CN101945884A

CN101945884A - 皮肤衰老预防或改善剂

Info

Publication number: CN101945884A
Application number: CN2009801051544A
Authority: CN
Inventors: 龟山明代; 藤村努
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2008-02-27
Filing date: 2009-02-26
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2029-02-26
Also published as: JP2009227657A; CN101945884B; WO2009107853A2; EP2257565B1; WO2009107853A3; US8853174B2; JP5665276B2; EP2257565A2; US20100331272A1

Abstract

本发明涉及一种皮肤衰老预防或改善剂，其显示出对皮肤上皱纹或松弛皮肤的形成的抑制、或改善皮肤上皱纹或松弛皮肤的较优异的作用。一种皮肤衰老预防或改善剂，含有由下式(1)所代表的三萜皂苷作为活性成分，其中R¹和R²中的至少一个是巴豆酰基，且另一个代表巴豆酰基或当归酰基；R³代表甲基或羟甲基；并且R⁴代表Glc、Xyl或Gal。

Description

皮肤衰老预防或改善剂

技术领域

本发明涉及一种皮肤衰老预防或改善剂，其具有抑制或改善皱纹或松弛皮肤形成的作用。

背景技术

为了保持健康和美丽的皮肤是倍受关注的问题，尤其对于女性。然而，皮肤的状况不断地受到多种因素的影响，诸如湿度、紫外线、年龄增长、疾病、应激和膳食习惯，并且结果，出现各种皮肤问题，诸如皮肤总体功能的下降和皮肤的衰老。

其中，由于年龄增长引起的皮肤衰老，由于暴露于阳光引起的光老化等导致皱纹或松弛皮肤发生。即，伴随着暴露于阳光或年龄增长，产生皮肤纤维的细胞在尺寸和数目上均变小，并且尤其是大量的胶原纤维丧失。因此，真皮的退化、皮下脂肪组织的减少等导致皮肤衰老，并且此衰老主要引起皱纹、皮肤松弛以及皮肤弹性的丧失。

迄今为止已经提出了抑制或改善包括此类皱纹、松弛皮肤等的衰老过程的组合物或方法(专利文件1、专利文件2、专利文件3、专利文件4、专利文件5和专利文件6)，但它们的作用均不一定令人十分满意。

因此，本发明的申请人发现马栗树(horse chestnut)(欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum))的提取物具有改善皱纹的优异作用，并且在之前提交了专利申请(专利文件7)。然而，没有完全清楚马栗树中存在的哪种组分表现出上面提到的作用。

[专利文件1]JP-A-62-185005

[专利文件2]JP-A-62-502546

[专利文件3]JP-A-02-72157

[专利文件4]JP-A-02-288822

[专利文件5]JP-A-07-41419

[专利文件6]JP-A-06-510542

[专利文件7]JP-A-2005-8571

发明内容

本发明涉及皮肤衰老预防或改善剂，所述药剂包括由下式(1)所代表的三萜皂苷作为活性成分：

其中R¹和R²中的至少一个是巴豆酰基(tigloyl)，且另一个代表巴豆酰基或当归酰基(angeloyl)；R³代表甲基或羟甲基；并且R⁴代表Glc、Xyl或Gal。

本发明还涉及一种皮肤外用制剂，包括0.00001-2质量％的上式(1)代表的三萜皂苷。

本发明还涉及上式(1)代表的三萜皂苷在制造皮肤衰老预防或改善剂中的应用。

本发明还涉及预防或改善皮肤衰老的方法，包括将上式(1)代表的三萜皂苷施用于人体。

此外，本发明还涉及由下式(1a)所代表的三萜皂苷：

其中R¹和R²中的至少一个是巴豆酰基，且另一个代表巴豆酰基或当归酰基；R³代表甲基或羟甲基；并且R⁴代表Glc、Xyl或Gal，条件是不包括其中R¹是巴豆酰基；R²是巴豆酰基或当归酰基；R³是羟甲基；并且R⁴是Glc的情况。

附图说明

图1显示从其获得印模(replica)用于线粗糙度分析(line roughness analysis)的面部区域，以及印模的分析区(L：位于离眼外角侧一端10mm远处的线(L＝10mm)，S：离眼外角侧一端2mm至14mm远的区域(面积：12mm×10mm))。

