CN108358945B

CN108358945B - 一种从迷迭香提取物中同时制备高纯度鼠尾草酚和鼠尾草酸的方法

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Publication number: CN108358945B
Application number: CN201810092815.5A
Authority: CN
Inventors: 李金杰; 尚小雅; 冀麟麟; 栾娜; 王欣; 郭俊霞
Original assignee: Beijing Union University
Current assignee: Beijing Union University
Priority date: 2018-01-30
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2021-01-22
Anticipated expiration: 2038-01-30
Also published as: CN111440184B; CN108358945A; CN111440184A

Abstract

一种从迷迭香提取物同时制备高纯度鼠尾草酚和鼠尾草酸的方法。将迷迭香提取物用水饱和的醋酸乙酯进行溶解；溶解液正相硅胶拌样，干法上柱，用氯仿∶甲醇∶乙酸＝(100～95)∶(0～5)∶(0～1‰)进行梯度洗脱，合并相同组分，减压浓缩得到纯度85％左右的鼠尾草酚和90％左右的鼠尾草酸粗品；再分别进行Sephadex LH‑20凝胶柱色谱纯化，流动相用氯仿‑甲醇或石油醚‑氯仿‑甲醇进行洗脱，合并相同组分，减压蒸干得到纯度在98％以上的鼠尾草酚和鼠尾草酸。该方法能够从迷迭香提取物中同时获得含量≥98％的高纯度鼠尾草酚和鼠尾草酸。凝胶柱可以反复使用，每次柱层析时间短，效率高。该方法简单、容易操作、收率高，适合规模化生产。

Description

一种从迷迭香提取物中同时制备高纯度鼠尾草酚和鼠尾草酸的方法

技术领域

本发明涉及一种从迷迭香提取物同时制备高纯度的天然抗氧化活性成分鼠尾草酚和鼠尾草酸的方法，具体涉及一种对分离大量鼠尾草酚和鼠尾草酸具有显著分离效果的Sephadex LH-20凝胶柱色谱的分离方法。

背景技术

迷迭香是一种天然的抗氧化剂，而鼠尾草酚和鼠尾草酸是其主要的抗氧化成分，随着功能食品行业的快速发展，对食用抗氧化产品的需求量越来越大；而随着迷迭香成功引种到我国及大面积的栽培，找到即简单易行又廉价的从迷迭香或其提取物制备高纯度抗氧化活性单体的方法，将具有很好的使用价值和现实意义。

有多篇专利报道了迷迭香中抗氧化活性物质的提取方法：CN 1698587A报道了迷迭香总酚类物质的提取方法，其中主要成分鼠尾草酚和鼠尾草酸的含量之和在13％以上；CN 101402864A发明制得的产品，其中主要抗氧化活性成分鼠尾草酚和鼠尾草酸的含量大于50wt％；CN 105669432 A得到的迷迭香提取物中鼠尾草酚和鼠尾草酸的含量在40-45％。但截止目前，有多篇专利报道了只从迷迭香中分离纯化得到高纯度鼠尾草酸的方法：CN102115442 A利用制备磷酸-硅胶柱层析，得到纯度为92％的鼠尾草酸；CN 104058955 A运用硅胶柱层析的方法，可获得纯度在98％以上鼠尾草酸；CN 101851158 A用中压色谱分离纯化，再用有机溶剂重结晶得到98％纯度的鼠尾草酸；CN 101113133 A迷迭香用EDTA二钠盐的弱碱水溶液进行提取，滤液用酸调pH并用有机溶剂调极性，得沉淀，干燥即得纯度为99.42％的鼠尾草酸。也有只从迷迭香中分离纯化得到鼠尾草酚的方法：CN 103319495 A利用大孔吸附树脂纯化得到鼠尾草酚粗品，再用亲水性有机溶剂结晶得到纯度95％的鼠尾草酚；CN 102171217 A将迷迭香提取液与加按一定比例的乙酸形成结晶，可得到的纯度85.6％的鼠尾草酚；专利CN 101835782 A和专利CN 101835783 A报道，利用催化由鼠尾草酸生产鼠尾草酚的方法，得到纯度90％以上的鼠尾草酚。鼠尾草酚和鼠尾草酸是迷迭香中的主要抗氧化成分，两者成分在迷迭香中的含量大约是1∶1.5～1∶5之间(例①刘永录等.不同采收期迷迭香中的鼠尾草酸和鼠尾草酚含量的动态变化.河南农业科学，2010，10：88-96；例②毕良武等.迷迭香抗氧化剂和精油综合提取技术研究(I)——两步提取法.林产化学与工业，2007，27(4)：11-15；例③毕良武等.迷迭香抗氧化剂和精油综合提取技术研究(III)——超临界CO₂萃取法[J].林产化学与工业，2007，27(6)：8-12)。现有技术中，只有用迷迭香或其提取物制备单一高纯度鼠尾草酸的方法，或单一鼠尾草酚的方法，没有同时得到两种高纯度成分的制备方法，这样，在制备一种成分的同时，就造成了另一种成分的浪费和损失，在工业化大生产时造成了很大的资源浪费。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种从迷迭香提取物中同时制备高纯度鼠尾草酚和鼠尾草酸的方法，该方法简单、容易操作、收率高，适合规模化生产。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种从迷迭香提取物中同时制备高纯度鼠尾草酚和鼠尾草酸的方法，该方法包括以下步骤：

