CN111363000B

CN111363000B - 一种从七叶皂苷钠中分离制备两种微量成分的方法

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Publication number: CN111363000B
Application number: CN202010283300.0A
Authority: CN
Inventors: 石召华; 关小羽; 叶利春; 彭娟; 张洋; 刘享平
Original assignee: Hubei Lishizhen Pharmaceutical Research Co ltd; Wuhan Aimin Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Hubei Lishizhen Pharmaceutical Research Co ltd; Wuhan Aimin Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-04-13
Filing date: 2020-04-13
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2040-04-13
Also published as: CN111363000A

Abstract

本发明公开了一种从七叶皂苷钠中分离制备两种微量成分的方法，所述的两种微量成分是Aesculioside D及Aesculioside C，该方法包括以下两个步骤：1)将七叶皂苷钠原料药上大孔树脂柱，用乙醇进行洗脱，收集洗脱液并浓缩、干燥，得到含有两种目标成分的粗品；2)将粗品连续进行两次制备液相色谱分离，分别收集含有Aesculioside D、Aesculioside C的目标流分并进行浓缩、干燥。采用上述方法有效地得到了七叶皂苷钠原料药中两种高纯度的成分单体。

Description

一种从七叶皂苷钠中分离制备两种微量成分的方法

技术领域

本发明涉及一种从七叶皂苷钠原料药中提取分离两种微量成分的方法。

背景技术

七叶皂苷钠是一种天然药物，是从七叶树科七叶树属植物的种子娑罗子中提取得到的总皂苷钠盐，临床上具有抗脑水肿，抗炎作用，主要用于治疗慢性静脉功能不全。七叶皂苷钠依据液相色谱分析出峰先后(见附图1)，将其主要活性成分依次命名为七叶皂苷A、B、C、D，但七叶皂苷钠中也包含很多其它微量成分。

在天然植物药现代化的热潮下，基于成分的复杂多样性，这些除七叶皂苷A、B、C、D以外的其它成分在天然药物的二次开发中显得尤为重要，其中不乏具有显著生物活性的很多新物质。另外，阐述七叶皂苷钠的效应物质基础，提升药物质量标准也是天然植物药走向国际化认证的重要前提，这也就要求对七叶皂苷钠中的成分单体进行有效的制备分离，得到大量的单体成分，为后续质量和药理毒理研究提供物质基础。

目前，根据中国药典中提供的检测七叶皂苷钠的HPLC色谱方法，只是在分析柱上定量定性分析原料药，进样量非常小，无法放大到制备柱上进行单体制备，另外由于这些微量成分在七叶皂苷钠中的含量非常低，很难有效地获得高纯度的产物，或者以非常高的成本获得少量的产物，无法满足中试放大生产的需要。因此大多文献如CN102020691，CN102532242报导的都是制备七叶皂苷A、B、C、D单体的方法，对于制备七叶皂苷钠中含量很少的微量成分目前还没有有效的制备方法，尤其是针对其中常规HPLC分析检测下分离度较差的成分，更具有难度。

发明内容

本发明的目的是提供一种从七叶皂苷钠中分离制备两种微量成分的方法。

一种从七叶皂苷钠中分离制备两种微量成分的方法，所述的两种微量成分是Aesculioside D及Aesculioside C，均为皂苷类成分，二者互为异构体，化学结构式如下：

该方法包括以下步骤：

1)粗品制备：将七叶皂苷钠原料药上大孔树脂柱，用乙醇进行洗脱，收集洗脱液并浓缩、干燥，得到含有两种目标成分的粗品；

2)一次制备液相色谱分离：将所得粗品溶解后微孔滤膜过滤，然后上制备液相色谱进行分离，所述制备液相色谱的色谱柱为反相色谱柱，填料为C18，填料粒径为10-15μm，流动相为乙腈和0.5-2‰甲酸体系，设置梯度洗脱，流速150-300mL/min，检测波长200-230nm，分段接收不同保留时间的成分峰流分，并旋干送检进行高效液相分析，保留与原料药液相色谱分析定位图中目标成分出峰时间一致的两组流分，从而得到Aesculioside D、Aesculioside C的两组富集样品；

3)二次制备液相色谱分离：分别将两组富集样品溶解后微孔滤膜过滤，然后再次上制备液相色谱进行分离，所述制备液相色谱的色谱柱为反相色谱柱，填料为C18，填料粒径为3-8μm，流动相为乙腈和0.5-2‰甲酸体系，设置等度洗脱，流速5-15mL/min，检测波长200-230nm，分段接收不同保留时间的成分峰流分，并旋干送检进行高效液相分析，保留与原料药液相色谱分析定位图中目标成分出峰时间一致的两组流分，从而得到AesculiosideD、Aesculioside C的两组纯品。