图2显示通过对眼外角的照片肉眼观察确定的评分的变化。

图3显示通过印模的线粗糙度分析获得的Ra和Rz的数据。

图4显示通过印模的表面粗糙度分析获得的Sa和Sz的数据(#：来自6名受试者的印模的分析数据(n＝6)，其中含有气泡的一个印模被排除在外。

具体实施方式

本发明涉及提供化妆品、药品等，它们在抑制皮肤皱纹或松弛皮肤的形成、或改善皮肤皱纹或松弛皮肤方面显示更优异的效果。

本发明的发明人对马栗树中含有组分进行研究，结果他们出人意料地发现上面所示的式(1)所表示的三萜皂苷，其是马栗树种子中含有的次要组分，具有显著地增强由皮肤成纤维细胞产生的收缩力的作用，并且可用于预防或改善皱纹或松弛皮肤。除了其一些衍生物以外，该三萜皂苷是由式(1a)代表的新化合物。

本发明的皮肤衰老预防或改善剂和皮肤外用制剂表现出抑制皱纹或松弛皮肤形成，或改善皱纹或松弛皮肤的作用。本发明的药剂和外用制剂可用作化妆品、药品等，它们抑制皱纹或松弛皮肤的形成，使皱纹或松弛皮肤的外观变得不引人注意，或可消除皱纹或松弛皮肤。

在本发明的由式(1)表示的三萜皂苷中，其中R¹是巴豆酰基，R²是巴豆酰基或当归酰基，R³是羟甲基，并且R⁴是Glc的化合物是已知化合物，而其他的化合物(式(1a))是新的化合物。

就改善皱纹或松弛皮肤的作用而言，即，就由皮肤成纤维细胞产生的收缩力而言，在式(1)和(1a)中，R³优选是羟甲基，其中R¹优选是巴豆酰基，其中R²优选地是巴豆酰基。

此外，R⁴优选是Glc或Xyl，并且更优选是Glc。

在这些式中，Glc代表葡萄糖残基，Gal代表半乳糖残基，且Xyl是木糖残基。

本发明的三萜皂苷的代表性实例显示如下。

[表1]

	R¹	R²	R³	R⁴
					化合物1	Tig	Tig	CH₂OH	Glc
化合物2	Tig	Ang	CH₂OH	Glc
					化合物3	Ang	Tig	CH₂OH	Glc
化合物4	Tig	Tig	CH₂OH	Xyl

化合物5	Ang	Tig	CH₂OH	Xyl
					化合物6	Tig	Tig	CH₃	Gal

Tig：巴豆酰基，Ang：当归酰基

已经报道马栗树的种子含有七叶素(escin)衍生物作为主要成分，诸如Escin Ia(R¹：巴豆酰基，R²：乙酰基，R³：羟甲基，R⁴：Glc)和Escin Ib(R¹：当归酰基，R²：乙酰基，R³：羟甲基，R4：Glc)，它们具有乙酰基作为R²(Chem.Pharm.Bull.46(11)，1764-1769(1998))。然而，如下面所述的测试例中所示，七叶素衍生物不显示如本发明的化合物中所观察到的增强收缩力的作用。

本发明的三萜皂苷(1)，包括化合物(1a)，可通过使用适当的分离和纯化方法诸如柱色谱、离子交换色谱和高效液相色谱，分离和纯化提取物来获得，该提取物从属于七叶树属(genus Aesculus)诸如马栗树(欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum L.))、Tochi-no-ki(日本七叶树(Aesculus turbinate))或中国马栗树(中国七叶树(Aesculus chinensis))的植物的种子通过溶剂提取而制备。下面，将说明化合物分离的实施例。

1)将乙醇-水混合溶液加入至马栗树种子的磨碎产物中，并且进行提取，同时在加热下搅拌该混合物，从而获得马栗树的提取物。

2)使1)中获得的提取物经过装填有Diaion HP20的柱，以吸附皂苷组分。吸附的皂苷用99.5vol％乙醇洗脱以获得混合物A。

3)将2)中获得的混合物A溶解在70vol％甲醇中，将己烷加入至溶液中，并且通过在分液漏斗中振荡而混合该混合物，以使该混合物分层。减压浓缩70vol％甲醇层并冻干而获得混合物B。