I.将迷迭香提取物用水饱和的醋酸乙酯溶解，正相硅胶拌样得到上柱样品，干法装柱、干法上样，用氯仿∶甲醇∶乙酸＝(100～95)∶(0～5)∶(0～1‰)(体积比)进行梯度洗脱，合并相同组分，获得5个组分，分别为：小极性杂质部分、鼠尾草酚粗品、鼠尾草酸粗品、主要成分为熊果酸的组分和大极性杂质部分；

II.用羟丙基葡聚糖凝胶分别对步骤I获得的鼠尾草酚粗品和鼠尾草酸粗品进行纯化，流动相用氯仿∶甲醇＝(2～2.5)∶1(体积比)或石油醚∶氯仿∶甲醇＝(2～5)∶(2～5)∶1(体积比)进行等度洗脱，合并相同组分，减压蒸干各组分，分别得到含量≥98％的鼠尾草酚和含量≥98％的鼠尾草酸两个产品。

如上所述的方法，优选地，所述迷迭香提取物为迷迭香花或叶的乙醇水溶液浸提物。

如上所述的方法，优选地，所述迷迭香提取物的提取方法为：将迷迭香花或叶粉碎，用体积百分浓度为(50～70)％乙醇水溶液按照液料比为(10～15)∶1(L/Kg)进行超声提取，时间为60～90分钟，连续提取2～4次，合并提取液，减压浓缩蒸干后得到迷迭香提取物。

如上所述的方法，优选地，所述步骤I中梯度洗脱分五次进行，流动相依次为：氯仿；氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100∶0∶1‰；氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100∶1∶1‰；氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100∶2∶1‰；氯仿、甲醇、乙酸，体积比为95∶5∶1‰。

如上所述的方法，优选地，所述步骤II中羟丙基葡聚糖凝胶柱的长度为120～150cm；湿法装柱，湿法上样；流动相在羟丙基葡聚糖凝胶中的流速为2～6ml/min。

如上所述的方法，优选地，所述步骤II中氯仿∶甲醇＝2.5∶1(体积比)，或者石油醚∶氯仿∶甲醇＝5∶5∶1(体积比)。

本发明的有益效果在于：本发明的方法只用一次正相硅胶吸附柱，既除去了样品中吸附性的色素杂质，又避免了正相硅胶多次重复上样导致死吸附而造成样品的损失。鼠尾草酚和鼠尾草酸在Sephadex LH-20凝胶柱色谱上有显著的分离效果，一次就可以将二者完全分离开；Sephadex LH-20凝胶对被分离样品没有吸附，可以反复多次使用。利用Sephadex LH-20凝胶柱色谱，首次同时分离得到≥98％高含量的鼠尾草酚和鼠尾草酸两种成分。本方法操作简单易行，适合用迷迭香提取物同时规模化生产含量≥98％的鼠尾草酚和鼠尾草酸两个产品。以迷迭香叶提取物为原料，≥98％的鼠尾草酚的收率达到83％，≥98％的鼠尾草酸的收率达到88％。

