTCuACί í CCAAAtíTTGGTGCAACTT—3’

ABS70JFs

3-GCGCAAGCTTCTGGCACCGCGGATCTGGGGCCGTCCTCA-3*

ABS71JFs

5’-GGC8GATCCTTAACCTTTTATACTGCTATTGAAAATGAA-3’

A reacção em cadeia como

com polimerase (PCR) foi realizada anteriormente descrito (Friedmann et al», Nucleic Acids Res. (1988), 16s87íS).

4. IFM-gama humano pode ser purificado de acordo com o processo do Exemplo 4A ou ser obtida comercialmente e os anticorpos contra ele podem ser adquiridos comercialmente. Por exemplo, Senzyme Corp» (Boston, MA) fornece IFN—gama humano recombinante <99% puro) com o código HB—IFN com o código IP—50® para transferências Western„

fc.XEMPLD3

EXEMPLO 1

ISOLAMENTO E EXPRESSÃO TRANSITÓRIA PQ CLONE DO

RECEPTOR DE IFN-GAMA DE TAMANHO COMPLETO

Os oligonucleõtidos AB75b e ΑΒ7ο*?, os quais são id'e'nticos às regiões não traduzidas 5^{* 9} receptor de IFN-gama, foram usado® da biblioteca de cDNA de placenti anteriormente (Friedman et al,, e 3⁵ da sequência ds cDNA do numa PCR com o lisado fágico essencialmente como descrito Nucl. Acids Res, C1988),

Ífes87185, A PCR fci realizada com um Techne programável Bri-Block (8RI, Essex, UK), nas seguirst.es condiçSess desnaturação a 95°C durante 2 minutos» emparelhamento dos iniciadores a 50°C durante 2 minutos e extensão da cadeia a 72*C durante 2 minutos, tudo durante 30 ciclos, com um ciclo final de elongação a 72°C durante minutos» Os produtos de PCR foram sujeitas a electroforese num gel de IX de agarose- e uma banda forte de aproximadamente 1,5 Kb correspondendo ao receptor ds IFN-gama de tamanho completo foi visualizado por coloração com brometo de etídio e isolado por electroeluição» A autenticidade do fragmenta fai confirmada com uma segunda PCR usando o oligómero AB758 como iniciador 5⁹ e AB697 como iniciador interno correspondendo a sequências na região intracelular do receptor de IFN-gama, para produzir um fragmento de aproximadamente 1,2 Kb.

Sítios de restrição para PstI (5⁵) e Sa1I (3⁹) foram introduzidos no fragmento do receptor ds IFN-gama de tamanho completo de 1.5 Kb com os oligómeros Α.Θ812 ε AB813 numa PCR como descrito atrás, 0 fragmento resultante foi isolado, digerido com PstI e SalI e ligado no plasmídeo pDSRS digerido com PstI/Sall (ATCC NS de Acesso 68232) CFig» 3), para expressão em células C0S7» A mistura de ligação resultante foi usada para transformar células competentes de E. coli 29A (adquiridas já prontas à E» <Λ s ; 1' ·' ..· coli Genetics Stock Center, Dept» of Biology, Vale University, P.O. Box 6666, New Haven, CT 06511-7444).

DNA de plasmídeo isolado pelo método de lise alcalina CBirnboim and Doly, “A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, Nucl. Acids Res», 7sl5i3 ¢1978)) a partir de 14 dos clones resultantes foi analisado e testada par análise de restrição e PCR» Sete clones continham o fragmento receptor de IFN-gama de 1,5 Kb» □ DNA de seis destes sete clones foi purificado por centrifugação em gradientes ds cloreto de césio/brometo de etidio (Maniatis et al»? Molecular Cloning? A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) e foi usado para transfectar transitóriamen us csiuísí

C0S7 )pg DNA/placa de 1Θ0 mmpelo método do

DEAE-dextrano essencialmente como descrito (McCutchan e Pagano, Enhancement of the infectivity of Simian Virus 40 Deoxyríbonucleic Acid with Diethylamino-ethyl—Dextran, 3» Natl. Uancer Inst», 41.351—356 (1968))» Após crescimento a 37-‘C durante 60-72 horas, as células fora® colhidas por tripsinízação suave e ressuspensas para lx Í0^Z células/ml em meio RPMI contendo 0,022 de azida de sódio e mantidas a 4°C« Foram então testadas quanto ã expressão do receptor de IFN-gama pelo pela ligação específica de IFN-gama marcado com I usando técnicas descritas no Exemplo 4 abaixo»

S r‘é:

clones apresentaram apresentaram um aumento marcado na ligação específica de interferão gama ínsrcstícj com (ver Tabela I abaixo). 0 DNA ds plasmídeo dos trãs clones foi sequenciada pelo método de terminação de cadeias didesoxi (Sanger et al», DNA Sequencing with Chain-terminating Inhibitors”, Proc Natl» Acad» Sei» USA, 74, 5463-6567 (1977)); a sequência do domínio extracelular era idêntica à sequência publicada CAguet et al», supra).