优选地，所述大孔树脂是D101、AB-8或HPD系列弱极性树脂。

优选地，所述乙醇洗脱，包括先用40-60％乙醇洗脱，再用70-90％乙醇洗脱两个步骤，收集70-90％乙醇洗脱液。

优选地，所述流动相中的甲酸为1‰甲酸。

优选地，所述梯度洗脱的时间为200min，所述乙腈占流动相的体积比由40％→46％。

优选地，所述等度洗脱的流动相比例为40-45:60-55。

本发明中所涉及的甲酸、乙醇、甲醇浓度均为体积浓度，溶剂均为水，如85％乙醇指的是每100ml乙醇水溶液中含有乙醇85ml。

本发明的有益效果是：

1)采用上述分离方法，有效地从七叶皂苷钠原料药中分离制备得到了除A、B、C、D以外的另两种微量成分，这两种成分均为皂苷类成分且互为异构体，在之前的工作中很少有对这两种成分的药理和毒理进行研究和报道，该成分的制备为七叶皂苷钠的二次开发、效应物质基础研究、质量标准提升以及国际化认证奠定了物质基础。

2)本发明首次采用半制备的方法从七叶皂苷钠原料药中获得以上两种成分，通过对半制备的工艺条件和参数进行摸索和优化，使制得的产物达到95％以上的高纯度，产物收率可达1.5％左右，具有较高的应用前景。

附图说明

图1是七叶皂苷钠原料药的液相色谱分析定位图。

图2是实施例1中一次反向制备的分离色谱图。

图3是实施例1中二次反向制备Aesculioside D的分离色谱图。

图4是实施例1中二次反向制备Aesculioside C的分离色谱图。

图5是Aesculioside D和Aesculioside C的HMBC相关谱图。

图6是一次制备中采用等度洗脱方式得到的反向制备分离色谱图。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但不因此限制本发明。以下实施例所使用的七叶皂苷钠原料药由武汉爱民制药股份有限公司自行生产，纯度为99.7％。

实施例1

1.树脂纯化

取D101大孔树脂1L，湿法装柱，称取七叶皂苷钠粉末5g，用10％乙醇超声溶解，将溶液上柱后先用55％乙醇洗脱5L弃去，再用85％乙醇洗脱3L，收集85％乙醇洗脱液，减压浓缩至干，得到655mg粗品。

2.一次制备

取步骤1中的粗品655mg，用65％甲醇50ml溶解，0.45μm微孔滤膜过滤后进行一次制备。采用制备液相色谱系统，柱型号DAC150，填料ODS-A-HG，粒径10μm，孔径20nm，流动相为乙腈-1‰甲酸体系，检测波长200nm，设置梯度洗脱方式：0-200min，乙腈占流动相比例40％→46％(体积)；洗脱流速为250mL/min，上样量为50mL。

分段接收不同保留时间的成分峰流分，并旋干送检进行高效液相分析，保留与原料药液相色谱分析定位图(图1)中目标成分出峰时间一致的两组流分，这两组流分在一次制备分离色谱图(图2)中的出峰时间段分别为97-103min(化合物1：AesculiosideD)和111-120min(化合物2：Aesculioside C)。

将出峰时间段分别为97-103min和111-120min的两组流分分别减压浓缩并干燥，从而得到Aesculioside D、Aesculioside C的两组富集样品，分别为140mg和120mg，将两组富集样品粉末分别进行高效液相分析检测纯度，分析结果采用峰面积归一化法处理，纯度分别为71％和63％。

3.二次制备

3.1将得到的两组富集样品分别再次用65％甲醇超声至完全溶解，浓度10mg/mL，经过0.45μm微孔滤膜过滤，分别得到Aesculioside D、Aesculioside C一次制备样品溶液，待进样进行二次制备。

3.2取上述Aesculioside D溶液上样，色谱柱填料为C18，粒径5μm，孔径12nm，流动相为乙腈/1‰甲酸(42：58，v/v)，检测波长为210nm，洗脱流速为10mL/min，洗脱时间72min，进样量0.5mL，连续套针进样。

分段接收不同保留时间的成分峰流分，并旋干送检进行高效液相分析，保留与原料药液相色谱分析定位图(图1)中目标成分出峰时间一致的流分，该组流分在二次制备分离色谱图(图3)中的出峰时间段为56-63min。

3.3取上述Aesculioside C溶液上样，色谱柱填料为C18，粒径5μm，孔径12nm，流动相为乙腈/1‰甲酸(41：59，v/v)，检测波长为210nm，洗脱流速为7mL/min，洗脱时间145min，进样量0.5mL，连续套针进样。

分段接收不同保留时间的成分峰流分，并旋干送检进行高效液相分析，保留与原料药液相色谱分析定位图(图1)中目标成分出峰时间一致的流分，该组流分在二次制备分离色谱图(图4)中的出峰时间段为133-139min。