4)3)中获得的混合物B用装填有ODS的柱进行快速柱色谱，并且用甲醇∶水(体积比50∶50→90∶10→100∶0)的混合溶液进行分步洗脱，从而获得混合物C。

5)4)中获得的混合物C用装填有硅胶的柱进行快速柱色谱，并且用氯仿∶甲醇∶水(8∶2∶1→7∶3∶0.5→6∶4∶1→仅甲醇)的混合溶液进行分步洗脱，从而获得混合物D。

6)5)中获得的混合物D进行装有ODS柱的中压色谱，并且用1％乙酸-70vol％甲醇和1％乙酸-甲醇进行分步洗脱，从而获得混合物E，其主要含有二酰化的三萜皂苷。

7)6)中获得的混合物E进行装有ODS柱的高效液相色谱，并且用加入0.005％三氟乙酸的45vol％乙腈的进行分馏，从而获得下面表1和表2中所示的皂苷a至g。

8)7)中获得的皂苷g进行循环制备型高效液相色谱以获得g-1和g-2。

此外，当进行该提取和分馏时，三萜皂苷(1)可单独获得或作为几种物种的混合物获得，但关于本发明的皮肤衰老预防或改善剂和皮肤外用制剂，可使用这些中的任意一种。

本发明的式(1)所代表的三萜皂苷具有增强皮肤成纤维细胞产生的收缩力的作用，如下面实施例中所述。皮肤成纤维细胞产生的收缩力是形成应力纤维的原因，其伴随着肌动蛋白聚合，并且增强由皮肤成纤维细胞产生的收缩力的物质相信能有效地预防或改善皮肤组织的衰老，即，皮肤的松弛、弹性降低、皱纹等(J.Cosmet.Sci.，57，369-376，2006)。

因此，本发明的三萜皂苷可用作皮肤衰老预防或改善剂或皮肤外用制剂，其显示诸如预防或改善皱纹和改善皮肤弹性的作用，并且该化合物可用于制造皮肤衰老预防或改善剂或皮肤外用制剂。皮肤衰老预防或改善剂或皮肤外用制剂可用作化妆品、药品、准药品(quasi-drugs)等。

此外，含有本发明的三萜皂苷的化妆品或准药品含有本发明的三萜皂苷，并且可适用于预防或改善皮肤衰老，预防或改善皱纹，以及预防或改善皮肤的弹性或回弹力降低的目的。

在使用本发明的皮肤衰老预防或改善剂用作药品的情况下，给药途径的例子可以为，例如，通过片剂、胶囊、颗粒、粉末、糖浆等口服给药，或通过注射剂、栓剂、吸入剂、透皮吸收制剂、外用制剂等胃肠外给药。优选施用于皮肤的皮肤外用制剂。当制备这些各种剂型的药物制剂时，本发明的式(1)所代表的三萜皂苷可单独使用，或与其他药学可接受的赋形剂，诸如媒介物、结合剂、填充剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂、防腐剂、调味剂、香味剂、成膜剂、载体、稀释剂等适当组合使用。

在使用本发明的皮肤衰老预防或改善剂或皮肤外用制剂作为准药品或化妆品材料的情况下，该药剂可被制备成清洁剂，化妆用化妆品材料等，并且该药剂可以取决于其用途以各种制剂形式提供，诸如洗剂、乳剂、化妆收敛剂(cosmetic toner)、凝胶、霜剂、凝胶、糊剂、泥敷剂(cataplasm)、膏药、贴剂(stick)、薄层(sheet)、软膏剂、粉末和颗粒。

这些各种制剂形式的准药品或化妆品材料可通过如下制备：单独使用本发明的式(1)所代表的三萜皂苷，或适当地将三萜化合物与可掺入至准药品、皮肤化妆品材料和清洁材料中的组分混合，所述组分诸如油类组分如植物油和动物油、药物(例如尿囊素、维生素E衍生物、甘草甜素、抗炎剂如抗坏血酸衍生物、抗氧化剂如α-生育酚和抗坏血酸、紫外线吸收剂、疼痛和炎症缓解剂、灭菌消毒剂、收敛剂、皮肤软化剂、激素或维生素)、湿润剂、醇类、螯合剂、pH调节剂、抗菌剂、增稠剂、着色剂、香味剂等。