附图说明

图1为高纯度鼠尾草酚HPLC检测图；

图2为高纯度鼠尾草酸HPLC检测图；

图3为鼠尾草酚¹H-NMR图；

图4为鼠尾草酚¹³C-NMR图；

图5为鼠尾草酸¹H-NMR图；

图6为鼠尾草酸¹³C-NMR图。

具体实施方式

实施例1制备迷迭香提取物

将干燥的迷迭香叶10Kg粉碎过20目筛，溶剂用体积百分浓度为60％的乙醇水溶液，液料比为12∶1(L/Kg)进行超声提取，超声时间75min。连续提取三次，合并提取液，减压浓缩蒸干后得到迷迭香提取物，其中鼠尾草酚含量为10.28wt％，鼠尾草酸含量为17.47wt％。

实施例2从迷迭香提取物中同时制备高纯度鼠尾草酚和鼠尾草酸

(一)正相硅胶柱分离纯化

将实施例1制备的迷迭香提取物500g加入5000ml用水饱和的醋酸乙酯中，超声溶解0.5小时，过滤，除去不溶物。滤液用500g正相硅胶(160-200目)拌样，3000g正相硅胶(160-200目)干法上柱，用常压正相硅胶柱色谱纯化。进行梯度洗脱，按照洗脱顺序，各流动相和提取物如下：

(1)流动相为氯仿，洗脱体积为5L，洗脱成分主要为小极性杂质部分；

(2)流动相为氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100∶0∶1‰，洗脱体积为10L，主要成分为含量在85％左右的鼠尾草酚；

(3)流动相为氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100∶1∶1‰，洗脱体积为15L，主要成分为含量在90％的鼠尾草酸；

(4)流动相为氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100∶2∶1‰，洗脱体积为10L，主要成分为熊果酸；

(5)流动相为氯仿、甲醇、乙酸，体积比为95∶5∶1‰，洗脱体积为5L，主要成分为大极性杂质部分。

合并相同组分，减压回收溶剂，可以得到含量≥98％的鼠尾草酚1.2g和鼠尾草酸1.9g，将含量85％左右的鼠尾草酚组分和含量90％左右的鼠尾草酸组分用于下一步凝胶柱分离。

(二)凝胶柱分离纯化

将步骤(一)获得的含85wt％左右的鼠尾草酚组分，反复用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20凝胶)进行纯化。凝胶柱的长度为150cm，湿法装柱，湿法上样。流动相用氯仿∶甲醇＝2.5∶1(体积比)进行洗脱，流动相的流速为5ml/min，层析时间为490min。合并相同组分，减压蒸干，得到≥98％高含量的鼠尾草酚41.5g。

采用上述方法，将步骤(一)获得的含90wt％左右的鼠尾草酸组分反复用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20凝胶)进行纯化，得到含量≥98％的鼠尾草酸74.75g。

(三)HPLC检测

分别对步骤(二)获得的鼠尾草酚和鼠尾草酸进行HPLC检测，结果见附图1和图2。

液相色谱仪：Waters 2545型2998检测器

色谱柱：Waters XBridge TM Shield RP 18Column(4.6*250mm，5μm)

流速：1mL/min

检测波长：284nm

进样量：10μl

供试品及对照品配制溶液：色谱级甲醇溶解

检测鼠尾草酚的流动相：甲醇∶水∶冰乙酸＝70∶30∶3‰

鼠尾草酚出峰时间：13.76min

检测鼠尾草酸的流动相：甲醇∶水∶冰乙酸＝78∶22∶3‰

鼠尾草酸出峰时间：14.82min。

(四)核磁共振一维谱的测定

用INOVA-500核磁共振仪(美国Varian公司)分别对步骤(二)获得的含量≥98％的鼠尾草酚和鼠尾草酸样品进行检测，得到一维核磁氢谱和碳谱数据，结果参见附图3-6。

1.鼠尾草酚的波谱数据

¹H-NMR(DMSO，500MHz)δ：0.78(3H，s，H-18)，0.81(3H，s，H-19)，1.12(3H，d，J＝7.0Hz，H-16)，1.23(3H，d，J＝7.0Hz，H-17)，3.22(1H，m，H-15)，5.46(1H，s，H-7)，6.70(1H，s，H-14)；

¹³C-NMR(DMSO，100MHz)δ：28.81(C-1)，18.57(C-2)，40.55(C-3)，34.18(C-4)，47.87(C-5)，29.26(C-6)，76.95(C-7)，134.25(C-8)，131.57(C-9)，44.95(C-10)，143.30(C-11)，143.07(C-12)，121.87(C-13)，111.28(C-14)，26.20(C-15)，22.82(C-16)，22.69(C-17)，31.38(C一18)，19.44(C-19)，175.54(C-20)。

