CN108084241A - 从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法，包括以下步骤：将羊栖菜粉末用有机溶剂浸提，将提取液浓缩后干燥，得岩藻甾醇粗提物；将L‑柠檬烯、甲醇和水配制成互不相溶的两相溶剂；将两相溶剂中的上相与下相按照1:1的体积比混合，然后加入岩藻甾醇粗提物，得到岩藻甾醇粗提物溶液；将两相溶剂中的上相注入逆流色谱仪分离柱内作为固定相，将岩藻甾醇粗提物溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，注入两相溶剂中的下相作移动相，收集保留时间为40～50min的组分，旋转蒸发后得到岩藻甾醇。采用本发明的方法能从羊栖菜中分离制备获得高纯度的岩藻甾醇。

Description

从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法

技术领域

本发明涉及羊栖菜中岩藻甾醇单体的逆流色谱分离制备方法，特别是采用逆流色谱法从羊栖菜粗提物中分离制备单体岩藻甾醇的方法。

背景技术

岩藻甾醇(Fucosterol)，又名24-亚乙基胆甾-5烯-3β醇，属于植物甾醇的一种，存在于多类海藻中，一般呈现出白色针状晶体，其分子式为C₂₉H₄₈O，大多通过非极性试剂以及硅胶柱层色谱进行分离提取，以质谱及核磁技术测定其化学结构(化学结构如式I所示)。

羊栖菜是一种暖温带-亚热带性海藻，广泛分布于东亚地区多个海域，因多汁肉厚，营养价值高等特点，已成为沿海居民喜爱的传统佳肴。在日本，羊栖菜被冠以“海上参”及“长寿菜”的称号，身价为海带的数倍。以羊栖菜作为原材料，已经成功地研制出一系列的调味品、休闲食品、保健食品以及相关的药品等。此外，作为传统的中草药，羊栖菜与海蒿子已被《中国药典》收藏为药用。岩藻甾醇(结构式如式Ⅰ所述)是羊栖菜中重要的生物活性物质，是植物甾醇的一种，相关药理学试验表明其具有促进生物内环境稳定、抗癌、调节胆固醇、降低血糖、消炎及抗氧化等多种生理功能。岩藻甾醇还可以作为药物及激素的合成原材料，如氢化可的松、雄性及雌性激素等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从羊栖菜中分离制备高纯度岩藻甾醇的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法，包括以下步骤：

1)、将羊栖菜粉末用有机溶剂浸提，将提取液旋转蒸发浓缩成浸膏，将所得浸膏干燥(于60±10℃烘干100～140分钟)，得岩藻甾醇粗提物(为浅棕色的粉末)；

2)、将L-柠檬烯、甲醇和水按照10:8.5～9.5:0.9～1.1的体积比配制后倒入分液器中，形成互不相溶的两相溶剂；

3)、将两相溶剂中的上相与下相按照1:1的体积比混合，得混合剂；将步骤1)所得的岩藻甾醇粗提物溶于所述混合剂中，得到岩藻甾醇粗提物溶液，所述岩藻甾醇粗提物与混合剂的料液比为0.3～0.5g/9～11ml；

4)、将步骤2)所得的两相溶剂中的上相注入逆流色谱仪分离柱内作为固定相，将步骤3)所得的岩藻甾醇粗提物溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，注入两相溶剂中的下相作移动相，移动相的流速为2.5±0.2ml/min，收集保留时间为40～50min的组分，旋转蒸发(温度为45±5℃，至旋干)后得到岩藻甾醇(为纯化的岩藻甾醇单体)。