3.4将上述制备得到的两组流分分别减压浓缩并干燥，最终分别得到82mg的Aesculioside D，和69mg的Aesculioside C，产率分别为1.64％和1.38％。将最终产物进行高效液相分析检测纯度，分析结果采用峰面积归一化法处理，得到Aesculioside D纯度96.7％，Aesculioside C纯度98.2％。

其中，原料药、洗脱流分、产物的高效液相分析检测条件如下：色谱柱：C18柱，5μm，4.6×250mm；检测波长200nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样体积：20μL；流动相体系为乙腈-1‰甲酸；洗脱梯度程序为：

时间min	A相％(乙腈)	B相％(1‰甲酸)
			0	25	75
20	33	67
			32	33	67
33	34	66
			150	60	40
160	25	75
			170	25	75

实施例2化合物结构确证

化合物1：白色粉末，分子式通过质谱：ESI-MS(neg.)：1169[M-H]^-,HRESI-MS(neg.):1169.5747(C₅₈H₈₉O₂₄,calcd.1169.5749)，确定为C₅₈H₉₀O₂₄。化合物1的苷元部分和糖链部分¹H、¹³C-NMR(见表1和表2)数据与文献(Z.Z.Zhang Chem Pharm Bull，1999，47(11)，1515-1520)报道的aesculioside D的波谱数据几乎一致，说明二者具有相同的母核，糖链和取代基，由于C-21和C-22位的取代基当归酰基(angeloyl)和巴豆酰基(tigeloyl)不易确定其确切连接位置，故通过分析二维核磁图谱(HSQC/HMBC)对其进行准确确定化合物的结构。

(1)C-21和C-22位取代基的确定

通过仔细分析化合物1的¹H、¹³C-NMR并结合HMBC和HSQC谱，可以确定含有一组巴豆酰基(tigloyl)信号[δ_H:7.07(1H,q,J＝7.1Hz),1.62(3H,d,J＝7.1Hz),1.93(3H s)；δ_C:167.9,129.5,136.8,14.2,12.4]和有一组当归酰基(angeloyl)信号[δ_H:5.84(1H,q,J＝7.1Hz),2.00(3H d,J＝7.1Hz),1.87(3H s)；δ_C:168.3,129.2,136.6,15.7,20.8]。通过仔细分析HMBC相关信号发现：H-21[δ_H 6.67(1H,d,J＝10.1Hz)]与巴豆酰基(tigloyl)的酯羰基信号C-1″″(δ_C 167.9)有强相关，可以确定巴豆酰基(tigloyl)连接在C-21位上；H-22[δ_H6.37(1H,d,J＝10.1Hz)]与当归酰基(angeloyl)的酯羰基信号C-1″″′(δ_C 168.3)有强相关，可以确定当归酰基(angeloyl)连接在C-22位。详细的HMBC相关信号见图5。

(2)糖连接位置和连接顺序的确定：

¹H、¹³C-NMR谱显示有三个糖端基信号，δ_H 4.89(1H,d,J＝7.7Hz,GlcA-1′)/δ_C104.6,δ_H 5.62(1H,d,J＝7.7Hz,Glc-1″)/δ_C 104.3,和δ_H 5.21(1H,d,J＝7.8Hz,Glc-1″′)/δ_C 104.8,表明糖链部分为三糖苷，且根据耦合常数可以推测均为β型糖。¹³C-NMR谱中处的一个羧碳基信号(δ_C 172.5)表明存在一个葡萄糖醛酸。该糖醛酸对应的端基氢δ_H 4.89(1H,d,J＝7.7Hz)与苷元母核C-3(δ_C 91.1)存在HMBC相关，表明为葡萄糖醛酸与母核3位形成糖苷键。在HMBC谱中另外2个糖端基氢δ_H 5.62(1H,d,J＝7.7Hz,Glc-1″),5.21(1H,d,J＝7.8Hz,Glc-1″′)分别与GlcA的C-2′(δ_C 79.7)和C-4′(δ_C 82.2)存在相关，故糖连接顺序与aesculioside D相同，确定为3-O-[β-D-葡萄糖基(1→2)-[β-D-葡萄糖基(1→4)]-β-D-葡萄糖醛酸基。

综上，通过对化合物1的¹H、¹³C-NMR谱数据与文献进行比对，并结合2D-NMR谱的解析，该化合物鉴定为21β-O-巴豆酰基-22α-O-当归酰基原七叶皂苷元-3β-O-[β-D-葡萄糖基(1→2)-[β-D-葡萄糖基(1→4)]-β-D-葡萄糖醛酸苷，即aesculioside D。