2.鼠尾草酸的波谱数据

¹H-NMR(DMSO，500MHz)δ：0.84(3H，s，H-18)，0.92(3H，s，H-19)，1.09(3H，d，J＝7.0Hz，H-16)，1.12(3H，d，J＝7.0Hz，H-17)，6.34(1H，s，H-14)；

¹³C-NMR(DMSO，100MHz)δ：31.68(C-1)，18.27(C-2)，40.93(C-3)，33.86(C-4)，53.51(C-5)，32.62(C-6)，20.11(C-7)，134.39(C-8)，129.10(C-9)，47.05(C-10)，145.20(C-11)，139.02(C-12)，126.82(C-13)，116.32(C-14)，26.05(C-15)，23.01(C-16)，22.73(C-17)，33.67(C-18)，19.76(C-19)，176.99(C-20)。

与已知文献进行比对，最终确证了鼠尾草酚和鼠尾草酸的结构。

实施例3从迷迭香提取物中同时制备高纯度鼠尾草酚和鼠尾草酸

(一)正相硅胶柱分离纯化

采用与实施例2步骤(一)相同的方法获得含量85％左右的鼠尾草酚组分和含量90％左右的鼠尾草酸。

(二)凝胶柱分离纯化

将步骤(一)获得的含85wt％左右的鼠尾草酚组分，反复用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20凝胶)进行纯化。凝胶柱的长度为120cm，湿法装柱，湿法上样。流动相用氯仿∶甲醇＝2∶1(体积比)进行洗脱，流动相的流速为3ml/min，层析时间为500min。合并相同组分，减压蒸干，得到≥98％高含量的鼠尾草酚40.8g。

采用上述方法，将步骤(一)获得的含90wt％左右的鼠尾草酸组分反复用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20凝胶)进行纯化，得到含量≥98％的鼠尾草酸73.75g。

(三)HPLC检测

分别对步骤(二)获得的鼠尾草酚和鼠尾草酸进行HPLC检测，检测条件同实施例2中步骤(三)，结果鼠尾草酚和鼠尾草酸出峰时间与实施例2相近似。

实施例4从迷迭香提取物中同时制备高纯度鼠尾草酚和鼠尾草酸

(一)正相硅胶柱分离纯化

(二)凝胶柱分离纯化

将步骤(一)获得的含85wt％左右的鼠尾草酚组分，反复用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20凝胶)进行纯化。凝胶柱的长度为150cm，湿法装柱，湿法上样。流动相用石油醚∶氯仿∶甲醇＝5∶5∶1(体积比)进行洗脱，流动相的流速为6ml/min，层析时间为490min。合并相同组分，减压蒸干，得到≥98％高含量的鼠尾草酚41.3g。

采用上述方法，将步骤(一)获得的含90wt％左右的鼠尾草酸组分反复用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20凝胶)进行纯化，得到含量≥98％的鼠尾草酸73.95g。

(三)HPLC检测

实施例5从迷迭香提取物中同时制备高纯度鼠尾草酚和鼠尾草酸

(一)正相硅胶柱分离纯化

(二)凝胶柱分离纯化

将步骤(一)获得的含85wt％左右的鼠尾草酚组分，反复用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20凝胶)进行纯化。凝胶柱的长度为150cm，湿法装柱，湿法上样。流动相用石油醚∶氯仿∶甲醇＝2∶2∶1(体积比)进行洗脱，流动相的流速为5ml/min，层析时间为500min。合并相同组分，减压蒸干，得到≥98％高含量的鼠尾草酚41.2g。

采用上述方法，将步骤(一)获得的含90wt％左右的鼠尾草酸组分反复用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20凝胶)进行纯化，得到含量≥98％的鼠尾草酸73.96g。

(三)HPLC检测

比较例1迷迭香提取物的溶解试验

称六份实施例1制备的迷迭香提取物，每份10g分为六组，每组分别用100ml：石油醚、氯仿、醋酸乙酯、丙酮、80％乙醇、用水饱和的醋酸乙酯进行超声溶解0.5小时，过滤去掉不溶物，滤液减压浓缩得浸膏，称量检测计算鼠尾草酚和鼠尾草酸的含量。具体分组操作如下：

第一组：10g迷迭香提取物，加100ml石油醚超声溶解0.5小时，过滤除去不溶物，滤液减压浓缩得浸膏3.9g，鼠尾草酚和鼠尾草酸含量分别为14.15％和17.87％，计算鼠尾草酚和鼠尾草酸绝对含量为0.5519g和0.6969g。石油醚不能将提取物中的鼠尾草酚和鼠尾草酸完全溶出。