备注说明：注入流动相后，岩藻甾醇便在逆流色谱仪内进行连续的分配，通过紫外检测器的在线监测，收集、合并流出物(收集保留时间为40～50min的组分)。

作为本发明的从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法的改进：

所述步骤1)中的浸提为：按照1kg/1～2L的料液比，在羊栖菜粉末中加入作为溶剂的无水乙醇，于回流条件下浸提2±0.5小时。

作为本发明的从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法的进一步改进：

所述步骤1)中，第一次浸提后，再重复浸提2～5次，重复浸提时，以95％乙醇作为溶剂，料液比同第一次浸提的料液比；将每次浸提所得的提取液合并后进行浓缩。

作为本发明的从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法的进一步改进：

所述L-柠檬烯、甲醇和水＝10:9:1的体积比。

作为本发明的从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法的进一步改进：

所述步骤1)中，提取液于45±5℃旋转蒸发浓缩至为原体积的5％～10％，得浸膏。

本发明采用的逆流色谱方法是一种连续的无需任何固体支持物的液液分配色谱方法，它避免了固态支持体或载体造成的吸附、损耗和变性等问题，能保证较高的峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂，能直接分离大量岩藻甾醇粗提样品，分离得到的岩藻甾醇纯度一般可达到93％以上。而且所用的逆流色谱仪比高效液相色谱仪更加简单便宜，其溶剂由普通溶剂配制，价格便宜，因此是一种经济的从羊栖菜提取物中分离岩藻甾醇的方法。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为实施例1中岩藻甾醇粗提物的高效液相分析图；

图2为实施例1中分离岩藻甾醇的逆流色谱图；

图3为实施例1中分离纯化的岩藻甾醇的高效液相分析图；

图4为实施例1中分离纯化的岩藻甾醇的核磁共振氢谱图；

图5为实施例1中分离纯化的岩藻甾醇的核磁共振碳谱图；

图6为实施例1中分离纯化的岩藻甾醇的核磁共振DEPT135谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、一种从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法，依次进行以下步骤：

1)、将1kg干的羊栖菜药材粉末(含水率≤5％，粒径为过100目的筛)用无水乙醇1.5L加热回流浸提2小时；

抽滤出溶剂，重复上述浸提，即，在滤渣中再加入1.5L的95％乙醇，重复以上操作三次，将4次浸提所得的提取液合并用旋转蒸发仪浓缩(温度为45℃，浓缩至为原体积的5％)成浸膏；将所得的浸膏于60℃烘干120分钟，得25g岩藻甾醇粗提物(羊栖菜粗提物)，其高效液相分析如图1所示，岩藻甾醇的含量为15.8％。

2)、用逆流色谱仪分离岩藻甾醇提取物：

用L-柠檬烯、甲醇和水，按体积比为10:9:1配制两相溶剂，在分液容器中静置分层，分出上下相。

将羊栖菜粗提物300mg溶于5ml上相和5ml下相中形成样品溶液(即，岩藻甾醇粗提物溶液)；逆流色谱柱内径2.6mm，柱体积为350ml。以上相作固定相，下相为移动相，待逆流色谱仪分离柱内中注满固定相后，将样品溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，转速为1200转，以2.5ml/min的流速注入移动相，通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长210nm，收集、合并流出物(收集保留时间为40～50min的组分)，旋转蒸发(温度为45℃，至旋干)，得到岩藻甾醇45mg，其纯度为93.4％，回收率为88.7％，见图2和图3。岩藻甾醇的一维核磁共振波谱及质谱数据如下：白色粉末。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ5.37(dt,J＝4.6,2.0Hz,1H,H-6),5.20(q,J＝6.7Hz,1H,H-28),3.54(tt,J＝11.2,4.7Hz,1H,H-3),1.59(d,J＝6.7Hz,4H),1.03(s,3H,H-21),0.99(dd,J＝6.8,1.8Hz,6H,H-19,26),),0.97–0.85(m,3H,H-27),0.70(s,3H,H-18)。碳谱归属如表1所示：

表1、岩藻甾醇的碳谱归属表

结合¹³C-NMR和DEPT 135°数据分析得到岩藻甾醇含有29个C原子，包括10个CH₂，15个CH和CH₃以及4个季碳(qC)。其中，δ_C:115.57，121.71，140.79，147.01表明该化合物含有两个烯双键，δ_C:71.87连接一个-OH。由氢谱中δ_H:5.20(q,J＝6.7Hz,1H)，1.59(d,J＝6.7Hz,3H,H-29)，1.01(s,3H,H-21)，0.99(dd,J＝6.8,1.8Hz,6H,H-26,27)和碳谱中δ_C:147.0，115.5信号，为侧链含有烯双键的甾醇类化合物。¹H NMR中的烯氢质子的信号δ5.37(dt,J＝4.6,2.0Hz,1H,H-6)和次甲基质子的多重峰信号δ3.54(tt,J＝11.2,4.7Hz,1H,H-3)以及支链上的甲基质子的信号δ1.03(s,3H,H-19)，0.70(s,3H,H-18)，和¹³C NMR中140.79(C-5,qC)，121.71(C-6,CH)是Δ⁵-3β-羟基甾体母核的典型特征。