EXEMPLO 2= CPNSTRUçSQ DE p3FR105-6 PARA EXPRESSÃO DO GENE

CODIFICADOR DO RECEPTOR SOLÚVEL DE IFN-GANA EN

E. COLI

Usando um fragmento de DiMA isolado a partir de uma biblioteca tíe cDNA e codificador do receptor do interfsrão gama, fizeram-se iniciadores para introduzir dois sítios para clonagem do domínio solúvel num plasmídeo de expressão procariótico» Construiu-se o iniciador AB870JF para introduzir um sítio de restrição Hindi 11 perto do extremo amina do DNA Co qual seria s. Gli na posição 20); e o iniciador AB8713F foi feito para introduzir um sítio ds restrição BamHl e um codão de paragem, o qual serviria para isolar e definir apenas o domínio solúvel da molécula» CEstes iniciadores isolam ε definem o domínio solúvel do receptor do IFW-gama menos a sua própria sequência líder; i»e», a sequência polipeptidica entre a sequência líder e a região transmembranar,>) Usando tecnologia de PCR, o fragmento de DNA (codificador do receptor de tamanho completo) e iniciadores foram combinados numa mistura de reacção como se segues IDO pmoles de iniciadores, 25 ng de DNA, 10 mM dNTPs polimsrase TAQ e 2 unidades de polimerase TAQ regulado para 30 ciclos para empareihamento, síntese num volume total de reacção ds 100 μΐ. Após PCR, o DMA foi separado num gel de 1a de agarose s o fragmento de 800 pb codificador do receptor do interfsrão gama foi visualizado por coloração com brometo de etídio e isolado da agarose, μΐ de tampão 0 sistema foi desnaturação e

Q plasmídeo p830-i ípINIII, líder UmpA) CD» Lundell st ‘Cytoplasmic and Periplasmic Expression of a Highly Basic

Protsin, Human Interleukin 4, in E, sli\ J» Indust» Microbiol vol, 4 (1989) e podendo ser obtida quando pedida a R, Kastelein em DNAX Research Institute of molecular Inc», 901 Califórnia Avsnue» Paio Alto» and Cellular Biology, CA 94304—1104) contem

sítios de restrição HindiII s BamHI=, os quais foram usados para clonar o fragmento do receptor de IFIM-gama na mesma grelha de leitura a jusante do líder OmpA como se segue; 2® pg de DNA do plasmídeo foram digeridos com 5® unidades da nucleass de restrição HindIII e depois con? 4® unidades da nuclease de restrição BamHI. Após digestão, a mistura de fragmentos de restrição migrou num gel de ®,65% de agarose? isolou-se um fragmento de 7,5 Kb representando o esqueleto do plasmídeo,. Qualquer outro plasmídeo adequado codificador de um sinal de secreção adequado poderia ter sido usado sm lugar deste»

fragmento de 7,5 Kb (®₃Í pg) representando o esqueleto de plasmídeo e í pg do fragmento de 80® Kb codificador do receptor do interferão gama foram ligados numa mistura contendo ATP, DNA-ligase de T4 Cí®® unidades) e ditiotreitol a ló'-C e num volume de 4® pl durante 14 horas» Metade do produto foi en cao

usado para transformar E. coli CK12) 294 preparada com CaCl», (pode ser adquirida a E» coli Genetics Stock Center, Dept. of Biology, Yale University, F‘»0» Box 6666, New Haven, CT 06511-7444). A mistura de transfarmação foi semeada em placas de ampicilina e incubada a 3®°C durante 16-24 horas» Várias colóniasforam então repicadas, e fermentadas e o DNA foi isolado e analisado por digestão com as enzi,mas referidas atrás (HindlII, baroHI) e seleccionado o clone pJFRí®5~6« clone pJFRÍ®5 tem o fragmento inserido a jusante de

OmpA e sob o controle do promotor Ιρρ/lac» 0 plasmídeo foi obtido a partir do expressão é pBR322 e é portador do gene LAC—I de tal forma que a induzida com isopropil-tio-fl-galactosido (IPTG).