掺入至皮肤衰老预防或改善剂和皮肤外用制剂中的式(1)所代表的三萜皂苷的量优选为0.00001-2质量％，更优选0.0001-0.5质量％，且进一步优选0.001-0.1质量％。此外，皮肤衰老预防或改善剂的给药量，以三萜化合物计，优选为每天0.001-200mg，更优选0.01-50mg，且进一步优选0.1-10mg。

实施例

制备例1

(1)将500g马栗树(Aesculus hippocastanum L.)种子磨碎，然后风动分离以去除剥除的外壳。向400g主要含有胚乳的种子的磨碎产物中加入4L乙醇和水的混合溶液(体积比50∶50)，并且将混合物提取，同时在50℃下加热并搅拌6小时。停止加热和搅拌，并且使提取物冷却至室温，然后过滤。乙醇和水的混合溶液(4L，体积比50∶50)再次加入至残渣中，并以相同的方式进行提取。将提取物过滤，并且将滤液与以前的滤液合并，从而获得马栗树提取物。提取物中提取的固体含量为约90g。

(2)使(1)中获得的提取物经过装有装填有Diaion HP20的柱，从而吸附包括目标组分的皂苷组分。用50vol％乙醇洗涤柱，并且用99.5vol％乙醇洗脱吸附的皂苷，从而获得7.0g混合物A。

(3)将(2)中获得的7.0g混合物A溶解在70vol％甲醇中，并向其中加入己烷。通过在分液漏斗中振荡而混合该混合物，然后使该混合物在室温下静置，从而使该混合物分层。减压浓缩70vol％甲醇层并冻干而获得5.2g混合物B。

(4)5.2g(3)中获得的混合物B用装填有ODS的柱进行快速柱色谱，并且用甲醇∶水(体积比50∶50→90∶10→100∶0)的混合溶液进行分步洗脱，从而获得3.8g含有目标组分的混合物C。在此，在混合物C中，除目标组分以外的组分大多数是七叶素衍生物。

(5)3.8g(4)中获得的混合物C用装填有硅胶的柱进行快速柱色谱，并且用氯仿∶甲醇∶水(8∶2∶1→7∶3∶0.5→6∶4∶1→仅甲醇)的混合溶液进行分步洗脱，从而获得2.8g含有目标组分的混合物D。

(6)2.8g(5)中获得的混合物D进行装有ODS柱的中压色谱，并且用1％乙酸-70vol％甲醇和1％乙酸-甲醇进行分步洗脱，从而获得442.4mg混合物E，其主要含有二酰化的三萜皂苷。

(7)从(6)中获得的混合物E中，40.0mg进行装有ODS柱的高效液相色谱，并且用加入0.005％三氟乙酸的45vol％乙腈的进行分馏，从而获得2.1mg皂苷a(化合物4)、6.8mg皂苷b(化合物1)、2.7mg皂苷c(化合物2)、0.9mg皂苷d(化合物5)、3.0mg皂苷e(化合物3)、1.1mg皂苷f和4.3mg皂苷g。分析皂苷a-f，并且确认为单一化合物。

(8)将(7)中获得的皂苷g通过循环制备型高效液相色谱进行分馏以获得1.5mg皂苷g-1和1.3mg皂苷g-2(化合物6)。

此外，在马栗树的提取物中，在混合物E中发现了在下面实施例中所述的增强细胞产生的收缩力的大部分活性。

获得的化合物的¹³C-NMR光谱数据在表2和3中给出。

[表2]

糖苷配基部分的¹³C-NMR数据(125MHz吡啶-d5中)

[表3]

糖部分的¹³C-NMR数据(125MHz吡啶-d5中)

Glc-A：葡糖醛酸残基

ND：由于信号强度低而未检测到

测试例1测量由细胞产生的收缩力(1)