实施例2、一种从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法：

将实施例1步骤2)中移动相的注入流速由2.5ml/min改成3ml/min，其余等同于实施例1。最终所得的岩藻甾醇，其纯度为91.9％，回收率为86.9％。

实施例3、一种从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法：

将实施例1步骤2)中羊栖菜粗提物的用量由300mg改成500mg，且，将移动相的注入流速由2.5ml/min改成3ml/min，其余等同于实施例1。最终所得的岩藻甾醇，其纯度为89.2％，回收率为85.6％。

对比例1-1、将实施例1中的L-柠檬烯、甲醇和水(体积比为10:9:1)组成的两相溶剂体系改成L-柠檬烯、甲醇和水(体积比为10:8:2)，其余同实施例1。

对比例1-2、将实施例1中的L-柠檬烯、甲醇和水(体积比为10:9:1)组成的两相溶剂体系改成L-柠檬烯、甲醇和水(体积比为10:10:1)，其余同实施例1。

对比例2、将实施例1中的L-柠檬烯、甲醇和水(体积比为10:9:1)组成的两相溶剂体系改成正己烷、甲醇和水(体积比为10:9:1)，其余同实施例1。

对比例3、将实施例1中的L-柠檬烯、甲醇和水(体积比为10:9:1)组成的两相溶剂体系改成正己烷、乙醇和水(体积比为10:9:1)，其余同实施例1。

对比例4、将实施例1中的L-柠檬烯、甲醇和水(体积比为10:9:1)组成的两相溶剂体系改成L-柠檬烯、乙醇和水(体积比为10:9:1)，其余同实施例1。

上述所有对比例所制备的岩藻甾醇的纯度如表2所述。

表2

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法，其特征是包括以下步骤：

1)、将羊栖菜粉末用有机溶剂浸提，将提取液旋转蒸发浓缩成浸膏，将所得浸膏干燥，得岩藻甾醇粗提物；

2)、将L-柠檬烯、甲醇和水按照10:8.5～9.5:0.9～1.1的体积比配制后倒入分液器中，形成互不相溶的两相溶剂；

3)、将两相溶剂中的上相与下相按照1:1的体积比混合，得混合剂；将步骤1)所得的岩藻甾醇粗提物溶于所述混合剂中，得到岩藻甾醇粗提物溶液，所述岩藻甾醇粗提物与混合剂的料液比为0.3～0.5g/9～11ml；

4)、将步骤2)所得的两相溶剂中的上相注入逆流色谱仪分离柱内作为固定相，将步骤3)所得的岩藻甾醇粗提物溶液注入逆流色谱仪的进样环中，开启逆流色谱仪，注入两相溶剂中的下相作移动相，移动相的流速为2.5±0.2ml/min，收集保留时间为40～50min的组分，旋转蒸发后得到岩藻甾醇。

2.根据权利要求1所述的从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法，其特征是：

所述步骤1)中的浸提为：按照1kg/1～2L的料液比，在羊栖菜粉末中加入作为溶剂的无水乙醇，于回流条件下浸提2±0.5小时。

3.根据权利要求2所述的从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法，其特征是：

所述步骤1)中，第一次浸提后，再重复浸提2～5次，重复浸提时，以95％乙醇作为溶剂，料液比同第一次浸提的料液比；将每次浸提所得的提取液合并后进行浓缩。

4.根据权利要求3所述的从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法，其特征是：

所述L-柠檬烯、甲醇和水＝10:9:1的体积比。

5.根据权利要求1～4任一所述的从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法，其特征是：

所述步骤1)中，提取液于45±5℃旋转蒸发浓缩至为原体积的5％～10％，得浸膏。