Π.Λ

EMPLO

PURIFICAÇÃO DO RECEPTOR SOLÚVEL DO INTERFERgQ-GAMft

HUMANO ft PARTIR DE E» COLI \>

O domínio extraceΙυΐar do receptor do IFN-gama humano foi purificado a partir de E» coli portadora do plasmídeo pJFR105-6. fts células foram cultivadas a 30°C em meio M9 com casaminoácidos Ci x sais mínimos- de M9 Bibco BRL NS M29800B), 3% (ρ/v) de casaminoácidos, 2 g/1 de glucose, 0,1 g/1 de tiamina e 0,2 g/1 de sulfato de magnésio! para ft^^. = 1?0» Adicionou-se 1PTG para 0,5 mM e a fermentação continuou a 30°C durante a noite (cultura final A,,~ = 3,5)» Colheu-se o meio condicionado de 12 litros de cultura e clarificou-se por centrifugação» 0 sobrenadante clarificado foi ajustado a 5% (p/v) de ácido tricloroacético (TCA) e a proteína precipitada a 4*C durante 60 minutos» A fracção insolúvel foi colhida por centrifugação a 10000 xg e ressuspensa em 120 ml de 200 mM Tris CpH 8) para solubilização» Após incubação a 4°C durante 60 minutos, o resíduo da fracção ressolubilizada foi colhida procentrifLigação„ 0 sobrenadante foi ajustado a. ureia. 4M, 20 mM Tris ípH 8), incubado a 4'^:<C durante 30 minutos e depois aplicado numa coluna de DEAE Sephadex Fast Flow (Pharmacia MS 17-0709-01), equilibrada com um tampão de 20 mM Tris (pH 8), 4M ureia» A coluna foi então eluída com um gradiente linear de cloreto de sódio 0-0,3 M no mesmo tampão Tris/ureia. 0 domínio extracelular solúvel do receptor IFN-gama humano eluiu a aproximadamente 0,18 M NaCl, 0 conjunto de fracções do receptor solúvel foi dializado contra 20 mM Tris CpH 8) e aplicado numa coluna de 5 ml de IFiM-gama-Affigel 10, equilibrada com 20 mM Tris» LIFN-gama humano foi acoplado covalentemente a Affigel 10 (Biorad Catalog NS 153-6046), de acordo com os processos recomendados pelo fabricante» Esta resina de afinidade continha 4 mg de IFN-gama/ml de resina suportei» A coluna foi lavada com ÍD ml de 0,2M NaCl em 200 mM Tris CpH 8) e depois com 10 ml de 0,5 M NaCl em 200 mM Tris ÍpH 8), 0 receptor solúvel foi então eluido com tampão carbonato de sódio 200 mM, pH 10 ções foram neutralizadas e reunidas s

3, 0,6 M NaCl, As fracdepois dialisado contra fosfato de sódio 20 mM, pH /.

mg do receptor solúvel No entanto, cerca de ava presente ns fracção desnaturado e reenrolado

Este processo deu entre 0,7 s í de IFN-gama por fermentação de 12 litros 507 do receptor solúvel de IFN-gama est insolúvel em TCA, Este material pode ser para dar mais proteína activa.

ÍXEMPLO

ENSAIO PARA RECEPTORES SOLÚVEIS DE IFN-SAMA

Purificação de Interferi

E. coli 274 portadora do plasmídeo pSIF4-137 (um vector de expressão baseado no pBR322 tendo o promotor da lipoproteína bacteriana (Ippí ε codificador de um gene de interferão gama humano (aminoácidos 4-137 da proteína madura)) foi cultivado em meio SC modificado (20 g/1 de glicerol, 30 g/1 de casaminoácidos (Difeo), 5 q/1 de KH„PO_ e 1 q/1 de MqSO,,,7H_0 > a 37‘-C» A Α,,_Λ — 2 4 ’ *42 660 foram colhidas e lisadas por disrupção com ultrassons» Uma fracção insolúvel acelular foi então isolada por centrifugação, ressuspensa em 20 mM Tris CpH 8), hidrocloreto de guanidina óM e 5 mM ditiotreitol e rsssolubi1izado por aquecimento a 5ó''C durante 30 minutos,.

Esta fracção solubi1izada foi então aplicada numa coluna de Sephacryl 200—tsc de 3 x '70 cm (Pharmacia AB), equilibrada em 20 mM Tris (pH 8), hidrocloreto de guanidina 6 mM à temperatura ambiente» Após fraccionamento as fracções contendo o interferão gama. (e,g,, coíso detectado por análise de transferências Western) foram reunidas, diluídas 120 vezes em 10 mM MH^OAc (pH 7) e misturadas a 4°C durante a noite» A resina SP-Sephadex

X.