由细胞产生的收缩力的测量根据Kolodney等人的方法(Kolodney MS，Wysolmerski RB，Isometric contraction by fibroblasts and endothelial cells in tissue culture：a quantitative study.(组织培养中成纤维细胞和内皮细胞的等长收缩：定量研究)J.Cell Biol.，117，73-82(1992)；和Kolodney MS，Elson EL，Correlation of myosin light chain phosphorylation with isometric contraction of fibroblasts.(肌球蛋白轻链磷酸化与成纤维细胞的等长收缩的相关性)J.Biol.Chem.，268，23850-23855(1993))在胶原凝胶培养系统中进行。

采用人皮肤成纤维细胞(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.，大阪，日本，传代数：3至8)。成纤维细胞包埋的胶原凝胶(1.5×10⁶细胞，1.5mg/mL胶原，I-A型Nitta Gelatin)悬浮并固定在装有约70mL无血清培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM))的烧杯中，培养基保持在37℃，并使胶原凝胶在约200mg重量的张力下稳定1小时。此后，用无血清DMEM稀释至其馏分中的终浓度的约70倍的测试物质以1.0mL的量加入(终浓度：3μM)。人皮肤成纤维细胞产生的收缩力用等张传感器(Isotonic Transducer，8gf，T-7-8-240，ORIENTEC，日本)测量，并通过BIOPAC系统(BIOPAC Systems Inc.，圣巴巴拉，CA，美国)记录。结果显示在表5中。

测试物质：

在上面所述的制备例中分离的皂苷中，使用表4中所示的皂苷b(化合物1)、皂苷c(化合物2)、皂苷e(化合物3)，并且七叶素Ia、Ib和皂苷g-1用作用于比较的对照。

[表4]

	R¹	R²	R⁴
				化合物1	Tig	Tig	Glc
化合物2	Tig	Ang	Glc
				化合物3	Ang	Tig	Glc
七叶素Ia	Tig	Ac	Glc
				七叶素Ib	Ang	Ac	Glc
皂苷g-1	Ang	Ang	Glc

[表5]

如表5中所示，七叶素Ia、Ib和皂苷g-1显示由成纤维细胞产生的收缩力没有增强，但本发明的化合物显示由成纤维细胞产生的收缩力有显著的增强。

测试例2测量由细胞产生的收缩力(2)

在上面所述的制备例中分离的皂苷中，通过与测试例1中相同的方法测量加入表6中所示的皂苷b(化合物1)或皂苷a(化合物4)的成纤维细胞产生的收缩力。结果显示在表7中。

[表6]

	R¹	R²	R⁴
				化合物1	Tig	Tig	Glc
化合物4	Tig	Tig	Xyl

[表7]

如表7中所示，确认具有不同类型的糖结合部分的化合物4也增强了由成纤维细胞产生的收缩力。

制备例2由人评价的样品的制备

向100g去除壳的马栗树种子的磨碎产物中加入1L 75vol％乙醇，将混合物在50℃下加热6小时并搅拌以进行提取。提取物冷却至室温后，进行过滤。将1L 75vol％乙醇加入至残渣中，在相同条件下再次进行提取，并将提取物过滤。将两个滤液合并，并向其中加入240g 1，3-丁二醇，生成的混合物减压浓缩。该浓缩物在低温下静置1周，然后过滤以去除所有不溶的组分。向得到的产物中加入1，3-丁二醇和水，从而制备3.5L 80％1，3-丁二醇溶液(固体含量：0.5质量％)，其包含高浓度的本发明的化合物。其用作本发明的三萜皂苷混合物的溶液。此三萜皂苷混合物的溶液含有总共0.02质量％的化合物1-6。

测试例3在人体上的测试

(1)测试设计

在7名健康女性受试者(年龄：30多岁至40多岁)的半侧脸上进行双盲比较试验，以比较含有制备例2中制备的三萜皂苷混合物的溶液的测试样品与不含有三萜皂苷混合物的溶液的安慰剂样品，这些受试者的眼外角处有皱纹。各受试者每天将预定的样品涂抹在其眼周围区域上，每天两次或三次，持续两个月。

表8显示测试样品的配方。

[表8]