化合物2：白色粉末，分子式通过质谱：ESI-MS(neg.)：1169[M-H]^-,HRESI-MS(neg.):1169.5745(C₅₈H₈₉O₂₄,calcd.1169.5749)确定为C₅₈H₉₀O₂₄。通过与Aesculioside D的核磁信号进行比较，发现具有相同的母核和糖链。该化合物含有两组巴豆酰基(tigloyl)信号：[δ_H:7.04(1H,q,J＝7.0Hz),1.59(3H,d,J＝7.2Hz),1.90(3H,s)；δ_C:168.1,129.5,136.7,14.2,12.4]和[δ_H:6.93(1H,q,J＝7.0Hz),1.42(3H,d,J＝7.0Hz),1.80(3H,s)；δ_C:168.5,129.2,137.0,14.1,12.3]。通过分析化合物2的HMBC相关信号发现：H-21[δ_H 6.74(1H,d,J＝10.1Hz)]和其中一个酯羰基C-1″″(δ_C 168.1)有强相关，H-22[δ_H 6.32(1H,d,J＝10.1Hz)]和另一个酯羰基C-1″″′(δ_C 168.5)有强相关，证实两个巴豆酰基(tigloyl)分别连在C-21和C-22位。通过对化合物2的糖链信号全归属，发现其糖链信号与AesculiosideD的信号完全一致，也为3-O-[β-D-葡萄糖基(1→2)-[β-D-葡萄糖基(1→4)]-β-D-葡萄糖醛酸基。通过与文献比对，可以确定该化合物为aesculioside C。

表1化合物1和2的¹H光谱数据

表2化合物1和2的¹³C光谱数据

实施例3不同制备条件的比较

1.一次制备不同洗脱程序的比较

取步骤1大孔树脂处理好的样品310mg，用65％甲醇50ml溶解，采用制备色谱系统，柱型号DAC150，填料ODS-A-HG，粒径10μm，流动相为乙腈-1‰甲酸体系，检测波长200nm，设置等度洗脱方式：乙腈：1‰甲酸＝50：50，收集72～83min、83～98min流分，干燥得到212mg。经液相色谱检测，两段流分未能实现aesculioside C，aesculioside D分离，其制备分离色谱图见图6。

2、二次制备不同流动相比例的比较

取一次富集Aesculioside D样品50mg，纯度为70％，用60％甲醇配制成10mg/ml溶液，进行二次制备纯化，检测波长为210nm，色谱柱为C18填料，粒径5μm，20*250mm，流动相比例为乙腈：1‰甲酸＝50：50，洗脱流速为10mL/min，进样量0.5mL。收集56～58min流分。浓缩送检，纯度为84％。

取一次制备Aesculioside C样品50mg，纯度为62％，用60％甲醇配制成10mg/ml溶液，进行二次制备纯化，检测波长为210nm，色谱柱为C18填料，粒径5μm，20*250mm，流动相比例为乙腈：1‰甲酸＝50：50，洗脱流速为7.0mL/min，进样量0.5mL。收集82-86min流分。浓缩送检，纯度为81％。

Claims

1.一种从七叶皂苷钠中分离制备两种微量成分的方法，其特征在于，所述的两种微量成分是Aesculioside D及Aesculioside C，结构式如下：

该方法包括以下步骤：

1)粗品制备：将七叶皂苷钠原料药上D101大孔树脂柱，先用40-60％乙醇洗脱，再用70-90％乙醇洗脱，收集70-90％乙醇洗脱液并浓缩、干燥，得到含有两种目标成分的粗品；

2)一次制备液相色谱分离：将所得粗品溶解后微孔滤膜过滤，然后上制备液相色谱进行分离，所述制备液相色谱的色谱柱为反相色谱柱，填料为C18，填料粒径为10-15μm，流动相为乙腈和1‰甲酸体系，设置梯度洗脱，流速150-300mL/min，梯度洗脱的时间为200min，乙腈占流动相的体积比由40％→46％，检测波长200-230nm，分段接收不同保留时间的成分峰流分，并旋干送检进行高效液相分析，保留与原料药液相色谱分析定位图中目标成分出峰时间一致的两组流分，从而得到Aesculioside D、Aesculioside C的两组富集样品；

3)二次制备液相色谱分离：分别将两组富集样品溶解后微孔滤膜过滤，然后再次上制备液相色谱进行分离，所述制备液相色谱的色谱柱为反相色谱柱，填料为C18，填料粒径为3-8μm，流动相为乙腈和1‰甲酸体系，流动相比例为40-45:60-55，设置等度洗脱，流速5-15mL/min，检测波长200-230nm，分段接收不同保留时间的成分峰流分，并旋干送检进行高效液相分析，保留与原料药液相色谱分析定位图中目标成分出峰时间一致的两组流分，从而得到Aesculioside D、Aesculioside C的两组纯品。