(Sigma Chemical Co») (10 ml como uma pasta de Isl em 20 mM iris, pH 8) foi adicionado a esta amostra s misturado a 4®C durante h8 minutos» A resina foi retirada por filtra* NH^OAc CpH 7) e e lavada com 10 interferão gama purificado foi eluído com 1 NaCl» A pureza, da fracção deste interferão gama foi superior 95%, como se mostra por electroforese em gal de SDS-poliacrilam ds» mM mM

B» Marcação do interferão-gama humano

125

Interferão-gama humano marcado com ' I foi preparado usando o reagente de Bolton Hunter (New Enqland Nuclear) de acordo com os processos descritos pelo fornecedor ía reacção de marcação continha 78 p.g/ml de interferão-gama em fosfato de sódio 20 mM a pH S) « Retirou—se o sal à mistura de reacção final por diálise e aplicou-se numa coluna de i x 24 cm de Sephadex 875 equilibrada em BBS e 0,2% de gelatina para separar o interferão-gama polimerizado da proteina dimérica» 0 conjunto de fracções de interferão—gama marcada para 50 Ti/mM foi guardado a 4'^:‘C até ser usado» u»

Preparação aa amostra usando E« coli

E» coli 73vT (ATCC- NS ds Acesso 53956), transformada com o plasmideo pJFR105-6, foi cultivada em meio nutritivo a 37‘-C até A

ÓÓ0 cultura foi então induzida com 0,1M IPT8 e o crescimento continuou a 37°C durante 3 horas» Os sobrenadantss das culturas induzidas foram testados reiativamente à expressão do receptor solúvel do IFN-gama usando o ensaio de ligação d esc rito abai xo«

t,n a-aio ds ligação k>

Células 11-937 (ATCC NS de Catálogo CRL 1593? foram inoculadas a partir de stocks congelados em 57» de dimetilsulíóxi~ do₅ 957, de soro fetal bovino em meio RPMI 1640 previamente aquecido (Hazelton Biologics, Inc.) e depois cultivadas e passaa das a 37^VC até densidades celulares não superiores a í x í&~ células/ml» As células foram colhidas por centrifugação imediatamente antes de usar, ressuspsnsss para 1,25 x 10⁷ células/ml em meio RPMI 1640 contendo 0,02% de azida de sódio e guardado em gelo» Todos os processos subsequentes foram realizados a 4°C»

Os ensaios de ligação a receptores foram realizados como se seque;

boram usadas por ensaio 1,25 x 10'¹ células UV3I (Cada ensaio deu um ponto na Figura 5 ;-IFN~gafliã foi adicionado te,, a 10 000 cpm equivalentes» 0 sobrenadante da cultura das células transfectadas com o plasmídeo TQ92-5B (expressando o gene do receptor solúvel) foi adicionado em volumes crescentes variando de 0 a 10© ml» Três componentes estavam presentes no ensaios células U-937, IFN-gama marcado com ^AI e uma amostra contendo o receptor solúvel de IFN-gama» As misturas contendo dois destes três componentes foram incubadas a 4°C durante 30 minutos» 0 terceiro componente foi então adicionado e a incubação continuou a 4°C durante 12$ minutos» As células foram centrifugadas através de óleo Liõõ μΐ ds uma mistura de ísl de fetalato ds dioctilo (Aldrich Chemical Co») e fetalato de dibutilo (Eastman Kodak Co»)3» Os tubos foram então congelados rapidamente» os sedimentos de células foram retirados do fundo de cada tubo e a radioactividade associada a cada sedimento foi determinada num contador gama

Como exemplo segue-se uma maneira de realizar o processo referido;

Diluições de meio condicionado suspeito de conter sceptor solúvel foram adicionadas (em o

Zr o

ul de meio RPMI) cav.ioa.oes cavidades de uma placa de microtitulação de 96 interferão-gama marcado ( aproximadamente 50 000 rpm em 5© p.l> foi adicionado a cada uma das cavidades seguido de 100 μΐ da suspensão de células U—937 (1,25 x 1© ^z células/ml). Após incubação a 4°C durante duas horas cada uma das misturas de reacção foi pipetada para um tubo de ensaio de 0,4 ml (Bio-Rad> contendo 150 μΐ de ftalato dioctílicosfetalato dibutílico ílsí>„ Os tubos de ensaio foram centrifugados num rotor basculante e congelados em azoto liquido e a ponta do tubo (contenda o sedimento de células congelado separado do meio de reacção pela camada de óleo) foi retirado e analisada a radioactividade num contador gama» As fracções de meio capazes de inibir a ligação do interferão—qama a células U-937 foram identifiçadas como contendo o receptor solúvel de IFN—gama. Os resultados estão apresentados na Tabela I» \>