第二组：10g迷迭香提取物，加100ml氯仿超声溶解0.5小时，过滤除去不溶物，滤液减压浓缩得浸膏5.0g，鼠尾草酚和鼠尾草酸含量分别为15.10％和22.90％，计算鼠尾草酚和鼠尾草酸绝对含量为0.7550g和1.1450g。氯仿溶解不能将提取物中的鼠尾草酚和鼠尾草酸完全溶出。

第三组：10g迷迭香提取物，加100ml醋酸乙酯超声溶解0.5小时，过滤除去不溶物，滤液减压浓缩得浸膏5.6g，鼠尾草酚和鼠尾草酸含量分别为16.01％和27.13％，计算鼠尾草酚和鼠尾草酸绝对含量为0.8966g和1.5193g。醋酸乙酯溶解，也不能将提取物中的鼠尾草酚和鼠尾草酸完全溶出。

第四组：10g迷迭香提取物，加100ml丙酮超声溶解0.5小时，过滤除去不溶物，滤液减压浓缩得浸膏6.0g，鼠尾草酚和鼠尾草酸含量分别为15.87％和26.93％，计算鼠尾草酚和鼠尾草酸绝对含量为0.9522g和1.6158g。丙酮溶解，也不能将提取物中的鼠尾草酚和鼠尾草酸完全溶出。

第五组：10g迷迭香提取物，加100ml 80％乙醇超声溶解0.5小时，过滤除去不溶物，滤液减压浓缩得浸膏6.5g，鼠尾草酚和鼠尾草酸含量分别为15.42％和26.13％，计算鼠尾草酚和鼠尾草酸绝对含量为1.0023g和1.6985g。80％乙醇溶解，能将提取物中的鼠尾草酚和鼠尾草酸完全溶出。

第六组：10g迷迭香提取物，加100ml用水饱和的醋酸乙酯超声溶解0.5小时，滤液减压浓缩得浸膏6.3g，鼠尾草酚和鼠尾草酸含量分别为16.27％和27.62％，计算鼠尾草酚和鼠尾草酸绝对含量为1.0250g和1.7401g。用水饱和的醋酸乙酯溶解，能将提取物中的鼠尾草酚和鼠尾草酸完全溶出，且最大限度地除去了大极性的杂质，回收溶剂简单容易。

Claims

1.一种从迷迭香提取物中同时制备高纯度鼠尾草酚和鼠尾草酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

I. 将迷迭香提取物用水饱和的醋酸乙酯溶解，正相硅胶拌样得到上柱样品，干法装柱、干法上样，用氯仿、甲醇和乙酸进行梯度洗脱，所述的梯度洗脱分五次进行，流动相依次为：氯仿；氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100：0：1‰；氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100：1：1‰；氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100：2：1‰；氯仿、甲醇、乙酸，体积比为95：5：1‰；合并相同组分，获得5个组分，分别为：小极性杂质部分、鼠尾草酚粗品、鼠尾草酸粗品、主要成分为熊果酸的组分和大极性杂质部分；

II. 反复用羟丙基葡聚糖凝胶分别对步骤I获得的鼠尾草酚粗品和鼠尾草酸粗品进行纯化，流动相用体积比为（2~2.5）:1的氯仿和甲醇或体积比为（2~5）:（2~5）:1的石油醚、氯仿和甲醇进行等度洗脱，流动相在羟丙基葡聚糖凝胶中的流速为2 ~ 6 ml/min，合并相同组分，减压蒸干各组分，分别得到含量≧98%的鼠尾草酚和含量≧98%的鼠尾草酸两个产品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述迷迭香提取物为迷迭香花或叶的乙醇水溶液浸提物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述迷迭香提取物的提取方法为：将迷迭香花或叶粉碎，用体积百分浓度为50~70%乙醇水溶液按照液料比为（10~15）：1，单位为L/Kg，进行超声提取，时间为60~90分钟，连续提取2~4次，合并提取液，减压浓缩蒸干后得到迷迭香提取物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤II中羟丙基葡聚糖凝胶柱的长度为120~150 cm；湿法装柱，湿法上样。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤II中氯仿与甲醇的体积比为2.5：1，或者石油醚、氯仿与甲醇的体积比为 5：5：1。