成分(质量％)	测试样品	安慰剂
			本发明的三萜皂苷混合物的溶液	3.0	-
黄原胶	0.1	0.1
			86％甘油	5.0	5.0
甲基聚硅氧烷	4.0	4.0
			羧基乙烯基聚合物	0.4	0.4
氢氧化钾	0.6	0.6
			鲸蜡基二甲丁基醚	0.1	0.1
新戊二醇二癸酸酯	0.1	0.1
			1，3-丁二醇	3.0	3.0
聚乙二醇	3.0	3.0
			琥珀酸	0.3	0.3
聚氧乙烯醚氢化蓖麻油	0.5	0.5
			防腐剂	0.3	0.3
香味剂	痕量	痕量
			95％合成醇	0.5	0.5
纯水	余量	余量

(2)评价样品对皱纹的功效的方法

(A)通过肉眼观察照片确定的评分

用数码照相机对就座并轻微闭眼的各受试者的右眼和左眼周围区域进行拍照(近距摄影)，然后打印在2L大小的纸上。

根据下列的分级基于在照片中观察到的眼外角处的皱纹的程度评价样品：0分：无皱纹，1分：少许皱纹，2分：一些皱纹，3分：许多皱纹，以及4分：相当多的皱纹(从1分至5分以0.25递增；即，总共17个级别)。在2个月试验开始时的分数减去试验结束时的分数(试验期：2个月)，就分数的变化比较各样品。

(B)对印模的粗糙度的分析

从仰卧并轻微闭眼的各受试者取右眼和左眼周围脸部区域的印模(Gc exafine，GC Co.Ltd.，东京，日本)。由此制备的印模进行三维粗糙度分析(PRIMOS软件包，GF Messetechnik GmbH，柏林)。图1显示了获得印模的脸部区域、和用于分析的区域。

使用PRIMOS软件(英文版4.0)，在2个月试验开始时获得的印模(参照)与试验结束时获得的相应印模之间进行布局匹配(configuration matching)。如图1中所示，印模的布局相配的部位被指定为用于眼外角的粗糙度分析的区域。使用软件确定该区域中的线粗糙度和表面粗糙度。采用的线粗糙度参数为Ra(算术平均粗糙度)和Rz(10点平均粗糙度)，采用的表面粗糙度参数为Sa(算术平均高度)和Sz(标度限制表面(scale limited surface)的最大高度)。

(3)结果

1)图2显示通过肉眼观察眼外角的照片确定的评分变化。

在安慰剂组中，在2个月试验开始时的评分和试验结束时的评分之间没有显著差异。相反，在应用本发明的三萜皂苷混合物的溶液组中，观察到评分显著减小。

2)图3显示通过印模的线粗糙度分析获得的Ra和Rz的数据。图4显示通过印模的表面粗糙度分析获得的Sa和Sz的数据(图4显示6个受试者的分析数据，该分析数据排除了一个受试者，因为来自该受试者的印模在分析区域中有气泡。

在安慰剂组中，线粗糙度分析显示在试验开始时的数据与试验结束时的数据之间没有显著差异。相反，在应用本发明的三萜皂苷混合物的溶液组中，在试验开始时的线粗糙度与试验结束时的线粗糙度之间观察到显著差异；即，观察到Ra和Rz的显著减小。

类似于上述情况，安慰剂组中的表面粗糙度分析显示试验开始时的数据与试验结束时的数据之间没有显著差异。相反，在应用本发明的三萜皂苷混合物的溶液组中，观察到Sa和Sz的显著减小。

Claims

1.一种皮肤衰老预防或改善剂，包括由下式(1)代表的三萜皂苷作为活性成分：

其中R¹和R²中的至少一个是巴豆酰基，且另一个代表巴豆酰基或当归酰基；R³代表甲基或羟甲基；并且R⁴代表Glc、Xyl或Gal。

2.根据权利要求1所述的皮肤衰老预防或改善剂，其用于预防或改善皱纹或松弛皮肤。

3.一种皮肤外用制剂，包括0.00001-2质量％的由下式(1)代表的三萜皂苷：

4.根据权利要求1所述的由式(1)代表的三萜皂苷在制造皮肤衰老预防或改善剂中的应用。

5.一种预防或改善皮肤衰老的方法，包括将根据权利要求1所述的由式(1)代表的三萜皂苷施用于人体。

6.由下式(1a)代表的三萜皂苷：