TABELA 1

DETECcSO DA EXPRESSaO DO RECEPTOR CLONADO DE

TAMANHO COMPLETO DO INTERFERSO GAMA EM CéLULAS C0S7

Exp, NS	Plasmídeo NS	Ligação de Fundo í 1)	Ligação ds Fundo Í2)	Ligação Espeeifica Í3)
1	T884-5	1832,8	7 “Ό C? A t tf úí	17Θ3,0
i?	T884-5	1560,5	77,8	1482,7
.-7	T886-5	1985,0	150»4	1834,6
·*?	T886-5	2404,6	1 Q7 A X »· / j}	97017 Λ- ’-· í tf
»_(*	T886-6	2525,9	230,9	2295,0
-r 3	*1 Sháóí'í3	2092,S	69,8	2023,0
4	Sem ϊ n se rç ão	110,7	136,8	0
4’	Sem Inserção	159,4	160,0	0
5	Sem DNA	125,4	184,4	0
5’	Sem DNA e sem	158,1	178,3	€·-
	cloroquina

ί 1)	1 cpm οε	.t£> '—ί γ X	ligado	a	0,	1 pg/ml de IFN-gama não marcado»
	4 ί upm ds
C2)		x xgado	aí	10	pg/ml de IFN-gama não marcado»
ί 3)	Ligação	pse .£ *f i C -5.		(1	) - C 2) »

A Figura 5 mostra os resultados de experiências sm que a ligaçães do receptor de inerferão-gama completo ens células U937 com interferão-gama é comparada com a ligação do receptor solúvel de interferão-gama deste invento» Neste ensaio de ligação de receptores o receptor solúvel do interferão-gama, produzido em E. coli, competiu numa forma dependente da dose na prevenção da

ligação do interferão-gama msroado com ‘^ivI aos seus receptores celulares» Nos processos dos testes de laboratório Ce»g», ensaios de detecção) usando esta inibição competitiva, o IFN-gama ou o seu receptor solúvel pode ser marcado com um marca que seja capaz de gerar um sinal, e.g», uma marca radioactiva ou uma marca química, especialmente uma marca fluorescente» Ainda, devido a esta inibição competitiva, o receptor solúvel do interferão gama do presente invento poderá ter utilização terapêutica no tratatais como artrite reumatóide» auco-imune* mento de doenças esc1erose mú1ti ρ1a, síndroma de Sjogren e lupus eritematoso» receptor solúvel do IFN-gama do invento pode ser administrado como uma composição farmacêutica» tais composições contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz do receptor solúvel do invento e um veículo farmacêutico ou excipiente» Um veículo farmacêutico pode ser qualquer substância não tóxica compatível adequada para libertação do receptor solúvel do interferão gama, do invento num doente» Num veículo pode-se incluir por exemplo ãgua estéril, álcool, gorduras, cêras e sólidos inertes ε podem Igualmente ser incorporados adjuvantes aceitáveis íe.g», agentes tamponantes, agentes dispersantes)« Geraimente, as composições úteis p-ara administração parental de tais drogas são bem conhecidas, e»g» ver Remington**» Pharmaceutical Sciences, 14â Ed» CMack Publishing Company, Easton, PA 198®)= Como alternativa, composições do invento podem ser introduzidas num doente através de um sistema de libertação de drogas implantável; e»g= ver Urquhart et al», Ann „ Rev» Pharmacol» Toxicol». vol» 24, pgs» 199-236 Cl 984),,

G receptor solúvel de IFN-gama do invento é normalmente administrado parenteralmente, de preferência intravenosamente» Se bem que o receptor solúvel do intsrferão-garaa não seja suposto ssr imunogénico, ele é- de preferência administrado lentamente.

através ds uma administração IV convencional ou. através de um depósito subcutâneo»

Quando administrado parenteralmsnte, o receptor solúvel do interferão gama será normalmente formulado com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável numa forma· de dosagem unitária adequada para injecção Ce»g», uma solução, suspensão ou emulsão)» Tais veículos são inerentemente não tóxicos e não terapêuticos» São exemplos de tais veículos soro fisiológico normal, solução de Ringer, solução de dsxtrose e solução de HankPodem também ser usados veículos não aquosos tais como óleos fixados e oleato de etilo» Um veículo preferido é 5% dextrose/soro fisiológico» 0 veículo poderá conter pequenas quantidades de aditivos como sejam substâncias que aumentam a isotonícidade e & estabilidade química, e»g», tampões e preservativos» 0 receptor de IFN-gama solúvel é de preferência formulado na forma purificada substancialmente livre de agragados, produtos de degradação e protexnas contaminantbí numa concentração en :erci de 5 cerca de 5€?© pg/ml, de preferência 20 a 250 pg/mL

A selecção de um regime de administração para o receptor solúvel de IFN-gama depende de vários factores, incluindo a velocidade de reciclagem no soro do receptor solúvel do IFN-gama, do nível de IFN-gama no soro associado qualquer possível imunogenicidade do rec vel, a acessibilidade do FN-gama alvo.

a doenças auto-imunes, eptor ds IFN-gama soiúa. afinidade do IFN-gama aoCs) seu(s) receptor(res) celularCes) relativamente à do

IFN-gama ao receptor solúvel de IFN-gama e similares»

A determinação da dosagem adequada de um composto do invento para uma situação particular pode ser realizada pelos familiarizados com a área» Seralments, o tratamento é iniciada cam dosagens inferiores ã dose óptima» A partir daí a dosagem é c->

aumentada em pequenas quantidades até o efeito óptimo nas circunstâncias ser atingido» Por conveniência» a dose diária total pode ser dividida e administrada em fracções ao longo do dia caso se pretenda»

A quantidade e frequência de administração do receptor de IFN-gama solúvel será regulado de acordo com a avaliação do médico assistente considerando factores tais como idade, estado e tamanho do doente assim como gravidade dos sintomas a serem tratados,

De acordo com o regime de administração, a quantidade de receptor solúvel de IFN-gama libertada num paciente é de preferência maximizada de forma consistente com um nível aceitável de efeitos secundários; e a quantidade libertada depende pois em parte da gravidade da doença a ser tratada.. De pref eréncia, a dose situa-se numa gama entre cerca de Θ,Ι s 500 pg/Kg por dia, mais preferencialmente cerca ds 1 a 5© pg/Kg por dia»

Um regime de dosagem típico recomendado é administração parenteral de Ipg/dia a 5 mg/dia, ds preferéncia 2© pg/dia a í mg/dia, em duas a quatro doses divididas para se conseguir alívio dos sintomas auto—imunes»

As descrições das realizações referidas do invento foram apresentadas com fins ilustrativos e descritivos» Elas não se destinam a ser exaustivas ou a limitar o inventa às formas precisas divulgadas e obviamente muitas modificações e variações são possíveis face aos ensinamentos dados atrás» As realizações foram escolhidas e descritas para explicar os príncipios do invento e a sua aplicação prática, de tal forma que que outros familiarizados com a matéria poderão assim usar e realizar adequadamente tais realizações e modificações do invento conforme φ

invento seja definido nelas idicaçSes que- lhe estão apensas.

Claims (7)

1. REIVINDICflçSES lã. — Processo para a. preparação de om receptor solúvel para o interferão gama (IFiM-gama), o qual consiste na fracção extracelular glicosilada ou não glicosilada do receptor celular transntenibranar natural humano do IFN-gama sem outras proteínas e as suas variações funcionalmente equivalentes?

   caracterizado por compreender os passos de;

   construção de um vector que compreende uma sequência de nucleotídeos codificadora do referido receptor solúvel, em que a sequência de nucleotídeos é capaz de ser expressa por um hospedeiro contendo o vector?

   incorporação do vector no hospedeiro? e manutenção do hospedeiro contendo o vector sob condições adequadas para a expressão da sequência, de nucleotídeos no receptor solúvel»
2. 2â» — Processo de acordo com a reivindicação í, caracterizado por se preparar um receptor solúvel, que tem a fórmula;

   (Ser (Y)_n Ser Ser Vai Pro Thr Pro Thr Asn Vai Thr Ile Glu 1 13 15 20 Ser Tyr Asn 25 Met Asn Pro Ile Vai Tyr 30 Trp Glu Tyr Gin Ile Met 35 Pro Gin Vai 40 Pro Vai Phe Thr Vai Glu 45 Vai Lys Asn Tyr Gly. Vai 50 Lys Asn Ser 55 Glu Trp Ile Asp Ala Cys 60 Ile Asn Ile Ser His His 65 Tyr Cys Asn 70 Ile Ser Asp His Vai Gly 75 Asp Pro Ser Asn Ser Leu 80 Trp Vai Arg 85 Vai Lys Àla Arg Vai Gly 90 Gin Lys Glu Ser Ala Tyr 95 Ala Lys Ser 100’ Glu Glu Phe Ala Vai Cys 105 Arg Asp Gly Lys Ile Gly 110 Pro Pro Lys 115 Leu Asp Ile Arg Lys Glu 120 Glu Lys Gin Ile Met Ile 125 Asp Ile Phe 130 His Pro Ser Vai Phe Vai 135 Asn Gly Asp Glu Gin Glu 140 Vai Asp Tyr 145 Asp Pro Glu Thr Thr Cys 150 Tyr Ile Arg Vai Tyr Asn 155 Vai Tyr Vai 160 Arg Met Asn Gly Ser Glu 165 Ile Gin Tyr Lys Ile Leu 170 Thr Gin Lys 175 Glu Asp Asp Cys Asp Glu 180 Ile Gin Cys Gin Leu Ala 185 Ile Pro Vai 190 Ser Ser Leu Asn Ser Gin 195 Tyr Cys Vai Ser Ala Glu 200 Gly Vai Leu His Vai Trp Gly Vai Thr Thr Glu Lys Ser Lys Glu

   205 210 215

   Vai Cys (Z)p

   220 do no extremo ums subsequência de um ou carbonilo da sequência mais aminoácidos começando no e

   Arg Ala Blu net θϊ 1 Tre

   Z é uma suhsequêncis de tremo amina da sequência

   Χίε Tre 11ε Fen Asn Ser

   Ala Asp Leu Sli Pro?

   um ou mais aminoácidos começanSer Ile Lis Sli?

   e «t, n e ρ são independentemente 0 ou 1«
3. 3ã» — Processo de acordo com a reivindicação 2., caracterizado por se preparar um receptor solúvel_? em que m e n são ambos lea subsequência em Y és

   Bli Tre Ala Asp Leu Bli Pro»
4. 4â„ - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar um receptor solúvel» em ques sTi₅ η ε ρ são todos 1 e as sequências representadas por Y e Z estão totalmente presentes? i.e., o receptor solúvel de IFN-gama tem a sequência de aminoácidos 1-231? ou

   m é 1 e n ê 1 e p έ 0 θ a sequência representada por Y está totalmente pr •esen te ? Í r-fô 3 o receptor solúvel de IFN-gama tem a sequênc ia de aminoác idos 1- -221 s ou

   C A_{ '1 ‘‘Gli? i.e o receptor solúvel de IFN-gama tem a sequência de amino-ácidos 6-221? ou m e 0 e n e p sa.o aiBuus (6),--.-, com bu a sequência representada por Y começa e a sequência representada por Z está totalmente presente? i.e., o receptor solúvel de IFN-gama tem a sequência de aminoácidos 6-231.

   Processo de acordo com a reivindicação caractsrizado por ss preparar um receptor solúvel, em que m é í e a sequência inclui um resíduo serina inicial.
5. 6s, - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar um receptor solúvel, em que m ê 1, n ê 1

   0, e a sequência representada por Y começa :om

   Gli?

   i.e», o receptor solúvel de IFN-gama tem a sequência de aminoácidos Ser-i-6-221.

   - Processo de acordo com a reivindicação

   u.

   caractsrizado por se preparar um receptor solúvel, em que m é 1 e n e /At p são ambos 1, a sequência representada por Y começa com 'Gli e a sequência representada por Z es-tâ totalmente presente? i.e», o receptor solúvel de IFN-gama tem a sequência de aminoácidos

   Ser+6-231»

   Ssi. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um receptor solúvel não glicosilado.
6. 9ã» - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade eficaz do receptor solúvel da reivindicação í e um veículo ou excipiente farmaceuticaroente aceitável.

   L0ã. - Processo cara a oreoaracão de comoosicão farraacêutica, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade eficaz do receptor solúvel da reivindicação 2 e uai veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável ,= iiã»

   Plasmídeo» caracterizado por ser o plasmídeo pjFR105-6»

   123. ·-- Método para inibição da ligação de IFN-gama a células tendo receptores para IFN-gama» caracterizado por compreender os passos deí administração de uma quantidade eficaz do receptor solúvel de IFN-gama da reivindicação 1 a. um meio contendo células tendo receptores para IFN-gama? e deixar que o referido receptor solúvel compita para os receptores celulares?

   sendo agama de dosagem de substância activa de ©,í pg até 500 pg por quilograma de peso corporal por dia» de preferãncia de cerca de 1 pg até 50 pg por quilograma de peso corporal por dia»
7. 13ã« - Método para inibição da ligação de IFN-gama a células tendo receptores para IFN-gama, caracterizado por compreender os passos des administração de uma quantidade eficaz do receptor solúvel de IFN-gama da reivindicação 2 a um meio contendo células tendo receptores para IFN-gama? e deixar que o referido receptor -solúvel compita para os receptores celularesg «V ’>? * ·^;

   -,- X · ? ί Π Λ

   ΤΤκ ^- ν) Ιι ·^Λ _χ·4*^,η sendo agasta de dosagem de substância activa de 0, í pg até por quilograma de peso corporal por dia, de preferência ch de 1 pg até 5® pg por quilograma de peso corporal por dia,

   50® pg cerca

   Lisboa, de Abril de 1WÍ

   J. PEREIRA DA CRUZ

   Agente Oficial da Propriedade Industriei RUA VICTOR CORDON, 10-A 3« 1200 LISBOA

   FOLHA 1 (6 FOLHAS)

   ATG GCT CTC CTC TTT CTC CTA CCC CTT GTC ATG CAG GGT GTG 42 riet Ala Leu Leu Phe Leu Leu Pro Leu Uai flet Gin Gly Uai -10 -5 AGC AGG GCT GAG ATG GGC ACC GCG GAT CTG GGG CCG TCC TCA GTG 87 Ser Arg Ala Glu flet Gly Thr Ala Asp Leu Gly Pro Ser Ser Uai 1 5 10 15 CCT ACA CCA ACT AAT GTT ACA ATT GAA TCC TAT AAC ATG AAC CCT 132 Pro Thr Pro Thr Asn Uai Thr Ile Glu Ser Tyr Asn tlet Asn Pro 20 25 30 ATC GTA TAT TGG GAG TAC CAG ATC ATG CCA CAG GTC CCT GTT TTT 177 lie Uai Tyr Trp Glu Tyr Gin Ile flet Pro Gin Uai Pro Uai Phe 35 40 45 ACC GTA GAG GTA AAG AAC TAT GGT GTT AAG AAT TCA GAA TGG ATT 222 Thr Uai Glu Uai Lys Asn Tyr Gly Uai Lys Asn Ser Glu Trp Ile 50 55 60 GAT GCC TGC ATC AAT ATT TCT CAT CAT TAT TGT AAT ATT TCT GAT 267 Asp Ala Cys Ile Asn Ile Ser Hie His Tyr Cys Rsn lie Ser Asp 65 70 75 CAT GTT GGT GAT CCA TCA AAT TCT CTT TGG GTC AGA GTT AAA GCC 312 His Uai Gly Asp Pro Ser Asn Ser Leu Trp Uai Arg Uai Lys Ala 80 85 90 AGG GTT GGA CAR AAA GAA TCT GCC TAT GCA RAG TCA GAA GAA TTT 357 Arg Uai Gly Gin Lys Glu Ser Ala Tyr Ala Lys Ser Glu G1 u Phe 95 100 105 GCT GTA TGC CGR GAT GGA AAA ATT GGA CCA CCT AAA CTG GRT ATC 402 Aio Uai Cys Arg Asp Gly Lys Ile Gly Pro Pro Lys Leu Asp Ile

   110 115 120

   FIGURu 1 (parte r)

   FOLHA 2 (6 FOLHAS)

   RGR RRG GRG GRG RRG Cflfl RTC RTG ATT GRC RTR TTT CRC CCT TCR 447 Rrg Lys Glu Glu Lys Gin Ile tlet Ile Rsp Ile Phe His Pro Ser 125 130 135 GTT TTT GTR RflT GGfl GRC GRG CRG GRR GTC GRT TRT GRT CCC GRR 492 Uai Phe Uai Rsn Gly Rsp Glu Gin Glu Uai Rsp Tyr Rsp Pro Glu HO 145 150 RCT RCC TGT TRC ATT RGG GTG TRC RflT GTG TRT GTG RGR RTG RRC 537 Thr Thr Cys Tyr 11e flrg Uai Tyr flsn Uai Tyr Uai Rrg Het Rsn 155 160 165 GGfl RGT GRG RTC CRG TRT flflfl RTR CTC RCG CRG RRG GRR GRT GRT 582 Gly Ser Glu Ile Gin Tyr Lys Ile Leu Thr Gin Lys Glu Rsp Rsp 170 175 180 TGT GRC GRG ATT CRG TGC CRG TTR GCG ATT CCR GTR TCC TCR CTG 627 Cys Rsp G1 u Ile Gin Cys Gin Leu Ria Ile Pro Uai Ser Ser Leu 185 190 195 RflT TCT CRG TRC TGT GTT TCR GCR GRR GGR GTC TTR CRT GTG TGG 672 flsn Ser G1 n Tyr Cys Uai Ser Ria Glu Gly Uai Leu His Uai Trp 200 205 210 GGT GTT RCR RCT Gflfl RRG TCR RRR GRR GTT TGT ATT RCC ATT TTC 717 Gly Uai Thr Thr Glu Lys Ser Lys Glu Uai Cys Ile Thr Ile Phe 215 220 225 RflT RGC RGT RTR flflfl GGT. 735 flsn Ser Ser 11e Lys Gly.

   FIGUR a / (PfiRTz B)

   230